Verlust- und Gewinn-of-function-Ansatz Frühe Zellschicksal Bestimmungsfaktoren in Preimplantation Maus Embryonen zur Untersuchung

Summary

Das Ziel dieses Protokolls ist es, ein Verlust- zu beschreiben und zu gewinnen-Funktionsmethode, die zur Identifizierung Neogenin als stufenspezifischen Rezeptor anwendbar ist, die und die innere Zellmasse Differenzierung in preimplantation Maus-Embryonen zu Trophektoderm führt.

Introduction

Preimplantation Embryonalentwicklung kann in mehrere verschiedene Stufen, von der Ein-Zell-Stadium zum Morula und der Blastozyste unterteilt werden. Vieles deutet darauf hin, dass die Polarität und Positions Cues eine Rolle in der frühen Zellschicksal Bestimmung in die Trophektoderm (TE) und der inneren Zellmasse (ICM) spielen. die Art der Signale jedoch, wie sie in zelluläre Signale transduziert werden und die physiologischen Zusammenhänge, in denen solche Signale zu initiieren Zelllinie Differenzierung fähig sind nicht bekannt. Diese differenzierten Zellen dann Spezialisierung durchlaufen, beginnend auf charakteristische Strukturen und Funktionen für die Embryo richtige Bildung und das Wachstum der Plazenta ^1-3 benötigt zu nehmen.

Präimplantationsembryonen sind besonders geeignet, um Manipulation durch direkte Injektion von modifizierten genetischen Materialien wie siRNA oder Ziel-cDNA und somit genutzt werden können spezifische Zielmoleküle zu untersuchen. Es gibt ein wachsendes Verständnis, dass genetischeAnalyse von Wirbeltierembryonen ist entscheidend unser Verständnis der embryonalen Entwicklung ⁴ voran. Precise Einführung eines Wildtyp-Gens oder einer mutierten Form in einen Embryo in einer angemessenen Zusammenhang Verstärkungs- oder Verlust der Funktion des Gens zu erreichen, hat die Untersuchung der entwicklungsregulierter Gene stark erleichtert. Verlust- und gain-of-Funktion via Mikroinjektion von genetischem Material in einzelne frühen Nicht-Säuger und Säugetierembryos ist relativ einfach aufgrund ihrer Größe und große Empfänglichkeit ^5. Mikroinjektions wird typischerweise unter Verwendung nicht-viraler Vektoren durchgeführt. Besonders vorteilhaft ist die Leichtigkeit der Verwendung von nicht-viralen Vektoren über virale Vektoren und Transgene genommen. Eine schnelle Verlust- oder gain-of-function - Expressionssystem in Maus - Embryonen entwickelt worden , das uns Genfunktionen in wirbel Embryologie ^6,7 zu sezieren und zu verstehen , ermöglicht.

Die Fluoreszenzmarkierung von Embryonen würde erheblich die Auswahl an MICR erleichternoinjected oder genetisch manipulierten Embryonen und zugleich ein Mittel gewähren , um indirekt die Expression von siRNA mikroinjiziert oder cDNA ⁸ basierend auf Fluoreszenzintensität quantifiziert werden . Um diese Markierung, fluoreszierende Protein cDNA erreichen, GFP oder RFP, sind Co-Injections entweder als Fusionskonstrukte oder getrennt. Die Fluoreszenzintensität von GFP oder RFP zeigt das Ausmaß der Expression von siRNA oder fremden DNA, die Verlust- oder gain-of-function, um sicherzustellen, wurde erreicht.

Hier präsentieren wir ein Mikromanipulations Protokoll für Verlust- und Gewinn-of-Funktion Technik, die es uns ermöglicht, zu identifizieren Neogenin als Rezeptor die extrazelluläre Signale wichtig in der frühen Zelldifferenzierung in preimplantation Maus-Embryonen weiterleitet.

Protocol

HINWEIS: Alle Verfahren für die Tierzucht und Sorgen wurden nach führten die IACUC Vorschriften Sahmyook University, Seoul, Südkorea.

1. Superovulation, Zucht und Eileiter Isolation

1. Pflegen inzüchtig C57BL / 6-Mäuse unter den folgenden Bedingungen: 22 ± 3 ° C, ~ 60% Luftfeuchtigkeit, 12 Stunden Licht / Dunkel-Zyklus, und Wasser und Nahrung ad libitum.
2. Induce Superovulation von 3-5 Wochen alten weiblichen Mäusen durch eine intraperitoneale Injektion von 5 IU trächtige Stute Serum-Gonadotropin (PMSG) bei 0,1 ml / Kopf folgte 48 Stunden später durch eine intraperitoneale Injektion von 5 IE humanes Choriongonadotropin (hCG) bei 0,1 ml /Kopf.
3. Unmittelbar der Injektion hCG, über Nacht Superovulationsbehandlung-induzierte Weibchen mit geschlechtsreifen Männchen der gleichen Stamm von ihnen im selben Käfig halten paaren.
4. Am nächsten Morgen, bestätigen den erfolgreichen Paarung durch die Anwesenheit eines Gegenstecker oder Vaginalpfropfens auf den weiblichen Genitaltrakt.
5. Sacrifice schwangere weibliche Mäusedurch CO ₂ Intoxikation gefolgt durch zervikale Dislokation 18-20 Stunden nach der hCG - Injektion.
6. Öffnen Sie die Bauchhöhle durch die Haut schneiden und dann die Bauch Schicht mit einer feinen Schere.
7. Pick-up die Gebärmutterhörner mit einer feinen Pinzette und ziehen weg die Gebärmutter, Eileiter, Eierstock, und Fettpolster sanft aus der Körperhöhle.
8. Schneiden Sie den Bereich zwischen den Eileiter und Eierstock mit einer feinen Schere. Neupositionierung der Zange und schneiden die Gebärmutter in der Nähe des Eileiters befestigt, mindestens 1 cm von dem oberen Teil des Uterus verlassen.
9. Übertragen die Eileiterampulle in eine 35 mm Petrischale mit M16-Medium bei Raumtemperatur. Pool den Eileitern von mehreren Mäusen in der gleichen Gericht.
10. Die Schalen werden unter einem Stereomikroskop für den Abruf von Embryonen.

2. Retrieval und Kultur von 2-pronukleären (2-PN) Embry

1. Schneiden Sie das Ende einer 30 oder 32 G Injektionsnadel, schleifen sie in eine stumpfe Spitze, und verwenden Sie es als eine Spülung Nadel.
2. Benutzenfeinen Pinzette das Ende des Eileiters auf die Spülung Nadel gleiten kann. Drücken Sie vorsichtig die Spitze der Spülung Nadel gegen den Boden der Schale es an Ort und Stelle zu halten. Spülen Sie die Eileiter mit ~ 0,1 ml M16 Medium, um die in eine Petrischale 2-PN Embryonen freizugeben.
3. Gewinnen Sie die 2-PN Embryonen zusammen mit umgebenden Cumulusmassen aus dem gespülten M16 Medium unter dem Stereomikroskop mit einer sterilen Glaspipette und übertragen sie in eine neue Petrischale.
4. Dissoziieren Cumuluszellen aus den 2-PN Embryonen durch enzymatischen Verdau mit 1,0 ml von 0,1-0,5% Hyaluronidase in Dulbeccos phosphatgepufferter Salzlösung (DPBS) bei 37 ° C für 5-10 min.
5. Entblößen Embryonen mit einer Glaspipette und physikalische Entfernung von Cumuluszellen vorsichtiges Pipettieren.
6. Waschen denudierten Embryonen dreimal mit 30-50 ml frischer Phosphat-gepufferter Kochsalzlösung (PBS) pro Embryo.
7. Inkubieren Embryonen in einer 35 mm-Kunststoff-Petrischale in M16 Medium mit 10 mg / ml Rinderserumalbumin (BSA ergänzt, FractIonen - V) bei 37 ° C in 5% CO ₂ in einem befeuchteten Inkubator , bis der Mikroinjektion durchgeführt wird, die in der Regel später weniger als 4 Stunden ist.

3. Embryo Reverse Transkription (RT) und die Polymerasekettenreaktion (PCR)

1. Sammeln mindestens 10 Embryonen aus jeder Stufe bis zum Blastozystenstadium und sie gemeinsam in 4,0 ul 5x-Reverse-Transkriptase-Vormischung Lösung, die reverse Transkriptase, RNase-Inhibitor, Oligo dT Primer, Random 6mers, dNTP-Gemisch, und die Reaktionspuffer in einem PCR-Röhrchen.
2. Hinzufügen RNase-freiem destilliertem H ₂ O auf ein Gesamtvolumen von 20 ul und beschallen die gepoolten Embryonen für 30 sec bei 200 W. der RT - Reaktion initiieren sofort bei 42 ° C für 1 Stunde , gefolgt von 5 min Inkubation bei 95 ° C.
3. Für jede 5,0 ul cDNA - Lösung erzeugt wird , führen normalen PCR - Amplifikation mit Primern für Neogenin, Cdx2, Sox2, Tead4, Nanog, Oct3 / 4, oder β-Aktin (Primersequenzen in Tabelle 1 ist . PCR besteht aus 40 Zyklen von 15 sec Inkubation bei 95 ° C, 30 sec bei Glühtemperatur (gezeigt in Tabelle 1) und 30 sec bei 72 ° C.
4. Getrennte PCR-Produkte durch Elektrophorese auf einem 2% Agarosegel und zu visualisieren, das Gel unter UV-Licht nach Färbung mit Ethidiumbromid.
5. Normalisieren Zielgenexpression gegen β-Actin-Ebenen.

4. Immuncytochemie von Embry

1. Fix Embryonen aus jeder Stufe mit 4% Paraformaldehyd in PBS für 30 min bei Raumtemperatur durch eine kurze Wasch gefolgt 3 mal mit PBS 0,01% BSA enthält.
2. Permeabilisieren Zellmembranen von 10 Embryonen Inkubieren in 1,0 ml PBS, enthaltend 0,1% Tween 20 und 0,1% Triton X-100 bei Raumtemperatur für 10 min.
3. So blockieren unspezifische die permeabilisierten Embryonen in 1,0 ml PBS Bindung Inkubation mit 10% normalem Ziegenserum für 30 Minuten bei Raumtemperatur.
4. Inkubieren Sie die blockierten Embryonen Witzh Kaninchen-anti-Neogenin Antikörper bei 1: 100 Verdünnung in PBS, enthaltend 0,1% BSA über Nacht bei 4 ° C.
5. jeder in Tropfen PBS Nach dreimaligem Waschen für 30 sec, inkubieren Embryonen entweder mit Alexa 488-konjugiertem Ziege-anti-Kaninchen-IgG oder Alexa 568-konjugiertem Ziege-anti-Kaninchen-IgG bei 1: 500-Verdünnung in PBS / BSA-Lösung über Nacht bei 4 ° C .
6. An Aktinfilamente visualisieren, inkubieren Embryonen in 1 & mgr; g / ml Phalloidin in PBS für 1 Stunde bei Raumtemperatur.
7. Beflecken die Kerne durch Zugabe von 5 ml PBS, die 1 & mgr; g / ml DAPI (4 ', 6-Diamidino-2-Phenylindol-Dihydrochlorid) für 5 min bei Raumtemperatur.
8. Wash Embryonen dreimal kurz mit PBS.
9. Übertragen Embryonen auf einen Glasobjektträger und bedecken sie mit einem Tropfen Mineralöl.
10. Nehmen Bilder bei 1,000x Vergrößerung mit einem konfokalen Mikroskop mit einem Anregungs der geeigneten Wellenlänge.

5. Herstellung von Neogenin-RFP und Neogenin-siRNA GFP Plasmide

1. Subklonen cDNA, die Maus Neogenin in ein rot fluoreszierendes Protein (RFP) enthaltenden Vektor, was zu Neogenin-flag-RFP.
2. Subklon RNA small hairpin Neogenin in ein Emerald Green Fluorescent Protein Targeting (EmGFP) enthaltenden Vektor, was in pcDNA-EmGFP-miR-Neogenin (in Abbildung 1 gezeigt).
3. Amplify beide Neogenin-flag-RFP und pcDNA-EmGFP-miR-Neogenin Plasmide und reinigen sie mit herkömmlichen Methoden.
4. Stellen Sie die Endkonzentrationen von Plasmiden auf ~ 1,0 & mgr; g / ml in sterile Tris-EDTA (TE) Puffer.

6. Mikroinjektion von Plasmiden in 2-PN Embry

1. Waschen Sie die entblößte 2-PN Embryonen einmal, kurz, mit frischen M16 Medien.
2. Zentrifugieren der 2-PN Embryonen für 10 min bei 1000 xg in einer Tischzentrifuge zur Beobachtung der Pronuclei zu erlauben.
3. Inkubiere die Embryonen in einem Mikrotropfen von 20-30 & mgr; l M16 Medien pro Embryo unter Mineralöl bei 37 ° C in 5% CO ₂ für eine additional 1-2 Std.
4. Herstellung Injektion Pipetten und halten Pipetten durch Ziehen Borosilikat-Glaskapillarröhren (OD = 1,2 mm; ID = 0,94 mm) mit einem mechanischen Puller.
5. Fabrizieren Injektion Pipetten stumpfen Spitzen und polierten Öffnungen von <500 & mgr; m Spitzenlänge zu haben und 1-2 um Spitze Innendurchmesser ein microgrinder und microforger verwenden.
6. Fabrizieren Pipetten halten, so dass sie stumpfen Spitzen und polierten Öffnungen mit einem Innendurchmesser von 20 & mgr; m und einem Außendurchmesser von 100 & mgr; m haben.
7. Lastinjektionspipetten mit einer ausreichenden Menge (> 200 nl) der Plasmid-Lösung mit 1,0 ug / ul.
8. Microinject ~ 10 pl von Plasmid-Lösung für jede 2-PN Embryo in einen der Vorkerne eine Mikroinjektors an einem motorisierten Mikromanipulator angebracht verwendet wird; Während dieses Vorgangs halten Embryonen in Position durch Unterdruck mit einer Haltepipette aufgebracht wird.
9. Nach Mikroinjektion, waschen Sie die 2-PN Embryonen 3-mal mit frischem M16 Medien für less als 1 min jedes Mal.
10. Kultur Die 2-PN Embryonen in einem Tropfen frisch M16 Medien auf einer Plastikkulturschale mit einer Mineralöltropfen abgedeckt Medien Verdampfung zu verhindern.
11. Beachten Sie die Embryonen bei 24 Stunden Abständen unter einem Differentialinterferenzkontrast (DIC) inverses Mikroskop bei 200-facher Vergrößerung.

Representative Results

Wir entdeckten , dass Neogenin vorübergehend in den frühen Entwicklungsstadien von preimplantation Maus - Embryonen, erscheinen so früh wie in der 2-Zellstadium und nachhaltig bis in die frühen Morula ausgedrückt wird , aber am Ende Morula defizienten immer und Blastozyste Stufen (2A). Zusätzlich wurde die räumliche Verteilung der Neogenin beschränkt hauptsächlich außerhalb der Zellen. Die Ergebnisse der RT-PCR - Analyse wurden im Einklang mit der frühen und vergängliche Natur Neogenin Ausdruck, an der 4-Zellen - Stadium Peaking aber völlig fehlt an der 16-Zell - Stadium oder später (2B). Im Gegensatz dazu hat F-Actin offenbaren nicht eine solche vorübergehende und polarisiert Expressionsmuster.

Wir untersuchten als nächstes, ob Neogenin Ebenen durch Mikroinjektion von entweder Neogenin cDNA-Vektoren (Neogenin Verstärkung) oder Vektoren beherbergen shRNA Targeting Neogenin (Neogenin los manipuliert werden könnte,s) in die 2-PN Zygote. Um visuell Neogenin Gewinn aus Neogenin Verlust, RFP unterscheiden und GFP wurden als Indikatoren (Abbildung 3) co-exprimiert, und die resultierende Neogenin Expressionsniveau wurde sowohl durch Immunfluoreszenz und durch Immunoblotting (Abbildung 4) bestätigt.

Abbildung 5 zeigt repräsentative Bilder von Embryonen in jeder Phase nach entweder Neogenin shRNA oder Neogenin cDNA an der 2-PN - Stufe empfängt. Es gab keine offensichtlichen grobe morphologische Unterschiede zwischen Neogenin Verlust und Neogenin Gewinn Embryonen und keine Entwicklungspotenzial Unterschiede zumindest bis zum Blastozystenstadium (Tabelle 2). In der Tat sind sowohl die Anzahl der überlebenden Embryonen in jeder Stufe und die Anzahl der fest Embryonen waren nicht signifikant verschieden.

Allerdings wurde weniger ICM Entwicklung in Neogenin Verlust ausgeprägt als Neogenin Gewinn Embryonenwas durch eine höhere Expression von ICM-spezifischen Oct3 / 4 in Neogenin Verstärkungs Embryonen (6A) und durch eine höhere Anzahl von Oct3 / 4-positive Zellen pro ICM Blastozyste in Neogenin Verstärkung als Neogenin Verlust Embryonen (6B). Darüber hinaus ergab RT-PCR-Analyse eine starke Korrelation zwischen der Expression von drei Transkriptionsfaktoren und der Neogenin. In Neogenin Verlust Blastozysten, wenig Oct3 / 4, Sox2 und Nanog nachgewiesen wurden, was in krassem Gegensatz zu einer deutlichen Steigerung der Expression aller drei Transkriptionsfaktoren in Neogenin Verstärkung über Kontrollembryonen (6C) ist. Unerwarteterweise impliziert die Expressionsniveaus von Cdx2 und Tead4, Transkriptionsfaktoren in TE Differenzierung / Wartung ^6,7, weniger wurden durch das Expressionsniveau von Neogenin beeinflusst, Validieren , dass die Hochregulierung von Neogenin zur Aktivierung von Transkriptionsregulatoren spezifisch für ICM führt aber nicht für TE Einrichtung. Alle gezeigten Daten sind m odified von Referenz ^9.

Abbildung 1: Die Struktur von pcDNA-EmGFP-miR-Neogenin. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Abbildung 2:. Die Expression von Neogenin Während embryonalen Maus - Entwicklung (A) Konfokalmikroskopische Bilder von Neogenin Ausdruck in Präimplantationsembryonen in verschiedenen Entwicklungsstadien. (B) Die Reverse Transkription - Polymerase - Kettenreaktion von Neogenin mRNA in Präimplantationsembryonen in verschiedenen Entwicklungsstadien. β-Actin wurde als interne Kontrolle verwendet.96fig2large.jpg "target =" _ blank "> Bitte hier klicken, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Abbildung 3:. Green Fluorescent Protein (GFP) und Red Fluorescent Protein (RFP) Expression als Indikatoren für Neogenin Verlust und Neogenin Gain, jeweils nach der Mikroinjektion eines Neogenin-Targeting shRNA Vektor konjugierte GFP oder Mikroinjektion eines Neogenin cDNA Vektor beherbergen beherbergen RFP in 2-PN Zygoten, die Expression von GFP und RFP wurde unter einem Fluoreszenzmikroskop auf die 2-Zelle und 4-Zellen-Stadien sichtbar gemacht. Linke Seite, Phasenkontrast-Bilder; mittlere und rechte Platten, Fluoreszenzbilder. Bitte hier klicken , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Abbildung 4:. Die Expression von Neogenin in einer Blastozyste Nach Mikroinjektion von entweder shRNA Neogenin oder Neogenin cDNA - Targeting (A) Nach der Mikroinjektion eines Neogenin-Targeting shRNA Vektor in 2-PN Zygoten wurde das Expressionsniveau von Neogenin in einzelnen Blastozyste Zellen ausgewertet durch Immunfärbung mit Anti-flag-Antikörper. Im linken Feld Rührei, Neogenin shRNA Vektoren mikroinjiziert wurden (Kontrolle). Im rechten Bereich Neogenin-Targeting wurden shRNA Vektoren mikroinjiziert. DAPI, DAPI (blau) wurde verwendet, um den Kern zu färben; Anti-Flag, die Visualisierung des Flag-Tag auf Neogenin (rot); GFP, grün fluoreszierendes Protein (grün); verschmolzen, Überlagerung von DAPI, Anti-Flag und GFP. (B) Ganzzelllysate von Blastozysten wurden mit Anti-Flag - Antikörpern einem Immunoblotting. GFP wurde als Ladekontrolle verwendet. Scrambled shRNA, Rühr- Neogenin shRNA Injektion; Ng shRNA, Neogenin-Targeting shRNA INJEC tion. (C) Die Neogenin cDNA - Vektoren oder die Neogenin-Targeting shRNA Vektoren wurden in die 2-PN Zygoten mikroinjiziert und die erhaltenen Blastozysten wurden einer Immunfärbung mit anti-Neogenin Antikörper Neogenin Expressionsniveau zu messen. In der oberen Platte wurde Neogenin-Targeting shRNA injiziert. Blastozysten wurden mit anti-Neogenin Antikörper (rot) immunhistochemisch. GFP, grün fluoreszierendes Protein (grün); Zusammengeführt, Überlagerung von DAPI, anti-Neogenin und GFP. In der unteren Platte wurden Neogenin cDNA-Vektoren mikroinjiziert. Blastozysten wurden mit anti-Neogenin Antikörper (grün) immunhistochemisch. DAPI DAPI Kernfärbung (blau); RFP, rot fluoreszierendes Protein (rot); Zusammengeführt, Überlagerung von DAPI, RFP und Anti-Neogenin. Bitte hier klicken , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

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Abbildung 5: Wirkungen von Neogenin Verlust oder Gewinn auf Embryonalentwicklung. 2-PN Maus-Embryonen wurden entweder mit kleinen Hairpin-RNA (shRNA) Targeting Neogenin (Neogenin Verlust) oder mit Vektoren beherbergen Neogenin cDNA (Neogenin Verstärkung) und kultiviert wurden bis zum Erreichen der Blastozysten-Stadium mikroinjiziert. Zu Neogenin Verlust von Neogenin Verstärkungs Embryonen differenzieren, GFP und RFP gemeinsam exprimiert wurden, respectively. Phasenkontrastbilder von Embryonen in verschiedenen Entwicklungsstadien gezeigt. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Abbildung 6: Neogenin Überexpression Bevorzugungen ICM Differenzierung (A) ICM - Zellen in Blastozysten durch Immunfärbung für Oct3 / 4 betrachtet wurden.. DAPI wurde sta verwendetin den Zellkern. (B) Die Anzahl der Oct3 / 4-positive ICM - Zellen in eine Blastozyste Kontrolle Neogenin Verlust und Neogenin Verstärkungs Embryonen sind als Mittelwert ± SEM von drei unabhängigen Experimenten dargestellt mit mindestens 10 in jedem Experiment verwendet Embryonen. * Signifikante Unterschiede von der Kontrolle bei p <0,05 von t - Test nach Student. (C) RT-PCR - Analyse von Oct3 / 4, Sox2, Nanog, Cdx2 und Tead4 mRNAs aus Blastozysten Neogenin Verlust, Neogenin Verstärkung und Kontrolle Embryonen. β-Actin wurde als interne Kontrolle verwendet. Bitte hier klicken , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Tabelle 1: Sequenzen der Primer und PCR - Bedingungen verwendet für RT-PCR.

Tabelle 2: Die Anzahl der überlebenden Maus Embryonen in jeder Entwicklungsstufe nach dem Empfang Neogenin shRNA oder Neogenin cDNA an der 2-PN Bühne.

Discussion

Im vorliegenden Protokoll zeigen wir neue Verfahren der Mikroinjektion von genetischen Materialien, entweder cDNA oder shRNA, in die 2-PN Maus-Embryonen, die Rolle der Neogenin in der frühen Zelldifferenzierung während der Maus Embryonalentwicklung zu erkunden. Genetische Veränderung von Präimplantationsembryonen ist eine leistungsstarke Technik in die wichtigsten Informationen über zugrunde liegenden molekularen Mechanismen aufzudecken für zum Beispiel die erste Zelllinie Bestimmung. Genetische Modifikation ist eine der am häufigsten verwendeten Methoden zur Ermittlung Genfunktion. Mit relativ großen receptibility der 2-PN Embryonen für fremde genetische Materialien und die Möglichkeit der Mikroinjektion von cDNA und shRNA in die 2-PN Embryonen, diese Embryomanipulation Technik kann mit minimaler körperlicher Störung des Embryos durchgeführt werden, ganz zu schweigen von der intrinsischen Komplementarität mit dieser genetischen Manipulation in Verbindung gebracht.

dass die zytoplasmatische Injektion Anbetracht ist einfacher und weniger schädlicheine höhere Expression von Fremd-DNA für das Überleben als Kerninjektion, aber dennoch im Zusammenhang mit Kerninjektion, eine Verbesserung, die hervorgehoben werden soll, ist die Verwendung von Zentrifugation die Vorkerne vor der Mikroinjektion in den Zellkern zu positionieren. Die technisch anspruchsvolle und anspruchs Schritt ist die Mikroinjektion von Fremd-DNA in den Vorkern einer befruchteten Eizelle. Dieser Schritt ist von entscheidender Bedeutung und erfordert erhebliche technische Kompetenz und umfassende Ausbildung der Mikroinjektionsverfahren zu meistern. Sobald diese Fähigkeit jedoch erworben wird, werden technische Variabilität und Fehler minimal. Die Routine Überleben von mikroinjiziert Embryonen ist zwischen 80-90% in unserer Einrichtung.

Im Gegensatz zu dieser Studie positioniert andere Forscher Embryonen, die durch die Pipette, so dass ein Vorkern in der Nähe der Plasmamembran wurde in der Nähe der Mikronadeln. Der Mikro Nadel wird dann in den Vorkern ^10,11 eingefügt. Wir erlebten einige Schwierigkeiten, die Pro-VisualisierungKern richtig unter dem Mikroskop ohne Zentrifugation. Offensichtlich Zentrifugation bringt den Kern nahe an der Plasmamembran zur besseren Identifizierung. Zugleich sollte es somit eine bessere Positionierung des Pronucleus noch Raum für Verbesserungen für eine bessere Visualisierung sein.

Im Gegensatz zu den transgenen Mäusen Produktion ist unser Protokoll für die Mikroinjektion von Plasmiden in Embryonen eine vorübergehende Transfektion von der Natur, und somit geeignet für die Genfunktion während preimplantation Embryonalentwicklung sezieren. Deshalb ist unser Protokoll für eine verlust- und gain-of-function-Technik verallgemeinert werden könnte weiter zu identifizieren Signalmoleküle in der frühen Embryonalentwicklung beteiligt.

Zusätzlich könnte Neogenin Signalisierung zur Entwicklung von embryonalen Stammzelllinien gegeben sehr vorteilhaft sein, dass Neogenin und seine Liganden sind wahrscheinlich Stammzellen spezifischen Transkriptionsfaktoren wie Oct3 / 4, Sox2 und Nanog verbessern.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
M16 medium,	Gibco BRL (Grand Island, NY)	M7292 LOT# 11A832
Goat serum,	Dako (Glostrup, Denmark)	X0907
PMSG	Folligon, Intervet, Holland	G4877-1000IU LOT#SLBD0719V
Mineral oil	Sigma Aldrich	CG5-1VL LOT# SLBC6783V
human chorionic gonadotropin and pregnant mare serum gonadotropin	(Intervet, Holland)	(invitrogen , 15596-026)
SuperScript® III Reverse Transcriptase	lifetechnologies	18080-044
PCR pre mixture	(Bioneer, Daejon, S. Korea)	GenDEPOT , A0224-050
Agarose (molecular grade)	BioRad	161-3101
Paraformaldehyde Solution, 4% in PBS	Affymetrix USA	19943
polyclonal rabbit anti-neogenin antibody	Santa Cruz Biotechnology, US	SC-15337
Alexa fluor 488 labeled anti-rabbit antibody	Molecular Probes (Invitrogen, USA)	A-11094
Alexa fluor 555 labeled anti-rabbit antibody	Molecular Probes (Invitrogen, USA)	A-21428
Alexa Fluor® 555 Phalloidin	Molecular Probes (Invitrogen, USA)	A34055
DAPI (4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride)	Invitrogen, USA	D1306
Recombinant Human RGM-C/Hemojuvelin	R&D systems	3720-RG
all plasmid constructs	Prof. Wen Cheng Xiong at Georgia Health Sciences University (Agusta, GA).		for the present studies were kindly provided by
Neon®  Transfection System	lifetech	MPK10096
Stereo Microscrope	Nikon	SMZ1000
Micromainpulation system with Nikon	Nikon	Narishige ONM-1
Micro Injector	Nikon Narishige	GASTIGHT #1750
Holder	Nikon Narishige	Narishige IM 16
Microfuge	Nikon Narishige	Narishige MF-900
grinder	Narishige	EG400
Puller	Sutter Instrumnet company	P-97
CO2 incubator	Thermo Scientific Forma	EW-39320-16
Veriti® 384-Well Thermal Cycler	lifetechnologies	4388444