サルヴィとTOF-SIMSによる水中で水和タンパク質のその場キャラクタリゼーションで
Summary
この作業は、水溶液中のタンパク質の生体分子のその場での飛行時間型二次イオン質量分析のためにマイクロチャネルに液体ハンドリング及び試料導入のためのプロトコルを示します。
Abstract
この作業は、液体真空インターフェース（サルヴィ）および飛行時間型二次イオン質量分析法（TOF-SIMS）での分析のためのシステムを使用して、水溶液中のタンパク質の生体分子のその場特徴付けに実証しています。フィブロネクチンタンパク質フィルムはサルヴィ検出領域を形成する窒化シリコン（SiN）膜上に固定化しました。 TOF-SIMS分析中、分析の三つのモードは、高空間分解能質量分析、二次元（2D）画像、深さプロファイリングを含む行いました。質量スペクトルは、正と負の両方のモードで取得しました。脱イオン水は、また、基準サンプルとして分析しました。我々の結果は、水中のフィブロネクチン膜は水のみと比較して、より明確で強い水クラスターのピークを有することを示します。アミノ酸断片の特徴的なピークは、水和タンパク質TOF-SIMSスペクトルにおいても観察されています。これらの結果は、表面上のタンパク質分子の吸着はdynamicaを研究することができることを示しますLLY初めて液体環境にサルヴィとTOF-SIMSを用いました。
Introduction
水分補給は、構造、1コンフォメーション、2およびタンパク質の生物学的活性を3に不可欠です。それらを取り囲む水分子のないタンパク質は、生存可能な生物学的活性を持っていないでしょう。具体的には、水の分子が表面と相互作用およびタンパク質の内部構造、およびタンパク質の異なる水和状態は、このような相互作用が別個にする。4固体表面とのタンパク質の相互作用は、ナノテクノロジー、バイオマテリアルと組織工学プロセスにおける意義と基本的な現象です。研究は、長いタンパク質が表面に遭遇すると立体構造変化が発生する可能性があることが示されています。 TOF-SIMSは、タンパク質-固体界面を研究する可能性を秘めている技術として想定されている。5-7潜在的にその構造のメカニズムの基本的な理解を提供する固体表面上のタンパク質の水和を、理解することが重要です、コンフォメーション、および生物学アル・アクティビティ。
しかし、主要な表面分析技術は、主に真空ベースであり、揮発性液体の研究のための直接のアプリケーションが原因で、真空環境下での揮発性液体の急速な蒸発のために困難です。我々は、液体の表面および液体-固体相互作用（TOF-SIMS）飛行時間型二次イオン質量分析法を用いて直接観察を可能にするために、液体真空インターフェース（サルヴィ）で分析するために、互換性のあるマイクロ流体インターフェースシステム真空を開発しました。8- 1）検出ウィンドウ2）の表面張力を開口部内に液体を保持するために使用され、そして3）サルヴィは、液面の直接撮像を可能にする直径2-3ミクロンの開口部である：11のユニークな態様は、以下が挙げられます複数の分析プラットフォーム間でポータブル。11,12
サルヴィは、検出領域及びポリジメチルシロキサン（PDMS）からなるマイクロチャネルとして窒化シリコン（SiN）膜で構成されています。それはfabrですクリーンルーム内でicated、および製造および主要な設計要因は、前の論文や特許に詳述されている。8月12日 TOF-SIMSのアプリケーション分析ツールは、水溶液と、複雑な液体混合物のさまざまな方法を使って実証されたように、いくつかのこれはナノ粒子を含んでいた。13-17具体的には、サルヴィ液体TOF-SIMSは、 その場で凝縮相のための新しい機会を開き、ライブ生物系（ すなわち 、バイオフィルム）、単一細胞、および固体-電解質界面の液体-固体界面のプロービングダイナミックできますTOF-SIMSを使用して液体を含む研究。しかし、現在の設計は、まだ気液相互作用を許可していません。これは、将来の発展の方向性です。サルヴィは、初めてこの研究で水和タンパク質膜を研究するために使用されてきました。
フィブロネクチンは、ジスルフィド結合の組によって連結された2つの略同一のモノマーからなる、18れるI一般的に使用されるタンパク質二量体であります細胞に結合する能力についてよく知られているよ。19,20は、それが水和タンパク質フィルムを動的サルヴィ液体TOF-SIMS法を用いて調べることができたことを示すためにモデル系として選択しました。タンパク質溶液をマイクロチャネルに導入しました。 12時間インキュベートした後、水和タンパク質膜のSiN膜の裏面に形成されました。脱イオン（DI）水を、タンパク質導入の後にチャネルを洗い流すために使用しました。情報は、動的TOF-SIMSを用いサルヴィマイクロチャネル内の水和フィブロネクチンタンパク分子から収集しました。 DI水はまた、水和フィブロネクチン薄膜から得られた結果と比較するための対照として調べました。明確な違いは、水和タンパク質フィルムとDI水との間で観察されました。この作業は、液体環境における表面上のタンパク質吸着は、新規サルヴィと液体TOF-SIMS法を用いて研究することができることを示しています。ビデオプロトコルは、興味のある人々のための技術的なガイダンスを提供することを意図していますTOF-SIMSとサルヴィの多様なアプリケーションのためのこの新しい分析ツールを利用することで、不要な液体ハンドリングミスと同様にTOF-SIMSデータ収集と分析を減らします。
Protocol
Representative Results
Discussion
サルヴィは、TOF-SIMS、走査型電子顕微鏡（SEM）等の真空ベースの機器によって動的液面と液体 – 固体界面の分析を可能にするマイクロ流体インターフェースです。真空中で液体を直接公開するための小さな開口の使用に、サルヴィは、任意の変更を加えることなく、多くの細く絞った分光法とイメージング技術に適しており、マイクロ流体工学の22移植性と汎用性は、真のマルチモー?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We are grateful to the Pacific Northwest National Laboratory (PNNL) Chemical Imaging Initiative-Laboratory Directed Research and Development (CII-LDRD) and Materials Synthesis and Simulation across Scales (MS3) Initiative LDRD fund for support. Instrumental access was provided through a W. R. Wiley Environmental Molecular Sciences Laboratory (EMSL) Science Themed Proposal. EMSL is a national scientific user facility sponsored by the Office of Biological and Environmental Research (BER) at PNNL. The authors thank Mr. Xiao Sui, Mr. Yuanzhao Ding, and Ms. Juan Yao for proof reading the manuscript and providing useful feedback. PNNL is operated by Battelle for the DOE under Contract DE-AC05-76RL01830.
Materials
| ToF-SIMS | IONTOF | TOF.SIMS 5 | Resolution: > 10,000 m/Δm for mass resolution; > 4,000 m/Δm for high spatial resolution |
| System for Analysis at the Liquid Vacuum Interface (SALVI) | Pacific Northwest National Laboratory | N/A | SALVI is a unique, self-contained, portable analytical tool that, for the first time, enables vacuum-based scientific instruments such as time-of-flight secondary ion mass spectrometry (ToF-SIMS) to analyze liquid surfaces in their natural state at the molecular level. |
| PEEK Union | Valco | ZU1TPK | for connecting the inlet and outlet of SALVI |
| 5 Axes Sample Stage | IONTOF | N/A | Stage is self-made for mounting SALVI in ToF-SIMS |
| Barnstead Nanopure Water Purification System | Thermo Fisher Scientific | D11921 | ROpure LP Reverse Osmosis filtration module (D2716) |
| Syringe | BD | 309659 | 1 mL |
| Pipette | Thermo Fisher Scientific | 21-377-821 | Range: 100 to 1000 mL |
| Pipette Tip | Neptune | 2112.96.BS | 1000 µL |
| Centrifuge Tube | Corning | 430791 | 15 mL |
| Fibronectin | Sigma-Aldrich | F1141 | 1 mg/mL |
| Ethanol | Thermo Fisher Scientific | S25310A | 95% Denatured |
| Gibco PBS | Thermo Fisher Scientific | 10010-023 | pH 7.4 |
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