In situ karakterisering af Hydratformerne Proteiner i vand ved Salvi og ToF-SIMS
Summary
Dette arbejde viser en protokol til flydende håndtering og indføring af prøve til en mikrokanal til in situ time-of-flight sekundær ion massespektrometri-analyse af biomolekyler i en vandig opløsning.
Abstract
Dette arbejde viser in situ karakterisering af protein biomolekyler i den vandige opløsning ved hjælp af systemet for analyse på Liquid Vacuum Interface (SALVI) og time-of-flight sekundær ion massespektrometri (ToF-SIMS). Den fibronectin protein film blev immobiliseret på siliciumnitrid (SiN) membran, der danner SALVI detekteringsområdet. Under ToF-SIMS-analyse, blev tre former for analyse udført herunder høj rumlig opløsning massespektrometri, todimensional (2D) billedbehandling, og dybde profilering. Massespektre blev opnået i både positive og negative tilstande. Deioniseret vand blev også analyseret som en referenceprøve. Vores resultater viser, at fibronectin film i vand har flere særskilte og stærkere vand klynge toppe sammenlignet med vand alene. Karakteristiske toppe af aminosyre fragmenter er også observeres i hydreret protein ToF-SIMS spektre. Disse resultater illustrerer, at proteinmolekyle adsorption på en overflade kan studeres Dynamically bruger SALVI og ToF-SIMS i flydende miljø for første gang.
Introduction
Hydrering er afgørende for strukturen, 1 konformation, 2 og biologisk aktivitet 3 af proteiner. Proteiner uden vandmolekyler omgiver dem ville ikke have levedygtige biologiske aktiviteter. Specifikt vandmolekyler interagerer med overfladen og interne struktur af proteiner, og forskellige hydrering tilstande af proteiner gør sådanne interaktioner forskellige. 4 Interaktionen af proteiner med faste overflader er et grundlæggende fænomen med implikationer i nanoteknologi, biomaterialer og vævsmanipulering processer. Undersøgelser har længe indikeret, at der kan forekomme konformationelle ændringer som et protein møder en overflade. ToF-SIMS er blevet planlagt som den teknik, der har potentiale til at studere protein-faststof-grænsefladen. 5-7 Det er vigtigt at forstå hydreringen af proteiner på faste overflader, hvilket potentielt giver en grundlæggende forståelse af mekanismen i deres struktur, kropsbygning, og biologiskal aktivitet.
Men større overflade analyseteknikker er for det meste vakuum-baserede og direkte ansøgninger for flygtige væskeformige undersøgelser er vanskelig på grund af den hurtige fordampning af flygtige væske under vakuum miljø. Vi udviklede et vakuum kompatibel mikrofluid interface, System til analyse på Liquid Vacuum Interface (SALVI), for at muliggøre direkte observationer af flydende overflader og flydende og faste stoffer interaktioner ved hjælp af time-of-flight sekundær ion massespektrometri (ToF-SIMS). 8- 11 de unikke aspekter omfatter følgende: 1) vinduet påvisning er en åbning på 2-3 um i diameter muliggør direkte afbildning af væskeoverfladen, 2) overfladespænding anvendes til at holde væsken inden i åbningen, og 3) SALVI er bærbare mellem flere analytiske platforme. 11,12
SALVI er sammensat af en siliciumnitrid (SiN) membran som detekteringsområdet og en mikrokanal lavet af polydimethylsiloxan (PDMS). Det er fabricated i rene rum, og fremstilling og centrale design faktorer er blevet beskrevet i tidligere artikler og patenter. 8-12 Ansøgningerne fra ToF-SIMS som et analytisk værktøj blev demonstreret ved hjælp af forskellige vandige opløsninger og komplekse flydende blandinger, nogle af som indeholdt nanopartikler. 13-17 Konkret SALVI flydende ToF-SIMS tillader dynamisk sondering af væske-faststof-grænsefladen af levende biologiske systemer (dvs. biofilm), enkelte celler, og faststof-elektrolyt interface, åbner nye muligheder for in situ kondenseret fase undersøgelser, herunder væsker ved hjælp ToF-SIMS. Men den nuværende udformning ikke tillader gas-væske interaktioner endnu. Dette er en retning for den fremtidige udvikling. SALVI er blevet anvendt til at undersøge den hydratiserede protein film i dette arbejde for første gang.
Fibronectin er et almindeligt anvendt protein dimer, der består af to næsten identiske monomerer forbundet af et par disulfidbindinger, 18, som is kendt for sin evne til at binde celler. 19,20 Det blev valgt som et modelsystem til at illustrere, at det hydratiserede proteinfilm kan dynamisk probes under anvendelse af SALVI flydende ToF-SIMS tilgang. Proteinopløsningen blev indført i mikrokanal. Efter inkubering i 12 timer blev en hydreret protein film dannet på bagsiden af SiN membranen. Deioniseret (DI) vand blev anvendt til at skylle kanalen efter protein introduktion. Der blev indsamlet fra hydrerede fibronektin proteinmolekyler i SALVI mikrokanalplade bruge dynamisk ToF-SIMS. DI vand blev også undersøgt som en kontrol til at sammenligne med resultater opnået fra hydreret fibronektin tynd film. Der blev observeret tydelige forskelle mellem den hydratiserede protein film og DI vand. Dette arbejde viser, at protein adsorption på overfladen i den flydende miljø kan studeres ved hjælp af romanen SALVI og flydende ToF-SIMS tilgang. Videoen protokollen er beregnet til at give teknisk vejledning for folk, der er interesseredei at udnytte dette nye analytisk værktøj til forskellige anvendelser af SALVI med ToF-SIMS og reducere unødvendige fejl i væskehåndtering samt ToF-SIMS indsamling og analyse af data.
Protocol
Representative Results
Discussion
SALVI er en mikrofluid interface, der tillader dynamisk væskeoverflade og væske-faststof-grænsefladen analyse ved vakuum baserede instrumenter, såsom ToF-SIMS og scanningselektronmikroskopi (SEM). På grund af brugen af små åbninger for at eksponere væske direkte i vakuum, SALVI er velegnet til mange fint fokuserede spektroskopi og billedbehandling teknikker uden ændringer; 22 portabilitet og alsidighed mikrofluidik gør det til en sand multimodal imaging platform. Tydelige funktioner og betydning af …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We are grateful to the Pacific Northwest National Laboratory (PNNL) Chemical Imaging Initiative-Laboratory Directed Research and Development (CII-LDRD) and Materials Synthesis and Simulation across Scales (MS3) Initiative LDRD fund for support. Instrumental access was provided through a W. R. Wiley Environmental Molecular Sciences Laboratory (EMSL) Science Themed Proposal. EMSL is a national scientific user facility sponsored by the Office of Biological and Environmental Research (BER) at PNNL. The authors thank Mr. Xiao Sui, Mr. Yuanzhao Ding, and Ms. Juan Yao for proof reading the manuscript and providing useful feedback. PNNL is operated by Battelle for the DOE under Contract DE-AC05-76RL01830.
Materials
| ToF-SIMS | IONTOF | TOF.SIMS 5 | Resolution: > 10,000 m/Δm for mass resolution; > 4,000 m/Δm for high spatial resolution |
| System for Analysis at the Liquid Vacuum Interface (SALVI) | Pacific Northwest National Laboratory | N/A | SALVI is a unique, self-contained, portable analytical tool that, for the first time, enables vacuum-based scientific instruments such as time-of-flight secondary ion mass spectrometry (ToF-SIMS) to analyze liquid surfaces in their natural state at the molecular level. |
| PEEK Union | Valco | ZU1TPK | for connecting the inlet and outlet of SALVI |
| 5 Axes Sample Stage | IONTOF | N/A | Stage is self-made for mounting SALVI in ToF-SIMS |
| Barnstead Nanopure Water Purification System | Thermo Fisher Scientific | D11921 | ROpure LP Reverse Osmosis filtration module (D2716) |
| Syringe | BD | 309659 | 1 mL |
| Pipette | Thermo Fisher Scientific | 21-377-821 | Range: 100 to 1000 mL |
| Pipette Tip | Neptune | 2112.96.BS | 1000 µL |
| Centrifuge Tube | Corning | 430791 | 15 mL |
| Fibronectin | Sigma-Aldrich | F1141 | 1 mg/mL |
| Ethanol | Thermo Fisher Scientific | S25310A | 95% Denatured |
| Gibco PBS | Thermo Fisher Scientific | 10010-023 | pH 7.4 |
References
- Tompa, K., Bokor, M., Verebelyi, T., Tompa, P. Water rotation barriers on protein molecular surfaces. Chem. Phys. 448, 15-25 (2015).
- Maruyama, Y., Harano, Y. Does water drive protein folding?. Chem. Phys. Lett. 581, 85-90 (2013).
- Chaplin, M. Opinion – Do we underestimate the importance of water in cell biology. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 7 (11), 861-866 (2006).
- Zhang, L., et al. Mapping hydration dynamics around a protein surface. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 104 (47), 18461-18466 (2007).
- Xia, N., May, C. J., McArthur, S. L., Castner, D. G. Time-of-flight secondary ion mass spectrometry analysis of conformational changes in adsorbed protein films. Langmuir. 18 (10), 4090-4097 (2002).
- Gray, J. J. The interaction of proteins with solid surfaces. Curr. Opin. Struct. Biol. 14 (1), 110-115 (2004).
- Wagner, M. S., Horbett, T. A., Castner, D. G. Characterization of the structure of binary and ternary adsorbed protein films using electron spectroscopy for chemical analysis, time-of-flight secondary ion mass spectrometry, and radiolabeling. Langmuir. 19 (5), 1708-1715 (2003).
- Yang, L., Yu, X. -. Y., Zhu, Z., Iedema, M. J., Cowin, J. P. Probing liquid surfaces under vacuum using SEM and and ToF-SIMS. Lab Chip. 11 (15), 2481-2484 (2011).
- Yang, L., Yu, X. -. Y., Zhu, Z. H., Thevuthasan, T., Cowin, J. P. Making a hybrid microfluidic platform compatible for in situ imaging by vacuum-based techniques. J. Vac. Sci. Technol. A. 29 (6), 061101 (2011).
- Yu, X. -. Y., Yang, L., Zhu, Z. H., Cowin, J. P., Iedema, M. J. Probing aqueous surfaces by ToF-SIMS. LC GC N. Am. (Oct), 34-38 (2011).
- Yu, X. -. Y., Yang, L., Cowin, J., Iedema, M., Zhu, Z. Systems and methods for analyzing liquids under vacuum. US patent. , (2013).
- Yu, X. -. Y., Liu, B., Yang, L., Zhu, Z., Marshall, M. J. Microfluidic electrochemical device and process for chemical imaging and electrochemical analysis at the electrode-liquid interface in situ. US patent. , (2014).
- Yang, L., Zhu, Z., Yu, X. -. Y., Thevuthasan, S., Cowin, J. P. Performance of a microfluidic device for in situ ToF-SIMS analysis of selected organic molecules at aqueous surfaces. Anal. Methods. 5 (10), 2515-2522 (2013).
- Yang, L., et al. In situ SEM and ToF-SIMS analysis of IgG conjugated gold nanoparticles at aqueous surfaces. Surf. Interface Anal. 46 (4), 224-228 (2014).
- Hua, X., et al. In situ molecular imaging of hydrated biofilm in a microfluidic reactor by ToF-SIMS. Analyst. 139 (7), 1609-1613 (2014).
- Hua, X., et al. Two-dimensional and three-dimensional dynamic imaging of live biofilms in a microchannel by time-of-flight secondary ion mass spectrometry. Biomicrofluidics. 9 (3), 031101 (2015).
- Liu, B., et al. In situ chemical probing of the electrode-electrolyte interface by ToF-SIMS. Lab Chip. 14 (5), 855-859 (2014).
- Pankov, R., Yamada, K. M. Fibronectin at a glance. J. Cell Sci. 115 (20), 3861-3863 (2002).
- Pierschbacher, M. D., Hayman, E. G., Ruoslahti, E. Location of the cell-attachment site in fibronectin with monoclonal antibodies and proteolytic fragments of the molecule. Cell. 26 (2), 259-267 (1981).
- Engvall, E., Ruoslahti, E. Binding of soluble form of fibroblast surface protein, fibronectin, to collagen. Int. J. Cancer. 20 (1), 1-5 (1977).
- Green, F. M., Gilmore, I. S., Seah, M. P. TOF-SIMS: Accurate mass scale calibration. J. Am. Soc. Mass Spectrom. 17 (4), 514-523 (2006).
- Yu, X. -. Y., Liu, B., Yang, L. Imaging liquids using microfluidic cells. Microfluid. Nanofluid. 15 (6), 725-744 (2013).
- Shi, H., Lercher, J. A., Yu, X. -. Y. Sailing into uncharted waters: recent advances in the in situ monitoring of catalytic processes in aqueous environments. Catal. Sci. Technol. 5 (6), 3035-3060 (2015).
- Deleu, M., Crowet, J. M., Nasir, M. N., Lins, L. Complementary biophysical tools to investigate lipid specificity in the interaction between bioactive molecules and the plasma membrane: A review. Biochim. Biophys. Acta-Biomembr. 1838 (12), 3171-3190 (2014).
- Kraft, M. L., Klitzing, H. A. Imaging lipids with secondary ion mass spectrometry. Biochim. Biophys. Acta Mol. Cell Biol. Lipids. 1841 (8), 1108-1119 (2014).
- Gilmore, I. S. SIMS of organics-Advances in 2D and 3D imaging and future outlook. J. Vac. Sci. Technol. A. 31 (5), 050819 (2013).
- Muramoto, S., et al. ToF-SIMS Analysis of Adsorbed Proteins: Principal Component Analysis of the Primary Ion Species Effect on the Protein Fragmentation Patterns. J. Phys. Chem. C. 115 (49), 24247-24255 (2011).
- Brüning, C., Hellweg, S., Dambach, S., Lipinsky, D., Arlinghaus, H. F. Improving the interpretation of ToF-SIMS measurements on adsorbed proteins using PCA. Surf. Interface Anal. 38 (4), 191-193 (2006).
- Gustavsson, J., et al. Surface modifications of silicon nitride for cellular biosensor applications. J. Mater. Sci.-Mater. Med. 19 (4), 1839-1850 (2008).
- Deng, J., Ren, T. C., Zhu, J. Y., Mao, Z. W., Gao, C. Y. Adsorption of plasma proteins and fibronectin on poly(hydroxylethyl methacrylate) brushes of different thickness and their relationship with adhesion and migration of vascular smooth muscle cells. Regen Biomater. , 17-25 (2014).
