Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Developmental Biology

Ölümsüzleştirdi Multipotent Otic Progenitor Hücrelerde Farklılaşma başlatılıyor

doi: 10.3791/53692 Published: January 2, 2016
* These authors contributed equally

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

1. IMOP Hücrelerde Öz yenileme bakımı

  1. Kültür ortamı iMOP hazırlayın: DMEM / F12, 1X B27 ek, 25 ug / ml ve 20 carbenecillin ng / ml bFGF. Steril reaktifler kullanılarak iMOP kültür ortamı 50 ml sağlayın. 37 ° C bir su banyosu içinde 50 ml konik DMEM / F12 49 ml kadar ısıtın.
    1. Çözülme 50X B27 takviyesi ve 37 ° C su banyosu içinde 5 dakika süre ile filtre ile sterilize edilmiş 100 mg / ml carbenecillin alikotları. RT'de 100 ug / ml bFGF kısım çözülme. Ekle 1 mi 50X B27, 100 ug / ml bFGF 10 ul DMEM / F12 içinde 100 mg / ml carbenecillin 12.5 ul.
  2. Kültürleme iMOP hücreleri için 60 mm doku kültürü çanağı içinde ortam 3 ml kullanın. Medya hacmini iki katına çıkararak her gün kültürlere taze medya ekleyin. BFGF o konsantrasyonu 5 ng / ml altına düşmeyecek emin olun.
    1. Aşağıdaki adımları listelenen kültürdeki 7 günden - 5 sonra% 5 CO 2. Geçiş hücreleri ile 37 ° C 'de kültür iMOP hücreleri. Bir 15 Aktarım kültürü10 ml'lik bir pipet kullanarak ml konik.
  3. HBSS 50 ml 0,5 M EDTA, pH 8.0, 0.1 ml seyreltilmesi ile HBSS 1 mM EDTA sağlayın. Ön Sıcak 1 mM EDTA, 37 ° C su banyosu içinde HBSS içinde yapılır.
  4. Yerçekimi çökelme veya 5 dakika boyunca 200 x g'de santrifüj ile hasat hücreleri. oda sıcaklığında karıştırıldı. 10 dakika - yerçekimi çökelme için, 5 37 ° C kuluçka makinesi içinde kültürleri içeren 15 ml'lik konik yerleştirin. Bu süreden sonra, otospheres 15 ml konik altında toplanır gözlemleyin.
    NOT: Aşırı merkezkaç kuvveti hücre hasarına neden olabilir.
  5. Dikkatlice aspire hücre pelet bozmadan pipet aspirasyon bir 2 ml kullanarak ortam geçirdi. Pelet hücre önceden ısıtılmış 1 mM EDTA HBSS çözeltisi 0,5 ml ilave edilir. P1000 pipet kullanarak, yavaşça yukarı pipetlemeyin ve aşağı 2-3 kez. 37 ° C 'de konik yerleştirin ve tek hücre ayrışmasını kolaylaştırmak için <5 dakika boyunca inkübe edin.
  6. Yavaşça otospheres ayrışmış olup olmadığını belirlemek için hücre çözümü girdap. No Oto Eğerküreler konik altına tortu, hücreler ayrışmış edilir. Inkübasyon süresi değişebilir.
    Not: EDTA ile uzun süreyle kuluçkalanması aşırı hücre ölümüne neden olur.
  7. , 37 ° C ila hücreleri çıkarın EDTA nötralize etmek ve sulandırmak için ortam 2 ml ekleyin. Oda sıcaklığında 5 dakika boyunca 200 x g'de santrifüj ile hücreler toplanır. Aspire dışarı 2 ml aspirasyon pipet kullanarak ve hücreleri yıkamak için 1X PBS 5 ml ekleyin EDTA seyreltilmiş.
  8. Oda sıcaklığında 5 dakika boyunca 200 xg'de hücreleri aşağı Spin ve 2 ml aspire pipet kullanarak 1X PBS dışarı aspire. 3 kez - hafifçe aşağı 2 yukarı pipetleme tarafından iMOP kültür ortamı, 0.5 ml P1000 pipet kullanarak hücreleri tekrar.
  9. Uygun kasetler 28 ile mikroakışkan parçacık sayacı kullanarak hücreleri saymak. IMOP hücrelerin birleşik plaka ~ 6 x10 6 hücre içerecektir. Medyada 100 ve sayım için kaset içine hücre çözeltisi 75 ul ekleyin: hücrelerini 1 seyreltilir. IMOP kültürlerdeki 6 cm tabak Plaka 1 x 10 6 hücreMedya yeniden (~ 1: 10 seyreltme). Passage iMOPs her 5-7 gün.
    NOT: Büyük otospheres oluşturacak veya ayırt edecek doku kültürü çanak alt eklemek Hücreler. Kültürler konfluent yaşın üzerinde iseniz hücreler de ölecektir.

2. Donma ve Çözülme IMOP Hücreleri

  1. Eritilmiş ve dondurmadan önce hücrelere 4 ° C'ye kadar çözüm dengeye sentetik dondurma ortamı hazırlayın.
  2. IMOP hücrelerinin konfluent 6 cm çanak hücreleri toplamak. 15 ml konik içine - (8 x 10 6 hücre ~ 6) 10 ml pipet ve transfer hücreleri kullanın.
  3. Yerçekimi çökelme veya oda sıcaklığında 5 dakika boyunca 200 x g'de santrifüj ile hasat hücreleri. Otospheres küçükse, hücreler yerçekimi sedimantasyon razı olmaz. İsteğe bağlı: toplam hücre numaralarını belirlemek için adım 1.9 kullanarak hücreleri saymak.
  4. Aspire arkasında gevşek hücre pelet bırakarak pipet aspirasyon bir 2ml kullanarak medya geçirdi.
  5. Ce tekrar süspansiyon sentetik donma medya 0.25 ml ekleyin~ 5 x 10 5 6 10 x 3 hücre / ml bir yoğunlukta lls. Yavaşça P1000 pipet ile hücreleri pipetle. Ucu süzülmüş 1 ml P1000 pipet kullanarak kriyojenik flakon hücre süspansiyonu aktarın.
  6. Bir alkol serbest dondurma kapta şişeleri yerleştirin ve sıcaklık ulaşıncaya kadar -80 ° C, dakikada 1 ° C düşürmek için -80 ° C'de dondurma kap yerleştirin.
  7. Hücrelerin uzun süreli depolama için bir sıvı azot depolama tankının gaz fazına şişeleri aktarın. Kültür hücreleri çözülme, -80 ° C donmuş hücreleri içeren kriyojenik flakon dengeye.
  8. 37 ° C su banyosunda Öncesi sıcak iMOP kültür ortamı.
  9. 37 ° C su banyosu içinde şişenin alt dönen tarafından hızlı bir şekilde dondurulmuş şişe çözülme. Son buz kristali ortadan kalktığı anda çözülmüş hücrelere önceden ısıtılmış iMOP kültür ortamı 1 ml ilave edilir. Transferi 15 ml konik içine hücreleri ve iMOP kültür ortamı ilave 4 ml ekleyin
  10. 15 ml co Spin5 dakika boyunca nical. 200 xg harcanan medya aspire ve. 6 cm tabak iMOP kültür ortamı ve plaka hücreleri 2 ml tekrar süspansiyon hücreleri. Genişlemesi için% 5, 37 ° C'de CO2 kültürleri inkübe edin.

3. Duyu Epiteli içine IMOP Hücreleri Farklılaşan

  1. DMEM / F12, 1X B27 takviyesi, 25 ug / ml carbenecillin: iMOP duyu epitelyum farklılaşma medya 50 ml hazırlayın. IMOP duyusal epitel farklılaşma medya 50 ml olun. 37 ° C bir su banyosu içinde 50 ml konik DMEM / F12 49 ml kadar ısıtın. Çözülme 50X B27 takviyesi ve 5 dakika süreyle 100 mg / ml carbenecillin alikotları. 37 ° C su banyosu içinde. 1 mi 50X B27 ve DMEM / F12 içinde 100 mg / ml carbenecillin 12.5 ul ekle.
  2. Hasat, tekrar süspansiyon ayırmak ve saymak için hücreler 1.4-1.9 adımları tekrarlayın
  3. Gün -3 kültür ortamı iMOP kullanarak bir 6 cm çanak Plaka 1 x 10 6 hücre. Gün 0 günü, transfer kültürleri 15 ml konik içine 10 ml pipet kullanarak. Otoimmun toplayınyerçekimi sedimantasyon küreler olarak adım 1.6 belirtti. Aspire dışarı pipet aspirasyon bir 2 ml kullanan medya geçirdi ve konik altındaki otospheres bırakın.
  4. Yavaşça duyu epitelyum farklılaşma medya 2 ml ekleyin. Transferi büyük delik 10 ml pipet kullanarak 6 cm çanak otospheres.
    NOT: Sert pipetleme Makine kesme otospheres hücreleri ayırmak olabilir.
  5. Her gün kültürlere taze duyusal epitel farklılaşma medya 2 ml ekleyin. Gerekirse, hücreler yerine yerçekimi sedimantasyon ve medya tarafından tahsil edilebilir.
  6. 15 ml konik aktarma ve otospheres adımda belirtildiği gibi harcanan medya pipet aspirasyon bir 2 ml kullanılarak 1.6.Aspirate tortu ve rahatsız otospheres bırakmak için izin vererek Gün 10'da otospheres toplayın.
  7. Oda sıcaklığında 15 dakika boyunca 1X PBS% 4 formaldehit içinde inkübe edilerek otospheres sabitleyin. , Formaldehit solüsyonu çıkarın yıkama tamponu (PBS 1X% 0.1 TritonX-10 içeren otospheres yıkayın0) blokaj tamponunda inkübe edildi (1X PBS,% 10 normal keçi serumu ve 1 saat süre ile,% 0.1 Triton X-100) ihtiva etmektedir.
    1. Tampon değiştirin ve sulandırılmış antikor ile tampon engelleme örnekleri kuluçkaya yatmaktadır. 4 ° C'de inkübe edin. 1X PBS 27 immün% 0.1 Triton X-100 ihtiva eden konuyu otosphere ile yıkayın örnekleri. P1000 pipet kullanarak bir bardak slayt medyayı montaj içine 1X PBS içine aktarın otospheres ve yer otospheres. Numune üzerinde lamel koyun ve montaj medya 4 ° C'de kurumaya bırakın.
  8. 16 bit CCD kamera ve 20X 0.75 havaya ya da bir 40X 1.3 NA immersiyon yağı amacı ile donatılmış bir inverted mikroskop kurulumu kullanarak Epifloresans görüntüleri elde edin. Mavi (377 ± 25 nm / 447 ± 30 nm), yeşil (475 ± 25 nm / 540 ± 25 nm), kırmızı (562 ± 20nm / ve 625: Listelenen (uyarma ve emisyon) dalga boyları kullanarak farklı renk kanallarından floresan toplayın ± 20nm) ve kızılötesi (628 20nm ± / ve 692 ± 20nm).

4. Assaying Edu Ortaklığın

  1. Gün -3 günü, 6 cm tabağına 1 x 10 6 iMOP hücreleri plaka. Üç gün sonra 0. günde, hasat, ayrışır, tekrar süspansiyon ve adımları 1,4-1,9 tekrarlayarak hücreleri saymak.
  2. Plaka iMOP kültür ortamı 2.5 x 10 5 hücre ve 6 kuyu yemeğin farklı kuyularda duyusal epitelyum farklılaşma medyada 5 x10 5 hücre.
  3. Bir edu birleştirme yöntemi kullanılarak 3. günde edu katılmasıyla S fazında hücrelerin yüzdesi belirlemek
    1. Kültür ortamında 1 uM edu bir nihai konsantrasyon elde etmek üzere iMOP kültürlere edu stokları ekleyin.
    2. 2 saat boyunca iMOP kültürlerinde edu inkübe ve% 5 CO2 ile 37 ° C 'de inkübe edilir. Hasat, ayırmak ve toplamak hücreler adımları 1,4-1,9 tekrarlayın. 15 dakika boyunca 1X PBS içinde% 4 formaldehit içinde ekleyin. RT'de hücreleri gidermek için. Oda sıcaklığında 5 dakika boyunca 200 x g'de santrifüj ile hasat hücreleri. Formaldehit çözeltisi ve properl kaldıry atmayın.
    3. Etiket Hoechst hücrelerin çekirdekleri ve üreticinin protokolüne uygun olarak yeşil floresan boya azid ile edu dahil.
      Not: tüm yıkamalar 1X PBS, iki kez 1X PBS ile% 3 BSA ve% 0.1 Tween 20 ile yıkayın hücreleri ile yapılır.
    4. Ve antifade reaktif kullanılan bir slayt Mount hücreleri numune üzerinde 1.5 cam kapak yerleştirin. Bir Epifloresans mikroskopi kullanılarak işaretli hücrelerin floresan görüntüler elde.

5. IMOP Türevli Nöronlar Farklılaşan

  1. Neurobasal ortam, 1X B27 takviyesi, 2 mM L-Glutamin: nöronal farklılaşma medya 50 ml sağlayın. 5 dakika için 37 ° C su banyosu içinde 50 kat B27 ve 200 mM L-Glutamin çözülme şişe. Neurobasal ortam 48.5 mi 1 ml 50X B27 ve 0.5 ml 200 mM L-Glutamin ekleyin.
  2. Steril 10 cm plaka yuvarlak 12 mm 1.5 cam lamelleri yerleştirilmesi ve sterilize lamelleri temizlemek için plakaya% 70 EtOH eklemek tarafından Coat coverglass.
  3. Yavaşça koya ajiterslips onlar etanol kaplıdır sağlamak. Oda sıcaklığında 10 dakika boyunca plaka bırakın. Kalan etanol yıkamak için steril 1X PBS ile lamelleri 3 kere yıkayın. 1X PBS kalan yıkamak için steril H 2 0 kez lamel durulayın.
  4. Pipet aspirasyon bir 2 ml kullanılarak H 2 0 aspire ve lamelleri kurumaya bırakın. 15 dakika boyunca doku kültürü kaputu UV ışığına lamelleri Açığa. Hemen kullanılmadığı takdirde mağazası steril bir ortamda lamelleri.
  5. 24 iyi bir çanak her bir kuyunun bir 12 mm yuvarlak lamel yerleştirin. Lamelleri kuyunun dibinde düz yalan emin olmak için hafifçe sallayın plaka.
  6. Çözülme 2 mg / 1X PBS içinde 10 ug / ml poli-D-lisin konsantrasyonuna oda sıcaklığında poli-D-lizin stok çözeltisi ml seyreltin. 10 ug / ml poli-D-lisin 0.25 ml çukurlara ekleyin. 1 saat boyunca 37 ° C inkübatör plaka bırakın.
  7. Steril 1X PBS ile 3 kez yıkayın. Oda sıcaklığında 10 mg / ml stok çözeltisi, laminin ve Çözme 10 ug / m seyreltin1X PBS l. Ekle 10 ug 24 çoklu kuyu çanak tek kuyuya çözüm çalışma / ml laminin 0.25 ml. 37 ° C inkübatör de plaka inkübe edin. 2 ml aspire pipet kullanarak laminin çözüm aspire.
  8. P1000 pipet ile 1X PBS 1 ml ilave edilmesi ve pipet aspire 2 ml aspire 1X PBS kaldırarak lamel 1X PBS ile 3 kez yıkayın. Hücreler kaplama için hazır olana kadar kuyuda son yıkama 1X PBS bırakın. Dissociating ve Gün -3 de 6 cm tabak adımlarla 1.4-1.9.Plate 1 x 10 6 hücre hücre sayımı, hasat nöronal farklılaşma başlatın.
  9. Gün 0, hasat günü, ayırmak ve 1.4-1.9 tekrar ederek hücreleri saymak. Tohum 1 x 10 5 - kuyuda 24-kuyu tabak çoklu başına önceden ısıtılmış nöronal farklılaşma medya 0.5 ml x 10 5 iMOP hücreleri 1.5. Aspire ve her gün kültürlere önceden ısıtılmış nöronal farklılaşma medya ekleyebilirsiniz.
  10. 15 dakika boyunca% 4 formaldehit içinde iMOP türetilmiş nöronlar sabitleyin. birt RT Gün 7'de çıkarın formaldehit çözeltisi, yıkama tamponu ile iMOP türetilmiş nöronlar yıkama blokaj tamponunda inkübe edildi (1X PBS,% 0.1 Triton X-100 ihtiva eder) (1X PBS,% 10 normal keçi serumu ve% 0.1 Triton X-ihtiva eden 100) 1 saat karıştırıldı.
    1. Tampon değiştirin ve sulandırılmış antikor ile tampon engelleme örnekleri kuluçkaya yatmaktadır. 4 ° C'de inkübe edin. 1X PBS% 0.1 Triton X-100 denek hücreleri içeren ile yıkayın örnekleri 27 immün için. Montaj medya üzerine yerleştirmeden önce 1X PBS ile coverglass yıkayın. Montaj medya adım 3.8 listelenen Epifloresans görüntüleri almadan önce 4 ° C'de kurumaya bırakın.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

IMOP Hücreleri bFGF Çekilme Azaltmaktadır Çoğalma

IMOP hücrelerin proliferatif kapasitesinin azaltılması ve iMOP hücrelerinin farklılaşmasını başlatmak için, bFGF kültürlerinden geri çekildi. Büyüme faktörü çekilmesi çoğalmasını azaltır olduğunu doğrulamak için, edu dahil bir çoğalma tahlilinde olarak kullanılmıştır. (BFGF) olmadan iMOP kültür ortamı (bFGF ihtiva eden) ve duyusal epitelyum ortamında kültürlenmiştir otospheres ile kültürlenen otospheres gelen edu dahil hücre yüzdesi karşılaştırıldı. Otosphere kültürler hasat edilmiştir ve sabit nükleotid analoğu edu ile doldurulmuşlardır. Incorporated Edu nükleotidler floresan Alexafluor 488 azid tıklama kimya kullanılarak işaretlendi. BFGF bulunmaması durumunda yetiştirilir otospheres alınan hücreler bFGF (Şekil 1A-F) ile kültürlenen hücrelere edu nisbetle birleşme azalma gözlendi. Boyut o gibif otosphere bir epifluorescent mikroskop ile otosphere gelen tüm hücreleri görselleştirmek için giderek daha zor oldu, arttı. Bu adres için, hücreler ayrılmış ve bunlar açıkça kitle halinde görüntülenmiştir böylece monte edilmiştir. Hatta ayrışma ve tespit sonrası, hücreler toplanmış yeniden. Bir ayrışmış durumda hücreleri korumak için, yeniden bir araya gelen hücreler engelledi deterjanlar test edildi. Tween 20 hücrelerinin yeniden birikmesini engellemiştir deterjan biriydi. Ayrılan hücreler,% 0.1 Tween 20 ile yıkandı ve slaytlar üzerine monte edilmiştir. Edu etiketli hücreler daha sonra Epifloresans mikroskobu (Şekil 1G, lH) ile görselleştirilmiştir. Bireysel deneylerden Temsilcisi sonuçları (n = 5) edu yüzdesinde anlamlı bir azalma bFGF çekilmesi (p <0.005) sonra 3 gün sonra% 19% 48 hücreleri etiketli gösterdi. Bu sonuçlar, S safhası hücrelerinin yüzdesinde ve iMOP hücrelerin proliferatif potansiyel sonra dramatik bir düşüş teyitbFGF çekilme.

IMOP türetilmiş Duyu Epiteli Express Cdkn1b ve Show Morfolojik Değişiklikler

IMOP duyusal epitel farklılaşma protokolünün bir zaman çizelgesi (Şekil 2A) gösterilmektedir. Proliferatif kültürlerden Otospheres tek hücre ayrışır ve iMOP kültür ortamı içinde 3 gün süre ile iyileşmeye bırakıldı. Bu yöntem, bu başlangıç ​​kültürlerde post-mitotik hücrelerine karşı hücreleri seçer ve çoğalan zenginleştirmek yardımcı olur. 3 gün sonra, yeni oluşturulmuş otospheres duyu epitelyum farklılaşma medya içerisinde tohumlanmıştır ve 10 gün boyunca güdümsüz farklılaşma maruz bırakılmıştır. Otospheres boyutu (Şekil 2B-D) 'de artan başlamadan önce ekim sonrasında farklı zaman noktalarında otospheres ihtiva eden tipik bir kültürlerin Parlak alan görüntüleri boyutunda bir ilk azalma olduğunu gösterdi.

27 morfolojik ve moleküler özellikleri vurgulamak için kullanılan moleküler belirteçler ile immün iMOP hücrelerin farklılaşması sırasında oluşan değişiklikleri, birçok veremiyoruz beri. Cdkn1b (p27 KIP) ifade farklılaşması için bir markör olarak kullanılabilir olup olmadığını belirlemek için, proliferatif veya duyusal epitelyum farklılaşmış iMOP kültürlerinden otospheres karşılaştırılmıştır. Floresan belirteçler görüntülenmiştir ve Epifloresans mikroskobu ile ele geçirildi. Proliferatif kültürlerden otospheres Temsilcisi görüntüleri hemen hemen hiç Phalloidin boyama (Şekil 3 AD) ile çekirdeklerin dışında Cdkn1b düşük ifadesini gösterdi. Duyusal epitelyum farklılaşma ortamında kültürlenmiştir Otospheres hücreleri (Şekil 3 EH) çevresel kenarları falloidin etiketleme görünümünü nükleer Cdkn1b eşlik eden yüksek ifadesini sergiledi. Çoğalan iMOP otospheres olarak, CDH1 (E-cadherin) ve phalloidin zayıf (Şekil 3 IL) etiketli. Farklılaştırılmış iMOP otospheres olarak, belirgin phalloidin ve CDH1 etiketleme aktin filamentler ve önceki sonuçları 27 benzer hücre-hücre yapışması (Şekil 3 MP) bölgelerinde morfolojik değişikliklere dikkat çekmektedir. Duyusal epitel farklılaşması sırasında, aktin filamentler morfolojik değişimler hücreler arası yapışma sitelerinde CDH1 ifade görünümünü paraleldir. Bu protokolde, Phalloidin ve CDH1 değişiklikleri ile birlikte Cdkn1b ifade artış iMOP hücrelerinde duyusal epithelia farklılaşmasının erken göstergeleri hizmet vermektedir.

IMOP türetilmiş Nöronlarda Cdkn1b ve Tubb3

IMOP nöronal farklılaşma protokolünün şematik bir (Şekil 4A) gösterilmiştir. Söz konusu protokole benzer, iMOP hücreleri ayrışmış ve arkadaşları vardıiMOP kültür ortamı içinde 3 gün süre ile geri izin verilmelidir. Otospheres hasat edilmiştir, tek hücre ayrışması ve poli-D-lisin ve laminin kaplı lamelleri üzerine tohumlandı. Hücreler 7 gün süre ile ayırt etmek için izin verilmiştir. Onlar iMOP türetilmiş nöronların (Şekil 4B-E) içine farklılaştırılmış olarak zaman noktalarında Temsilcisi parlak bir alan görüntüler ilerleyici morfolojik değişiklikler görüntülenir. Gün 7 ile, uzun nöritler hücre gövdeleri (Şekil 4E ok başları) uzanan görülebilir. IMOP hücreleri ve iMOP türetilmiş nöronlar çoğalan, nöronal farklılaşması sırasında Cdkn1b ekspresyon seviyelerindeki değişiklikleri tespit etmek için karşılaştırılmıştır. Otospheres Hoechst ve Cdkn1b antikorları ile etiketlenmiştir. çoğalan otospheres gelen iMOP hücreleri düşük nükleer Cdkn1b ifadesi (Şekil 4 FH) ile birkaç hücreler vardı. Bundan başka, iMOP türetilmiş nöronlar 7 gün nöronal farklılaşma (Şekil 4 sonrası nükleer Cdkn1b ifadesi hücrelerin sayısında bir artış gösterdiIK). Cdkn1b hücreler nöronal soy kabul olup olmadığını saptamak üzere, nöronal marker Tubb3 ile iMOP türetilen nöron etiketleme yapıldı. IMOP türetilen nöron temsili görüntüleri Cdkn1b ve Tubb3 (Şekil 5 AD) ko-etiketleme göstermiştir. Büyütme ve bu hücrelerden nevritlerin miktar, her Tubb3 ile bağlantılı ortalama 1,5 nöritler hücre etiketli göstermiştir (n = 60) (Şekil 5 EG). Cdkn1b ve Tubb3 ile immün eden nöronal farklılaşma protokolde bipolar ya da psödo-tek kutuplu iMOP türetilen nöron farklılaşma bir göstergesi olarak da kullanılabilir.

Nükleer Cdkn1b İfade Düzeyleri Farklılaşma başlatılması sonra artırın

Onlar farklılaşma tabi olarak otospheres morfolojik değişimler iMOP hücrelerinde niteliksel değişiklikleri gösterir. Immu kantitatif sonuçlar elde etmek içinnofluorescence görüntüler erken farklılaşma olayları, duyusal epitel farklılaşmasını geçiren bireysel prolifere iMOP hücreleri (n = 239) ve iMOP hücrelerinden Cdkn1b nükleer floresan yoğunluğu belirtmek için (n = 246) ölçüldü. Bağımsız deneyden Cdkn1b floresan sinyalleri normalleştirmek için, tek tek hücrelerden Hoechst floresan Cdkn1b oranı tespit edilmiştir. IMOP hücreler (kırmızı) ayırt çoğalan iMOP hücreleri (siyah) ve duyusal epitelyumdan Cdkn1b normalleştirilmiş floresan yoğunluğu histogramlar (Şekil 6A) çizilmiştir. Yüksek Cdkn1b ifade eden hücrelerin sayısında bir artış çoğalan iMOP hücreleri (siyah) için histogram duyusal epitelyum farklılaşması (kırmızı) akrabası için histogram bir sağa kayma gözlenmiştir. Cdkn1b, normalize Cdkn1b floresan yoğunluğu birimleri için bir eşik değerini (0.65) ifade eden hücrelerin yüzdesi artışı belirlemek için ayarlanmış (ok başı) ve hücrelerin yüzdesi abo edildi eşiği belirlendi ettik. Duyusal epitel farklılaşması sonra iMOP hücreleri Cdkn1b (Şekil 6B) sentezleyen hücrelerin 67.1% 25,3'ten% arasında bir artış göstermiştir. Aynı kantitatif analiz iMOP türetilen nöron uygulanmıştır. (N = 583), proliferatif iMOP hücreleri karşılaştıran (n = 525) ve 7 günlük iMOP türetilen nöron zaman iMOP türevli nöronlarla ilgili histogramın bir sağa kayışı iMOP hücreleri (Şekil 6C) proliferasyon histogram göreli olarak gözlenmiştir. Eşiğinin üzerinde hücrelerin yüzdesi belirlenmesi% 85.5 (Şekil 6D) için% 23.5 ila Cdkn1b hücrelerde bir artış olduğunu göstermiştir. Tarif edilen protokollar kullanılarak Cdkn1b ifade kantitatif analiz duyu epitel ve nöronal farklılaşması sırasında Cdkn1b upregüle hücrelerin sayısında bir artış doğruladı. Cdkn1b ifade eden hücrelerin artan sayıları, bu protokollerde iMOP hücrelerinin farklılaşmasını teyit etmek için kullanılabilir.

1 ">:" keep-together.within sayfa = fo "jove_content figür 1
BFGF mevcudiyetinde kültürlenmiş IMOP Kültürler Proliferatif State belirlemek için edu Incorporation Bir Tahlil Olarak Şekil 1.. IMOP türetilmiş otospheres. Hücrelerin çekirdekleri (A), Hoechst ve (B) edu Alexafluor 488. (C), Hoechst ve edu floresans birleştirilmiş görüntü ile etiketlenmiştir. Otospheres bFGF eksik medyada 3 gün kültüre. Kültürlenen hücreler, Hoechst ve edu etiketleme (D), Hoechst ve (E) edu Alexafluor 488. (F) birleştirilmiş görüntü ile etiketlenmiştir. 1X PBS% 0.1 Tween 20 içeren hücreler otospheres ve yıkama ayrışan sonra Hoechst (kırmızı) ile edu (yeşil) işaretli hücrelerin birleştirilmiş Fluoresans görüntüleri bFGF mevcudiyetinde ya da bFGF (H) yokluğunda (G) kültürlenmiş otospheres elde edildi. Ölçek uzunluğuedu belirtilen. (I) 'in yüzde bFGF mevcudiyetinde veya yokluğunda kültürlenmiş iMOP hücreleri hücreleri etiketli sürece çubuklar 10 mikron. Bar grafiği ve hata çubukları içinde ifade edildi analiz bireysel hücrelerin sayısı ortalama (SEM) standart hata olarak tasvir edilmiştir. Hücre sayımları n = 5 bağımsız deneyden edildi. Student t-testi istatistiksel önemini belirlemek amacıyla yapılmıştır. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

Şekil 2,
Duyusal Epithelia Farklılaşma Şekil 2. Genel şematik. Duyusal epitel içine iMOP hücrelerini ayırt etmek için (A) Timeline. Çizgi grafiği hücre ayrışma ve medya değişiklikleri zamanı işaret eder. (B) Tipik faz kontrastkılavuzsuz duyu epitelyum farklılaşması sırasında 0. günde otospheres görüntüleri, (C) 3, (D) 7 ve (E) 10. Ölçek çubuğunun uzunluğu 100 mm. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

Şekil 3,
IMOP kültür ortamı içinde kültüre iMOP hücrelerinin IMOP türetilmiş Duyu Epithelia. Otosphere Hücre Döngüsü Durması'na farklılaşması Gösterge Belirteçleri Şekil 3. ifadesi. Hücrelerin çekirdekleri (A), Hoechst, ve (B) Cdkn1b antikoru ile etiketlenmiştir. Lifli aktin (C) falloidinle etiketlenmiştir. (D) proliferatif iMOP hücreleri ihtiva eden tipik bir otospheres arasında birleştirilmiş bir görüntü. IMOP hücrelerinden Otospheres duyu epith içinde kültürlendi10 gün boyunca elia kültür ortamı. Otopsheres gelen hücreler (E), Hoechst, (F) Cdkn1b ve (G) falloidinle işaretlenmiştir. Otospheres (H) Birleştirilmiş görüntü Cdkn1b ve Phalloidin etiketleme arttı göstermeyen. Prolifere otospheres (I) 'in, Hoechst, (J) CDH1, (K) falloidinle etiketlenmiştir. (L) Birleştirilmiş görüntü bu belirteçlerin zayıf floresan gösterir. Duyusal epitel ayrışmıştır Otospheres da (M), Hoechst, (N) CDH1, (O) falloidinle etiketlenmiştir. (P) Birleştirilmiş görüntü tipik güçlü CDH1 ve Phalloidin etiketleme gösterir. Ölçek çubukları uzunluğu belirtilmediği sürece 10 mikron bulunmaktadır. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

g alt = "Şekil 4" src = "/ files / ftp_upload / 53692 / 53692fig4.jpg" />
Nöronal Farklılaşma Şekil 4. Genel şematik. Nöronların içine iMOP hücrelerini ayırt etmek için (A) Timeline. (B) 1. Gün, (C) 3, (D) 5 ve (E) 7. Ok uçları neurites işaret nöronal farklılaşma geçiren iMOP hücrelerinin Faz kontrastlı görüntüler. (F), Hoechst ve (G) Cdkn1b ile etiketlenmiş iMOP kültür ortamı otospheres gibi kültürlenen iMOP hücrelerin floresans ve görüntüler. (H) Hoechst Cdkn1b ile etiketlenmiş hücrelerin Birleştirilmiş görüntüsü. Nöronal farklılaşma ortam içinde 7 günlük bir kültürden sonra, iMOP hücrelerin floresans ve görüntüler. Hücrelerin çekirdekleri (I) 'Hoechst (J) Cdkn1b ile işaretlendi. Hoechst Cdkn1b ile etiketlenmiş hücrelerin (K) Birleştirilmiş görüntüsü. Belirtilmediği sürece ölçekli barlar uzunluğu 10 mikron bulunmaktadır. om / files / ftp_upload / 53692 / 53692fig4large.jpg "target =" _ blank "> bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

Şekil 5,
Şekil Hücre Döngüsü Exit ve Nöronal Farklılaşma Moleküler İşaretleyiciler Gösterge Niteliğindeki 5. ifadesi. 7 gün nöronal farklılaşma sonra iMOP hücreleri. Çekirdekler, hücresel morfolojiyi ve (C) Cdkn1b antikorları seçmek için (A), Hoechst, (B) Tubb3 (nöronal β-tubulin) antikorları ile etiketlenmiştir. (D) bireysel hücrelerin Cdkn1b ve Tubb3 etiketlenmesi ile Birleştirilmiş görüntü. Ölçek çubuğunun uzunluğu 20 mm. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

OAD / 53692 / 53692fig6.jpg "/>
Cdkn1b ifade Şekil 6. Cdkn1b tek hücre Kantitatif florasan yoğunluğu Analiz. (A) Normalize florasan yoğunluğu tek tek hücrelerden Cdkn1b Hoechst floresan yoğunluğunun oranının hesaplanmasıyla belirlenmiştir. Normalleştirilmiş floresan yoğunluğu bir histogram olarak hücre sayıları göreli çizildi. Duyusal epitel (SE) (kırmızı) ayrışmıştır, bFGF (siyah) ve iMOP otospheres mevcudiyetinde kültürlenmiş iMOP hücreleri çoğalan Cdkn1b Normalize floresan yoğunluğu gösterilmektedir. Bir eşik çoğalan (siyah) ve duyusal epitel farklılaşmış kültürlerinde (kırmızı), 0.65 normalleştirilmiş floresan yoğunluğu birimleri (ok başı) (B) eşik değerinin üzerinde Cdkn1b eksprese iMOP hücrelerinin yüzdesi olarak belirlenmiştir. (C), Hoechst ve Myo6 antikorlar ile etiketlenir duyu epitelyum farklılaşmış iMOP hücrelerinin floresan görüntü birleştirilmiştir. (D (E) (siyah) çoğalan ve farklılaşan nöronal kültürler (kırmızı) eksprese eden Cdkn1b iMOP hücrelerin yüzdesi. Analiz için kullanılan tek tek hücreler, her çubuk grafikte belirtilmiştir bulundu. Sonuçlar Farklı deneylerden derlenmiştir (n = 3) ve hata barları SEM olarak gösterilmiştir. Student t-testi istatistiksel olarak anlamlı belirlemek için kullanılmıştır. (F) bipolar veya Hoechst ve Tubb3 etiketli sahte tek kutuplu iMOP kökenli nöronların floresan görüntü birleştirilmiştir. Ölçek çubukları uzunluğu 20 mikron bulunmaktadır. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

Hücre Kültürü Gemi Surface Konum (cm2) Hücre Sayısı Rutin Bakım için Tohumlu Duyusal Epithelia Farklılaşma için Tohumlu Hücre Sayısı Hücre Sayısı Nöronal Farklılaşma için Tohumlu 60 mm Dish ölçekleme Faktörü Göreli Kullanılan Medya Hacmi (ml)
Multwell Tabaklar
96 0.3 10,000 20,000 10.000-50.000 0.015 0.1
24 2 90,000 180.000 100.000-150.000 0.100 0.5
12 4 180.000 360000 300,000 0.200 1
6 10 500.000 1.000.000 500,000-750,000 0.500 2
Yemekleri
35 mm 10 500.000 1.000.000 500.000 0.500 2
60 mm 20 1.000.000 2.000.000 1,000,000-1,500,000 1.000 3
100 mm 60 2500000 5.000.000 2,500,000- 3.000.000 3.000 8

Var IMOP Hücrelerinin Farklılaşma Bakım Tablo 1. Hücre Numaralarıious doku kültürü plakası Biçimleri.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

IMOP Kültürleri İzleme

Yeni bir iMOP hücre çizgisinin farklılaşmasını kendini yenileme korunması ve geliştirilmesi için bir protokol açıklanan ve ek kaplama biçimleri (Tablo 1) yer almaktadır. Rutin genişleme ve iMOP hücrelerin farklılaşması yardımcı Birkaç kritik adımlar belirtilmiştir. Pluripotent kök hücre kültürleri benzer, iMOP hücreleri teorik belirsiz ömrünü var. Hücre hatları düzgün korunur emin olmak için, iMOP kültürleri rutin hücre canlılığı, kendini yenileme ve farklılaşma potansiyelinin izlenir. Ayrışma sonra hücre canlılığı belirlemek için, tripan mavi boya kullanır. Genel olarak, hücre içinde% 70 ayrışma sonra canlı bulunmaktadır. Yapılır c-Myc ve Sox2 antikorları ile immün, iMOP hücrelerinde kendini yenileme izlemek için. Proliferatif kültür koşulları altında, iMOP hücreleri 18 saat ~ ikiye katlanması zaman var. Yapmak veya kendini yenileme belirteçlerin ifadesi değişikliklerzaman ubling değişmiş kendini yenileme potansiyel göstergeleridir. IMOP hücreleri, duyu epitelyal veya nöronlar için erken evre markerlerinin hücre döngüsü çıkışı ve ifade farklılaşma potansiyeli izlemek için hücrelerinin farklılaşma potansiyelini değerlendirmek için kullanılır. IMOP hücreleri yukarıda açıklanan kriterleri birini geçemiyor, bu kültürleri sonlandırmak için tavsiye edilmektedir.

IMOP Kültürleri Etkileyen Değişkenler

IMOP hücrelerin kültürlenmesi biri kritik bir safha, kendini yenileme teşvik etmek kültürlerinde bFGF aktif konsantrasyonunu sağlamaktır. hücrelerin 29,30 kültürlerken bFGF bildirildi 37 ° C 'de yüksek hassastır. Kültürlerin Büyüme önemli ölçüde bağlı bFGF istikrarsızlık kendiliğinden farklılaşma etkilenebilir. Mevcut protokolde, taze ortam sürekli olarak 5 ng / ml 'nin üzerinde bFGF seviyesini korumak amacıyla kültürlere sağlanır. BFGF seviyeleri stabilizasyonu gelen kontrollü salımını kullanılarakglikolik ve laktik asit polyester mikroküreler medyada 31 bFGF'nin sürekli seviyelerini korumak için gerekli ortam değişiklikleri sıklığını azaltabilir. Sürekli serbest bırakılabilir bFGF eklenmesi sıklıkla iMOP kültürlerinde bFGF seviyeleri korumak için medyayı eklemek gerek azaltacaktır.

IMOP hücrelerinin canlılığını muhafaza Diğer önemli adım ayrışma reaktifler ve mekanik makas maruziyetin sınırlamaktır. Mevcut protokolde, dissosiyasyon 1 mM EDTA ile kuluçka ile gerçekleştirilir. Dinç pipetle neden aşırı mekanik kesme azaltılması ve hücre canlılığı artırmaya yardımcı olacaktır iMOP hücreleri Pasajlanması birden çok santrifüj adımları sınırlayıcı, EDTA ile aşırı inkübasyon süresi Engellemeye. Bu adımlar verilen dikkat etkili bir kültürler genişletilmesi sırasında hücrelerin çok sayıda canlılığını muhafaza edebilir.

IMOP hücreleri rutin kültürü sırasında hücrelerin ayrışan için çeşitli yöntemler test edildi. MechanPipetleme gelen nik kesme otospheres ayırmak için kullanılabilir, ancak eşit şekilde ya da sürekli olarak tek hücre üretmez. IMOP selüler ayrılması için ticari olarak temin edilebilen reaktifler kullanılması etkin bir otospheres gelen tek hücreler oluşturmak, ancak bu reaktifler otospheres ıslah edilmesi ve muamele edilen yüzeyler için uygun hücre yapışma özelliklerini etkiler. Ticari reaktifler kullanmak için, birden çok yıkama farklılaşma protokoller kullanılarak daha önce ayrılma reaktifleri uzaklaştırmak için gerekmiştir.

Mevcut farklılaşma protokollerde, duyusal epitelyum ve nöronal farklılaşma durumları tek hücreler veya ölü hücrelerin kümeleri şeklinde gözlenmiştir hücre ölümü ile sonuçlanmıştır. Apoptotik hücre ölümü in vitro uzun süreli kültür sırasında uygun farklılaşma ya da hayatta kalma ipuçları eksikliği nedeniyle olabilir. B27 takviyesi ihtiva Hem farklılaşma durumları hücrelerinin hayatta kalmasını teşvik etmek. B27 bağlı ek rağmenent birincil hippokampal nöronların 32 yaşamasını uzattığı gösterilmiştir, bu iMOP hücrelerin hayatta kalma teşvik etmek için yeterli olmayabilir. Böyle korumak ve rutin kültür sırasında ve in vitro ayrımında iMOP hücrelerinin hayatta artırmaya yardımcı olabilir ROCK inhibitörü olarak bileşiklerin eklenmesi. KAYA önleyicisi yoğun farklılaşma 33 etkilemeden serumsuz kültürlerde hücre hayatta kalmasını sağlamak için pluripotent kök hücre kültürlerinde kullanılmaktadır. Kültür ortamına ROCK inhibitörü eklenmesi iMOP hücrelerinin farklılaşma potansiyelinin etkilemeden uzun farklılaşma protokolleri sırasında hücre sağkalım artırmaya yardımcı olabilir. Artan hücre sağkalım verimli olgun saç hücreleri veya SGNs çok sayıda üretmek için protokollerin geliştirilmesini sağlayacaktır.

IMOP Farklılaşma Erken Marker arttıkça Cdkn1b İfade

Erken koklear gelişimi sırasında, hücrenin ilk olaydöngüsü çıkış saç hücreleri, destek hücreleri ve SGNs 34 için farklılaşma önce gelir. Nöronal atalarıdır Terminal mitoz bir dalga tabanından başlayarak ve koklea 35 apeks yönünde ilerlemektedir yayılır. Rakip degrade olarak, saç hücreleri ve destekleyici hücrelere doğuran prosensory atalarıdır terminal mitoz koklea 34,36 tabanına apeksten ilerler. Cdkn1b temporal ifade post-mitotik duruma iyi korelasyon rağmen, gelişmekte olan koklea hücre döngüsü çıkmak teşvik tek faktör en olası değildir. Bu destek olarak, Cdkn1b mutant hayvanlar hala post-mitotik saç hücreleri 37 gelişebilir. Bunun yerine, Cdkn1b farklılaşma başlangıcını işaretlemek için erken bir göstergesi olarak da kullanılabilir. Kılavuzsuz iMOP farklılaşma kültürlerde, farklılaşma için erken işaretleyici bariz morfolojik özellikleri görülebilir önce farklılaşma erken aşamalarında teşvik etmek protokollerini geliştirmek yardımcı olacaktır. </ p>

Otik gelişmeye benzer şekilde, döngü çıkış iMOP hücrelerinde artmış Cdkn1b seviyelerinde farklılaşma ve sonuçları başlatır. IMOP çoğalan hücreleri olarak, Cdkn1b sadece düşük seviyede ifadesi gözlenebilir. Örneğin Cdkn1a (p21 CIP) gibi diğer siklin bağımlı kinaz inhibitörleri iMOP hücrelerde normal hücre döngüsü ilerlemesinin sorumlu olabilir. Duyusal epitel ve iMOP hücrelerin nöronal farklılaşma sırasında, tek hücre nicel analiz iMOP kültürleri (Şekil 6A, C) ayırıcı Cdkn1b artış ifadesi hücrelerin bir alt kümesini göstermiştir. Bu hücrelerde Cdkn1b ifadesi, nihai değişimi yapılan iMOP hücrelerin bir göstergesidir.

Hücre Kader Tayini incelenmesi için bir Hücresel Platformu olarak IMOP Hücreleri

IMOP hücreleri, in vitro olarak, farklı otik soy bir progenitör durumundan geçiş için de, otik hücre kaderine incelemek için kullanılabilirbelirlenmesi. Şu anda, açıklanan protokol, farklı kulak hücre tipleri oluşturmak için güdümsüz farklılaşma prosedürleri kullanılır. IMOP sistemi biyolojik olarak aktif moleküllerin, bileşikler ve belirli genlerin olgun kılı hücresinin doğru iMOP hücreleri kılavuz destekleyen hücre ve SGN soyların ek olarak sağlar. IMOP hücresel platformun bir kullanımı farklılaşmasını teşvik aday uyarlamaları faktörlerin (TF) için test etmektir. Anahtar TF sentezlenmesi saç hücre ya da nöron farklılaşmasını sürmek için kullanılabilir. Markerlerin ya da saç hücreleri ve SGNs morfolojik özellikleri ile birlikte Cdkn1b ifadesi farklı otik soy 38,39 aday TF'lerin katkılarını belirlemek için kullanılabilir.

Böyle Atoh1 aday TFs saç hücre gelişimi için gereklidir ve hasarlı cochlea 40,41 saç hücre farklılaşması teşvik etmek repurposed oylandı. IMOP hücrelerine Atoh1 Giriş saç hücre farklılaşmasını teşvik yardımcı olabilir. Developikoklea ng Ngn1 ve NeuroD1 hem in vivo 42-44 uygun SGN farklılaşması için gereklidir. IMOP hücrelerinde Ngn1 ya NeuroD1 ifadesi SGN farklılaşmasını teşvik edebilir. Bu deneyler, TFs tek tek ya da kombinasyon halinde sentezleme nöronlar 45-48 içine fibroblastlar ya pluripotent kök hücrelerin dönüştürmek üreten indüklenen nöronal hücreleri (İN) ile benzerdir. Normalde saç hücreleri veya SGNs gelişimi sırasında ifade TFs Giriş saç hücre veya SGN soyunun doğru iMOP hücreleri yönlendirmek için iyi bir stratejidir.

IMOP türetilmiş saç hücreleri ve SGNs çok sayıda farklılaşmasını teşvik koşullar hızlı bir şekilde gerçekleştirilebilir ve uygun maliyetle kemirgenlerde emek-yoğun testler başlatılır önce hastalığı modelleme, küçük molekül tarama ve toksikoloji testleri için güçlü bir hücresel platform sağlayacak . Açıklanan protokol s için kullanılabilir basit ve işe yarar bir sistem sunulurotik progenitör farklılaşmasını tudying ve büyük ölçekli deneyler ile uyumludur.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
CoolCell LX Alcohol-Free Cell Freezing Containers BioCision BCS-405
Cryogenic Vials (2 ml)  Corning 430654
1.5 Thickness Glass Coverslip (Round 12 mm) Electron Microscopy Sciences 72230-01
DMEM/F12 Life Technologies 11320-082
Neurobasal Medium Life Technologies 21103
Phosphate Buffered Saline (PBS) pH 7.4 Life Technologies 10010-023
Hank's Balanced Salt Solution (HBSS) Life Technologies 14025-092
B27 Supplement (50X) Serum Free Life Technologies 17504-044 Stored as 1 ml aliquots
L-Glutamine(200 mM)  Life Technologies 25030-081 Stored as 5 ml aliquots
Natural Mouse Laminin Life Technologies 23017-015 Stored as 1 mg/ml aliquots
Click-iT EdU Alexa Fluor 488  Life Technologies C10337
Synth-A-Freeze Cryopreservation Media Life Technologies A12542-01
Prolong Gold Antifade Mountant Life Technologies 47743-736 Stored as 10 mg/ml 100 µl aliquots
Moxi Z Mini Automated Cell Counter Orflo  MXZ001
Moxi Z Cassette Type S Orflo  MXC002
Recombinant Murine Fibroblast Growth Factor, basic (bFGF) Peprotech 450-33 Resuspended in 0.1% BSA in H20 and stored as 20 mg/ml aliquots
Poly-D-Lysine Sigma P7886 Resuspended in 1X PBS and stored as 10 mg/ml 100 µl aliquots
Carbenicillin, Disodium Salt Thermo Fisher Scientific BP2648-1 Resuspended in 10 mM Hepes pH 7.4 and stored as 100 mg/ml aliquots
5 ml pipet individually wrapped paperback (200/case) Thermo Fisher Scientific 1367811D
10 ml pipet individually wrapped paperback (200/case) Thermo Fisher Scientific 1367811E
Tissue Culture Treated Biolite 24-Well Plate Thermo Fisher Scientific 130188
Tissue Culture Treated Biolite 6-Well Plate Thermo Fisher Scientific 130184 
Tissue Culture Treated 6 cm Dish Thermo Fisher Scientific 130181 
EMD Millipore Millex Sterile Syringe PVDF Filter Pore size: 0.22 μm Thermo Fisher Scientific SLGV033RS
TipOne filter pipet tips 0.1 - 10 μl elongated filter tip USA Scientific 1120-3810
TipOne filter pipet tips 1 - 20 μl filter tip USA Scientific 1120-1810
TipOne filter pipet tips 1 - 200 μl  filter tip USA Scientific 1120-8810
TipOne filter pipet tips 101 - 1000 μl filter tip USA Scientific 1126-7810
15 ml conical tubes sterile 20 bags of 25 tubes (500 tubes) USA Scientific 1475-0511
50 ml conical tubes sterile 20 bags of 25 tubes (500 tubes) USA Scientific 1500-1211

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Petit, C., Richardson, G. P. Linking genes underlying deafness to hair-bundle development and function. Nat Neurosci. 12, (6), 703-710 (2009).
  2. Kujawa, S. G., Liberman, M. C. Adding insult to injury: cochlear nerve degeneration after 'temporary' noise-induced hearing loss. J Neurosci. 29, (45), 14077-14085 (2009).
  3. Kujawa, S. G., Liberman, M. C. Acceleration of age-related hearing loss by early noise exposure: evidence of a misspent youth. J Neurosci. 26, (7), 2115-2123 (2006).
  4. Huth, M. E., Ricci, A. J., Cheng, A. G. Mechanisms of aminoglycoside ototoxicity and targets of hair cell protection. Int J Otolaryngol. 2011, 937861-93 (2011).
  5. Brigande, J. V., Heller, S. Quo vadis, hair cell regeneration? Nat Neurosci. 12, (6), 679-685 (2009).
  6. Groves, A. K. The challenge of hair cell regeneration. Exp Biol Med (Maywood). 235, (4), 434-446 (2010).
  7. Okano, T., Kelley, M. W. Stem cell therapy for the inner ear: recent advances and future directions. Trends Amplif. 16, (1), 4-18 (2012).
  8. Ronaghi, M., Nasr, M., Heller, S. Concise review: Inner ear stem cells--an oxymoron, but why? Stem Cells. 30, (1), 69-74 (2012).
  9. Chen, W., et al. Restoration of auditory evoked responses by human ES-cell-derived otic progenitors. Nature. 490, (7419), 278-282 (2012).
  10. Koehler, K. R., Mikosz, A. M., Molosh, A. I., Patel, D., Hashino, E. Generation of inner ear sensory epithelia from pluripotent stem cells in 3D culture. Nature. (2013).
  11. Oshima, K., et al. Mechanosensitive hair cell-like cells from embryonic and induced pluripotent stem cells. Cell. 141, (4), 704-716 (2010).
  12. Diensthuber, M., Oshima, K., Heller, S. Stem/progenitor cells derived from the cochlear sensory epithelium give rise to spheres with distinct morphologies and features. J Assoc Res Otolaryngol. 10, (2), 173-190 (2009).
  13. Doetzlhofer, A., White, P., Lee, Y. S., Groves, A., Segil, N. Prospective identification and purification of hair cell and supporting cell progenitors from the embryonic cochlea. Brain Res. 1091, (1), 282-288 (2006).
  14. Doetzlhofer, A., White, P. M., Johnson, J. E., Segil, N., Groves, A. K. In vitro growth and differentiation of mammalian sensory hair cell progenitors: a requirement for EGF and periotic mesenchyme. Dev Biol. 272, (2), 432-447 (2004).
  15. Martinez-Monedero, R., Yi, E., Oshima, K., Glowatzki, E., Edge, A. S. Differentiation of inner ear stem cells to functional sensory neurons. Dev Neurobiol. 68, (5), 669-684 (2008).
  16. Oshima, K., Senn, P., Heller, S. Isolation of sphere-forming stem cells from the mouse inner ear. Methods Mol Biol. 493, 141-162 (2009).
  17. Nishimura, K., Nakagawa, T., Sakamoto, T., Ito, J. Fates of murine pluripotent stem cell-derived neural progenitors following transplantation into mouse cochleae. Cell Transplant. 21, (4), 763-771 (2012).
  18. Wu, D. K., Kelley, M. W. Molecular mechanisms of inner ear development. Cold Spring Harb Perspect Biol. 4, (8), a008409 (2012).
  19. Jiang, H., et al. Lineage analysis of the late otocyst stage mouse inner ear by transuterine microinjection of a retroviral vector encoding alkaline phosphatase and an oligonucleotide library. PLoS One. 8, (7), e69314 (2013).
  20. Sapede, D., Dyballa, S., Pujades, C. Cell lineage analysis reveals three different progenitor pools for neurosensory elements in the otic vesicle. J Neurosci. 32, (46), 16424-16434 (2012).
  21. Satoh, T., Fekete, D. M. Clonal analysis of the relationships between mechanosensory cells and the neurons that innervate them in the chicken ear. Development. 132, (7), 1687-1697 (2005).
  22. Raft, S., et al. Cross-regulation of Ngn1 and Math1 coordinates the production of neurons and sensory hair cells during inner ear development. Development. 134, (24), 4405-4415 (2007).
  23. Neves, J., Parada, C., Chamizo, M., Giraldez, F. Jagged 1 regulates the restriction of Sox2 expression in the developing chicken inner ear: a mechanism for sensory organ specification. Development. 138, (4), 735-744 (2011).
  24. Mak, A. C., Szeto, I. Y., Fritzsch, B., Cheah, K. S. Differential and overlapping expression pattern of SOX2 and SOX9 in inner ear development. Gene Expr Patterns. 9, (6), 444-453 (2009).
  25. Kiernan, A. E., et al. Sox2 is required for sensory organ development in the mammalian inner ear. Nature. 434, (7036), 1031-1035 (2005).
  26. Puligilla, C., Dabdoub, A., Brenowitz, S. D., Kelley, M. W. Sox2 induces neuronal formation in the developing mammalian cochlea. J Neurosci. 30, (2), 714-722 (2010).
  27. Kwan, K. Y., Shen, J., Corey, D. P. C-MYC transcriptionally amplifies SOX2 target genes to regulate self-renewal in multipotent otic progenitor cells. Stem Cell Reports. 4, (1), 47-60 (2015).
  28. Dittami, G. M., Sethi, M., Rabbitt, R. D., Ayliffe, H. E. Determination of mammalian cell counts, cell size and cell health using the Moxi Z mini automated cell counter. J Vis Exp. (64), (2012).
  29. Levenstein, M. E., et al. Basic fibroblast growth factor support of human embryonic stem cell self-renewal. Stem Cells. 24, (3), 568-574 (2006).
  30. Furue, M. K., et al. Heparin promotes the growth of human embryonic stem cells in a defined serum-free medium. Proc Natl Acad Sci U S A. 105, (36), 13409-13414 (2008).
  31. Lotz, S., et al. Sustained levels of FGF2 maintain undifferentiated stem cell cultures with biweekly feeding. PLoS One. 8, (2), e56289 (2013).
  32. Brewer, G. J., Torricelli, J. R., Evege, E. K., Price, P. J. Optimized survival of hippocampal neurons in B27-supplemented Neurobasal, a new serum-free medium combination. J Neurosci Res. 35, (5), 567-576 (1993).
  33. Watanabe, K., et al. A ROCK inhibitor permits survival of dissociated human embryonic stem cells. Nat Biotechnol. 25, (6), 681-686 (2007).
  34. Ruben, R. J. Development of the inner ear of the mouse: a radioautographic study of terminal mitoses. Acta Otolaryngol. Suppl 220. 1-44 (1967).
  35. Matei, V., et al. Smaller inner ear sensory epithelia in Neurog 1 null mice are related to earlier hair cell cycle exit. Dev Dyn. 234, (3), 633-650 (2005).
  36. Lee, Y. S., Liu, F., Segil, N. A morphogenetic wave of p27Kip1 transcription directs cell cycle exit during organ of Corti development. Development. 133, (15), 2817-2826 (2006).
  37. Chen, P., Segil, N. p27(Kip1) links cell proliferation to morphogenesis in the developing organ of Corti. Development. 126, (8), 1581-1590 (1999).
  38. Hasson, T., et al. Unconventional myosins in inner-ear sensory epithelia. J Cell Biol. 137, (6), 1287-1307 (1997).
  39. Barclay, M., Ryan, A. F., Housley, G. D. Type I vs type II spiral ganglion neurons exhibit differential survival and neuritogenesis during cochlear development. Neural Dev. 6, 33 (2011).
  40. Bermingham, N. A., et al. Math1: an essential gene for the generation of inner ear hair cells. Science. 284, (5421), 1837-1841 (1999).
  41. Izumikawa, M., et al. Auditory hair cell replacement and hearing improvement by Atoh1 gene therapy in deaf mammals. Nat Med. 11, (3), 271-276 (2005).
  42. Kim, W. Y., et al. NeuroD-null mice are deaf due to a severe loss of the inner ear sensory neurons during development. Development. 128, (3), 417-426 (2001).
  43. Liu, M., et al. Essential role of BETA2/NeuroD1 in development of the vestibular and auditory systems. Genes Dev. 14, (22), 2839-2854 (2000).
  44. Ma, Q., Anderson, D. J., Fritzsch, B. Neurogenin 1 null mutant ears develop fewer, morphologically normal hair cells in smaller sensory epithelia devoid of innervation. J Assoc Res Otolaryngol. 1, (2), 129-143 (2000).
  45. Pang, Z. P., et al. Induction of human neuronal cells by defined transcription factors. Nature. 476, (7359), 220-223 (2011).
  46. Vierbuchen, T., et al. Direct conversion of fibroblasts to functional neurons by defined factors. Nature. 463, (7284), 1035-1041 (2010).
  47. Zhang, Y., et al. Rapid single-step induction of functional neurons from human pluripotent stem cells. Neuron. 78, (5), 785-798 (2013).
  48. Blanchard, J. W., et al. Selective conversion of fibroblasts into peripheral sensory neurons. Nat Neurosci. 18, (1), 25-35 (2015).
Ölümsüzleştirdi Multipotent Otic Progenitor Hücrelerde Farklılaşma başlatılıyor
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Azadeh, J., Song, Z., Laureano, A. S., Toro-Ramos, A., Kwan, K. Initiating Differentiation in Immortalized Multipotent Otic Progenitor Cells. J. Vis. Exp. (107), e53692, doi:10.3791/53692 (2016).More

Azadeh, J., Song, Z., Laureano, A. S., Toro-Ramos, A., Kwan, K. Initiating Differentiation in Immortalized Multipotent Otic Progenitor Cells. J. Vis. Exp. (107), e53692, doi:10.3791/53692 (2016).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter