In Situ Karakterisering av Hydratiserte Proteiner i vann ved Salvi og TOF-SIMS
Summary
Dette arbeidet viser en protokoll for væskehåndtering og prøve innføring i en microchannel for in situ time-of-flight secondary ion mass spectrometry analyse av protein biomolekyler i en vandig oppløsning.
Abstract
Dette arbeidet viser in situ karakterisering av protein biomolekyler i vandig løsning ved hjelp av System for analyse i Liquid Vacuum Interface (SALVI) og time-of-flight sekundær ion massespektrometri (TOF-SIMS). Den fibronektin protein Filmen ble immobilisert på silisiumnitrid (SiN) membran som danner SALVI registreringsområdet. Under TOF-SIMS-analyse, ble tre modi for analyse utført inkludert høy romlig oppløsning massespektrometri, to-dimensjonale (2D) avbildning, og dybde profilering. Massespektra ble kjøpt i både positive og negative moduser. Avionisert vann ble også analysert som en referanseprøve. Våre resultater viser at fibronektin filmen i vann har flere distinkte og sterkere vann cluster topper sammenlignet med vann alene. Karakteristiske toppene aminosyre fragmenter er også observerbare i hydrert protein TOF-SIMS spektra. Disse resultatene illustrerer at proteinmolekyl adsorpsjon på en overflate kan studeres Dynamically hjelp SALVI og TOF-SIMS i væsken miljø for første gang.
Introduction
Hydrering er avgjørende for konstruksjonen, en konformasjon, 2 og biologisk aktivitet tre av proteiner. Proteiner uten vannmolekyler som omgir dem ville ikke ha livskraftige biologiske aktiviteter. Nærmere bestemt vannmolekyler kommuniserer med overflaten og indre struktur av proteiner, og forskjellige hydrering tilstander av proteiner gjøre slike interaksjoner tydelig. 4 Interaksjonen mellom proteiner med faste overflater er en grunnleggende fenomen med implikasjoner i nanoteknologi, biomaterialer og vev tekniske prosesser. Studier har lenge indikert at konformasjonelle forandringer kan oppstå som et protein oppstår en overflate. TOF-SIMS har blitt tenkt som den teknikk som har potensial til å studere protein-faststoffgrenseflaten. 5-7 er det viktig å forstå hydrering av proteiner på faste overflater, noe som potensielt gir en grunnleggende forståelse av mekanismen for deres struktur, konformasjon og biologiskal aktivitet.
Men hovedflate analytiske teknikker er for det meste vakuumbasert og direkte applikasjoner for flyktige flytende studier er vanskelig på grunn av den hurtige fordampning av flyktig væske under vakuum miljø. Vi utviklet et vakuum kompatibel microfluidic grensesnitt, System for analyse i Liquid Vacuum Interface (SALVI), for å muliggjøre direkte observasjoner av flytende overflater og væske solid samhandling ved hjelp av time-of-flight sekundær ion massespektrometri (TOF-SIMS). 8- 11 den unike aspekter omfatter følgende: 1) deteksjonsvinduet er en åpning på 2-3 mikrometer i diameter tillater direkte avbildning av væskeoverflaten, 2) overflatespenningen brukes til å holde væsken i åpningen, og 3) er SALVI portable mellom flere analytiske plattformer. 11,12
SALVI er sammensatt av et silisiumnitrid (SiN) membran som registreringsområdet, og en microchannel fremstilt av polydimetylsiloksan (PDMS). Det er fabricated i rent rom, og fabrikasjon og nøkkelen design faktorer har blitt beskrevet i tidligere artikler og patenter. 8-12 Søknadene av TOF-SIMS som et analytisk verktøy ble demonstrert ved hjelp av en rekke vannløsninger og komplekse flytende blandinger, noen av som inneholdt nanopartikler. 13-17 Nærmere bestemt tillater SALVI væske TOF-SIMS dynamisk sondering av væske-faststoffgrenseflaten av levende biologiske systemer (dvs. biofilm), enkeltceller, og faststoff-elektrolytt-grensesnittet, åpner nye muligheter for in situ kondensert fase studier inkludert væsker ved hjelp av TOF-SIMS. Men den nåværende utforming ikke tillate gass-væske interaksjoner ennå. Dette er en retning for fremtidig utvikling. SALVI har blitt brukt til å studere det hydratiserte proteinet filmen i dette arbeidet for første gang.
Fibronektin er et vanlig brukt protein dimer, som består av to nesten identiske monomerer forbundet av et par av disulfidbindinger, 18, som jegs som er kjent for sin evne til å binde celler. 19,20 Det ble valgt som et modellsystem for å illustrere at det hydratiserte proteinet filmen kan være dynamisk analysert ved hjelp av SALVI flytende TOF-SIMS tilnærming. Proteinløsningen ble innført i microchannel. Etter inkubering i 12 timer, et hydratisert proteinfilm dannet på baksiden av SiN membranen. Deionisert (DI) vann ble anvendt for å skylle av kanalen etter at proteinet innledning. Informasjon ble samlet inn fra hydrerte fibronektin proteinmolekyler i SALVI microchannel bruker dynamisk TOF-SIMS. DI vann ble også undersøkt som en kontroll for å sammenligne med resultatene fra hydrert fibronektin tynn film. Det ble ikke observert tydelige forskjeller mellom hydrert protein film og DI vann. Dette arbeidet viser at protein adsorpsjon på overflaten i væsken miljøet kan studeres ved hjelp av romanen SALVI og væske TOF-SIMS tilnærming. Videoen protokollen er ment å gi teknisk veiledning for folk som er interesserti å utnytte denne nye analyseverktøy for ulike anvendelser av SALVI med TOF-SIMS og redusere unødvendige feil i væskehåndtering samt TOF-SIMS datainnsamling og analyse.
Protocol
Representative Results
Discussion
SALVI er en microfluidic grensesnitt som lar dynamisk væskeoverflaten og væske-solid grensesnitt analyse av vakuumbaserte instrumenter, for eksempel TOF-SIMS og scanning elektronmikroskopi (SEM). På grunn av bruken av små åpninger for å utsette væsken direkte i vakuum, er SALVI egnet for mange fint fokuserte spektroskopi og bildeteknikker uten noen modifikasjoner, 22 portabilitet og allsidighet MicroFluidics gjør det til en sann multimodal bildebehandling plattformen. Forskjellige funksjoner og betydn…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We are grateful to the Pacific Northwest National Laboratory (PNNL) Chemical Imaging Initiative-Laboratory Directed Research and Development (CII-LDRD) and Materials Synthesis and Simulation across Scales (MS3) Initiative LDRD fund for support. Instrumental access was provided through a W. R. Wiley Environmental Molecular Sciences Laboratory (EMSL) Science Themed Proposal. EMSL is a national scientific user facility sponsored by the Office of Biological and Environmental Research (BER) at PNNL. The authors thank Mr. Xiao Sui, Mr. Yuanzhao Ding, and Ms. Juan Yao for proof reading the manuscript and providing useful feedback. PNNL is operated by Battelle for the DOE under Contract DE-AC05-76RL01830.
Materials
| ToF-SIMS | IONTOF | TOF.SIMS 5 | Resolution: > 10,000 m/Δm for mass resolution; > 4,000 m/Δm for high spatial resolution |
| System for Analysis at the Liquid Vacuum Interface (SALVI) | Pacific Northwest National Laboratory | N/A | SALVI is a unique, self-contained, portable analytical tool that, for the first time, enables vacuum-based scientific instruments such as time-of-flight secondary ion mass spectrometry (ToF-SIMS) to analyze liquid surfaces in their natural state at the molecular level. |
| PEEK Union | Valco | ZU1TPK | for connecting the inlet and outlet of SALVI |
| 5 Axes Sample Stage | IONTOF | N/A | Stage is self-made for mounting SALVI in ToF-SIMS |
| Barnstead Nanopure Water Purification System | Thermo Fisher Scientific | D11921 | ROpure LP Reverse Osmosis filtration module (D2716) |
| Syringe | BD | 309659 | 1 mL |
| Pipette | Thermo Fisher Scientific | 21-377-821 | Range: 100 to 1000 mL |
| Pipette Tip | Neptune | 2112.96.BS | 1000 µL |
| Centrifuge Tube | Corning | 430791 | 15 mL |
| Fibronectin | Sigma-Aldrich | F1141 | 1 mg/mL |
| Ethanol | Thermo Fisher Scientific | S25310A | 95% Denatured |
| Gibco PBS | Thermo Fisher Scientific | 10010-023 | pH 7.4 |
References
- Tompa, K., Bokor, M., Verebelyi, T., Tompa, P. Water rotation barriers on protein molecular surfaces. Chem. Phys. 448, 15-25 (2015).
- Maruyama, Y., Harano, Y. Does water drive protein folding?. Chem. Phys. Lett. 581, 85-90 (2013).
- Chaplin, M. Opinion – Do we underestimate the importance of water in cell biology. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 7 (11), 861-866 (2006).
- Zhang, L., et al. Mapping hydration dynamics around a protein surface. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 104 (47), 18461-18466 (2007).
- Xia, N., May, C. J., McArthur, S. L., Castner, D. G. Time-of-flight secondary ion mass spectrometry analysis of conformational changes in adsorbed protein films. Langmuir. 18 (10), 4090-4097 (2002).
- Gray, J. J. The interaction of proteins with solid surfaces. Curr. Opin. Struct. Biol. 14 (1), 110-115 (2004).
- Wagner, M. S., Horbett, T. A., Castner, D. G. Characterization of the structure of binary and ternary adsorbed protein films using electron spectroscopy for chemical analysis, time-of-flight secondary ion mass spectrometry, and radiolabeling. Langmuir. 19 (5), 1708-1715 (2003).
- Yang, L., Yu, X. -. Y., Zhu, Z., Iedema, M. J., Cowin, J. P. Probing liquid surfaces under vacuum using SEM and and ToF-SIMS. Lab Chip. 11 (15), 2481-2484 (2011).
- Yang, L., Yu, X. -. Y., Zhu, Z. H., Thevuthasan, T., Cowin, J. P. Making a hybrid microfluidic platform compatible for in situ imaging by vacuum-based techniques. J. Vac. Sci. Technol. A. 29 (6), 061101 (2011).
- Yu, X. -. Y., Yang, L., Zhu, Z. H., Cowin, J. P., Iedema, M. J. Probing aqueous surfaces by ToF-SIMS. LC GC N. Am. (Oct), 34-38 (2011).
- Yu, X. -. Y., Yang, L., Cowin, J., Iedema, M., Zhu, Z. Systems and methods for analyzing liquids under vacuum. US patent. , (2013).
- Yu, X. -. Y., Liu, B., Yang, L., Zhu, Z., Marshall, M. J. Microfluidic electrochemical device and process for chemical imaging and electrochemical analysis at the electrode-liquid interface in situ. US patent. , (2014).
- Yang, L., Zhu, Z., Yu, X. -. Y., Thevuthasan, S., Cowin, J. P. Performance of a microfluidic device for in situ ToF-SIMS analysis of selected organic molecules at aqueous surfaces. Anal. Methods. 5 (10), 2515-2522 (2013).
- Yang, L., et al. In situ SEM and ToF-SIMS analysis of IgG conjugated gold nanoparticles at aqueous surfaces. Surf. Interface Anal. 46 (4), 224-228 (2014).
- Hua, X., et al. In situ molecular imaging of hydrated biofilm in a microfluidic reactor by ToF-SIMS. Analyst. 139 (7), 1609-1613 (2014).
- Hua, X., et al. Two-dimensional and three-dimensional dynamic imaging of live biofilms in a microchannel by time-of-flight secondary ion mass spectrometry. Biomicrofluidics. 9 (3), 031101 (2015).
- Liu, B., et al. In situ chemical probing of the electrode-electrolyte interface by ToF-SIMS. Lab Chip. 14 (5), 855-859 (2014).
- Pankov, R., Yamada, K. M. Fibronectin at a glance. J. Cell Sci. 115 (20), 3861-3863 (2002).
- Pierschbacher, M. D., Hayman, E. G., Ruoslahti, E. Location of the cell-attachment site in fibronectin with monoclonal antibodies and proteolytic fragments of the molecule. Cell. 26 (2), 259-267 (1981).
- Engvall, E., Ruoslahti, E. Binding of soluble form of fibroblast surface protein, fibronectin, to collagen. Int. J. Cancer. 20 (1), 1-5 (1977).
- Green, F. M., Gilmore, I. S., Seah, M. P. TOF-SIMS: Accurate mass scale calibration. J. Am. Soc. Mass Spectrom. 17 (4), 514-523 (2006).
- Yu, X. -. Y., Liu, B., Yang, L. Imaging liquids using microfluidic cells. Microfluid. Nanofluid. 15 (6), 725-744 (2013).
- Shi, H., Lercher, J. A., Yu, X. -. Y. Sailing into uncharted waters: recent advances in the in situ monitoring of catalytic processes in aqueous environments. Catal. Sci. Technol. 5 (6), 3035-3060 (2015).
- Deleu, M., Crowet, J. M., Nasir, M. N., Lins, L. Complementary biophysical tools to investigate lipid specificity in the interaction between bioactive molecules and the plasma membrane: A review. Biochim. Biophys. Acta-Biomembr. 1838 (12), 3171-3190 (2014).
- Kraft, M. L., Klitzing, H. A. Imaging lipids with secondary ion mass spectrometry. Biochim. Biophys. Acta Mol. Cell Biol. Lipids. 1841 (8), 1108-1119 (2014).
- Gilmore, I. S. SIMS of organics-Advances in 2D and 3D imaging and future outlook. J. Vac. Sci. Technol. A. 31 (5), 050819 (2013).
- Muramoto, S., et al. ToF-SIMS Analysis of Adsorbed Proteins: Principal Component Analysis of the Primary Ion Species Effect on the Protein Fragmentation Patterns. J. Phys. Chem. C. 115 (49), 24247-24255 (2011).
- Brüning, C., Hellweg, S., Dambach, S., Lipinsky, D., Arlinghaus, H. F. Improving the interpretation of ToF-SIMS measurements on adsorbed proteins using PCA. Surf. Interface Anal. 38 (4), 191-193 (2006).
- Gustavsson, J., et al. Surface modifications of silicon nitride for cellular biosensor applications. J. Mater. Sci.-Mater. Med. 19 (4), 1839-1850 (2008).
- Deng, J., Ren, T. C., Zhu, J. Y., Mao, Z. W., Gao, C. Y. Adsorption of plasma proteins and fibronectin on poly(hydroxylethyl methacrylate) brushes of different thickness and their relationship with adhesion and migration of vascular smooth muscle cells. Regen Biomater. , 17-25 (2014).
