Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Chemistry

In situ karakterisering af Hydratformerne Proteiner i vand ved Salvi og ToF-SIMS

doi: 10.3791/53708 Published: February 15, 2016
* These authors contributed equally

Summary

Dette arbejde viser en protokol til flydende håndtering og indføring af prøve til en mikrokanal til in situ time-of-flight sekundær ion massespektrometri-analyse af biomolekyler i en vandig opløsning.

Abstract

Dette arbejde viser in situ karakterisering af protein biomolekyler i den vandige opløsning ved hjælp af systemet for analyse på Liquid Vacuum Interface (SALVI) og time-of-flight sekundær ion massespektrometri (ToF-SIMS). Den fibronectin protein film blev immobiliseret på siliciumnitrid (SiN) membran, der danner SALVI detekteringsområdet. Under ToF-SIMS-analyse, blev tre former for analyse udført herunder høj rumlig opløsning massespektrometri, todimensional (2D) billedbehandling, og dybde profilering. Massespektre blev opnået i både positive og negative tilstande. Deioniseret vand blev også analyseret som en referenceprøve. Vores resultater viser, at fibronectin film i vand har flere særskilte og stærkere vand klynge toppe sammenlignet med vand alene. Karakteristiske toppe af aminosyre fragmenter er også observeres i hydreret protein ToF-SIMS spektre. Disse resultater illustrerer, at proteinmolekyle adsorption på en overflade kan studeres Dynamically bruger SALVI og ToF-SIMS i flydende miljø for første gang.

Introduction

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Hydrering er afgørende for strukturen, 1 konformation, 2 og biologisk aktivitet 3 af proteiner. Proteiner uden vandmolekyler omgiver dem ville ikke have levedygtige biologiske aktiviteter. Specifikt vandmolekyler interagerer med overfladen og interne struktur af proteiner, og forskellige hydrering tilstande af proteiner gør sådanne interaktioner forskellige. 4 Interaktionen af proteiner med faste overflader er et grundlæggende fænomen med implikationer i nanoteknologi, biomaterialer og vævsmanipulering processer. Undersøgelser har længe indikeret, at der kan forekomme konformationelle ændringer som et protein møder en overflade. ToF-SIMS er blevet planlagt som den teknik, der har potentiale til at studere protein-faststof-grænsefladen. 5-7 Det er vigtigt at forstå hydreringen af proteiner på faste overflader, hvilket potentielt giver en grundlæggende forståelse af mekanismen i deres struktur, kropsbygning, og biologiskal aktivitet.

Men større overflade analyseteknikker er for det meste vakuum-baserede og direkte ansøgninger for flygtige væskeformige undersøgelser er vanskelig på grund af den hurtige fordampning af flygtige væske under vakuum miljø. Vi udviklede et vakuum kompatibel mikrofluid interface, System til analyse på Liquid Vacuum Interface (SALVI), for at muliggøre direkte observationer af flydende overflader og flydende og faste stoffer interaktioner ved hjælp af time-of-flight sekundær ion massespektrometri (ToF-SIMS). 8- 11 de unikke aspekter omfatter følgende: 1) vinduet påvisning er en åbning på 2-3 um i diameter muliggør direkte afbildning af væskeoverfladen, 2) overfladespænding anvendes til at holde væsken inden i åbningen, og 3) SALVI er bærbare mellem flere analytiske platforme. 11,12

SALVI er sammensat af en siliciumnitrid (SiN) membran som detekteringsområdet og en mikrokanal lavet af polydimethylsiloxan (PDMS). Det er fabricated i rene rum, og fremstilling og centrale design faktorer er blevet beskrevet i tidligere artikler og patenter. 8-12 Ansøgningerne fra ToF-SIMS som et analytisk værktøj blev demonstreret ved hjælp af forskellige vandige opløsninger og komplekse flydende blandinger, nogle af som indeholdt nanopartikler. 13-17 Konkret SALVI flydende ToF-SIMS tillader dynamisk sondering af væske-faststof-grænsefladen af levende biologiske systemer (dvs. biofilm), enkelte celler, og faststof-elektrolyt interface, åbner nye muligheder for in situ kondenseret fase undersøgelser, herunder væsker ved hjælp ToF-SIMS. Men den nuværende udformning ikke tillader gas-væske interaktioner endnu. Dette er en retning for den fremtidige udvikling. SALVI er blevet anvendt til at undersøge den hydratiserede protein film i dette arbejde for første gang.

Fibronectin er et almindeligt anvendt protein dimer, der består af to næsten identiske monomerer forbundet af et par disulfidbindinger, 18, ​​som is kendt for sin evne til at binde celler. 19,20 Det blev valgt som et modelsystem til at illustrere, at det hydratiserede proteinfilm kan dynamisk probes under anvendelse af SALVI flydende ToF-SIMS tilgang. Proteinopløsningen blev indført i mikrokanal. Efter inkubering i 12 timer blev en hydreret protein film dannet på bagsiden af ​​SiN membranen. Deioniseret (DI) vand blev anvendt til at skylle kanalen efter protein introduktion. Der blev indsamlet fra hydrerede fibronektin proteinmolekyler i SALVI mikrokanalplade bruge dynamisk ToF-SIMS. DI vand blev også undersøgt som en kontrol til at sammenligne med resultater opnået fra hydreret fibronektin tynd film. Der blev observeret tydelige forskelle mellem den hydratiserede protein film og DI vand. Dette arbejde viser, at protein adsorption på overfladen i den flydende miljø kan studeres ved hjælp af romanen SALVI og flydende ToF-SIMS tilgang. Videoen protokollen er beregnet til at give teknisk vejledning for folk, der er interesseredei at udnytte dette nye analytisk værktøj til forskellige anvendelser af SALVI med ToF-SIMS og reducere unødvendige fejl i væskehåndtering samt ToF-SIMS indsamling og analyse af data.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

1. Rengøring og sterilisering af SALVI Microchannel

  1. Sterilisering af mikrokanalen i SALVI
    1. Tegn 2 ml 70% ethanol vandig opløsning ind i en sprøjte, tilslut sprøjten med indløbet slutningen af ​​SALVI, og langsomt tilføre 1 ml af væsken i 10 min. Fjern sprøjten i slutningen af ​​injektionen. Dernæst tilslutte ind- og udløb af SALVI bruge en polyetheretherketon (PEEK) union. Alternativt, brug en sprøjtepumpe til at gennemføre den samme procedure. For eksempel indstille strømningshastigheden på 100 pl / min.
    2. Hold SALVI mikrokanalplade fyldt med 70% ethanol-opløsning ved stuetemperatur i 4 timer.
  2. Indføre Deioniseret (DI) Vand i SALVI
    1. Tegn 2 ml steriliseret DI vand i en sprøjte, tilslut sprøjten med indløb SALVI, og langsomt tilføre 1 ml af væsken i 10 min. Fjern sprøjten, og tilslut ind- og udløb af SALVI ved hjælp af en PEEK union. Alternativt, brug en sprøjtepumpe som nævnt itrin 1.1.1.

2. Immobilisering af protein Film i SALVI

  1. Immobilisere Protein Film i SALVI
    1. Tegn 2 ml fibronectin (10 pg / ml i phosphatpufret saltvand, PBS) opløsning i en sprøjte, tilslut sprøjten med indløb SALVI, langsomt injicere 1 ml af væsken i 10 min, fjern sprøjten, og tilslut indløb og udløb af SALVI ved hjælp af en PEEK union.
    2. Inkubér SALVI fyldt med fibronectin opløsning i en ren dyrkningsskål, holde skålen i hætten ved stuetemperatur i 12 timer.
    3. Tegn 2 ml steriliseret DI vand i en sprøjte og forbind sprøjten med indløb SALVI. Injicer langsomt 1 ml vand i 10 min, fjern sprøjten, og tilslut ind- og udløb af SALVI.
      Bemærk: Hvis der er udstyret med et lysmikroskop, kontrollere SALVI under mikroskop for at sikre, at SiN membranen er intakt før ToF-SIMS-analyse. Nu SALVI enheden er klar til ToF-SIMS etANALYSE.

3. Installer SALVI ind TOF-SIMS Loadlock Chamber

Bemærk: Handsker skal bæres på alle tidspunkter ved håndtering af SALVI enhed og installere det på ToF-SIMS scenen for at undgå potentielle forureninger under overfladen analyse.

  1. Mount SALVI ind på scenen
    1. Læg ToF-SIMS etape på en flad og ren overflade. Sæt SALVI enhed på scenen med silicium wafer og synd membran vender opad. Fastgør SALVI hjælp fire metal fastspænding stykker og skru metal stykker holder hjørnet af enheden i metalpladen med fire skruer.
    2. Forsigtigt rulle op PFTE slange forbundet til mikrofluid kanal. Brug fire metalstykker og fire skruer til at holde den stive del ned. Kontroller, at enheden er anbragt i det åbne rum på SIMS tidspunkt, således at det ikke interfererer med det primære ionstrålen under analyse. Ekstra billede og illustration af SALVI fabrication og installation findes i tidligere publikationer. 8,9,11
  2. Monter Faraday Cup ind på scenen
    1. Fastgør Faraday kop på scenen med en skrue.
  3. Læg Stage i TOF-SIMS Loadlock Chamber
    1. Åbn ToF-SIMS loadlock, hold og sætte scenen vandret på læsserampen, og luk loadlock døren.

4. ToF-SIMS datafangst

  1. Tænd vakuumpumpen og sikre passende vakuum (f.eks i størrelsesordenen 10 -6 mbar eller Torr) nås i loadlock kammer.
  2. Flyt SALVI ind i hovedkammeret, når vakuumet stabiliseret efter omkring 30 min.
    Bemærk: vakuum skal være lavere end 5 x 10 -6 mbar vakuum i de vigtigste kammer under dataindsamling. Ellers højere vakuum er tegn på en lækage i SALVI systemet.
  3. Juster den primære ion stråle og analysator af ToF-SIMS med enrumlig opløsning på ca. 400 nm i henhold til producentens anbefalinger. Den nuværende af primære strålebundt er 1.200 pA mens cyklustiden er 30 psek under DC modus.
    Bemærk: Denne proces følger i vid udstrækning producentens anbefalinger.
  4. Find den mikro kanal med optisk mikroskop. Brug den optiske billede center som en reference og tilpasse det at være i overensstemmelse med det sekundære ion billedets centrum.
  5. Før hver måling bruge en 1 KeV O 2 + stråle (~ 40 nA) for at scanne i vinduet synd med en 500 x 500 um 2 område for ~ 15 sek at fjerne overfladeforurening. Også bruge en elektron oversvømmelse pistol til at kompensere overfladen opladning under alle målinger. Brug den automatiske funktion af oversvømmelse pistol i standardtilstanden for dette skridt.
  6. Vælg positiv eller negativ tilstand før dataopsamling. Brug 25 keV Bi 3 + stråle som den primære ionstråle i alle målinger.
    Bemærk: Trinene ligner feller positive og negative opkøb data. For af hensyn til plads, er den positiv modus beskrevet i detaljer her.
    1. Dybde Profilering
      1. Scan Bi 3 + stråle på en rund med en diameter på ~ 2 um med 32 pixels med 32 pixels opløsning.
      2. For at minimere den tid, der kræves for at slå-gennem SiN membran, brug en lang puls bredde (dvs. 180 ns, stråle strøm ~ 1,0 Pa ved en cyklustid på 100 psek) Bi 3 + stråle. Intensiteterne af sekundære ioner repræsentant fra flydende ved jordoverfladen, når stempel-through er nået. Punch-through varierer fra 300 sek til 500 sek, afhængigt af parti af SiN membranen.
        Bemærk: Denne forskel synes at være relateret til det parti SiN membraner erhvervet efter vores erfaringer. Imidlertid punch-through tid ikke virkelig påvirker dataanalyse.
      3. Efter SiN membran Punch-igennem, holde den samme strøm til omkring 200 sek tilopnå tilstrækkelige data til 2D-billede rekonstruktioner.
      4. Reducer puls bredde til 80 ns til dataindsamling til at erhverve spektre med bedre masse opløsning. Fortsæt denne erhvervelse for om en anden 200 sek. De spektrale data, der er vist i figur 1 opnås fra denne region.
    2. 2D-billedbehandling og Mass Spectra
      1. Opsaml 2D billedbehandling og massespektre data samtidigt ved måling af dybden profilering data. TOF-SIMS instrument gemmer alle oplysninger om hver plet under eksperimentet. Dataene er vist i forskellige vinduer (FPanel - Spectra, FPanel - Profiler og FPanel - Billeder separat) i den digitale kontrol software. Tjek data i hver panel velovervejet under dataindsamling.

Analyse 5. ToF-SIMS data

Bemærk: Data analyse indledningsvis udføres ved hjælp af IonToF ToF-SIMS instrumental software.

  1. Åbn enANALYSE software SIMS (Measurement Explorer) og klik derefter på "profiler ',' spektre 'og' billede 'knapper, henholdsvis at behandle dybde profil, m / z spektrum, og billeddata.
  2. Åbn datafiler, der har filtypenavnet ".ita".
  3. Vælg toppe af interesse, skal du skrive artsnavnet i boksen "ion", og mærke dem med forskellige farver i spektre. Brug musen rullehjulet til at trække langs x-aksen. Brug Ctrl og rullehjul til at justere peak højder og bredder. Bogstavet "L" skifter mellem Lineær og log tilstande langs y-aksen.
  4. Gennemføre genopbygning data, før masse kalibrering. Ellers er det svært at vælge afstanden mellem toppene i massen kalibreringstrin.
    1. Vælg de dybde profilering data af interesse og rekonstruere spektre i henhold til den dybde profil tidsmæssige serie.
    2. Klik på knappen genopbygning. I "Start Reconstruction" vinduet, skriv en scanning vifte af intpåløbne. Klik på "OK" for at rekonstruere dybde profildata.
  5. Udfør en masse kalibrering. Tryk på "F3" for at åbne "masse kalibrering" vinduet. Vælg toppe for kalibrering baseret på den specifikke prøve. 21 I dette arbejde, bruge følgende toppe CH3 + (m / z 15), H 3 O + (m / z 19), C 2 H 5 + (m / z 29 ), H 5 O 2 + (m / z 37), C3-H 7 + (m / z 43), H7 O 3 + (m / z 55), H 9 O 4 + (m / z 71), H 11 O 5 + (m / z 99) og H 13 O 6 + (m / z 109) for den positive mode. Brug følgende toppe CH - (m / z 13), O - (m / z 16), OH - (m / z 17), C 2 H - (m / z 25), C 3 H - (m / z 37), og C 4 H - (m / z 49) for den negative tilstand.
    1. Vælg et højdepunkt,sørge for, at den nedadgående pil peger på toppen i nederste venstre hjørne af vinduet. Klik på, at peak og skriv peak navn i "masse kalibrering" vinduet, klik på "Tilføj", og ion af interesse indgår i massen kalibrering.
    2. Endelig skal du klikke på knappen "Kalibrer igen". Kontroller, om de arealer af henholdsvis top er i de rigtige steder efter deres mellem masse og ladning. I menuen "Spectrum", vælge og klik på "Anvend Mass Calibration" til "All Spectra" eller "Valgte spektre", afhængigt af den specifikke analyse gennemføres.
  6. Som peak udvælgelse er nødvendig for analysen, fastlægge karakteristiske toppe af prøven i henhold til litteraturen, andre tidligere resultater. Sammenlign intensiteten af ​​toppene af interesse i m / z spektre. Hvis det er nødvendigt, tilføje nye toppe eller slette ubrugelige toppe i peak listen.
    1. Tilføj toppe. Klik på et højdepunkt, finde de røde linjer i venstre nederste vindue. Hold på "Ctrl" tasten, rulle musen vandret for at definere Topbredden som tilføjer en spids til top listen automatisk. En anden måde at tilføje en top er at vælge et højdepunkt i de vigtigste spektrum-vinduet, og derefter klikke på "tilføj peak" knappen over vinduet. Hvis der er mange toppe at tilføje, i menuen "Spectrum", vælg "search toppe", kontrollere relaterede specifikationer i den nyligt åbnede vindue, derefter tilføje toppe efter behov.
    2. Sådan eksporterer et højdepunkt liste, i menuen "Peak List", vælg "Gem ..." top listen i "itmil" format. Brug Ctrl og venstre knap for at trække langs spektret. I spektre vinduet, skal du vælge et højdepunkt af interesse og trække de to stiplede linjer til ønskelige stillinger.
    3. Sådan importerer du et højdepunkt liste, i menuen "Mass interval List", vælg "Importer ...", find en eksisterende peak liste fil med filtypen ".ITPL". Klik på "Åbn".
    4. For at bruge en "itmil" peak liste, iden "Mass Interval List" i menuen, klik på "Åbn ...", finder filen, og klik derefter på "Åbn".
  7. Påfør en top liste at analysere data. På det venstre-bunden af ​​"Spectra" vinduet, er der et vindue kaldet "Mass Interval List". Den importerede peak liste vises her.
    1. Højreklik på peak liste fil, der skal bruges, anvende den til den "aktive spektrum" eller "alle spektre".
  8. Se data profiler. I "Profile" vinduet, til Brug bogstavet "M" passer til vindue (hele spektret) og bogstavet "N" til at passe til y-aksen. Brug Ctrl og rul hjulet til at justere profilen bredde. Eller bruge "/" og "*" i den centrale bord for at ændre y-aksen rækkevidde og højde.
  9. Eksporter data til yderligere plotte hjælp andre grafiske software efter den indledende analyse.
    1. For at eksportere en dybde profil, i "Profil" vinduet, klik på menuen "Filer", vælg derefter "Export & #34 ;, og vælg derefter "Gem som" a ".txt" fil.
    2. For at eksportere en m / z spektrum fil, i "Spectra" vinduet, klik på menuen "Filer", vælg derefter "Export", og derefter vælge "Gem som" a ".txt" fil.
    3. Sådan eksporteres en billedfil, i "Image" vinduet, print screen og gem som billedfilen.

6. ToF-SIMS data plotning og præsentation

Bemærk: Brug et grafisk værktøj til at plotte data efter SIMS data behandles ved hjælp af den instrumentale software.

  1. Brug et grafisk værktøj til at importere dataene.
  2. Gør et plot ved hjælp af m / z som x-aksen og peak intensitet som y-aksen for at vise den rekonstruerede spektrum. Et eksempel er givet i figur 1.
  3. Gør et plot ved hjælp af sputter tid som x-aksen og peak intensitet som y-aksen for at vise den rekonstruerede dybdeprofil tidsmæssig serie. Et eksempel er givet i Figure 2.
  4. Kombiner rekonstruerede 2D-billeder med forskellig m / z og danne en matrix for at vise ion kortlægning. Et eksempel er givet i figur 2.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Et par repræsentative resultater præsenteres for at demonstrere fordelene ved den foreslåede protokol. Ved at bruge SALVI mikrofluid interface, kan den primære ionstråle (Bi 3 +) direkte bombardere på det hydratiserede fibronectin film i DI vand. Således molekylære kemiske kortlægning af væskeoverfladen held kan erhverves.

Figur 1a og 1b viser den positive ToF-SIMS massespektre af det hydratiserede fibronectin film og DI vand hhv. Toppene af interesse, herunder vand klynger (dvs. m / z 19, 37, 55, 73, 91 og 109) og aminosyrefragmenter (dvs., m / z 30, 44, 61, 74, 81, 83, og 98) er angivet med de røde pile. Foruden de karakteristiske toppe af aminosyrefragmenter, som er blevet bredt rapporteret ved anvendelse tørre proteinprøver, er toppene af vand klynger observeret imassespektre af hydratiseret fibronectin film i DI vand. Desuden intensiteterne af disse vand klynge toppe er meget forskellige fra dem i massen spektre af DI vand. Dette resultat giver direkte bevis for egenskaben af ​​vandmolekyler omkring og inde i hydratiserede proteinmolekyler, der spiller en rolle i deres adsorption på en overflade.

Figur 2a viser dybden profil tidsserier af det hydrerede fibronectin film og DI vand. Da prøven er under SiN membran, intensiteten af udvalgte sekundære ioner er ubetydelige før SiN membranen er udstanset gennem (dvs. 280 sek for fibronektin og 340 sek for DI vand). Når SiN membranen stanses igennem, intensiteten af ​​disse sekundære ioner stige betydeligt. Ved brug af lange pulsbredde, massen opløsning er forholdsvis lav. Derfor er den korte bredde proces impuls anvendes til at opnå data med bedre masseopløsningfor billed- og spektrum rekonstruktioner som fremhævet i figur 2a. Efter en periode (dvs. 60 sekunder for fibronectin og 220 sek til DI vand), den reducerede impulsbredden anvendes til opnåelse m / z spektre med bedre masseopløsning. De endelige m / z spektre blev rekonstrueret fra 200 sec målinger markeret med grønt skraverede områder i dybden profil tidsmæssige serier. Figur 2b viser de 2D-billeder fra den hydratiserede fibronectin film og DI vand, som svarer til det grønne skraverede område i figur 2a. Disse 2D-billeder repræsenterer tællinger af udvalgte sekundære ioner fra prøven: jo lysere billede, jo højere sekundære ion tæller. Sådanne intuitive billeder giver en klar sammenligning af udvalgte sekundære ioner mellem forskellige prøver, som er nyttige i dataanalyse. Ifølge vores erfaringer, forskellen i SiN Punch-gennem tiden varierer fra parti til parti af Sin membraner. Men det påvirker ikke resultaterne af den dynamiske ToF-SIMS-analyse.

Figur 1
Figur 1: Sammenligninger af TOF-SIMS positive spektre af det hydrerede fibronectin film og DI-vand i SALVI mikrokanal (a) de rekonstruerede m / z-spektrum af fibronectin.. (B) DI vand spektrum.

Figur 2
Figur 2:. Dybde profiler og 2D-billeder hydratiseret fibronectin og DI vand (a) Dybden profilering tidsserie af fibronectin og DI-vand i positiv modus. (B) 2D-billeder rekonstrueret svarende til den grønne skraverede 200 sek tidssegmenter langs dybden profil tidsserier i (a). Adskillige karakteristiske mellem masse og ladning af relevans for vand klynger(Fx m / z 1, 19, 37, 55) er vist i tillæg til kendte aminosyre fragmenter (f.eks m / z 30, 83, 98). Klik her for at se en større version af dette tal.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

SALVI er en mikrofluid interface, der tillader dynamisk væskeoverflade og væske-faststof-grænsefladen analyse ved vakuum baserede instrumenter, såsom ToF-SIMS og scanningselektronmikroskopi (SEM). På grund af brugen af små åbninger for at eksponere væske direkte i vakuum, SALVI er velegnet til mange fint fokuserede spektroskopi og billedbehandling teknikker uden ændringer; 22 portabilitet og alsidighed mikrofluidik gør det til en sand multimodal imaging platform. Tydelige funktioner og betydning af SALVI i forhold til andre eksisterende teknikker er sammenfattet i flere seneste anmeldelser. 22-25 Som udvikleren af SALVI teknologi, har vores gruppe været aktivt anvende det på en række undersøgelser med dynamiske flydende overflader og flydende og faste stoffer grænseflader . Nogle eksempler på nye anvendelser omfatter mammale cellemembraner, bakterier biofilm fastgørelse, 15,16 eller nanopartikel dannelse som et resultat af vandige overflade oxidationer. I denne paper, vi præsenterer første flydende ToF-SIMS resultater af hydreret protein tynde film adsorberet på SiN overflade.

Det er helt afgørende at omhyggeligt håndtere de fremhævede trin i protokollen. For eksempel, når tegning væske ind i sprøjten i trin 1 og 2, skal du sørge for, at der ikke er nogen bobler inde i sprøjten. Fordi når boblerne injiceres i SALVI, kan de fremkalde lækage i vakuum. 9. Så hvis der observeres nogen bobler, er det klogt at slippe af med dem ved at sætte sprøjten lodret og forsigtigt skubbe boblerne ud. Desuden er det meget vigtigt at gøre SiN vindue i SALVI flad for optimeret ToF-SIMS-analyse, som beskrevet i trin 3. Dette levelness af detekteringsområdet direkte påvirker kvaliteten af data i henhold til design af ToF-SIMS. 26 Det er nødvendigt visuelt inspicere enheden efter at sikre alt ind på SIMS scenen. Hvis SiN vinduet ikke er vandret, justere skruerne og ændre højdenaf SALVI enheden for at sikre, at alt er på det samme plan så meget som muligt. Disse delikate punkter skal erfaring og omhyggelighed, som afgørende for succes og pålidelighed hele eksperimentet.

Som vist i figur 1b, toppene med m / z 19, 37, 55, 73, 91 og 109 har høje tællinger. Dette indikerer, at der er en god række af vand klynger (H 3 O +, H 5 O 2 +, H 7 O 3 +, H 9 O 4 +, H 11 O 5 + og H 13 O 6 +) i den positive sekundære ioner. De andre vand klynger (data ikke vist) med højere m / z-værdier har også relativt stærke toppe i forhold til deres nabolande toppe. Disse store mængder af vand klynger udsendes fra DI vandoverfladen efter SiN Punch-igennem. Vandklynge signaler i positiv modus har ikke været observerbare i forrige work; og dette blev tilskrevet lavt antal sekundære ioner og ikke-optimerede ToF-SIMS forhold i fortiden. 8 Med den fortsatte indsats optimere Salvi og ToF-SIMS akkvisitionsbetingelser såsom den primære ionstråle (dvs. Bi + vs . Bi 3 +), pulsbredde og aktuelle forhold under dybde profilering, er det nu muligt at observere op til 44 vand klynger i den positive tilstand ved hjælp af betingelserne præsenteret i dette papir. De viste resultater her er lovende for yderligere at undersøge rollen af ​​vand i dynamikken i forskellige biologiske molekyler og biologiske systemer.

Her som et eksempel for at illustrere fordelene ved SALVI og ToF-SIMS i at studere biologiske molekylær dynamik, blev hydrering af fibronektin protein præsenteres. Toppene af m / z 30, 44, 61, 74, 81, 83, og 98 hører til aminosyre fragmenter i henhold til den foregående rapport, 27,28, som er meget stærkere end DI watare vist i figur 1b. Denne forskel i den forøgede intensitet af aminosyre-fragmenter i fibronectin prøven viser, at disse sekundære ioner er faktisk fra proteinerne selv. Desuden toppene af vand klynger i figur 1a er meget stærkere end Dl-vand i figur 1b, hvilket indebærer, at egenskaberne af vandmolekyler i proteinet adsorption overflade og grænseflade-løsning kunne være meget forskellige fra dem i rent vand.

Figur 2a viser repræsentative dybde profilering tidsmæssig serie på to forskellige prøver: fibronectin og DI vand i SALVI mikrokanal. Profileringen data dybde blev indsamlet som vinduet SiN blev bombarderet af Bi 3 + primær ionstråle med den lange puls bredde. Som det ses i figur 2a, er vinduet SiN udstanset gennem på omkring 300 sek. Før SiN vindue i SALVI udstanses through, intensiteten af ​​udvalgte sekundære ioner er temmelig lav. Når vinduet synd er stanset igennem, intensiteterne af de sekundære ioner straks stige som væskeoverfladen begynder at blive bombarderet af den primære ion stråle. For eksempel intensiteterne af H + og H 3 O + viser en stor stigning, hvilket indikerer observation af vandoverfladen. 8,9 Selv intensiteterne er ustabile lige efter hulning-gennem eller ved grænsefladen, kan de når relativ stabil værdierne efter en tidsperiode (f.eks 60 sekunder ved fibronectin og 220 sek til DI vand henholdsvis i figur 2a). Forskellen i det lange pulsbredde boring ikke rigtig påvirke analyseresultaterne illustreret her, når rekonstruktion m / z spektre (f.eks, figur 1), fordi de effektive m / z spektre erhverves efter SiN Punch-igennem. Dog kan en forsker vælger at bruge de samme betingelser for alle prøverne for konsistens og lethed i at vælge datasektioner under dataanalyse. For at opnå bedre masseopløsning, blev impulsbredden efterfølgende reduceres og intensiteterne blev reduceret tilsvarende i den sidste del af dybden profilering eksperiment. Dybden profil tidsserier blev kontinuert opsamlet i yderligere 200 sekunder for at tilvejebringe rigelig data for m / z spektralanalyse. Segmenterne af tid, som m / z spektre blev rekonstrueret er fremhævet i grønne skraverede områder.

Fibronectin har været meget anvendt til overfladen adsorption før celledyrkning; Mange undersøgelser har vist fibronectin er ansvarlig for celleadhæsion og celle-biomateriale interaktioner. 19,20,29 En nylig undersøgelse kendetegnet tykkelsen af fibronectin adsorberet på poly (hydroxylethyl methacrylat) børster hjælp ellipsometri. Den fibronektin tynd film blev bestemt til at være 3-12 nm tyk. 30 En sådan tykkelse er rimeligt for dybden profilanalyse i en vandig Solution. 8,9 Med udviklingen af SALVI, direkte analyse af det hydratiserede protein adsorberet på den faste overflade er nu muligt. Denne tilgang kan potentielt har brede anvendelser i undersøgelse af interaktion mellem proteiner med faste overflader dynamisk.

Figur 2b viser den valgte 2D-billeder af forskellige sekundære ioner fra fibronectin og DI vandprøver hhv. 2D-billeder opnås fra dybde profilering temporale data i grønne skraverede områder i figur 2a, som svarer til væskeoverfladen efter SiN Punch-through som beskrevet tidligere. Billederne af udvalgte aminosyre fragment sekundære ioner CH 4 N +, C 5 H 7 O + og C 4 H 4 NO 2 + (dvs. m / z 30, 83 og 98) for fibronektin tynde film var meget lysere end de DI vand. Dette viser, at aminosyre-fragment sekundære ioner observeres from fibronektin molekylerne inde blænde den 2 um diameter. Endvidere billederne af udvalgte toppe (f.eks, m / z 1, 19, 37, og 55) svarende til flere vand klynger af fibronectin er bemærkelsesværdigt lysere end Dl-vand. Dette resultat viser, at hydratisering af fibronectin gør vandmolekylerne omgiver biomolekylet forskellig fra de vandmolekyler i DI-vand.

Sammenfattende har dette arbejde forudsat slående bevis på protein hydrering induceret vand molekyle ejendom ændringer. Sådanne resultater kunne give en forbedret grundlæggende forståelse på strukturen, kropsbygning, og den biologiske aktivitet af proteiner adsorberet på en fast overflade i den flydende mikromiljø.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
ToF-SIMS IONTOF TOF.SIMS 5 Resolution: >10,000 m/Δm for mass resolution; >4,000 m/Δm for high spatial resolution 
System for Analysis at the Liquid Vacuum Interface (SALVI) Pacific Northwest National Laboratory N/A SALVI is a unique, self-contained, portable analytical tool that, for the first time, enables vacuum-based scientific instruments such as time-of-flight secondary ion mass spectrometry (ToF-SIMS) to analyze liquid surfaces in their natural state at the molecular level.
PEEK Union Valco ZU1TPK for connecting the inlet and outlet of SALVI
5 Axes Sample Stage IONTOF N/A Stage is self-made for mounting SALVI in ToF-SIMS
Barnstead Nanopure Water Purification System Thermo Fisher Scientific D11921 ROpure LP Reverse Osmosis filtration module (D2716)
Syringe BD 309659 1 ml
Pipette Thermo Fisher Scientific 21-377-821 Range: 100 to 1,000 ml
Pipette Tip Neptune 2112.96.BS 1,000 µl
Centrifuge Tube Corning 430791 15 ml
Fibronectin Sigma-Aldrich F1141 1 mg/ml
Ethanol Thermo Fisher Scientific S25310A 95% Denatured
Gibco PBS Thermo Fisher Scientific 10010-023 pH 7.4

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Tompa, K., Bokor, M., Verebelyi, T., Tompa, P. Water rotation barriers on protein molecular surfaces. Chem. Phys. 448, 15-25 (2015).
  2. Maruyama, Y., Harano, Y. Does water drive protein folding? Chem. Phys. Lett. 581, 85-90 (2013).
  3. Chaplin, M. Opinion - Do we underestimate the importance of water in cell biology. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 7, (11), 861-866 (2006).
  4. Zhang, L., et al. Mapping hydration dynamics around a protein surface. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 104, (47), 18461-18466 (2007).
  5. Xia, N., May, C. J., McArthur, S. L., Castner, D. G. Time-of-flight secondary ion mass spectrometry analysis of conformational changes in adsorbed protein films. Langmuir. 18, (10), 4090-4097 (2002).
  6. Gray, J. J. The interaction of proteins with solid surfaces. Curr. Opin. Struct. Biol. 14, (1), 110-115 (2004).
  7. Wagner, M. S., Horbett, T. A., Castner, D. G. Characterization of the structure of binary and ternary adsorbed protein films using electron spectroscopy for chemical analysis, time-of-flight secondary ion mass spectrometry, and radiolabeling. Langmuir. 19, (5), 1708-1715 (2003).
  8. Yang, L., Yu, X. -Y., Zhu, Z., Iedema, M. J., Cowin, J. P. Probing liquid surfaces under vacuum using SEM and and ToF-SIMS. Lab Chip. 11, (15), 2481-2484 (2011).
  9. Yang, L., Yu, X. -Y., Zhu, Z. H., Thevuthasan, T., Cowin, J. P. Making a hybrid microfluidic platform compatible for in situ imaging by vacuum-based techniques. J. Vac. Sci. Technol. A. 29, (6), 061101 (2011).
  10. Yu, X. -Y., Yang, L., Zhu, Z. H., Cowin, J. P., Iedema, M. J. Probing aqueous surfaces by ToF-SIMS. LC GC N. Am. (Oct), 34-38 (2011).
  11. Yu, X. -Y., Yang, L., Cowin, J., Iedema, M., Zhu, Z. Systems and methods for analyzing liquids under vacuum. US patent. 8,555,710 B2 (2013).
  12. Yu, X. -Y., Liu, B., Yang, L., Zhu, Z., Marshall, M. J. Microfluidic electrochemical device and process for chemical imaging and electrochemical analysis at the electrode-liquid interface in situ. US patent. 20,140,038,224 A1 (2014).
  13. Yang, L., Zhu, Z., Yu, X. -Y., Thevuthasan, S., Cowin, J. P. Performance of a microfluidic device for in situ ToF-SIMS analysis of selected organic molecules at aqueous surfaces. Anal. Methods. 5, (10), 2515-2522 (2013).
  14. Yang, L., et al. In situ SEM and ToF-SIMS analysis of IgG conjugated gold nanoparticles at aqueous surfaces. Surf. Interface Anal. 46, (4), 224-228 (2014).
  15. Hua, X., et al. In situ molecular imaging of hydrated biofilm in a microfluidic reactor by ToF-SIMS. Analyst. 139, (7), 1609-1613 (2014).
  16. Hua, X., et al. Two-dimensional and three-dimensional dynamic imaging of live biofilms in a microchannel by time-of-flight secondary ion mass spectrometry. Biomicrofluidics. 9, (3), 031101 (2015).
  17. Liu, B., et al. In situ chemical probing of the electrode-electrolyte interface by ToF-SIMS. Lab Chip. 14, (5), 855-859 (2014).
  18. Pankov, R., Yamada, K. M. Fibronectin at a glance. J. Cell Sci. 115, (20), 3861-3863 (2002).
  19. Pierschbacher, M. D., Hayman, E. G., Ruoslahti, E. Location of the cell-attachment site in fibronectin with monoclonal antibodies and proteolytic fragments of the molecule. Cell. 26, (2), 259-267 (1981).
  20. Engvall, E., Ruoslahti, E. Binding of soluble form of fibroblast surface protein, fibronectin, to collagen. Int. J. Cancer. 20, (1), 1-5 (1977).
  21. Green, F. M., Gilmore, I. S., Seah, M. P. TOF-SIMS: Accurate mass scale calibration. J. Am. Soc. Mass Spectrom. 17, (4), 514-523 (2006).
  22. Yu, X. -Y., Liu, B., Yang, L. Imaging liquids using microfluidic cells. Microfluid. Nanofluid. 15, (6), 725-744 (2013).
  23. Shi, H., Lercher, J. A., Yu, X. -Y. Sailing into uncharted waters: recent advances in the in situ monitoring of catalytic processes in aqueous environments. Catal. Sci. Technol. 5, (6), 3035-3060 (2015).
  24. Deleu, M., Crowet, J. M., Nasir, M. N., Lins, L. Complementary biophysical tools to investigate lipid specificity in the interaction between bioactive molecules and the plasma membrane: A review. Biochim. Biophys. Acta-Biomembr. 1838, (12), 3171-3190 (2014).
  25. Kraft, M. L., Klitzing, H. A. Imaging lipids with secondary ion mass spectrometry. Biochim. Biophys. Acta Mol. Cell Biol. Lipids. 1841, (8), 1108-1119 (2014).
  26. Gilmore, I. S. SIMS of organics-Advances in 2D and 3D imaging and future outlook. J. Vac. Sci. Technol. A. 31, (5), 050819 (2013).
  27. Muramoto, S., et al. ToF-SIMS Analysis of Adsorbed Proteins: Principal Component Analysis of the Primary Ion Species Effect on the Protein Fragmentation Patterns. J. Phys. Chem. C. 115, (49), 24247-24255 (2011).
  28. Brüning, C., Hellweg, S., Dambach, S., Lipinsky, D., Arlinghaus, H. F. Improving the interpretation of ToF-SIMS measurements on adsorbed proteins using PCA. Surf. Interface Anal. 38, (4), 191-193 (2006).
  29. Gustavsson, J., et al. Surface modifications of silicon nitride for cellular biosensor applications. J. Mater. Sci.-Mater. Med. 19, (4), 1839-1850 (2008).
  30. Deng, J., Ren, T. C., Zhu, J. Y., Mao, Z. W., Gao, C. Y. Adsorption of plasma proteins and fibronectin on poly(hydroxylethyl methacrylate) brushes of different thickness and their relationship with adhesion and migration of vascular smooth muscle cells. Regen Biomater. 17-25 (2014).
<em>In situ</em> karakterisering af Hydratformerne Proteiner i vand ved Salvi og ToF-SIMS
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Yu, J., Zhou, Y., Hua, X., Zhu, Z., Yu, X. Y. In Situ Characterization of Hydrated Proteins in Water by SALVI and ToF-SIMS. J. Vis. Exp. (108), e53708, doi:10.3791/53708 (2016).More

Yu, J., Zhou, Y., Hua, X., Zhu, Z., Yu, X. Y. In Situ Characterization of Hydrated Proteins in Water by SALVI and ToF-SIMS. J. Vis. Exp. (108), e53708, doi:10.3791/53708 (2016).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter