Verlies- en Gain-of-function Aanpak Early Cell Fate Determinanten Onderzoek in Pre-implantatie muizenembryo's
Summary
Het doel van dit protocol is een verliesgevende beschrijven en gain-of functiemethode dat geldt voor neogenin identificeren als een stadium-specifieke receptor die tot trophectoderm en binnenste celmassa differentiatie van pre-implantatie muizenembryo's is.
Abstract
Gene silencing and overexpression techniques are instrumental for the identification of genes involved in embryonic development. Direct target gene modification in preimplantation embryos provides a means to study the underlying mechanisms of genes implicated in, for instance, cellular differentiation into the trophectoderm (TE) and the inner cell mass (ICM). Here, we describe a protocol that examines the role of neogenin as an authentic receptor for initial cell fate determination in preimplantation mouse embryos. First, we discuss the experimental manipulations that were used to produce gain and loss of neogenin function by microinjecting neogenin cDNA and shRNA; the effectiveness of this approach was confirmed by a strong correlation between the pair-wise expression levels of either red fluorescent protein (RFP) or green fluorescent protein (GFP) and the immunocytochemical quantification of neogenin expression. Secondly, overexpression of neogenin in preimplantation mouse embryos leads to normal ICM development while neogenin knockdown causes the ICM to develop abnormally, implying that neogenin could be a receptor that relays extracellular cues to drive blastomeres to early cell fates. Given the success of this detailed protocol in investigating the function of a novel embryonic developmental stage-specific receptor, we propose that it has the potential to aid in exploration and identification of other stage-specific genes during embryogenesis.
Introduction
Preimplantatie embryonale ontwikkeling kan worden onderverdeeld in verschillende afzonderlijke fasen, van de ene cel stadium de morula en blastocyst. Veel bewijs suggereert dat de polariteit en positionele signalen een rol spelen in het begin van lot van de cel bepaling in de kaart spelen trophectoderm (TE) en de binnenste celmassa (ICM). De aard van de signalen, hoe ze worden getransduceerd in cellulaire signalen en de fysiologische contexten waarin zulke signalen kunnen initiëren cellijn differentiatie niet bekend. Deze gedifferentieerde cellen vervolgens aan specialisatie, beginnend op kenmerkende structuren en functies voor embryo vorming en groei van de placenta 1-3 te nemen.
Pre-implantatie embryo's zijn bijzonder vatbaar voor manipulatie door directe injectie van genetisch gemodificeerde materialen zoals siRNA of cDNA doelwit en kan dus worden gebruikt om specifieke doelmoleculen bestuderen. Er is een groeiend besef dat de genetischeanalyse van gewervelde embryo's is van cruciaal belang voor onze kennis van de embryonale ontwikkeling 4. Preciezer van een wildtype gen of een mutante vorm tot een embryo in een geschikte context te bereiken gain of verlies van functie van het gen aanzienlijk vergemakkelijkt de studie van ontwikkeling gereguleerde genen. Verlies- en gain-of-function via micro-injectie van genetisch materiaal in afzonderlijke niet-zoogdieren en zoogdieren embryo begin relatief eenvoudig vanwege hun grote omvang en grote ontvankelijkheid 5. Micro-injectie wordt meestal uitgevoerd met behulp van niet-virale vectoren. Bijzonder voordeel is gehouden met het gemak van het gebruik van niet-virale vectoren in virale vectoren en transgenen. Een snelle verlies- of gain-of-function expressiesysteem in muizenembryo's is ontwikkeld dat ons in staat stelt te ontleden en te begrijpen genfuncties in gewervelde embryologie 6,7.
TL-etikettering van embryo's zou zeer de selectie van MICR vergemakkelijkenoinjected of genetisch gemanipuleerde embryo en tegelijkertijd verlenen middel indirect kwantificeren van het expressieniveau van microgeïnjecteerde siRNA of cDNA gebaseerd op fluorescentie-intensiteit 8. Om deze etikettering, fluorescerend eiwit cDNA, GFP of RFP te bereiken, zijn co-geïnjecteerd als ofwel fusieconstructen of afzonderlijk. De fluorescentie-intensiteit van GFP of RFP onthult de mate van expressie van siRNA of vreemd DNA dat verliesgevende zorgen of gain-of-function is bereikt.
Hier presenteren we een micromanipulatie protocol voor verlies- en gain-of-functie techniek die ons toeliet om neogenin identificeren als een receptor die extracellulaire signalen belangrijk in het begin van celdifferentiatie relais in pre-implantatie muizenembryo's.
Protocol
Representative Results
Discussion
In dit protocol tonen we nieuwe werkwijzen voor micro-injectie van genetisch materiaal, hetzij cDNA of shRNA, in de 2-PN muizenembryo's om de rol van neogenin begin celdifferentiatie staand tijdens embryogenese van de muis. Genetische modificatie van pre-implantatie embryo's is een krachtige techniek in het blootleggen van de belangrijkste informatie over de onderliggende moleculaire mechanismen voor, bijvoorbeeld, de eerste cel lineage bepalen. Genetische modificatie is een van de meest gebruikte methoden voor …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
De auteurs willen ook graag aan de groep Dr. Xiong bij Georgia Health Sciences University erkennen voor de productie en het delen van de constructen voor neogenin cDNA en shRNA vectoren. Deze studie werd ondersteund door subsidies van de Basic Science Research Program (2013R1A1A4A01012572) gefinancierd door de Koreaanse Research Foundation en door een onderzoeksbeurs van Sahmyook University.
Materials
| M16 medium, | Gibco BRL (Grand Island, NY) | M7292 LOT# 11A832 | |
| Goat serum, | Dako (Glostrup, Denmark) | X0907 | |
| PMSG | Folligon, Intervet, Holland | G4877-1000IU LOT#SLBD0719V | |
| Mineral olie | Sigma Aldrich | CG5-1VL LOT# SLBC6783V | |
| human chorionic gonadotropin and pregnant mare serum gonadotropin | (Intervet, Holland) | (invitrogen , 15596-026) | |
| SuperScript® III Reverse Transcriptase | lifetechnologies | 18080-044 | |
| PCR pre mixture | (Bioneer, Daejon, S. Korea) | GenDEPOT , A0224-050 | |
| Agarose (molecular grade) | BioRad | 161-3101 | |
| Paraformaldehyde Solution, 4% in PBS | Affymetrix USA | 19943 | |
| polyclonal rabbit anti-neogenin antibody | Santa Cruz Biotechnology, US | SC-15337 | |
| Alexa fluor 488 labeled anti-rabbit antibody | Molecular Probes (Invitrogen, USA) | A-11094 | |
| Alexa fluor 555 labeled anti-rabbit antibody | Molecular Probes (Invitrogen, USA) | A-21428 | |
| Alexa Fluor® 555 Phalloidin | Molecular Probes (Invitrogen, USA) | A34055 | |
| DAPI (4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride) | Invitrogen, USA | D1306 | |
| Recombinant Human RGM-C/Hemojuvelin | R&D systems | 3720-RG | |
| all plasmid constructs | Prof. Wen Cheng Xiong at Georgia Health Sciences University (Agusta, GA). | the present studies were kindly provided by | |
| Neon® Transfection System | lifetech | MPK10096 | |
| Stereo Microscrope | Nikon | SMZ1000 | |
| Micromainpulation system with Nikon | Nikon | Narishige ONM-1 | |
| MicroInjector | Nikon Narishige | GASTIGHT #1750 | |
| Holder | Nikon Narishige | Narishige IM 16 | |
| Microfoge | Nikon Narishige | Narishige MF-900 | |
| grinder | Narishige | EG400 | |
| Puller | Sutter Instrumnet company | P-97 | |
| CO2 incubator | Thermo Scientific Forma | EW-39320-16 | |
| Veriti® 384-Well Thermal Cycler | lifetechnologies | 4388444 |
References
- Yamanaka, Y., Ralston, A., Stephenson, R. O., Rossant, J. Cell and molecular regulation of the mouse blastocyst. Dev. Dyn. 235 (9), 2301-2314 (2006).
- Sasaki, H. Mechanisms of trophectoderm fate specification in preimplantation mouse development. Dev. Growth Differ. 52 (3), 263-273 (2010).
- Nishioka, N., Yamamoto, S., Kiyonari, H., Sato, H., Sawada, A., Ota, M., et al. Tead4 is required for specification of trophectoderm in pre-implantation mouse. Mech. Dev. 125 (3-4), 270-283 (2008).
- Ovitt, C. E., Schöler, H. R. The molecular biology of Oct-4 in the early mouse embryo. Mol. Hum. Reprod. 4 (11), 1021-1031 (1998).
- Stein, P., Schindler, K. Mouse Oocyte Microinjection, Maturation and Ploidy Assessment. J. Vis. Exp. (53), e2851 (2011).
- Shin, M. R., Cui, X. S., Jun, J. H., Jeong, Y. J., Kim, N. H. Identification of mouse blastocyst genes that are down regulated by double-stranded RNA-mediated knockdown of Oct-4 expression. Mol. Reprod. Dev. 70 (4), 390-396 (2005).
- Khang, I., Sonn, S., Park, J. -. H., Rhee, K., Park, D., Kim, K. Expression of epithin in mouse preimplantation development: Its role in compaction. Dev. Biol. 281, 134-144 (2005).
- Prieto, D., Aparicio, G., Machado, M., Zolessi, F. R. Application of the DNA-Specific Stain Methyl Green in the Fluorescent Labeling of Embryos. J. Vis. Exp. (99), e52769 (2015).
- Lee, J. H., Choi, S. S., Kim, H. W., Xiong, W. C., Min, C. K., Lee, S. J. Neogenin as a receptor for early cell fate determination in preimplantation mouse embryos. PLoS One. 9 (7), e101989 (2014).
- Gordon, J. W., Scangos, G. A., Plotkin, D. J., Barbosa, J. A., Ruddle, F. H. Genetic transformation of mouse embryos by microinjection of purified DNA. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 77 (12), 7380-7384 (1980).
- Brinster, R. L., Chen, H. Y., Trumbauer, M. E., Yagle, M. K., Palmiter, R. D. Factors affecting the efficiency of introducing foreign DNA into mice by microinjecting eggs. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 82, 4438-4442 (1985).
