Dette arbejde viser en protokol til flydende håndtering og indføring af prøve til en mikrokanal til in situ time-of-flight sekundær ion massespektrometri-analyse af biomolekyler i en vandig opløsning.
Dette arbejde viser in situ karakterisering af protein biomolekyler i den vandige opløsning ved hjælp af systemet for analyse på Liquid Vacuum Interface (SALVI) og time-of-flight sekundær ion massespektrometri (ToF-SIMS). Den fibronectin protein film blev immobiliseret på siliciumnitrid (SiN) membran, der danner SALVI detekteringsområdet. Under ToF-SIMS-analyse, blev tre former for analyse udført herunder høj rumlig opløsning massespektrometri, todimensional (2D) billedbehandling, og dybde profilering. Massespektre blev opnået i både positive og negative tilstande. Deioniseret vand blev også analyseret som en referenceprøve. Vores resultater viser, at fibronectin film i vand har flere særskilte og stærkere vand klynge toppe sammenlignet med vand alene. Karakteristiske toppe af aminosyre fragmenter er også observeres i hydreret protein ToF-SIMS spektre. Disse resultater illustrerer, at proteinmolekyle adsorption på en overflade kan studeres Dynamically bruger SALVI og ToF-SIMS i flydende miljø for første gang.
Hydrering er afgørende for strukturen, 1 konformation, 2 og biologisk aktivitet 3 af proteiner. Proteiner uden vandmolekyler omgiver dem ville ikke have levedygtige biologiske aktiviteter. Specifikt vandmolekyler interagerer med overfladen og interne struktur af proteiner, og forskellige hydrering tilstande af proteiner gør sådanne interaktioner forskellige. 4 Interaktionen af proteiner med faste overflader er et grundlæggende fænomen med implikationer i nanoteknologi, biomaterialer og vævsmanipulering processer. Undersøgelser har længe indikeret, at der kan forekomme konformationelle ændringer som et protein møder en overflade. ToF-SIMS er blevet planlagt som den teknik, der har potentiale til at studere protein-faststof-grænsefladen. 5-7 Det er vigtigt at forstå hydreringen af proteiner på faste overflader, hvilket potentielt giver en grundlæggende forståelse af mekanismen i deres struktur, kropsbygning, og biologiskal aktivitet.
Men større overflade analyseteknikker er for det meste vakuum-baserede og direkte ansøgninger for flygtige væskeformige undersøgelser er vanskelig på grund af den hurtige fordampning af flygtige væske under vakuum miljø. Vi udviklede et vakuum kompatibel mikrofluid interface, System til analyse på Liquid Vacuum Interface (SALVI), for at muliggøre direkte observationer af flydende overflader og flydende og faste stoffer interaktioner ved hjælp af time-of-flight sekundær ion massespektrometri (ToF-SIMS). 8- 11 de unikke aspekter omfatter følgende: 1) vinduet påvisning er en åbning på 2-3 um i diameter muliggør direkte afbildning af væskeoverfladen, 2) overfladespænding anvendes til at holde væsken inden i åbningen, og 3) SALVI er bærbare mellem flere analytiske platforme. 11,12
SALVI er sammensat af en siliciumnitrid (SiN) membran som detekteringsområdet og en mikrokanal lavet af polydimethylsiloxan (PDMS). Det er fabricated i rene rum, og fremstilling og centrale design faktorer er blevet beskrevet i tidligere artikler og patenter. 8-12 Ansøgningerne fra ToF-SIMS som et analytisk værktøj blev demonstreret ved hjælp af forskellige vandige opløsninger og komplekse flydende blandinger, nogle af som indeholdt nanopartikler. 13-17 Konkret SALVI flydende ToF-SIMS tillader dynamisk sondering af væske-faststof-grænsefladen af levende biologiske systemer (dvs. biofilm), enkelte celler, og faststof-elektrolyt interface, åbner nye muligheder for in situ kondenseret fase undersøgelser, herunder væsker ved hjælp ToF-SIMS. Men den nuværende udformning ikke tillader gas-væske interaktioner endnu. Dette er en retning for den fremtidige udvikling. SALVI er blevet anvendt til at undersøge den hydratiserede protein film i dette arbejde for første gang.
Fibronectin er et almindeligt anvendt protein dimer, der består af to næsten identiske monomerer forbundet af et par disulfidbindinger, 18, som is kendt for sin evne til at binde celler. 19,20 Det blev valgt som et modelsystem til at illustrere, at det hydratiserede proteinfilm kan dynamisk probes under anvendelse af SALVI flydende ToF-SIMS tilgang. Proteinopløsningen blev indført i mikrokanal. Efter inkubering i 12 timer blev en hydreret protein film dannet på bagsiden af SiN membranen. Deioniseret (DI) vand blev anvendt til at skylle kanalen efter protein introduktion. Der blev indsamlet fra hydrerede fibronektin proteinmolekyler i SALVI mikrokanalplade bruge dynamisk ToF-SIMS. DI vand blev også undersøgt som en kontrol til at sammenligne med resultater opnået fra hydreret fibronektin tynd film. Der blev observeret tydelige forskelle mellem den hydratiserede protein film og DI vand. Dette arbejde viser, at protein adsorption på overfladen i den flydende miljø kan studeres ved hjælp af romanen SALVI og flydende ToF-SIMS tilgang. Videoen protokollen er beregnet til at give teknisk vejledning for folk, der er interesseredei at udnytte dette nye analytisk værktøj til forskellige anvendelser af SALVI med ToF-SIMS og reducere unødvendige fejl i væskehåndtering samt ToF-SIMS indsamling og analyse af data.
SALVI er en mikrofluid interface, der tillader dynamisk væskeoverflade og væske-faststof-grænsefladen analyse ved vakuum baserede instrumenter, såsom ToF-SIMS og scanningselektronmikroskopi (SEM). På grund af brugen af små åbninger for at eksponere væske direkte i vakuum, SALVI er velegnet til mange fint fokuserede spektroskopi og billedbehandling teknikker uden ændringer; 22 portabilitet og alsidighed mikrofluidik gør det til en sand multimodal imaging platform. Tydelige funktioner og betydning af …
The authors have nothing to disclose.
We are grateful to the Pacific Northwest National Laboratory (PNNL) Chemical Imaging Initiative-Laboratory Directed Research and Development (CII-LDRD) and Materials Synthesis and Simulation across Scales (MS3) Initiative LDRD fund for support. Instrumental access was provided through a W. R. Wiley Environmental Molecular Sciences Laboratory (EMSL) Science Themed Proposal. EMSL is a national scientific user facility sponsored by the Office of Biological and Environmental Research (BER) at PNNL. The authors thank Mr. Xiao Sui, Mr. Yuanzhao Ding, and Ms. Juan Yao for proof reading the manuscript and providing useful feedback. PNNL is operated by Battelle for the DOE under Contract DE-AC05-76RL01830.
ToF-SIMS | IONTOF | TOF.SIMS 5 | Resolution: > 10,000 m/Δm for mass resolution; > 4,000 m/Δm for high spatial resolution |
System for Analysis at the Liquid Vacuum Interface (SALVI) | Pacific Northwest National Laboratory | N/A | SALVI is a unique, self-contained, portable analytical tool that, for the first time, enables vacuum-based scientific instruments such as time-of-flight secondary ion mass spectrometry (ToF-SIMS) to analyze liquid surfaces in their natural state at the molecular level. |
PEEK Union | Valco | ZU1TPK | for connecting the inlet and outlet of SALVI |
5 Axes Sample Stage | IONTOF | N/A | Stage is self-made for mounting SALVI in ToF-SIMS |
Barnstead Nanopure Water Purification System | Thermo Fisher Scientific | D11921 | ROpure LP Reverse Osmosis filtration module (D2716) |
Syringe | BD | 309659 | 1 mL |
Pipette | Thermo Fisher Scientific | 21-377-821 | Range: 100 to 1000 mL |
Pipette Tip | Neptune | 2112.96.BS | 1000 µL |
Centrifuge Tube | Corning | 430791 | 15 mL |
Fibronectin | Sigma-Aldrich | F1141 | 1 mg/mL |
Ethanol | Thermo Fisher Scientific | S25310A | 95% Denatured |
Gibco PBS | Thermo Fisher Scientific | 10010-023 | pH 7.4 |