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Chemistry

In Situ Caratterizzazione di idrate proteine ​​in acqua da Salvi e TOF-SIMS

doi: 10.3791/53708 Published: February 15, 2016
* These authors contributed equally

Summary

Questo lavoro presenta un protocollo di gestione dei liquidi e di introduzione del campione ad un microcanali per in situ tempo di volo ioni secondari analisi di spettrometria di massa di biomolecole proteina in una soluzione acquosa.

Abstract

Questo lavoro dimostra in situ caratterizzazione di biomolecole di proteine ​​nella soluzione acquosa utilizzando il sistema per l'analisi al Interface Vacuum Liquid (SALVI) e tempo di volo spettrometria di massa di ioni secondari (TOF-SIMS). Il film proteine ​​fibronectina è stato immobilizzato sulla membrana di nitruro di silicio (SiN) che forma l'area di rilevamento SALVI. Durante l'analisi ToF-SIMS, sono stati condotti tre modalità di analisi compreso alta spettrometria di massa spaziale risoluzione, immagini bidimensionali (2D), e profili di profondità. Gli spettri di massa sono stati acquisiti in entrambe le modalità positivi e negativi. acqua deionizzata è stato anche analizzato come un campione di riferimento. I nostri risultati mostrano che il film fibronectina in acqua ha più distinti e più forti picchi di cluster di acqua rispetto alla sola acqua. picchi caratteristici di frammenti di amminoacidi sono anche osservabili nella proteina idratata ToF-SIMS spettri. Questi risultati dimostrano che molecola proteica adsorbimento su una superficie può essere studiato Dynamically usando Salvi e ToF-SIMS nell'ambiente liquido per la prima volta.

Introduction

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L'idratazione è cruciale per la struttura, 1 conformazione, 2 e 3 attività biologica delle proteine. Le proteine ​​senza molecole d'acqua che li circondano non avrebbero attività biologiche vitali. In particolare, le molecole d'acqua interagiscono con la superficie e la struttura interna delle proteine, e diversi stati di idratazione di proteine ​​rendono tali interazioni distinte. 4 L'interazione delle proteine ​​con le superfici solide è un fenomeno fondamentale, con implicazioni nel campo delle nanotecnologie, biomateriali e processi di ingegneria tissutale. Studi hanno a lungo indicato che i cambiamenti conformazionali possono verificarsi come proteina incontra una superficie. ToF-SIMS è stato concepito come la tecnica che ha il potenziale per studiare all'interfaccia proteina-solido. 5-7 È importante comprendere l'idratazione di proteine ​​su superfici solide, che fornisce potenzialmente una comprensione fondamentale del meccanismo della loro struttura, conformazione e biological'attività al.

Tuttavia, le tecniche analitiche superficie maggiore sono per lo più sotto vuoto-based e applicazioni dirette per Studi liquidi volatili sono difficili a causa della rapida evaporazione del liquido volatile in ambiente sottovuoto. Abbiamo sviluppato un vuoto un'interfaccia microfluidica compatibile, sistema per l'analisi presso l'interfaccia Vacuum Liquid (SALVI), per consentire osservazioni dirette di superfici liquide e interazioni liquido-solido che utilizzano tempo di volo di ioni secondari spettrometria di massa (TOF-SIMS). 8- 11 Gli aspetti unici sono i seguenti: 1) la finestra di rilevamento è un'apertura di 2-3 micron di diametro che permette l'imaging diretto della superficie del liquido, 2) tensione superficiale è utilizzato per contenere il liquido all'interno del diaframma, e 3) Salvi è portatile tra più piattaforme analitiche. 11,12

Salvi è composto da una membrana di nitruro di silicio (SiN) come area di rilevamento e un microcanale in polidimetilsilossano (PDMS). E 'fabricated nella stanza pulita, ei fattori di fabbricazione e di progettazione chiave sono stati dettagliatamente nei precedenti documenti e brevetti. 8-12 Le applicazioni di ToF-SIMS come strumento analitico sono state dimostrate utilizzando una varietà di soluzioni acquose e le miscele di liquidi complessi, alcuni dei che conteneva le nanoparticelle. 13-17 in particolare, SALVI liquido TOF-SIMS consente dinamica sondare l'interfaccia liquido-solido dei sistemi live biologici (ad esempio, biofilm), celle singole, e l'interfaccia solido-elettrolitico, aprendo nuove opportunità per in situ condensato fase studi, tra cui liquidi con l'ausilio TOF-SIMS. Tuttavia, il design attuale non consente ancora interazioni gas-liquido. Questa è una direzione per lo sviluppo futuro. SALVI è stato utilizzato per studiare il film proteina idrata in questo lavoro per la prima volta.

Fibronectina è un dimero proteine ​​comunemente usato, costituito da due monomeri quasi identici collegati da una coppia di ponti disolfuro, 18 che is ben noto per la sua capacità di legare le cellule. 19,20 E 'stato scelto come sistema modello per illustrare che il film proteina idratata potrebbe essere sondato in modo dinamico con il liquido SALVI ToF-SIMS approccio. La soluzione proteica è stata introdotta nel microcanali. Dopo incubazione per 12 ore, un film proteina idratata formata sul lato posteriore della membrana SiN. Deionizzata (DI) l'acqua è stata utilizzata per risciacquare il canale dopo l'introduzione di proteine. Le informazioni sono state raccolte da idrati molecole di proteine ​​fibronectina nel microcanali SALVI usando dinamica TOF-SIMS. DI acqua è stato studiato anche come controllo da confrontare con i risultati ottenuti da idratato film sottile fibronectina. sono state osservate differenze distinte tra il film proteina idratata e acqua deionizzata. Questo lavoro dimostra che l'assorbimento di proteine ​​sulla superficie in ambiente liquido può essere studiato con il romanzo Salvi e liquido approccio ToF-SIMS. Il protocollo video è destinato a fornire una guida tecnica per le persone che sono interessatead utilizzare questo nuovo strumento di analisi per le diverse applicazioni di SALVI con ToF-SIMS e ridurre gli errori inutili in gestione dei liquidi, nonché l'acquisizione di dati ToF-SIMS e l'analisi.

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Protocol

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1. Pulizia e sterilizzazione della Microchannel SALVI

  1. Sterilizzazione della Microchannel in SALVI
    1. Disegnare 2 ml di soluzione acquosa al 70% di etanolo in una siringa, collegare la siringa con l'estremità di entrata della SALVI, e iniettare lentamente 1 ml del liquido in 10 min. Rimuovere la siringa al termine dell'iniezione. Quindi, collegare l'ingresso e l'uscita di SALVI utilizzando un polietereterchetone (PEEK) unione. In alternativa, utilizzare una pompa a siringa per condurre la stessa procedura. Ad esempio, impostare la velocità di flusso a 100 microlitri / min.
    2. Mantenere la microcanali SALVI riempito con soluzione di etanolo al 70% a temperatura ambiente per 4 ore.
  2. Introdurre deionizzata (DI) Acqua in SALVI
    1. Disegnare 2 ml di acqua deionizzata sterile in una siringa, collegare la siringa con l'ingresso di SALVI, e iniettare lentamente 1 ml del liquido in 10 min. Rimuovere la siringa e collegare l'ingresso e l'uscita di SALVI utilizzando un'unione PEEK. In alternativa, utilizzare una pompa a siringa, come indicato inpasso 1.1.1.

2. immobilizzazione del Film di proteine ​​in SALVI

  1. Immobilizzare il Film di proteine ​​in SALVI
    1. Disegnare 2 ml di fibronectina (10 ug / ml in tampone fosfato, PBS) soluzione in una siringa, collegare la siringa con l'ingresso di SALVI, lentamente iniettare 1 ml del liquido in 10 min, rimuovere la siringa, e collegare l'ingresso e l'uscita di SALVI utilizzando una unione PEEK.
    2. Incubare la SALVI riempito con la soluzione fibronectina in un piatto di coltura pulito, mantiene il piatto nella cappa a temperatura ambiente per 12 ore.
    3. Disegnare 2 ml di acqua deionizzata sterile in una siringa e collegare la siringa con l'ingresso di Salvi. Iniettare lentamente 1 ml di acqua in 10 minuti, rimuovere la siringa, e collegare l'ingresso e l'uscita di Salvi.
      Nota: Se dotato di un microscopio ottico, controllare il SALVI sotto il microscopio per assicurare che la membrana peccato è intatto prima analisi ToF-SIMS. Ora il dispositivo è pronto per SALVI TOF-SIMS unANALISI.

3. Installare SALVI nella Loadlock Camera TOF-SIMS

Nota: I guanti devono essere indossati in ogni momento durante la manipolazione del dispositivo Salvi e installarla sul palco TOF-SIMS per evitare potenziali contaminazioni durante l'analisi di superficie.

  1. Montare SALVI allo stage
    1. Posare la fase TOF-SIMS su una superficie piana e pulita. Mettere il dispositivo SALVI sul palco con il wafer di silicio e la membrana SiN rivolto verso l'alto. Fissare il SALVI con quattro pezzi di fissaggio in metallo e avvitare i pezzi di metallo che tengono l'angolo del dispositivo nella piastra metallica con quattro viti.
    2. Delicatamente arrotolare il tubo PTFE collegato al canale microfluidica. Utilizzare quattro pezzi di metallo e quattro viti per tenere la parte rigida verso il basso. Assicurarsi che il dispositivo è posizionato nello spazio aperto sulla scena SIMS modo che non interferisca con il fascio di ioni primario durante l'analisi. Ulteriori immagini e illustrazione del fabricat SALVIione e l'installazione sono disponibili in pubblicazioni precedenti. 8,9,11
  2. Montare la Coppa Faraday allo stage
    1. Fissare la coppa di Faraday sul palco da una vite.
  3. Caricare lo stage nelle TOF-SIMS Loadlock Camera
    1. Aprire il loadlock ToF-SIMS, tenere e impostare la fase orizzontale sulla piattaforma di carico, e chiudere la porta loadlock.

4. ToF-SIMS acquisizione dati

  1. Accendere la pompa di aspirazione e garantire vuoto adatto (per esempio, dell'ordine di 10 -6 mbar o Torr) viene raggiunto nella camera loadlock.
  2. Spostare il SALVI nella camera principale una volta il vuoto è stabilizzata dopo circa 30 min.
    Nota: Il vuoto deve essere inferiore a 5 x 10 -6 mbar di vuoto nella camera principale durante l'acquisizione dei dati. Altrimenti, alto vuoto è indicativo di una perdita nel sistema SALVI.
  3. Regolare il fascio di ioni primario e analizzatore di ToF-SIMS con unrisoluzione spaziale di circa 400 nm secondo le raccomandazioni del produttore. La corrente del fascio primario è di 1.200 pA, mentre il tempo di ciclo è di 30 msec sotto la modalità DC.
    Nota: Questo processo segue in gran parte le raccomandazioni del produttore.
  4. Trovare il canale microfluidica utilizzando il microscopio ottico. Utilizzare il centro ottico di immagine come riferimento e allinearlo a essere coerente con il centro dell'immagine di ioni secondari.
  5. Prima di ogni misurazione, utilizzare un 1 KeV O 2 + fascio (~ 40 nA) per eseguire la scansione sulla finestra SiN con una superficie di 500 x 500 micron 2 per ~ 15 secondi per eliminare la contaminazione superficiale. Inoltre, utilizzare un cannone inondazione elettronico per compensare la carica superficie durante tutte le misure. Utilizzare la funzione automatica della pistola inondazioni nella modalità predefinita per questo passo.
  6. Selezionare la modalità positiva o negativa prima dell'acquisizione dei dati. Utilizzare la keV Bi 3 + trave 25 come il fascio di ioni primario in tutte le misure.
    Nota: La procedura è simile fo acquisizioni di dati positivi e negativi. Per motivi di spazio, la modalità positiva è descritto in dettaglio qui.
    1. profondità Profiling
      1. Eseguire la scansione del fascio + Bi 3 su un'area circolare con un diametro di ~ 2 micron con 32 pixel di risoluzione di 32 pixel.
      2. Per ridurre al minimo il tempo necessario per punch-through la membrana SiN, utilizzare una larghezza di impulso lunga (cioè, 180 nsec, la corrente del fascio ~ 1,0 pA in un tempo di ciclo di 100 msec) Bi 3 + fascio. Le intensità di ioni secondari rappresentante l'aumento superficie del liquido quando viene raggiunto punch-through. Il tempo di punch-through varia da 300 sec a 500 sec, a seconda del lotto di membrana SiN.
        Nota: Questa differenza sembra essere correlato al lotto di membrane SiN acquisite secondo la nostra esperienza. Tuttavia, il tempo di punch-through non influisce realmente l'analisi dei dati.
      3. Dopo la membrana SiN punch-through, mantenere la stessa corrente per circa 200 secondi perottenere dati sufficienti per 2D ricostruzioni di immagini.
      4. Ridurre la larghezza di impulso di 80 nanosecondi per la raccolta dei dati per acquisire gli spettri con una migliore risoluzione di massa. Continuare questa acquisizione per circa altri 200 sec. I dati dello spettro mostrati nella Figura 1 sono ottenuti da questa regione.
    2. 2D Imaging e Mass Spectra
      1. Raccogliere il immagini 2D e dati di spettri di massa, allo stesso tempo quando si misurano i dati di profili di profondità. Lo strumento TOF-SIMS salva tutte le informazioni di ogni spot durante l'esperimento. I dati sono mostrati in diverse finestre (Fpanel - Spectra, Fpanel - Profili e Fpanel - separatamente le immagini) del software di controllo digitale. Controllare i dati in ogni pannello giudiziosamente durante l'acquisizione dei dati.

Analisi 5. TOF-SIMS dati

Nota: L'analisi dei dati è inizialmente effettuata utilizzando il software strumentale IonToF TOF-SIMS.

  1. Aprire l'unasoftware ANALISI DELLA SIMS (Measurement Explorer) e quindi fare clic su "profili ',' pulsanti 'immagine spettri' e ', rispettivamente per elaborare profilo di profondità, m / z spettro, e dati di immagine.
  2. Aprire i file di dati che hanno l'estensione ".ita".
  3. Selezionare i picchi di interesse, digitare il nome della specie nella casella "ioni", e li etichetta con colori diversi in spettri. Utilizzare la rotellina del mouse per trascinare lungo l'asse x. Utilizzare Ctrl e rotella di scorrimento per regolare altezze dei picchi e larghezze. Lettera switch "L" tra le modalità lineari e log lungo l'asse y.
  4. Condurre ricostruzione dei dati prima della calibrazione di massa. Altrimenti, è difficile scegliere la spaziatura tra i picchi in fase di calibrazione di massa.
    1. Selezionare i dati di profondità profiling di interesse e ricostruire gli spettri in base alla profondità serie temporali profilo.
    2. Fare clic sul pulsante di ricostruzione. Nella finestra "Start ricostruzione", digitare un intervallo di scansione di interest. Fai clic su "OK" per ricostruire i dati del profilo di profondità.
  5. Eseguire una calibrazione di massa. Premere il tasto "F3" per aprire la finestra "calibrazione di massa". Scegli i picchi per la calibrazione in base al campione specifico. 21 In questo lavoro, utilizzare i seguenti picchi CH 3 + (m / z 15), H 3 O + (m / z 19), C 2 H 5 + (m / z 29 ), H 5 O 2 + (m / z 37), C 3 H 7 + (m / z 43), H 7 O 3 + (m / z 55), H 9 O 4 + (m / z 71), H 11 O 5 + (m / z 99) e H 13 O 6 + (m / z 109) per il modo positivo. Utilizzare il seguente picchi CH - (m / z 13), O - (m / z 16), OH - (m / z 17), C 2 H - (m / z 25), C 3 H - (m / z 37), e C 4 H - (m / z 49) per il modo negativo.
    1. Selezionare un picco,fare in modo che la freccia verso il basso è puntato verso il picco nell'angolo in basso a sinistra della finestra. Fare clic su tale picco e digitare il nome di picco nella finestra "calibrazione di massa", fai clic su "Aggiungi", e lo ione di interesse è compreso nella calibrazione di massa.
    2. Infine, fare clic sul pulsante "Recalibrate". Controllare se le aree dei picchi sono al posto giusto in base alla loro massa per caricare rapporti. Nel menu "Spectrum", selezionare e fare clic su "Applica calibrazione di massa" a "tutti gli spettri" o "spettri Selected", in base all'analisi specifica condotta.
  6. Come selezione di picco è necessario per l'analisi del campione, determinare picchi caratteristici del campione secondo la letteratura o di altri risultati precedenti. Confrontare l'intensità dei picchi di interesse della m / z spettri. Se necessario, aggiungere nuovi picchi o cancellare i picchi inutili nella lista di picco.
    1. Aggiungi picchi. Fare clic su un picco, trovare le linee rosse nella casella in basso a sinistra. Hold il tasto "Ctrl", scorrere il mouse in senso orizzontale per definire ampiezza del picco, che aggiunge un picco alla lista di picco automaticamente. Un altro modo per aggiungere un picco è quello di selezionare un picco nella finestra principale di spettro, e quindi fare clic sul pulsante "aggiungi picco" sopra la finestra. Se ci sono molti picchi da aggiungere, nel menu "Spectrum", selezionare "picchi di ricerca", verificare le specifiche connessi nella finestra appena aperta, quindi aggiungere i picchi in base alle esigenze.
    2. Per esportare un elenco di picco, nel menu "Peak List", selezionare "Salva ...", la lista di picco nel formato "itmil". Utilizzare i tasti Ctrl e tasto sinistro per trascinare lungo lo spettro. Nella finestra di spettri, selezionare un picco di interesse e trascinare le due linee tratteggiate a posizioni desiderabili.
    3. Per importare un elenco di picco, nel menu "Messa intervallo List", scegliere "Importa ...", individuare un file di elenco di picco esistente con l'estensione ".ITPL". Fai clic su "Apri".
    4. Per utilizzare un "itmil" lista di picco, inil menu "Messa Lista Intervallo", fare clic su "Apri ...", trovare il file, quindi fare clic su "Apri".
  7. Applicare un elenco di picco per analizzare ulteriormente i dati. Al-basso a sinistra della finestra "Spectra", c'è una finestra chiamata "Mass Elenco Interval". L'elenco di picco importato viene mostrato qui.
    1. Fare clic destro sul file di elenco di picco da utilizzare, applicare alla "spettro attivo" o "tutti gli spettri".
  8. Visualizzare i profili di dati. Nella finestra "Profilo", Usa lettera "M" per adattarsi alla finestra (gamma completa) e la lettera "N" per adattarsi al asse y. Utilizzare Ctrl e rotellina di scorrimento per regolare la larghezza del profilo. Oppure utilizzare "/" e "*" sulla tastiera per modificare l'intervallo dell'asse Y e l'altezza.
  9. Esportare i dati per un ulteriore tracciato utilizzando altri software di grafica dopo la prima analisi.
    1. Per esportare un profilo di profondità, nella finestra "profilo", fare clic sul menu "File", quindi selezionare "Export & #34 ;, quindi selezionare "Salva con nome" file ".txt".
    2. Per esportare un file spettro m / z, nella finestra "Spectra", fare clic sul menu "File", quindi selezionare "Export", quindi selezionare "Salva con nome" file ".txt".
    3. Per esportare un file di immagine, nella finestra, stampa schermo "Immagine" e salvare come file immagine.

6. ToF-SIMS dati tracciato e presentazione

Nota: utilizzare uno strumento grafico per tracciare i dati dopo i dati SIMS vengono elaborati utilizzando il software strumentale.

  1. Utilizzare uno strumento grafico per importare i dati.
  2. Fare una trama con il m / z come l'asse delle ascisse e l'intensità di picco come l'asse y per mostrare lo spettro ricostruito. Un esempio è riportato nella figura 1.
  3. Fare un grafico usando il tempo di polverizzazione come l'asse delle ascisse e l'intensità di picco come l'asse y per visualizzare il profilo di profondità serie temporali ricostruito. Un esempio è dato in FiguRE 2.
  4. Combina immagini 2D ricostruite di diversa m / z e formare una matrice per mostrare la mappatura di ioni. Un esempio è riportato nella figura 2.

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Representative Results

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Un paio di risultati rappresentativi sono presentati per dimostrare i vantaggi del protocollo proposto. Utilizzando l'interfaccia microfluidica SALVI, il fascio di ioni primario (Bi 3 +) può bombardare direttamente sul film fibronectina idratato in acqua deionizzata. Così la mappatura chimica molecolare della superficie del liquido può essere acquisito correttamente.

Figura 1a e 1b mostrano gli spettri di massa ToF-SIMS positivo dell'acqua pellicola fibronectina e DI idratata, rispettivamente. I picchi di interesse tra cui cluster d'acqua (cioè, m / z 19, 37, 55, 73, 91 e 109) frammenti e amino acidi (vale a dire, m / z 30, 44, 61, 74, 81, 83, e 98) sono indicati dalle frecce rosse. Oltre ai picchi caratteristici di frammenti di amminoacidi, che sono stati ampiamente riportati utilizzando campioni di proteine ​​secche, i picchi di cluster acqua si osservano nelspettri di massa di film di fibronectina idratato in acqua deionizzata. Inoltre, le intensità di questi picchi di cluster acqua sono molto diversi da quelli del spettri di massa di acqua deionizzata. Questo risultato fornisce la prova diretta della proprietà delle molecole d'acqua circostanti e all'interno delle molecole proteiche idrati che svolgono un ruolo nella loro adsorbimento su una superficie.

La figura 2a mostra la serie storica profilo di profondità del film fibronectina idratata e acqua deionizzata. Quando il campione è sotto la membrana peccato, le intensità di seconde ioni selezionati sono trascurabili prima membrana peccato è perforato attraverso (ad esempio, 280 sec per fibronectina e 340 secondi per l'acqua DI). Una volta che la membrana SiN è perforato attraverso, le intensità di questi ioni secondari aumentano significativamente. Quando si utilizza la larghezza di impulso lunga, la risoluzione di massa è relativamente basso. Pertanto, il processo breve larghezza di impulso viene utilizzato per ottenere dati con una migliore risoluzione di massaper l'immagine e spettro ricostruzioni come evidenziato in figura 2a. Dopo un periodo di tempo (ad esempio, 60 sec per fibronectina e 220 ​​sec per acqua DI), l'ampiezza dell'impulso ridotta viene utilizzato per ottenere m / z spettri con una migliore risoluzione di massa. Gli ultimi m / z spettri sono stati ricostruiti da 200 misurazioni sec evidenziato in verde aree ombreggiate nella serie temporale profilo di profondità. La figura 2b mostra le immagini 2D del film fibronectina idratata e acqua deionizzata, che corrispondono al verde area ombreggiata nella figura 2a. Queste immagini 2D rappresentano i conti di ioni secondari selezionati dal campione: più luminosa è l'immagine, più alto è il numero di ioni secondari. Tali immagini intuitive danno una chiara confronto di ioni secondari selezionati tra i diversi campioni, che è utile per l'analisi dei dati. Secondo le nostre esperienze, la differenza di SiN tempo punch-through varia da lotto a lotto delle membrane peccato. Tuttavia, esso non influenza la risultati della dinamica analisi ToF-SIMS.

Figura 1
Figura 1: I confronti degli spettri positiva ToF-SIMS del film fibronectina idratata e acqua deionizzata nel microcanale SALVI (a) Il ricostruito m / z spettro della fibronectina.. (B) Lo spettro acqua deionizzata.

figura 2
Figura 2:. Profili di profondità e le immagini 2D di fibronectina idratati e acqua deionizzata (a) La profondità dei profili serie storiche di fibronectina e acqua deionizzata in modalità positiva. (B) immagini 2D ricostruite corrispondente al verde ombreggiata 200 segmenti temporali sec lungo la serie temporale profilo di profondità in (a). Diversi di massa caratteristica per caricare rapporti di rilevanza ai cluster d'acqua(Ad esempio, m / z 1, 19, 37, 55) sono riportati, oltre a noti frammenti di amminoacidi (ad esempio, m / z 30, 83, 98). Si prega di cliccare qui per vedere una versione più grande di questa figura.

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Discussion

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SALVI è un'interfaccia microfluidico che consente superficie del liquido dinamico e analisi interfaccia liquido-solido da strumenti vuoto based, come ToF-SIMS e microscopia elettronica a scansione (SEM). A causa l'utilizzo di piccole aperture per esporre il liquido direttamente nel vuoto, SALVI è adatto per molte spettroscopia e di imaging tecniche finemente focalizzato, senza alcuna modifica; 22 la portabilità e la versatilità di microfluidica ne fanno una vera e propria piattaforma di imaging multimodale. Caratteristiche distinte e il significato di SALVI rispetto ad altre tecniche esistenti sono riassunti in diverse recensioni recenti. 22-25 Come lo sviluppatore della tecnologia SALVI, il nostro gruppo ha applicato attivamente a una serie di studi che coinvolgono superfici liquide dinamici e interfacce liquido-solido . Alcuni esempi di nuove applicazioni includono membrane cellulari di mammiferi, batteri allegato biofilm, 15,16 o formazione di nanoparticelle come risultato di ossidazioni superficiali acquose. In questo paper, vi presentiamo i risultati iniziali liquido TOF-SIMS del idratato proteina film sottile adsorbito sulla superficie peccato.

E 'abbastanza fondamentale per gestire con attenzione i passi evidenziati nel protocollo. Ad esempio, quando si disegna il liquido nella siringa nei passaggi 1 e 2, assicurarsi che non ci siano bolle all'interno della siringa. Perché una volta che le bolle sono iniettati nel SALVI, possono indurre perdita nel vuoto. 9 Così, se si rispettano tutte le bolle, è prudente sbarazzarsi di loro impostando la siringa in posizione verticale e spingendo delicatamente le bolle fuori. Inoltre, è molto importante per rendere la finestra peccato SALVI appartamento in ottimizzato analisi ToF-SIMS, come descritto nel passaggio 3. Questa planarità della superficie di rilevamento influisce direttamente sulla qualità dei dati secondo il disegno del ToF-SIMS. 26 Ne è necessario ispezionare visivamente il dispositivo dopo essersi assicurato tutto sul palco SIMS. Se la finestra il peccato non è orizzontale, regolare le viti e cambiare l'altezzadel dispositivo SALVI per assicurare che tutto è allo stesso piano per quanto possibile. Questi punti delicati necessitano esperienza e attenzione, che determinano il successo e affidabilità dell'intero esperimento.

Come mostrato in Figura 1b, i picchi con m / z 19, 37, 55, 73, 91 e 109 hanno grandi conteggi. Questo indica che ci sono un buon numero di cluster d'acqua (H 3 O +, H 5 O 2 +, H 7 O 3 +, H 9 O 4 +, H 11 O 5 + e H 13 O 6 +) in positivo ioni secondari. Gli altri cluster acqua (dati non riportati) con più elevati valori m / z hanno anche picchi relativamente forte rispetto ai loro picchi vicini. Queste grandi quantità di grappoli d'acqua sono emessi dalla superficie dell'acqua DI dopo il peccato punch-through. segnali di cluster acqua in modalità positiva non sono osservabili nel precedente work; e questo è stato attribuito alle bassa conta di ioni secondari e non ottimizzato ToF-SIMS condizioni in passato. 8 Con lo sforzo continuo per ottimizzare le condizioni di acquisizione Salvi e TOF-SIMS, come il fascio di ioni primario (vale a dire, Bi + vs . Bi 3 +), la larghezza di impulso e corrente durante profili di profondità, è ora possibile osservare fino a 44 cluster acqua in modalità positiva utilizzando le condizioni presentate in questo documento. I risultati qui riportati sono promettenti per indagare ulteriormente il ruolo dell'acqua nella dinamica di varie molecole biologiche e sistemi biologici.

Ecco come un esempio per illustrare i vantaggi di Salvi e ToF-SIMS nello studio di dinamica molecolare biologici, l'idratazione di proteine ​​fibronectina è stato presentato. I picchi di m / z 30, 44, 61, 74, 81, 83, e 98 appartengono ai frammenti di amminoacidi secondo il rapporto precedente, 27,28, che sono molto più forti di quelli di DI water mostrato in Figura 1b. Questa differenza di maggiore intensità dei frammenti di amminoacidi nel campione fibronectina suggerisce che questi ioni secondari sono infatti dalle proteine ​​stesse. Inoltre, i picchi di cluster acqua in Figura 1a sono molto più forti di quelli di acqua deionizzata in Figura 1b, il che implica che le proprietà di molecole d'acqua sulla superficie della proteina adsorbimento e soluzione interfacciale potrebbero essere molto diversi da quelli in acqua pura.

La figura 2a mostra rappresentante profili di profondità serie temporale dei due campioni diversi: fibronectina e acqua deionizzata nel microcanali SALVI. I dati di profilo di profondità sono stati raccolti come la finestra SiN veniva bombardato da + primario fascio ionico Bi 3 con la larghezza di impulso lunga. Come si vede nella figura 2a, la finestra di SiN è perforato attraverso a circa 300 sec. Prima che la finestra di peccato nel SALVI è perforato through, le intensità di ioni secondari selezionati sono piuttosto bassi. Una volta che la finestra SiN è perforato attraverso, le intensità degli ioni secondari aumentano immediatamente come la superficie del liquido inizia bombardati dal fascio di ioni primario. Ad esempio, le intensità di H + e H 3 O + mostrano un forte aumento, indicando l'osservazione della superficie dell'acqua. 8,9 Sebbene le intensità sono proprio instabile dopo il punch-through o all'interfaccia, possono raggiungere relativamente stabile valori dopo un periodo di tempo (ad esempio, 60 sec per fibronectina e 220 ​​sec per acqua deionizzata, rispettivamente, nella figura 2a). La differenza nel lungo larghezza di impulso foratura realtà non influenza i risultati delle analisi qui illustrati nel ricostruire m / z spettri (ad esempio, figura 1), in quanto le effettive m / z spettri vengono acquisiti dopo la SiN punch-through. Tuttavia, un ricercatore può scegliere di utilizzare le stesse condizioni per tutti i campioni FOR coerenza e la facilità nella scelta di sezioni di dati durante l'analisi dei dati. Al fine di ottenere una migliore risoluzione di massa, l'ampiezza dell'impulso è stato successivamente ridotto e le intensità sono diminuiti conseguenza nell'ultima parte dell'esperimento profili di profondità. Le serie temporali profilo di profondità sono stati continuamente raccolti per altri 200 secondi per fornire ampi di dati per m / z analisi spettrale. I segmenti di tempo che m / z spettri sono stati ricostruiti sono evidenziate in verde ombreggiato.

Fibronectina è stato ampiamente utilizzato per adsorbimento superficie prima di coltura cellulare; molti studi hanno dimostrato fibronectina è responsabile per l'adesione cellulare e le interazioni cellula-biomateriale. 19,20,29 Un recente studio ha caratterizzato lo spessore della fibronectina adsorbito su poli (metacrilato) hydroxylethyl spazzole usando ellissometria. Il film sottile fibronectina è stata determinata da 3-12 nm di spessore. 30 Tale spessore è ragionevole per l'analisi approfondita dei profili in una solu acquosazione. 8,9 Con lo sviluppo di SALVI, analisi diretta della proteina idratata adsorbito sulla superficie solida è ora possibile. Questo approccio potenzialmente può avere ampie applicazioni in studio delle interazioni tra proteine ​​con superfici solide in modo dinamico.

Figura 2b mostra le immagini 2D selezionate di diversi ioni secondari da campioni fibronectina e acqua deionizzata, rispettivamente. Immagini 2D sono ottenute dai profili di profondità dati temporali verdi aree ombreggiate nella Figura 2a, che corrispondono alla superficie del liquido dopo la SiN punch-through come descritto in precedenza. Le immagini di ioni secondari selezionati aminoacidi frammento di acido CH 4 N +, C 5 H 7 O + e C 4 H 4 NO 2 + (vale a dire, m / z 30, 83 e 98) per il film sottile fibronectina erano molto più luminoso di quelli per acqua deionizzata. Ciò indica che gli ioni secondari amino acido frammenti sono osservate fROM le molecole fibronectina all'interno del diaframma di diametro 2 micron. Inoltre, le immagini di picchi selezionate (ad esempio, m / z 1, 19, 37, e 55), corrispondenti a diversi cluster acqua di fibronectina sono notevolmente maggiori di quelli acqua deionizzata. Questo risultato dimostra che l'idratazione della fibronectina rende le molecole d'acqua che circondano la biomolecola distinta dalle molecole d'acqua in acqua DI.

In sintesi, questo lavoro ha fornito prove che colpisce sulla proteina dell'acqua di idratazione indotto alterazioni proprietà molecola. Tali risultati potrebbero fornire una migliore comprensione fondamentale sulla struttura, conformazione e l'attività biologica di proteine ​​adsorbite su una superficie solida nel microambiente liquido.

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
ToF-SIMS IONTOF TOF.SIMS 5 Resolution: >10,000 m/Δm for mass resolution; >4,000 m/Δm for high spatial resolution 
System for Analysis at the Liquid Vacuum Interface (SALVI) Pacific Northwest National Laboratory N/A SALVI is a unique, self-contained, portable analytical tool that, for the first time, enables vacuum-based scientific instruments such as time-of-flight secondary ion mass spectrometry (ToF-SIMS) to analyze liquid surfaces in their natural state at the molecular level.
PEEK Union Valco ZU1TPK for connecting the inlet and outlet of SALVI
5 Axes Sample Stage IONTOF N/A Stage is self-made for mounting SALVI in ToF-SIMS
Barnstead Nanopure Water Purification System Thermo Fisher Scientific D11921 ROpure LP Reverse Osmosis filtration module (D2716)
Syringe BD 309659 1 ml
Pipette Thermo Fisher Scientific 21-377-821 Range: 100 to 1,000 ml
Pipette Tip Neptune 2112.96.BS 1,000 µl
Centrifuge Tube Corning 430791 15 ml
Fibronectin Sigma-Aldrich F1141 1 mg/ml
Ethanol Thermo Fisher Scientific S25310A 95% Denatured
Gibco PBS Thermo Fisher Scientific 10010-023 pH 7.4

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<em>In Situ</em> Caratterizzazione di idrate proteine ​​in acqua da Salvi e TOF-SIMS
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Yu, J., Zhou, Y., Hua, X., Zhu, Z., Yu, X. Y. In Situ Characterization of Hydrated Proteins in Water by SALVI and ToF-SIMS. J. Vis. Exp. (108), e53708, doi:10.3791/53708 (2016).More

Yu, J., Zhou, Y., Hua, X., Zhu, Z., Yu, X. Y. In Situ Characterization of Hydrated Proteins in Water by SALVI and ToF-SIMS. J. Vis. Exp. (108), e53708, doi:10.3791/53708 (2016).

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