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Chemistry

In-situ-Charakterisierung von Hydrated Proteine ​​in Wasser durch SALVI und TOF-SIMS

doi: 10.3791/53708 Published: February 15, 2016
* These authors contributed equally

Summary

Diese Arbeit stellt ein Protokoll für die Flüssigkeitshandhabung und Probenaufgabe zu einem Mikrokanal zur in situ-Time-of-Flight-Sekundärionen-Massenspektrometrie-Analyse von Protein Biomolekülen in einer wässrigen Lösung.

Abstract

Diese Arbeit zeigt, in-situ-Charakterisierung von Protein Biomolekülen in der wässrigen Lösung in dem Liquid Vacuum-Schnittstelle des Systems für die Analyse unter Verwendung von (SALVI) und Time-of-Flight-Sekundärionenmassenspektrometrie (TOF-SIMS). Die Fibronektin Proteinfilm wurde auf dem Siliziumnitrid (SiN), die die Membran immobilisiert SALVI Erfassungsbereich bildet. Während ToF-SIMS-Analyse wurden drei Arten der Analyse durchgeführt, einschließlich hoher räumlicher Auflösung Massenspektrometrie, zweidimensionale (2D) Bildgebung und Tiefenprofilierung. Massenspektren wurden im positiven und negativen Modus erworben. Entionisiertes Wasser wurde als Referenzprobe analysiert. Unsere Ergebnisse zeigen, dass die Fibronektin Film in Wasser hat deutlicher und stärker Spitzen Wassercluster zu Wasser allein verglichen. Charakteristische Peaks von Aminosäure-Fragmente sind ebenfalls zu beobachten in der hydratisierten Protein TOF-SIMS-Spektren. Diese Ergebnisse zeigen, dass Proteinmolekül Adsorption an einer Oberfläche dynamica sucht werden könnenlly Verwendung SALVI und ToF-SIMS in der flüssigen Umgebung zum ersten Mal.

Introduction

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Hydratation ist entscheidend für die Struktur, Konformation 1, 2 und 3 der biologischen Aktivität von Proteinen. Proteine ​​ohne Wassermoleküle um sie herum wäre nicht lebensfähig biologischen Aktivitäten haben. Genauer gesagt, interagieren Wassermoleküle mit der Oberfläche und die innere Struktur von Proteinen und verschiedenen Hydratationszustände von Proteinen machen solche Wechselwirkungen deutlich. 4 Die Wechselwirkung von Proteinen mit festen Oberflächen ist ein grundlegendes Phänomen mit Auswirkungen im Bereich der Nanotechnologie, Biomaterialien und Prozesse Tissue Engineering. Studien haben darauf hingewiesen, dass lange Konformationsänderungen eintreten können als ein Protein mit einer Oberfläche trifft. ToF-SIMS wurde als ein Verfahren, vorgesehen, dass das Potenzial, die Protein-fest-Grenzfläche zu untersuchen hat. 5-7 ist es wichtig, die Hydratation von Proteinen auf festen Oberflächen zu verstehen, die möglicherweise ein grundlegendes Verständnis des Mechanismus ihrer Struktur liefert, Konformation und biologischeal Aktivität.

Allerdings sind große Oberflächenanalysetechniken meistens vakuumbasierten und direkte Anwendungen für flüchtige Flüssigkeit Studien sind schwierig aufgrund der raschen Verdampfung der flüchtigen Flüssigkeit unter der Vakuumumgebung. Wir entwickelten ein Vakuum kompatibel mikrofluidische Schnittstelle, System zur Analyse auf dem Liquid Vacuum Interface (SALVI), direkte Beobachtungen von Flüssigkeitsoberflächen und Flüssig-Fest-Interaktionen zu ermöglichen mit Time-of-Flight-Sekundärionenmassenspektrometrie (TOF-SIMS). 8- 11 die einzigartigen Aspekte schließen die folgenden ein: 1) das Detektionsfenster eine Öffnung von 2-3 um im Durchmesser direkte Abbildung der Flüssigkeitsoberfläche ermöglicht, 2) Oberflächenspannung wird die Flüssigkeit in der Öffnung zu halten, und 3) ist SALVI tragbaren zwischen mehreren Analyseplattformen. 11,12

SALVI besteht aus einem Siliziumnitrid (SiN) Membran als dem Erfassungsbereich und einem Mikrokanal aus Polydimethylsiloxan (PDMS). Es ist fabrcated im Reinraum, und die Herstellung und die wichtigsten Designfaktoren wurden in früheren Veröffentlichungen und Patenten ausführlich dargestellt. 8-12 Die Anwendungen der TOF-SIMS als analytisches Werkzeug wurden gezeigt, eine Vielzahl von wässrigen Lösungen und komplexen Flüssigkeitsmischungen verwenden, einige der die Nanopartikel enthalten. 13-17 Insbesondere SALVI Flüssigkeit TOF-SIMS ermöglicht der flüssig-Fest-Grenzfläche von lebenden biologischen Systemen Rammsondierung (dh Biofilme), Einzelzellen und Festelektrolyt-Schnittstelle, für neue Möglichkeiten öffnen in situ kondensierten Phase Studien einschließlich Flüssigkeiten TOF-SIMS verwenden. Allerdings ist der aktuelle Entwurf noch nicht Gas-Flüssigkeits-Interaktionen ermöglichen. Dies ist eine Richtung für die zukünftige Entwicklung. SALVI wurde verwendet, um den hydratisierten Proteinfilm in dieser Arbeit zum ersten Mal zu studieren.

Fibronectin ist ein häufig verwendetes Protein-Dimer, bestehend aus zwei nahezu identischen Monomeren durch ein Paar Disulfidbindungen verbunden sind, 18, ​​die is für seine Fähigkeit, bekannte Zellen zu binden. 19,20 Sie als Modellsystem ausgewählt wurde zu veranschaulichen, dass die hydrierten Proteinfilm dynamisch die SALVI Flüssigkeit mit TOF-SIMS Ansatz untersucht werden konnte. Die Proteinlösung wurde in den Mikrokanal eingeführt. Nach Inkubation für 12 Stunden, ein hydratisiertes Proteinfilm auf der Rückseite des SiN-Membran gebildet. Deionisiertes Wasser (DI) wurde verwendet, um den Kanal nach der Protein Einführung abzuspülen. Die Informationen wurden in der SALVI Mikrokanal mit dynamischen TOF-SIMS aus hydrierten Fibronektin Proteinmolekülen gesammelt. DI-Wasser wurde ebenfalls als Kontrolle untersucht mit den Ergebnissen aus hydrierten Fibronektin Dünnschicht erhalten zu vergleichen. Deutliche Unterschiede zwischen dem hydratisierten Proteinfilm und DI-Wasser beobachtet. Diese Arbeit zeigt, dass die Proteinadsorption an der Oberfläche in der flüssigen Umgebung können mit dem neuartigen SALVI und Flüssigkeit TOF-SIMS Ansatz untersucht werden. Die Video-Protokoll ist für den Menschen eine technische Anleitung zur Verfügung zu stellen, die daran interessiert sindin diese neue Analysewerkzeug für vielfältige Anwendungen von SALVI mit TOF-SIMS zu nutzen und unnötige Fehler in Liquid Handling sowie TOF-SIMS Datenerfassung und -analyse zu reduzieren.

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Protocol

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1. Reinigung und Sterilisation des SALVI Microchannel

  1. Sterilisation des Mikrokanals in SALVI
    1. Unentschieden 2 ml 70% Ethanol wässrigen Lösung in eine Spritze, verbinden Sie die Spritze mit dem Einlassende von SALVI, und spritzen langsam 1 ml der Flüssigkeit in 10 Minuten. Entfernen Sie die Spritze am Ende der Injektion. Als nächstes den Einlass und Auslass von SALVI ein Polyetheretherketon (PEEK) Vereinigung anschließen werden. Alternativ können Sie eine Spritzenpumpe die gleiche Prozedur durchzuführen. Sie können beispielsweise die Strömungsgeschwindigkeit bei 100 & mgr; l / min.
    2. Halten Sie die SALVI Mikrokanal gefüllt mit 70% Ethanol-Lösung bei Raumtemperatur für 4 Stunden.
  2. Einführung Entionisiertes (DI) Wasser in SALVI
    1. Unentschieden 2 ml sterilisiertem VE-Wasser in eine Spritze, verbinden Sie die Spritze mit dem Einlass von SALVI, und spritzen langsam 1 ml der Flüssigkeit in 10 Minuten. Entfernen Sie die Spritze, und verbinden Sie den Eingang und Ausgang von SALVI einer PEEK-Vereinigung mit. Alternativ können Sie eine Spritzenpumpe wie erwähnt inSchritt 1.1.1.

2. Immobilisierung des Proteins Film in SALVI

  1. Immobilisierung der Proteinfilm in SALVI
    1. Unentschieden 2 ml Fibronektin (10 ug / ml in phosphatgepufferter Kochsalzlösung, PBS) Lösung in eine Spritze, verbinden Sie die Spritze mit dem Einlass von SALVI, spritzen langsam 1 ml der Flüssigkeit in 10 Minuten, entfernen Sie die Spritze, und verbinden Sie den Einlass und Ausgang des SALVI mit einer PEEK-Vereinigung.
    2. Inkubation des SALVI mit der Fibronektin-Lösung in einem sauberen Kulturschale gefüllt, für 12 Stunden das Gericht in die Haube bei Raumtemperatur halten.
    3. Unentschieden 2 ml sterilisiertem VE-Wasser in eine Spritze und verbinden Sie die Spritze mit dem Einlass von SALVI. spritzen langsam 1 ml Wasser in 10 Minuten, entfernen Sie die Spritze, und verbinden Sie den Eingang und Ausgang von SALVI.
      Hinweis: Wenn mit einem Lichtmikroskop ausgestattet, unter dem Mikroskop die SALVI überprüfen, um sicherzustellen, dass der SiN-Membran vor ToF-SIMS-Analyse intakt ist. Nun ist die SALVI Gerät ist bereit für TOF-SIMS einalysis.

3. Installieren SALVI in der TOF-SIMS Schleusenkammer

Hinweis: Schutzhandschuhe sollten jederzeit getragen werden, wenn das Gerät SALVI Handhabung und auf die TOF-SIMS Phase der Installation von potentiellen Verunreinigungen während der Oberflächenanalyse zu vermeiden.

  1. Berg SALVI auf die Bühne
    1. Legen Sie die TOF-SIMS Bühne auf eine ebene und saubere Fläche. Setzen Sie den SALVI Gerät auf die Bühne mit der Silizium-Wafer und SiN-Membran nach oben. Befestigen Sie die SALVI mit vier Metallklemmstücke und schrauben Sie die Metallteile der Ecke des Geräts in die Metallplatte mit vier Schrauben halten.
    2. aufrollen vorsichtig die PTFE-Schlauch an den mikrofluidischen Kanal verbunden. Verwenden Sie vier Metallstücke und vier Schrauben, die das steife Teil zu halten. Stellen Sie sicher, dass das Gerät in dem freien Platz auf dem SIMS Stufe so positioniert ist, dass es nicht mit dem primären Ionenstrahl während der Analyse nicht stört. Zusätzliche Bild und Darstellung der SALVI fabricatIon und Installation sind in früheren Veröffentlichungen zur Verfügung. 8,9,11
  2. Montieren Sie den Faraday-Cup auf die Bühne
    1. Befestigen Sie den Faraday-Cup auf der Bühne mit einer Schraube.
  3. Laden Sie die Bühne in die TOF-SIMS Schleusenkammer
    1. Öffnen Sie die TOF-SIMS Schleusen, halten und die Bühne horizontal auf der Ladefläche, und schließen Sie die Schleusentür.

4. TOF-SIMS Datenerfassung

  1. Einschalten der Vakuumpumpe und sicherzustellen geeignetes Vakuum (beispielsweise in der Größenordnung von 10 -6 mbar oder Torr) in der Ladeschleusenkammer erreicht.
  2. Bewegen Sie den SALVI in die Hauptkammer, sobald das Vakuum nach etwa 30 min stabilisiert.
    Hinweis: Das Vakuum sollte niedriger sein als 5 x 10 -6 mbar Vakuum in der Hauptkammer während der Datenerfassung. Ansonsten ist höheres Vakuum eines Lecks in dem System SALVI indikativ.
  3. Stellen Sie den Primärionenstrahl und Analysator von TOF-SIMS mit einräumliche Auflösung von etwa 400 nm gemäß den Herstellerempfehlungen. Der Strom des Primärstrahls ist 1.200 pA, während die Zykluszeit von 30 Mikrosekunden unter DC-Modus befindet.
    Hinweis: Dieser Vorgang weitgehend folgt Empfehlungen des Herstellers.
  4. Finden Sie den mikrofluidischen Kanal des optischen Mikroskop. Verwenden Sie die optische Bildmitte als Referenz und richten Sie sie an der Sekundärionen-Bildmitte, konsequent zu sein.
  5. Vor jeder Messung verwenden, um eine 1 keV O 2 + Strahl (~ 40 nA) auf dem SiN-Fenster mit einem 500 x 500 & mgr; m 2 Fläche zu scannen für ~ 15 sec Oberflächenverunreinigungen zu entfernen. Verwenden Sie außerdem eine Elektronenflutkanone Oberfläche Aufladung bei allen Messungen zu kompensieren. Verwenden Sie die automatische Funktion des Hochwasserpistole in den Standardmodus für diesen Schritt.
  6. Wählen positiven oder negativen Modus, bevor die Datenerfassung. Verwenden Sie die 25 keV Bi 3 + Strahl als primäre Ionenstrahl in alle Messungen.
    Hinweis: Die Schritte sind ähnlich foder positive und negative Datenerfassungen. Für das Interesse der Raum wird die positive Modus im Detail beschrieben.
    1. Tiefenprofilierung
      1. Scannen Sie den Bi 3 + Strahl auf eine runde Fläche mit einem Durchmesser von ca. 2 & mgr; m mit 32 Pixeln mal 32 Pixeln Auflösung.
      2. Um die Zeit zu minimieren, die erforderlich zum Durchgriff der SiN-Membran, mit einem langen Impulsbreite (dh 180 nsec, Strahlstrom ~ 1,0 Pa bei einer Zykluszeit von 100 & mgr; s) Bi 3 + Strahl. Die Intensitäten von sekundären Ionen repräsentativ von der Flüssigkeitsoberfläche erhöhen, wenn Durchgriff erreicht wird. Die Punch-Through Zeit variiert von 300 sec bis 500 sec, je nach Charge des SiN-Membran.
        Anmerkung: Dieser Unterschied in den Ansatz von SiN Membranen verwandt zu sein scheint erworben nach unseren Erfahrungen. Allerdings ist die Punch-Through-Zeit nicht wirklich die Datenanalyse beeinflussen.
      3. Nach dem SiN Membrandurchgriff, halten Sie das gleiche für etwa 200 sec Strom zugenügend Daten für 2D-Bildrekonstruktionen erhalten.
      4. Reduzieren Sie die Impulsbreite auf 80 ns für Sammlungsdaten Spektren mit einer besseren Massenauflösung zu erwerben. Setzen Sie diese Akquisition noch etwa 200 Sekunden. Die Spektraldaten in 1 gezeigt werden aus diesem Bereich erhalten.
    2. 2D-Imaging und Massenspektren
      1. Sammeln Sie die 2D-Bildgebung und Massenspektren Daten zur gleichen Zeit, als die Tiefenprofilmessdaten. Die TOF-SIMS Gerät speichert alle Daten von jedem Punkt während des Experiments. (- Spectra, FPanel - FPanel Profile und FPanel - Bilder separat) Die Daten werden in verschiedenen Fenstern angezeigt des digitalen Steuerungssoftware. Prüfen Sie Daten in jedem Feld umsichtig bei der Datenerfassung.

5. TOF-SIMS Datenanalyse

Hinweis: Die Datenanalyse zunächst ausgeführt, um die IonToF TOF-SIMS instrumental Software.

  1. Öffnen Sie die einealysis Software von SIMS (Messung Explorer) und klicken Sie dann auf die "Profile", "Spektrum" und "Bild" Tasten bzw. Tiefenprofil, m / z-Spektrum, und Bilddaten zu verarbeiten.
  2. Öffnen Sie die Dateien, die die Erweiterung ".ita" haben.
  3. Wählen Sie Spitzen von Interesse, geben Sie den Artnamen in "Ion" ein, und beschriften Sie sie mit verschiedenen Farben in den Spektren. Verwenden Sie das Mausrad auf der x-Achse zu ziehen. Mit Strg und Scroll-Rad-Spitze Höhen und Breiten anzupassen. Buchstabe "L" wird zwischen Linear- und Log-Modi auf der y-Achse.
  4. Führen Datenrekonstruktion vor Massenkalibrierung. Ansonsten ist es schwierig, den Abstand zwischen den Peaks im Massenkalibrierungsschritt zu wählen.
    1. Wählen Sie die Tiefenprofildaten von Interesse und rekonstruieren die Spektren nach dem Tiefenprofil Zeitreihe.
    2. Klicken Sie auf die Rekonstruktion Taste. In der "Start Wiederaufbau" -Fenster, geben Sie einen Scanbereich von interest. Klicken Sie auf "OK", um die Tiefenprofil Daten rekonstruieren.
  5. Führen Sie eine Massenkalibrierung. Drücken Sie "F3", um den "Massenkalibrierung" -Fenster. Wählen Sie Spitzen für die Kalibrierung auf der Basis der spezifischen Probe. 21 In dieser Arbeit, die folgenden Spitzen CH 3 + (m / z 15), H 3 O + (m / z 19), C 2 H 5 + (m / z 29 ), H 5 O 2 + (m / z 37), C 3 H 7 + (m / z 43), H 7 O 3 + (m / z 55), H 9 O 4 + (m / z 71), 11 H O 5 + (m / z 99) und H 13 O 6 + (m / z 109) für die positive Betriebsart. Verwenden Sie die folgenden Peaks CH - (m / z 13), O - (m / z 16), OH - (m / z 17), C 2 H - (m / z 25), C 3 H - (m / z 37), und C 4 H - (m / z 49) für die negative Betriebsart.
    1. Wählen Sie eine Spitze,stellen Sie sicher, dass der Pfeil nach unten ist auf dem Höhepunkt in der linken unteren Ecke des Fensters zeigte. Klicken Sie auf diesen Höhepunkt und geben Sie den Spitzennamen in der "Massenkalibrierung" Fenster, klicken Sie auf "Hinzufügen", und das Ion von Interesse ist in der Massenkalibrierung enthalten.
    2. Klicken Sie abschließend auf die Schaltfläche "Recalibrate". Überprüfen Sie, ob die Flächen der Peaks in den richtigen Stellen sind nach ihrem Masse-Ladungs-Verhältnissen. In der "Spectrum" -Menü und klicken Sie auf "Übernehmen Massenkalibrierung" auf "All Spectra" oder "Ausgewählte Spektren", auf die spezifische Analyse je durchgeführt.
  6. Als Höhepunkt Auswahl für die Probenanalyse erforderlich ist, der Literatur oder anderen bisherigen Erkenntnissen nach charakteristischen Peaks der Probe bestimmen. Vergleichen Sie die Intensität der Peaks von Interesse in der m / z-Spektren. Falls erforderlich, neue Spitzen oder löschen nutzlos Spitzen in der Peak-Liste.
    1. In Spitzen. Klicken Sie auf eine Spitze, die roten Linien in der linken unteren Fenster finden. Hold die "Strg" -Taste, bewegen Maus horizontal Peakbreite zu definieren, die automatisch einen Peak, der dem Peak-Liste hinzufügt. Eine weitere Möglichkeit, einen Höhepunkt hinzuzufügen, ist ein Höhepunkt in der Haupt Spektrum Fenster auszuwählen, und dann auf "Hinzufügen peak" zu klicken über dem Fenster. Wenn es viele Spitzen an, in der "Spectrum" Menü sind, wählen Sie "Suche Spitzen", überprüfen bezogenen Spezifikationen in dem sich öffnenden Fenster, dann Spitzen nach Bedarf hinzufügen.
    2. Um eine Peak-Liste exportieren, in der "Peak-Liste" Menü wählen Sie "Speichern unter ...", um die Peak-Liste im "itmil" -Format. Verwenden Sie die Strg-Taste und linke Taste auf dem Spektrum zu ziehen. In den Spektren Fenster, wählen Sie einen Höchststand von Interesse und ziehen Sie die beiden gestrichelten Linien, um wünschenswerte Positionen.
    3. Um eine Peak-Liste zu importieren, in der "Mass Intervall-Liste" Wählen Sie im Menü "Import ...", suchen Sie eine bestehende Spitzenlistendatei mit der Dateiendung ".ITPL". Klicken Sie auf "Öffnen".
    4. eine "itmil" Peak-Liste zu verwenden,die "Mass Intervall List" Menü klicken Sie auf "Öffnen ...", um die Datei zu finden, dann auf "Öffnen" klicken.
  7. Tragen Sie eine Peak-Liste zur weiteren Daten zu analysieren. Am linken unteren Teil "Spectra" -Fenster, gibt es ein Fenster "Mass Interval Liste" genannt. Das importierte Spitzen Liste ist hier aufgetaucht.
    1. Rechtsklick auf die Peak-Liste-Datei verwendet werden soll, wenden sie auf die "aktive Spektrum" oder "alle Spektren".
  8. Sehen Sie sich die Datenprofile. Im "Profil" Fenster, Nutzung Buchstaben "M" auf Fenster (Vollbereich) und der Buchstabe "N" zu passen zu der y-Achse zu passen. Mit Strg und Scrollrad das Profil Breite anzupassen. Oder nutzen Sie "/" und "*" auf der Tastatur die Y-Achsenbereich und Höhe zu ändern.
  9. Datenexport für die weiter nach der ersten Analyse mit anderen Grafik-Software plant.
    1. Um ein Tiefenprofil, in dem "Profil" Fenster exportieren, klicken Sie auf das Menü "Datei" und dann "Export & #34 ;, und wählen Sie dann "Speichern unter" einem ".txt" -Datei.
    2. So exportieren einen m / z-Spektrum-Datei, in der "Spectra" Fenster, klicken Sie auf das Menü "Datei" und dann "Export" und wählen Sie "Speichern unter" einem ".txt" -Datei.
    3. eine Bilddatei, in der "Bild" Fenster, Print Screen und speichern wie die Bilddatei zu exportieren.

6. TOF-SIMS Daten Plotten und Präsentation

Hinweis: Verwenden Sie eine grafische Werkzeug, um die Daten zu zeichnen, nachdem die SIMS Daten verarbeitet werden, die instrumental-Software.

  1. Verwenden Sie ein Grafik-Tool die Daten zu importieren.
  2. Machen Sie einen Plan mit dem m / z als der x-Achse und Spitzenintensität als der y-Achse des rekonstruierten Spektrums zu zeigen. Ein Beispiel ist in Abbildung 1 wiedergegeben.
  3. Machen Sie einen Plan mit der Sputter-Zeit wie die x-Achse und Spitzenintensität als der y-Achse des rekonstruierten Tiefenprofil zeitliche Serie zu zeigen. Ein Beispiel ist gegeben in FiguRE 2.
  4. Kombinieren Sie rekonstruierten 2D-Bilder von verschiedenen m / z und bilden eine Matrix, die die Ionen-Mapping zu zeigen. Ein Beispiel ist in Abbildung 2 wiedergegeben.

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Representative Results

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Einige repräsentative Ergebnisse sind die Vorteile des vorgeschlagenen Protokolls zu demonstrieren. Durch die Verwendung der Mikrofluid-SALVI Schnittstelle der Primärionenstrahl (Bi 3 +) auf dem hydratisierten Film Fibronektin in DI Wasser direkt bombardieren. So ist die molekulare chemische Kartierung der Flüssigkeitsoberfläche erfolgreich erworben werden kann.

1a und 1b zeigen die positive TOF-SIMS-Massenspektren des hydrierten Fibronektin Film und DI-Wasser auf. Die Peaks von Interesse, einschließlich Wassercluster (dh, m / z 19, 37, 55, 73, 91 und 109) und Aminosäure-Fragmente (dh, m / z 30, 44, 61, 74, 81, 83 und 98) werden durch die roten Pfeile angedeutet. Zusätzlich zu den charakteristischen Peaks von Aminosäure-Fragmente, die allgemein mit trockener Proteinproben berichtet worden sind, werden die Peaks von Wassercluster in der beobachteteMassenspektren von hydrierten Fibronektin Film in DI-Wasser. Darüber hinaus sind die Intensitäten dieser Wassercluster Spitzen sehr verschieden von denen in den Massenspektren von DI-Wasser. Dieses Ergebnis liefert den direkten Beweis für das Eigentum von Wassermolekülen umgeben und innerhalb der hydratisierten Proteinmoleküle, die eine Rolle in ihrer Adsorption auf einer Oberfläche spielen.

2a zeigt das Tiefenprofil Zeitreihe des hydratisierten Fibronektin Film und DI-Wasser. Wenn die Probe unter dem SiN-Membran ist, werden die Intensitäten der ausgewählten zweiten Ionen vernachlässigbar sind, bevor der SiN-Membran durchstanzt (dh 280 sec für Fibronektin und 340 sec für DI Wasser). Sobald die SiN-Membran durchstanzt wird, erhöhen sich die Intensitäten dieser Sekundärionen signifikant. Wenn die lange Impulsbreite verwenden, ist die Massenauflösung relativ gering. Daher ist die kurze Impulsbreite Verfahren zur Gewinnung von Daten mit einer besseren Massenauflösung verwendetfür Bild und Spektrum Rekonstruktionen, wie in Figur 2a markiert. Nach einem Zeitraum (dh 60 sec für Fibronektin und 220 sec für DI-Wasser) wird das reduzierte Impulsbreite verwendet, um m / z Spektren mit besseren Massenauflösung erhalten. Die endgültigen m / z-Spektren wurden von 200 sec Messungen rekonstruiert grün hervorgehoben schattierten Bereiche im Tiefenprofil zeitliche Serie. 2B zeigt die 2D-Bilder aus dem hydratisierten Fibronektin Film und DI-Wasser, die in 2a zu dem grünen schraffierte Fläche entsprechen. Diese 2D-Bilder stellen die Grafen von ausgewählten Sekundärionen aus der Probe: je heller das Bild, desto höher ist die Sekundärionenzahl. Solche intuitive Bilder geben einen klaren Vergleich ausgewählter Sekundärionen zwischen verschiedenen Proben, die in der Datenanalyse nützlich ist. Nach unseren Erfahrungen, ändert sich der Unterschied in der SiN Punch-Through-Zeit von Charge zu Charge des SiN-Membranen. Allerdings hat dies keine Auswirkungen der WiederErgebnisse des dynamischen TOF-SIMS-Analyse.

Abbildung 1
Abbildung 1: Vergleich des ToF-SIMS positive Spektren des hydratisierten Fibronektin Film und DI-Wasser in den SALVI Mikrokanal (a) Das rekonstruierte m / z-Spektrum von Fibronektin.. (B) Die DI-Wasser-Spektrum.

Figur 2
Abb. 2: Tiefenprofile und 2D-Bilder aus hydriertem Fibronektin und DI-Wasser (a) Die Tiefenprofilierung Zeitreihe von Fibronektin und DI-Wasser im positiven Modus. (B) 2D-Bilder rekonstruiert grünen entsprechenden schattierten 200 sec Zeitsegmente entlang der Tiefenprofil Zeitreihe in (a). Mehrere charakteristische Massenverhältnisse von Bedeutung für Wassercluster zu laden(ZB m / z 1, 19, 37, 55) werden neben bekannten Aminosäure Fragmente gezeigt (zB m / z 30, 83, 98). Bitte hier klicken, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

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Discussion

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SALVI ist ein Mikrofluidik-Schnittstelle, die durch Vakuumbasierte Instrumente, wie TOF-SIMS und Rasterelektronenmikroskopie (SEM) dynamische Flüssigkeitsoberfläche und Flüssig-Fest-Schnittstellenanalyse ermöglicht. Durch die Verwendung von kleinen Öffnungen Flüssigkeit auszusetzen direkt im Vakuum, ist SALVI für viele fein fokussierten Spektroskopie und bildgebenden Verfahren ohne Änderungen; 22 die Portabilität und Flexibilität der Mikrofluidik es eine echte multimodale Bildgebungsplattform machen. Besondere Merkmale und die Bedeutung der SALVI im Vergleich zu anderen Techniken sind in mehreren aktuellen Übersichten zusammengefasst. 22-25 Als Entwickler des SALVI Technologie, unsere Gruppe aktiv wurde es zu einer Vielzahl von Studien die Anwendung mit dynamischer Flüssigkeitsoberflächen und Flüssig-Fest-Schnittstellen . Einige Beispiele für neue Anwendungen umfassen Säugetierzellmembranen, Bakterien Biofilm Befestigungs, 15,16 oder Nanopartikelbildung als Folge der Wasseroberflächenoxidationen. In diesem papro, präsentieren wir erste Flüssigkeit TOF-SIMS Ergebnisse des wasserhaltigen Dünnschicht-Protein auf der SiN Oberfläche adsorbiert.

Es ist ziemlich kritisch, sorgfältig die markierten Schritte in dem Protokoll handhaben. Zum Beispiel, wenn die Flüssigkeit in die Spritze in den Schritten 1 und 2 zeichnen, stellen Sie sicher, dass es keine Luftblasen in der Spritze. Denn wenn die Blasen in SALVI eingespritzt werden, können sie Leckage im Vakuum induzieren. 9 Wenn also keine Blasen beobachtet werden, ist es ratsam, sie los zu erhalten, indem Sie die Spritze aufrecht setzen und sanft die Blasen aus drückt. Darüber hinaus ist es sehr wichtig, die SiN-Fenster in SALVI flach zur optimierten TOF-SIMS-Analyse zu machen, wie in Schritt 3 beschrieben Dies Egalität der Erfassungsbereich wirkt sich direkt auf die Datenqualität nach dem Entwurf von TOF-SIMS. 26 Es notwendig ist, um visuell das Gerät untersuchen, nachdem alles, was auf den SIMS Bühne zu sichern. Wenn die SiN-Fenster nicht horizontal ist, die Schrauben einstellen und die Höhe änderndes SALVI Vorrichtung um sicherzustellen, dass alles, was in der gleichen Ebene so weit wie möglich ist. Diese zarten Punkte brauchen Erfahrung und Sorgfalt, die den Erfolg und die Zuverlässigkeit des gesamten Experiments bestimmen.

Wie in 1B gezeigt, sind die Peaks mit m / z 19, 37, 55, 73, 91 und 109 hohe Zählungen haben. Dies zeigt an, dass es eine ganze Reihe von Wassercluster sind (H 3 O +, H 5 O 2 +, H 7 O 3 +, H 9 O 4 +, H 11 O 5 + und H 13 O 6 +) in der positiven Sekundärionen. Die anderen Wassercluster mit höheren m / z-Werte (Daten nicht gezeigt) haben auch relativ starke Peaks im Vergleich zu ihren benachbarten Peaks. Diese großen Mengen von Wasser-Clustern aus dem DI Wasseroberfläche nach dem SiN punch-through emittiert. Wassercluster Signale im positiven Modus haben nicht zu beobachten gewesen im vorherigen work; und dies wurde auf die niedrigen Zählungen von Sekundärionen zugeschrieben und nicht optimierten ToF-SIMS Bedingungen in der Vergangenheit. 8 Mit der kontinuierlichen Aufwand bei der Optimierung der SALVI und ToF-SIMS Erfassungsbedingungen, wie beispielsweise der Primärionenstrahl (dh Bi + vs mit den hier vorgestellten Bedingungen. Bi 3+) und aktuellen Bedingungen während Tiefenprofilierung Impulsbreite ist es nun möglich, im positiven Modus bis 44 Wassercluster zu beobachten, auf. Hier gezeigten Ergebnisse sind vielversprechend, um die Rolle des Wassers in der Dynamik von verschiedenen biologischen Molekülen und biologischen Systemen untersuchen.

Hier beispielhaft die Vorteile der SALVI und ToF-SIMS zur Veranschaulichung in biologischen Moleküldynamik zu studieren, die Hydratisierung von Fibronektin Protein präsentiert. Die Peaks von m / z 30, 44, 61, 74, 81, 83 und 98 gehören zu den Aminosäurefragmente nach dem letzten Bericht, 27,28, die viel stärker sind als die von DI Water in 1b gezeigt. Dieser Unterschied in der erhöhten Intensität der Aminosäure-Fragmente in der Probe Fibronektin legt nahe, dass diese Sekundärionen tatsächlich von den Proteinen selbst. Darüber hinaus sind die Peaks von Wassercluster in Figur 1a deutlich stärker als die von DI-Wasser in 1b, die konnten die Eigenschaften von Wassermolekülen in der Proteinadsorption Ober- und Grenzflächen Lösung von denen sehr verschieden sein in reinem Wasser impliziert, dass.

2a zeigt repräsentative Tiefenprofilierung zeitliche Folge von zwei verschiedenen Proben: Fibronektin und DI-Wasser in der SALVI Mikrokanal. Die Tiefenprofildaten wurden gesammelt, wie die SiN-Fenster durch die mit der langen Impulsbreite Primärionenstrahl + Bi 3 bombardiert wurde. Wie in 2a zu sehen ist, wird die SiN-Fenster bei etwa 300 sec durchgestanzt. Vor dem Fenster SiN in SALVI gestanzt through, die Intensitäten ausgewählter Sekundärionen sind ziemlich gering. Sobald die SiN Fenster gestanzt wird durch steigen die Intensitäten der Sekundärionen unmittelbar als die Flüssigkeitsoberfläche durch den Primärionenstrahl beschossen begonnen wird. Beispielsweise können die Intensitäten von H + und H 3 O + zeigen eine starke Zunahme, was auf die Beobachtung der Wasseroberfläche. 8,9 Obwohl die Intensitäten instabil direkt nach dem Durchgriff oder an der Grenzfläche sind, können sie relativ stabil erreichen Werte nach einer gewissen Zeit (beispielsweise 60 sec für Fibronektin und 220 sec für DI-Wasser bzw. in Abbildung 2a). Der Unterschied in der langen Impulsbreite Bohrungen wirkt sich nicht wirklich die Analyseergebnisse hier dargestellt, wenn m / z Spektren Rekonstruktion (beispielsweise Figur 1), da die effektive m / z-Spektren nach der SiN Durchgriff erfasst werden. Jedoch kann ein Forscher wählen die gleichen Bedingungen für alle Proben zu verwenden for Konsistenz und Benutzerfreundlichkeit bei der Wahl Datenabschnitte während der Datenanalyse. Um besser war Massenauflösung, die Impulsbreite zu erhalten, anschließend reduziert und die Intensitäten wurden entsprechend im letzteren Teil des Tiefenprofilierung Experiment verringert. Das Tiefenprofil Zeitreihe wurden kontinuierlich gesammelt für weitere 200 sec genügend Daten für m / z Spektralanalyse zu schaffen. Die Segmente der Zeit, die m / z-Spektren rekonstruiert wurden, sind in grün schattierten Bereiche hervorgehoben.

Fibronectin wurde Oberflächenadsorption vor der Zellkultivierungs weit verbreitet; Viele Studien haben für die Zelladhäsion und Zell-Biomaterial-Interaktionen. 19,20,29 Eine neue Studie aus der Dicke von Fibronektin adsorbiert an Poly (Hydroxyethylmethacrylat) Bürsten Ellipsometrie Fibronektin ist verantwortlich gezeigt. Die Fibronektin Dünnschicht bestimmt 3-12 nm dick. 30 Eine solche Dicke zu sein, ist angemessen für die Tiefenprofilanalyse in einer wässrigen Lötion. 8,9 Mit der Entwicklung der SALVI, ist nun eine direkte Analyse der hydratisierten Protein auf der festen Oberfläche adsorbiert möglich. Dieser Ansatz kann potentiell breite Anwendungen müssen die Wechselwirkungen von Proteinen mit festen Oberflächen dynamisch zu studieren.

2b zeigt die ausgewählten 2D-Bilder von verschiedenen Sekundärionen von Fibronektin und DI Wasserproben, respectively. 2D-Bilder werden aus den Tiefenprofilierung von Zeitdaten in grün schraffierten Bereiche in Figur 2a erhalten, die nach der SiN zur Flüssigkeitsoberfläche entsprechen Punch-Through wie zuvor beschrieben. Die Abbildungen ausgewählter Aminosäurefragment Sekundärionen CH 4 N +, C 5 H 7 O + und C 4 H 4 NO 2 + (dh, m / z 30, 83 und 98) für die Fibronektin Dünnschicht waren deutlich heller als jene für DI-Wasser. Dies zeigt, dass die Aminosäurefragment Sekundärionen f eingehalten werdenROM mit der Fibronektin-Moleküle innerhalb der 2 Mikrometer Durchmesser Öffnung. Ferner sind die Bilder der ausgewählten Peaks (zum Beispiel m / z 1, 19, 37 und 55) mit mehreren Wassercluster von Fibronektin entsprechen, sind bemerkenswert heller als die von entionisiertem Wasser. Dieses Ergebnis zeigt, daß die Hydratation von Fibronectin die Wassermoleküle macht die Biomolekül Unterschied zu den Wassermolekülen in dem DI-Wasser umgibt.

Zusammenfassend hat diese Arbeit schlagender Beweis auf Proteinhydratation induzierten Wassermolekül Eigenschaft Änderungen vorgesehen. Solche Ergebnisse könnten ein verbessertes grundlegendes Verständnis über die Struktur, Konformation und biologische Aktivität von Proteinen auf einer festen Oberfläche in der flüssigen Mikroumgebung adsorbiert bieten.

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
ToF-SIMS IONTOF TOF.SIMS 5 Resolution: >10,000 m/Δm for mass resolution; >4,000 m/Δm for high spatial resolution 
System for Analysis at the Liquid Vacuum Interface (SALVI) Pacific Northwest National Laboratory N/A SALVI is a unique, self-contained, portable analytical tool that, for the first time, enables vacuum-based scientific instruments such as time-of-flight secondary ion mass spectrometry (ToF-SIMS) to analyze liquid surfaces in their natural state at the molecular level.
PEEK Union Valco ZU1TPK for connecting the inlet and outlet of SALVI
5 Axes Sample Stage IONTOF N/A Stage is self-made for mounting SALVI in ToF-SIMS
Barnstead Nanopure Water Purification System Thermo Fisher Scientific D11921 ROpure LP Reverse Osmosis filtration module (D2716)
Syringe BD 309659 1 ml
Pipette Thermo Fisher Scientific 21-377-821 Range: 100 to 1,000 ml
Pipette Tip Neptune 2112.96.BS 1,000 µl
Centrifuge Tube Corning 430791 15 ml
Fibronectin Sigma-Aldrich F1141 1 mg/ml
Ethanol Thermo Fisher Scientific S25310A 95% Denatured
Gibco PBS Thermo Fisher Scientific 10010-023 pH 7.4

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References

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<em>In-situ-Charakterisierung</em> von Hydrated Proteine ​​in Wasser durch SALVI und TOF-SIMS
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Yu, J., Zhou, Y., Hua, X., Zhu, Z., Yu, X. Y. In Situ Characterization of Hydrated Proteins in Water by SALVI and ToF-SIMS. J. Vis. Exp. (108), e53708, doi:10.3791/53708 (2016).More

Yu, J., Zhou, Y., Hua, X., Zhu, Z., Yu, X. Y. In Situ Characterization of Hydrated Proteins in Water by SALVI and ToF-SIMS. J. Vis. Exp. (108), e53708, doi:10.3791/53708 (2016).

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