Summary

Verlies- en Gain-of-function Aanpak Early Cell Fate Determinanten Onderzoek in Pre-implantatie muizenembryo's

Published: June 06, 2016
doi:

Summary

Het doel van dit protocol is een verliesgevende beschrijven en gain-of functiemethode dat geldt voor neogenin identificeren als een stadium-specifieke receptor die tot trophectoderm en binnenste celmassa differentiatie van pre-implantatie muizenembryo's is.

Abstract

Gene silencing and overexpression techniques are instrumental for the identification of genes involved in embryonic development. Direct target gene modification in preimplantation embryos provides a means to study the underlying mechanisms of genes implicated in, for instance, cellular differentiation into the trophectoderm (TE) and the inner cell mass (ICM). Here, we describe a protocol that examines the role of neogenin as an authentic receptor for initial cell fate determination in preimplantation mouse embryos. First, we discuss the experimental manipulations that were used to produce gain and loss of neogenin function by microinjecting neogenin cDNA and shRNA; the effectiveness of this approach was confirmed by a strong correlation between the pair-wise expression levels of either red fluorescent protein (RFP) or green fluorescent protein (GFP) and the immunocytochemical quantification of neogenin expression. Secondly, overexpression of neogenin in preimplantation mouse embryos leads to normal ICM development while neogenin knockdown causes the ICM to develop abnormally, implying that neogenin could be a receptor that relays extracellular cues to drive blastomeres to early cell fates. Given the success of this detailed protocol in investigating the function of a novel embryonic developmental stage-specific receptor, we propose that it has the potential to aid in exploration and identification of other stage-specific genes during embryogenesis.

Introduction

Preimplantatie embryonale ontwikkeling kan worden onderverdeeld in verschillende afzonderlijke fasen, van de ene cel stadium de morula en blastocyst. Veel bewijs suggereert dat de polariteit en positionele signalen een rol spelen in het begin van lot van de cel bepaling in de kaart spelen trophectoderm (TE) en de binnenste celmassa (ICM). De aard van de signalen, hoe ze worden getransduceerd in cellulaire signalen en de fysiologische contexten waarin zulke signalen kunnen initiëren cellijn differentiatie niet bekend. Deze gedifferentieerde cellen vervolgens aan specialisatie, beginnend op kenmerkende structuren en functies voor embryo vorming en groei van de placenta 1-3 te nemen.

Pre-implantatie embryo's zijn bijzonder vatbaar voor manipulatie door directe injectie van genetisch gemodificeerde materialen zoals siRNA of cDNA doelwit en kan dus worden gebruikt om specifieke doelmoleculen bestuderen. Er is een groeiend besef dat de genetischeanalyse van gewervelde embryo's is van cruciaal belang voor onze kennis van de embryonale ontwikkeling 4. Preciezer van een wildtype gen of een mutante vorm tot een embryo in een geschikte context te bereiken gain of verlies van functie van het gen aanzienlijk vergemakkelijkt de studie van ontwikkeling gereguleerde genen. Verlies- en gain-of-function via micro-injectie van genetisch materiaal in afzonderlijke niet-zoogdieren en zoogdieren embryo begin relatief eenvoudig vanwege hun grote omvang en grote ontvankelijkheid 5. Micro-injectie wordt meestal uitgevoerd met behulp van niet-virale vectoren. Bijzonder voordeel is gehouden met het gemak van het gebruik van niet-virale vectoren in virale vectoren en transgenen. Een snelle verlies- of gain-of-function expressiesysteem in muizenembryo's is ontwikkeld dat ons in staat stelt te ontleden en te begrijpen genfuncties in gewervelde embryologie 6,7.

TL-etikettering van embryo's zou zeer de selectie van MICR vergemakkelijkenoinjected of genetisch gemanipuleerde embryo en tegelijkertijd verlenen middel indirect kwantificeren van het expressieniveau van microgeïnjecteerde siRNA of cDNA gebaseerd op fluorescentie-intensiteit 8. Om deze etikettering, fluorescerend eiwit cDNA, GFP of RFP te bereiken, zijn co-geïnjecteerd als ofwel fusieconstructen of afzonderlijk. De fluorescentie-intensiteit van GFP of RFP onthult de mate van expressie van siRNA of vreemd DNA dat verliesgevende zorgen of gain-of-function is bereikt.

Hier presenteren we een micromanipulatie protocol voor verlies- en gain-of-functie techniek die ons toeliet om neogenin identificeren als een receptor die extracellulaire signalen belangrijk in het begin van celdifferentiatie relais in pre-implantatie muizenembryo's.

Protocol

LET OP: Alle procedures voor het fokken van dieren en zorgen werden uitgevoerd volgens de IACUC reglementen van Sahmyook University, Seoul, Zuid-Korea. 1. superovulatie, Fokkerij en eileider Isolation Handhaaf inteelt C57BL / 6 muizen onder de volgende voorwaarden: 22 ± 3 ° C, ~ 60% luchtvochtigheid, 12 uur licht / donker-cyclus, en water en voedsel ad libitum. Induceren van superovulatie van 3-5 weken oude vrouwelijke muizen door een intraperitoneale injectie van 5 IU drachtige merrie ser…

Representative Results

We ontdekten dat neogenin is transiënt tot expressie tijdens de vroege ontwikkelingsstadia van pre-implantatie muizenembryo's verschijnen reeds in het 2-cel stadium en duren tot de vroege morula maar steeds deficiënt in de late morula en blastocyst stadium (figuur 2A). Bovendien, de ruimtelijke verdeling van neogenin beperkt was voornamelijk buiten cellen. De resultaten van RT-PCR analyse waren consistent met de vroege en voorbijgaande aard van neogenin uitdrukking…

Discussion

In dit protocol tonen we nieuwe werkwijzen voor micro-injectie van genetisch materiaal, hetzij cDNA of shRNA, in de 2-PN muizenembryo's om de rol van neogenin begin celdifferentiatie staand tijdens embryogenese van de muis. Genetische modificatie van pre-implantatie embryo's is een krachtige techniek in het blootleggen van de belangrijkste informatie over de onderliggende moleculaire mechanismen voor, bijvoorbeeld, de eerste cel lineage bepalen. Genetische modificatie is een van de meest gebruikte methoden voor …

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

De auteurs willen ook graag aan de groep Dr. Xiong bij Georgia Health Sciences University erkennen voor de productie en het delen van de constructen voor neogenin cDNA en shRNA vectoren. Deze studie werd ondersteund door subsidies van de Basic Science Research Program (2013R1A1A4A01012572) gefinancierd door de Koreaanse Research Foundation en door een onderzoeksbeurs van Sahmyook University.

Materials

M16 medium, Gibco BRL (Grand Island, NY) M7292 LOT# 11A832
Goat serum,  Dako (Glostrup, Denmark) X0907
PMSG Folligon, Intervet, Holland G4877-1000IU LOT#SLBD0719V
Mineral olie Sigma Aldrich CG5-1VL LOT# SLBC6783V
human chorionic gonadotropin and pregnant mare serum gonadotropin  (Intervet, Holland) (invitrogen , 15596-026)
SuperScript® III Reverse Transcriptase lifetechnologies 18080-044
PCR pre mixture  (Bioneer, Daejon, S. Korea) GenDEPOT , A0224-050
Agarose (molecular grade) BioRad 161-3101
Paraformaldehyde Solution, 4% in PBS Affymetrix USA 19943
polyclonal rabbit anti-neogenin antibody Santa Cruz Biotechnology, US SC-15337
Alexa fluor 488 labeled anti-rabbit antibody Molecular Probes (Invitrogen, USA) A-11094
Alexa fluor 555 labeled anti-rabbit antibody Molecular Probes (Invitrogen, USA) A-21428
Alexa Fluor® 555 Phalloidin Molecular Probes (Invitrogen, USA) A34055
DAPI (4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride) Invitrogen, USA D1306
Recombinant Human RGM-C/Hemojuvelin R&D systems 3720-RG
all plasmid constructs  Prof. Wen Cheng Xiong at Georgia Health Sciences University (Agusta, GA). the present studies were kindly provided by 
Neon®  Transfection System lifetech MPK10096
Stereo Microscrope Nikon SMZ1000
Micromainpulation system with Nikon Nikon Narishige ONM-1
MicroInjector Nikon Narishige GASTIGHT #1750
Holder Nikon Narishige Narishige IM 16
Microfoge Nikon Narishige Narishige MF-900
grinder Narishige EG400
Puller Sutter Instrumnet company P-97
CO2 incubator Thermo Scientific Forma EW-39320-16
Veriti® 384-Well Thermal Cycler  lifetechnologies 4388444

References

  1. Yamanaka, Y., Ralston, A., Stephenson, R. O., Rossant, J. Cell and molecular regulation of the mouse blastocyst. Dev. Dyn. 235 (9), 2301-2314 (2006).
  2. Sasaki, H. Mechanisms of trophectoderm fate specification in preimplantation mouse development. Dev. Growth Differ. 52 (3), 263-273 (2010).
  3. Nishioka, N., Yamamoto, S., Kiyonari, H., Sato, H., Sawada, A., Ota, M., et al. Tead4 is required for specification of trophectoderm in pre-implantation mouse. Mech. Dev. 125 (3-4), 270-283 (2008).
  4. Ovitt, C. E., Schöler, H. R. The molecular biology of Oct-4 in the early mouse embryo. Mol. Hum. Reprod. 4 (11), 1021-1031 (1998).
  5. Stein, P., Schindler, K. Mouse Oocyte Microinjection, Maturation and Ploidy Assessment. J. Vis. Exp. (53), e2851 (2011).
  6. Shin, M. R., Cui, X. S., Jun, J. H., Jeong, Y. J., Kim, N. H. Identification of mouse blastocyst genes that are down regulated by double-stranded RNA-mediated knockdown of Oct-4 expression. Mol. Reprod. Dev. 70 (4), 390-396 (2005).
  7. Khang, I., Sonn, S., Park, J. -. H., Rhee, K., Park, D., Kim, K. Expression of epithin in mouse preimplantation development: Its role in compaction. Dev. Biol. 281, 134-144 (2005).
  8. Prieto, D., Aparicio, G., Machado, M., Zolessi, F. R. Application of the DNA-Specific Stain Methyl Green in the Fluorescent Labeling of Embryos. J. Vis. Exp. (99), e52769 (2015).
  9. Lee, J. H., Choi, S. S., Kim, H. W., Xiong, W. C., Min, C. K., Lee, S. J. Neogenin as a receptor for early cell fate determination in preimplantation mouse embryos. PLoS One. 9 (7), e101989 (2014).
  10. Gordon, J. W., Scangos, G. A., Plotkin, D. J., Barbosa, J. A., Ruddle, F. H. Genetic transformation of mouse embryos by microinjection of purified DNA. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 77 (12), 7380-7384 (1980).
  11. Brinster, R. L., Chen, H. Y., Trumbauer, M. E., Yagle, M. K., Palmiter, R. D. Factors affecting the efficiency of introducing foreign DNA into mice by microinjecting eggs. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 82, 4438-4442 (1985).

Play Video

Cite This Article
Lee, J. H., Cho, Y. I., Choi, S. S., Kim, H., Min, C. K., Lee, S. J. Loss- and Gain-of-function Approach to Investigate Early Cell Fate Determinants in Preimplantation Mouse Embryos. J. Vis. Exp. (112), e53696, doi:10.3791/53696 (2016).

View Video