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Chemistry

In Situ Caracterização de Proteínas hidratadas em água por SALVI e TOF-SIMS

doi: 10.3791/53708 Published: February 15, 2016
* These authors contributed equally

Summary

Este trabalho apresenta um protocolo para o manuseamento de líquidos e a introdução da amostra a um microcanal para in situ de tempo-de-voo de iões secundários análise de espectrometria de massa de biomoléculas de proteína numa solução aquosa.

Abstract

Este trabalho demonstra a caracterização no local de biomoléculas de proteína na solução aquosa utilizando o Sistema de Análise na Interface de líquidos de vácuo (SALVI) e espectrometria de massa de íons secundários time-of-flight (TOF-SIMS). O filme proteína fibronectina foi imobilizado sobre a membrana de nitreto de silício (SIN), que forma a área de detecção Salvi. Durante a análise TOF-SIMS, três modos de análise foram realizados, incluindo alta espectrometria de massa espacial resolução, imagens bidimensionais (2D) e perfis de profundidade. Os espectros de massa foram adquiridos em ambos os modos positivos e negativos. água desionizada, também foi analisada como uma amostra de referência. Os nossos resultados mostram que a película de fibronectina em água tem picos de fragmentação água mais distintos e mais fortes em comparação com água sozinha. Picos característicos de fragmentos de aminoácidos também são observáveis ​​na proteína hidratado TOF-SIMS espectros. Estes resultados ilustram que a molécula de proteína de adsorção sobre uma superfície pode ser estudada Dynamically usando SALVI e TOF-SIMS no meio líquido para a primeira vez.

Introduction

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A hidratação é crucial para a estrutura, uma conformação, 2 e 3, a actividade biológica das proteínas. Proteínas sem as moléculas de água em torno deles não têm atividades biológicas viáveis. Especificamente, as moléculas de água interagir com a superfície interna e estrutura das proteínas, e diferentes estados de hidratação de proteínas fazer tais interacções distinta. 4 A interacção de proteínas com superfícies sólidas é um fenómeno fundamental com implicações em nanotecnologia, biomateriais e processos de engenharia de tecidos. Estudos têm indicado que a longo alterações conformacionais podem ocorrer como uma proteína encontra uma superfície. TOF-SIMS foi visualizada como a técnica que tem o potencial para estudar a interface de proteína-sólido 7/5. É importante compreender a hidratação de proteínas sobre superfícies sólidas, o que potencialmente oferece uma compreensão fundamental do mecanismo da sua estrutura, conformação e biológicaactividade al.

No entanto, as técnicas analíticas superfície principal está baseada em vácuo e aplicações diretas para estudos líquidos voláteis são difíceis devido à rápida evaporação do líquido volátil sob o ambiente de vácuo. Nós desenvolvemos um vácuo de interface microfluídico compatível, Sistema de Análise na Interface de líquidos de vácuo (SALVI), para permitir a observação direta de superfícies líquidas e interações líquido-sólido utilizando time-of-flight ion secundário espectrometria de massa (TOF-SIMS). 8- 11 os aspectos originais incluem o seguinte: 1) a janela de detecção é uma abertura de 2-3 um de diâmetro permitindo imagem directa da superfície do líquido, 2) a tensão de superfície é utilizada para conter o líquido no interior da abertura, e 3) é SALVI portáveis ​​entre múltiplas plataformas analíticas 11,12.

SALVI é composta de uma membrana de nitreto de silício (SiN) como a área de detecção e um microcanal feito de polidimetilsiloxano (PDMS). É Fabricated na sala limpa, e os fatores de fabricação e design de chave foram detalhados em artigos e patentes anteriores. 8-12 As aplicações da TOF-SIMS como uma ferramenta analítica foram demonstrados usando uma variedade de soluções aquosas e as misturas de líquidos complexos, alguns dos que continha nanopartículas. 13-17 Especificamente, SALVI líquido TOF-SIMS permite dinâmica sondagem da interface líquido-sólido de sistemas vivos biológicos (ou seja, os biofilmes), células individuais, e interface de eletrólito sólido, abrindo novas oportunidades para a fase situ condensado estudos, incluindo líquidos usando TOF-SIMS. No entanto, o projeto atual não permite interações gás-líquido ainda. Esta é uma direção para o desenvolvimento futuro. Salvi foi usado para estudar o filme proteico hidratado neste trabalho pela primeira vez.

A fibronectina é um dímero da proteína utilizada, consiste de dois monómeros quase idênticas ligadas por um par de ligações dissulfureto, 18 que is bem conhecido por sua capacidade de ligar as células 19,20. Ele foi escolhido como um sistema modelo para ilustrar que o filme proteína hidratado poderia ser sondado dinamicamente usando o líquido SALVI TOF-SIMS abordagem. A solução de proteína foi introduzido no microcanal. Após incubação durante 12 h, uma película de proteína hidratado formado no lado de trás da membrana SiN. Deionizada (DI) de água foi usada para enxaguar o canal após a introdução de proteínas. As informações foram coletadas a partir de moléculas de proteína fibronectina hidratados no microcanal SALVI usando dinâmica TOF-SIMS. DI água também foi estudada como um controlo para comparação com os resultados obtidos a partir de película fina fibronectina hidratado. Foram observadas diferenças distintas entre o filme de proteína hidratado e água DI. Este trabalho demonstra que a adsorção de proteínas na superfície no meio líquido pode ser estudada usando o novo SALVI e abordagem TOF-SIMS líquido. O protocolo de vídeo é destinado a fornecer orientação técnica para as pessoas que estão interessadasem utilizar esta nova ferramenta analítica para diversas aplicações de SALVI com TOF-SIMS e reduzir erros desnecessários na manipulação de líquidos, bem como a aquisição de dados TOF-SIMS e análise.

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Protocol

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1. Limpeza e Esterilização do microcanal SALVI

  1. Esterilização do microcanal no SALVI
    1. Desenhar 2 ml de solução aquosa a 70% de etanol para uma seringa, conectar a seringa com a extremidade de entrada de Salvi e lentamente injectar 1 ml do líquido em 10 min. Remover a seringa no final da injecção. Em seguida, conecte a entrada e saída de SALVI usando um poliéter união (PEEK). Como alternativa, usar uma bomba de seringa para conduzir o mesmo procedimento. Por exemplo, definir a velocidade de fluxo de 100 mL / min.
    2. Manter o microcanal SALVI preenchido com uma solução de etanol a 70% à temperatura ambiente durante 4 h.
  2. Introduzir água desionizada (DI) em SALVI
    1. Desenhar 2 ml de água desionizada esterilizada para uma seringa, conectar a seringa com a entrada de Salvi e lentamente injectar 1 ml do líquido em 10 min. Retire a seringa e conecte a entrada e saída de SALVI usando uma união PEEK. Como alternativa, usar uma bomba de seringa, como mencionado emetapa 1.1.1.

2. A imobilização do Film Proteína em SALVI

  1. Imobilizar o Film Proteína em SALVI
    1. Desenhar 2 ml de fibronectina (10 ug / ml em tampão de fosfatos salino, PBS) solução para uma seringa, conectar a seringa com a entrada de Salvi lentamente injectam-se 1 ml do líquido em 10 min, remover a seringa, e ligar a entrada e na saída do SALVI usando uma união PEEK.
    2. Incubar a SALVI preenchido com a solução de fibronectina numa placa de cultura limpa, manter o prato na capa, à temperatura ambiente durante 12 h.
    3. Desenhar 2 ml de água desionizada esterilizada para uma seringa e ligar a seringa com a entrada de SALVI. Lentamente injectar 1 ml de água em 10 minutos, retire a seringa, e se conectar a entrada e saída de SALVI.
      Nota: Se equipado com um microscópio de luz, verifique a SALVI sob o microscópio para garantir que a membrana SiN está intacta antes da análise TOF-SIMS. Agora o dispositivo SALVI está pronto para TOF-SIMS umANÁLISE.

3. Instale SALVI no Loadlock Câmara TOF-SIMS

Nota: Devem ser usadas luvas em todos os momentos ao manusear o dispositivo SALVI e instalá-lo para o palco TOF-SIMS para evitar possíveis contaminações durante a análise de superfície.

  1. Mount SALVI para o Palco
    1. Coloque o estágio TOF-SIMS sobre uma superfície plana e limpa. Coloque o dispositivo SALVI para o palco com o wafer de silício e membrana SiN voltada para cima. Fixar o SALVI usando quatro de metal de fixação peças e parafuso as peças de metal segurando o canto do aparelho na placa de metal com quatro parafusos.
    2. Gentilmente enrolar o tubo de PTFE conectado ao canal microfluídico. Use quatro pedaços de metal e quatro parafusos para segurar a parte rígida para baixo. Certifique-se de que o dispositivo é posicionado no espaço aberto na fase SIMS de modo que não interfere com o feixe de iões primário durante a análise. imagem adicional e ilustração da fabricat SALVIion e instalação estão disponíveis em publicações anteriores. 8,9,11
  2. Monte a Copa Faraday para o Palco
    1. Fixe o copo de Faraday no palco por um parafuso.
  3. Carregar o palco para a TOF-SIMS Loadlock Câmara
    1. Abra o loadlock TOF-SIMS, manter e definir o cenário horizontalmente para a plataforma de carregamento, e feche a porta loadlock.

4. Aquisição de Dados TOF-SIMS

  1. Ligar a bomba de vácuo e garantir de vácuo adequada (por exemplo, da ordem de 10 mbar ou -6 Torr) é atingido na câmara loadlock.
  2. Mover o SALVI para dentro da câmara principal uma vez que o vácuo é estabilizado após cerca de 30 min.
    Nota: O vácuo deve ser inferior a 5 x 10 -6 mbar de vácuo na câmara principal durante a aquisição de dados. Caso contrário, maior vácuo é indicativo de uma fuga no sistema de SALVI.
  3. Ajustar o feixe de íons primário e analisador de TOF-SIMS com umresolução espacial de cerca de 400 nm de acordo com as recomendações do fabricante. A corrente de feixe primário é de 1.200 pA enquanto o tempo de ciclo é de 30 ms sob o modo DC.
    Nota: Este processo segue em grande parte as recomendações do fabricante.
  4. Localizar o canal microfluídico usando o microscópio óptico. Use o centro óptico de imagem como uma referência e alinhá-lo para ser coerente com o centro da imagem de íons secundários.
  5. Antes de cada medição, use um 1 KeV O 2 + feixe (~ 40 nA) para digitalizar na janela do pecado com uma área de 500 x 500 mm 2 para ~ 15 segundos para remover a contaminação da superfície. Além disso, use uma arma de inundação de elétrons para compensar o carregamento de superfície durante todas as medições. Use a função automática da arma de inundação no modo padrão para esta etapa.
  6. Selecione o modo positivo ou negativo antes de aquisição de dados. Use a 25 keV Bi feixe 3 + como o feixe de íons primário em todas as medições.
    Nota: Os passos são f semelhanteou aquisições de dados positivos e negativos. Por questões de espaço, o modo positivo é descrita em detalhes aqui.
    1. Profiling profundidade
      1. Digitalizar o feixe + Bi 3 em uma área circular com um diâmetro de ~ 2 mm com 32 pixels por resolução de 32 pixels.
      2. Para minimizar o tempo necessário para perfurar, através da membrana de SiN, utilizar uma largura de impulso de comprimento (isto é, 180 nanossegundos, a corrente do feixe ~ 1,0 Pa, a um tempo de ciclo de 100 ms) Bi + 3 feixe. As intensidades de iões secundários representante do aumento da superfície líquida quando punch-through é alcançado. O tempo de difusão de volume varia de 300 s a 500 s, de acordo com o lote da membrana SiN.
        Nota: Esta diferença parece estar relacionada com o lote de membranas SiN adquiridos de acordo com a nossa experiência. No entanto, o tempo de soco-through realmente não afeta a análise dos dados.
      3. Após a membrana SiN punch-through, manter o mesmo atual de cerca de 200 segundos paraobter dados suficientes para reconstruções de imagens 2D.
      4. Reduzir a largura de pulso para 80 nanossegundos para coleta de dados para adquirir espectros com melhor resolução de massa. Continue esta aquisição por cerca de outros 200 seg. Os dados do espectro mostrado na Figura 1 são obtidas a partir desta região.
    2. 2D Imaging and Mass Spectra
      1. Recolha de imagem 2D e dados de espectro de massa, ao mesmo tempo em que a medição dos dados de profundidade de perfil. O instrumento TOF-SIMS salva todas as informações de cada ponto durante o experimento. Os dados são apresentados em diferentes janelas (FPanel - Spectra, FPanel - Perfis e FPanel - imagens separadamente) do software de controle digital. Verifique os dados em cada painel judiciosamente durante a aquisição de dados.

Análise 5. TOF-SIMS Dados

Nota: A análise dos dados é inicialmente realizada utilizando o software instrumental IonToF TOF-SIMS.

  1. Abra a umasoftware ANÁLISE da SIMS (Medição Explorer) e, em seguida, clique no botão "perfis", "espectros" e "botões de imagem ', respectivamente, para processar perfil de profundidade, espectro m / z, e dados de imagem.
  2. Abra os arquivos de dados que têm a extensão ".ita".
  3. Selecione picos de interesse, escreva o nome da espécie na caixa "ion", e rotulá-los com cores diferentes no espectro. Use a roda de rolagem do mouse para arrastar ao longo do eixo-x. Use Ctrl e roda de rolagem para ajustar alturas de pico e larguras. Letra "L" alterna entre os modos lineares e Log ao longo do eixo y.
  4. Realizar a reconstrução dos dados antes da calibração de massa. Caso contrário, é difícil escolher o espaçamento entre picos, no passo de calibração de massa.
    1. Selecione os dados de perfis de profundidade de interesse e reconstruir os espectros de acordo com a série temporal de perfil de profundidade.
    2. Clique no botão de reconstrução. Na janela "Iniciar Reconstrução", digite um intervalo de varrimento de interest. Clique em "OK" para reconstruir os dados do perfil de profundidade.
  5. Faça uma calibração de massa. Pressione "F3" para abrir a janela "calibração de massa". Escolha picos para calibração com base na amostra específica. 21 Neste trabalho, utilizar os seguintes picos CH3 + (m / z 15), o H 3 O + (m / z 19), C 2 H 5 + (m / z 29 ), H 5 O 2 + (m / z 37), C 3 H 7 + (m / z 43), H 7 O 3 + (m / z 55), H 9 O 4 + (m / z 71), H 11 o 5 + (m / z 99) e H 13 o 6 + (m / z 109) para o modo positivo. Use os seguintes picos CH - (m / z 13), ó - (m / z 16), OH - (m / z 17), C 2 H - (m / z 25), C 3 H - (m / z 37), e C 4 H - (m / z 49) para o modo negativo.
    1. Selecione um pico,certifique-se de que a seta para baixo está apontado para o pico no canto inferior esquerdo da janela. Clique que o pico e digite o nome do pico na janela "calibração de massa", clique em "Adicionar", e o íon de interesse está incluído na calibração de massa.
    2. Finalmente, clique no botão "Recalibrate". Verifique se as áreas de picos estão nos lugares certos acordo com a sua massa e carga rácios. No menu "Spectrum", selecione e clique em "Aplicar Calibração de Massa" para "todos os espectros" ou "espectros selecionado", dependendo da análise específica a ser conduzida.
  6. Como a seleção de pico é necessário para a análise da amostra, determinar os picos característicos da amostra de acordo com a literatura ou de outras descobertas anteriores. Comparar a intensidade dos picos de interesse na m / z espectros. Se necessário, adicione novos picos ou excluir picos inúteis na lista de pico.
    1. Adicionar picos. Clique em um pico, encontrar as linhas vermelhas na janela inferior esquerda. hold a tecla "Ctrl", role o mouse horizontalmente para definir a largura de pico, o que acrescenta um pico à lista de pico automaticamente. Outra forma de adicionar um pico é selecionar um pico na janela espectro principal, e, em seguida, clique no botão "adicionar pico" acima da janela. Se houver muitos picos para adicionar, no menu "Spectrum", selecione "picos de busca", verificar as especificações relacionadas na nova janela aberta, em seguida, adicione picos, conforme necessário.
    2. Para exportar uma lista de pico, no menu "Lista de pico", selecione "Salvar ..." a lista de pico no formato "itmil". Use o Ctrl eo botão esquerdo para arrastar ao longo do espectro. Na janela de espectros, selecione um pico de interesse e arraste as duas linhas tracejadas a posições desejáveis.
    3. Para importar uma lista de pico, no menu "Mass Lista intervalo", selecione "Importar ...", localize um arquivo de lista de pico existente com a extensão de arquivo ".ITPL". Clique em "Abrir".
    4. Para usar um "itmil" lista de pico, emo menu "Mass Lista Interval", clique em "Abrir ...", localize o arquivo e clique em "Abrir".
  7. Aplicar uma lista de pico para analisar melhor os dados. No-inferior esquerdo da janela "Spectra", há uma janela chamada "Missa Lista Interval". A lista de pico importado é mostrado aqui em cima.
    1. Direito do mouse no arquivo de lista de pico a ser utilizado, aplicá-lo para o "espectro ativo" ou "todos os espectros".
  8. Visualizar os perfis de dados. Na janela "Perfil", Use letra "M" para se ajustar à janela (série completa) ea letra "N" para se ajustar ao eixo y. Use Ctrl e roda de rolagem para ajustar a largura do perfil. Ou use "/" e "*" na placa chave para alterar o intervalo de eixo-y e altura.
  9. Exportar dados para o traço mais usando outro software gráfico após a análise inicial.
    1. Para exportar um perfil de profundidade, na janela "Perfil", clique no menu "Arquivo" e selecione "Export & #34 ;, e selecione "Salvar como" um arquivo ".txt".
    2. Para exportar um arquivo de espectro m / z, na janela "Spectra", clique no menu "Arquivo" e selecione "Exportar" e selecione "Salvar como" um arquivo ".txt".
    3. Para exportar um arquivo de imagem, na janela, tela de impressão "Imagem" e salvar como arquivo de imagem.

6. TOF-SIMS Plotagem de dados e Apresentação

Nota: Use uma ferramenta gráfica para traçar os dados após os dados SIMS são processadas utilizando o software instrumental.

  1. Use uma ferramenta gráfica para importar os dados.
  2. Fazer um lote utilizando o m / z como o eixo dos x e a intensidade do pico como o eixo Y a mostrar o espectro reconstruído. Um exemplo é dado na Figura 1.
  3. Fazer um lote utilizando o tempo de descarga eléctrica como o eixo dos x e a intensidade do pico como o eixo Y a mostrar a séries temporais perfil de profundidade reconstruída. Um exemplo é dado na Figure 2.
  4. Combinar imagens 2D reconstruídas de diferente m / z e formar uma matriz para mostrar o mapeamento de iões. Um exemplo é dado na Figura 2.

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Representative Results

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Um par de resultados representativos são apresentados para demonstrar as vantagens do protocolo proposto. Usando a interface microfluídico SALVI, o feixe de íons primário (Bi 3 +) podem bombardear diretamente sobre o filme fibronectina hidratada em água DI. Assim, o mapeamento químico molecular da superfície do líquido pode ser adquirido com sucesso.

A Figura 1A e 1B mostram os espectros de massa positivo TOF-SIMS da película fibronectina e água Dl hidratado, respectivamente. Os picos de interesse, incluindo aglomerados de água (isto é, m / z 19, 37, 55, 73, 91 e 109) fragmentos e de aminoácidos (isto é, m / z 30, 44, 61, 74, 81, 83, e 98) são indicados pelas setas vermelhas. Para além dos picos característicos de fragmentos de ácidos aminados, que têm sido amplamente relatados utilizando amostras de proteínas secas, os picos de clusters de água são observados noOs espectros de massa de filme fibronectina hidratada em água DI. Além disso, as intensidades destes picos de fragmentação de água são muito diferentes daquelas nos espectros de massa de água Dl. Este resultado fornece a prova directa da propriedade de moléculas de água em torno e no interior das moléculas de proteína hidratados que desempenham um papel na sua adsorção sobre uma superfície.

A Figura 2a mostra a série temporal perfil de profundidade do filme fibronectina hidratado e água DI. Como a amostra é sob a membrana SiN, as intensidades de segunda íons selecionados são insignificantes, antes da membrana pecado é perfurado (ou seja, 280 seg para fibronectina e 340 segundos para a água DI). Uma vez que a membrana pecado é perfurado, as intensidades destes íons secundários aumentar significativamente. Ao usar a largura de impulso de comprimento, a resolução de massa é relativamente baixo. Portanto, o processo de largura de pulso curto é usado para obter dados de massa com uma resolução melhorde imagem e de espectro reconstruções como destacado na Figura 2a. Depois de um período de tempo (isto é, 60 seg para a fibronectina e 220 ​​seg para água Dl), a largura de impulso reduzida é usado para obter m / z espectros com uma melhor resolução de massa. Os m / espectros z finais foram reconstituídas a partir de 200 medições sec destaque em áreas sombreadas verdes nas séries temporais perfil de profundidade. A Figura 2b mostra as imagens 2D do filme fibronectina hidratado e água DI, que correspondem à área sombreada a verde na Figura 2a. Estas imagens 2D representam as contagens de íons secundários selecionados a partir da amostra: mais clara a imagem, quanto maior a contagem de íons secundários. Tais imagens intuitivos dar uma comparação clara de iões secundários seleccionados entre diferentes amostras, o que é útil para a análise de dados. De acordo com as nossas experiências, a diferença no tempo SiN soco-through varia de lote para lote das membranas pecado. No entanto, isso não afecta o resultados da análise TOF-SIMS dinâmico.

figura 1
Figura 1: Comparação dos espectros positivo TOF-SIMS da película fibronectina hidratado e água Dl no microcanal SALVI (a) O espectro m / z reconstruído de fibronectina.. (B) O espectro de água Dl.

Figura 2
Figura 2:. Perfis de profundidade e imagens 2D de fibronectina hidratado e de água Dl (um) A profundidade de perfil de séries temporais de fibronectina e de água Dl no modo positivo. (B) 2D imagens reconstruídas correspondente ao verde sombreada 200 segmentos de tempo seg ao longo da série temporal no perfil de profundidade (um). Vários massa característica de cobrar índices de relevância para clusters de água(Por exemplo, m / z 1, 19, 37, 55) são mostrados, além de fragmentos de aminoácidos conhecidos (por exemplo, m / z 30, 83, 98). Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

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Discussion

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SALVI é uma interface que permite microfluídico superfície do líquido dinâmico e análise de interface líquido-sólido por instrumentos de vácuo com base, tais como TOF-SIMS e microscopia eletrônica de varredura (MEV). Devido ao uso de pequenas aberturas para expor o líquido directamente no vácuo, SALVI é adequado para muitas técnicas de espectroscopia de imagiologia e finamente focados sem quaisquer modificações; 22 a portabilidade e versatilidade de microfluidos tornar-se um verdadeiro plataforma de imagem multimodal. Características distintas e significado da SALVI em comparação com outras técnicas existentes são resumidos em vários comentários recentes 22-25 Como desenvolvedor da tecnologia SALVI., O nosso grupo tem vindo a aplicar ativamente a uma variedade de estudos envolvendo superfícies líquidas dinâmicas e interfaces líquido-sólido . Alguns exemplos de novas aplicações incluem membranas de células de mamíferos, bactérias de fixação de biofilme, 15,16 formação de nanopartículas ou como um resultado de oxidação de superfície aquosas. Neste PApor, apresentamos resultados iniciais líquido TOF-SIMS da película fina de proteína hidratado adsorvida na superfície do pecado.

É bastante crítico para lidar com cuidado as etapas destacadas no protocolo. Por exemplo, ao desenhar líquido na seringa nas etapas 1 e 2, certifique-se de que não existem quaisquer bolhas para dentro da seringa. Porque uma vez que as bolhas são injetadas SALVI, eles podem induzir vazamento no vácuo. 9 Assim, se forem observadas todas as bolhas, é prudente para se livrar deles, definindo a seringa na posição vertical e gentilmente empurrar as bolhas para fora. Além disso, é muito importante para fazer a janela pecado em SALVI plana para análise TOF-SIMS optimizada, tal como descrito no passo 3. Este nivelamento da área de detecção afecta directamente a qualidade dos dados de acordo com o design de TOF-SIMS. 26 É é necessário inspecionar visualmente o dispositivo depois de garantir tudo no palco SIMS. Se a janela do pecado não é horizontal, ajustar os parafusos e alterar a alturado dispositivo SALVI para assegurar que tudo está no mesmo plano, tanto quanto possível. Estes pontos delicados precisam de experiência e cuidado, que determinam o sucesso ea confiabilidade de todo o experimento.

Tal como mostrado na Figura 1b, os picos com m / z 19, 37, 55, 73, 91 e 109 têm valores elevados. Isto indica que há um bom número de aglomerados de água (H 3 O +, H 5 O 2 +, H 7 O 3 +, H 9 O 4 +, H 11 O 5 + e H 13 O 6 +) na positiva iões secundários. Os outros clusters de água (dados não apresentados) com valores de m / z superiores também têm picos relativamente fortes em comparação com os picos vizinhos. Essas grandes quantidades de aglomerados de água são emitidos a partir da superfície da água desionizada após a SiN vazada. sinais de fragmentação de água no modo positivo não ter sido observado no anterior wTrabalho; e este era atribuído às baixas contagens de íons secundários e não-otimizados TOF-SIMS condições no passado. 8 Com o esforço contínuo na optimização das condições de aquisição SALVI e TOF-SIMS, como o feixe de íons primária (isto é, Bi + vs . Bi 3 +), largura de pulso e condições atuais durante perfis de profundidade, é agora possível observar até 44 clusters de água no modo positivo com as condições apresentadas neste trabalho. Os resultados apresentados aqui são promissores para investigar o papel da água na dinâmica de várias moléculas biológicas e de sistemas biológicos.

Aqui, como um exemplo para ilustrar as vantagens de SALVI e TOF-SIMS em estudar a dinâmica molecular biológicos, foi apresentada a hidratação da proteína fibronectina. Os picos de m / z 30, 44, 61, 74, 81, 83 e 98 pertencem aos fragmentos de aminoácidos de acordo com o relatório anterior, 27,28, que são muito mais fortes do que os de DI water mostrado na Figura 1b. Esta diferença no aumento da intensidade dos fragmentos de aminoácidos na amostra fibronectina sugere que estes iões secundários são, de facto dos próprios proteínas. Além disso, os picos de clusters de água na Figura 1A são muito mais fortes do que os de água Dl na figura 1b, o que implica que as propriedades de moléculas de água na superfície da adsorção de proteínas e solução interfacial pode ser muito diferentes daqueles em água pura.

A Figura 2a mostra séries temporais profundidade de perfis representativos de duas amostras diferentes: fibronectina e água DI no microcanal SALVI. Os dados de perfis de profundidade foram recolhidos como a janela SiN estava sendo bombardeado pela Bi 3 + feixe de íons primária com a largura de pulso longa. Como visto na Figura 2a, a janela pecado é perfurado através de cerca de 300 seg. Antes da janela de SiN na SALVI é perfurado through, as intensidades dos íons secundários selecionados são muito baixos. Quando a janela do pecado é perfurado, as intensidades dos íons secundários aumentar imediatamente como a superfície do líquido começa a ser bombardeados pelo feixe de íon primário. Por exemplo, as intensidades de H + e H 3 O + mostram um grande aumento, indicando a observação da superfície da água. 8,9 Embora as intensidades são certa instabilidade após a difusão de volume ou na interface, podem atingir-se relativamente estável valores após um período de tempo (por exemplo, 60 seg para a fibronectina e 220 ​​seg para água Dl, respectivamente, na Figura 2a). A diferença no tempo de perfuração de largura de pulso realmente não afeta os resultados da análise ilustrados aqui quando reconstruir m / z espectros (por exemplo, Figura 1), porque os m / z espectros eficazes são adquiridas após o pecado punch-through. No entanto, um investigador pode escolher usar as mesmas condições para todas as amostras foR consistência e facilidade na escolha de secções de dados durante a análise de dados. A fim de se obter uma melhor resolução de massa, a largura do pulso foi subsequentemente reduzido e as intensidades foram diminuídas em conformidade na última porção do experimento profundidade de perfil. As séries temporais perfil de profundidade foram continuamente recolhidos para outros 200 seg para fornecer dados amplas para m análise espectral / z. Os segmentos de tempo em que m / z espectros foram reconstruídos são destacadas em áreas verdes sombreadas.

A fibronectina tem sido amplamente utilizada para a adsorção de superfície antes da cultura celular; muitos estudos têm mostrado fibronectina é responsável pela adesão celular e as interacções das células-biomaterial. 19,20,29 Um estudo recente caracterizado a espessura da fibronectina adsorvidas em escovas poli (hidroxietil metacrilato) usando elipsometria. A película fina fibronectina foi determinada ser 3-12 nm de espessura. 30 Tal espessura é razoável para a análise em profundidade de perfil em uma solu aquosação 8,9. Com o desenvolvimento de Salvi análise directa da proteína hidratado adsorvido sobre a superfície sólida é agora possível. Esta abordagem potencialmente pode ter amplas aplicações em estudar as interações de proteínas com superfícies sólidas dinamicamente.

A Figura 2b mostra as imagens 2D seleccionados de iões secundários de diferentes amostras de fibronectina e de água Dl, respectivamente. 2D imagens são obtidas a partir dos dados temporais profundidade de perfil em áreas sombreadas verdes na Figura 2A, as quais correspondem à superfície do líquido após a SiN puncionada tal como descrito anteriormente. As imagens de iões secundários fragmento aminoácido seleccionado de CH 4 N +, C 5 H 7 O + e C 4 H 4 NO 2 + (isto é, m / z 30, 83 e 98) para a película fina fibronectina eram muito mais brilhante do que aqueles para a água DI. Isto indica que os iões secundários de fragmentos de aminoácidos são observados from as moléculas de fibronectina no interior da abertura 2 um de diâmetro. Além disso, as imagens de picos seleccionados (por exemplo, m / z 1, 19, 37, e 55) que corresponde a vários aglomerados de água da fibronectina são notavelmente mais brilhante do que aqueles de água Dl. Este resultado demonstra que a hidratação da fibronectina torna as moléculas de água que rodeiam a biomolécula distinta das moléculas de água na água DI.

Em resumo, este trabalho apresentou elementos de prova marcante na água induzida alterações molécula de propriedades de hidratação de proteínas. Tais resultados podem fornecer uma compreensão fundamental melhorado sobre a estrutura, conformação, e a actividade biológica de proteínas adsorvidas sobre uma superfície sólida no microambiente líquido.

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
ToF-SIMS IONTOF TOF.SIMS 5 Resolution: >10,000 m/Δm for mass resolution; >4,000 m/Δm for high spatial resolution 
System for Analysis at the Liquid Vacuum Interface (SALVI) Pacific Northwest National Laboratory N/A SALVI is a unique, self-contained, portable analytical tool that, for the first time, enables vacuum-based scientific instruments such as time-of-flight secondary ion mass spectrometry (ToF-SIMS) to analyze liquid surfaces in their natural state at the molecular level.
PEEK Union Valco ZU1TPK for connecting the inlet and outlet of SALVI
5 Axes Sample Stage IONTOF N/A Stage is self-made for mounting SALVI in ToF-SIMS
Barnstead Nanopure Water Purification System Thermo Fisher Scientific D11921 ROpure LP Reverse Osmosis filtration module (D2716)
Syringe BD 309659 1 ml
Pipette Thermo Fisher Scientific 21-377-821 Range: 100 to 1,000 ml
Pipette Tip Neptune 2112.96.BS 1,000 µl
Centrifuge Tube Corning 430791 15 ml
Fibronectin Sigma-Aldrich F1141 1 mg/ml
Ethanol Thermo Fisher Scientific S25310A 95% Denatured
Gibco PBS Thermo Fisher Scientific 10010-023 pH 7.4

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<em>In Situ</em> Caracterização de Proteínas hidratadas em água por SALVI e TOF-SIMS
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Yu, J., Zhou, Y., Hua, X., Zhu, Z., Yu, X. Y. In Situ Characterization of Hydrated Proteins in Water by SALVI and ToF-SIMS. J. Vis. Exp. (108), e53708, doi:10.3791/53708 (2016).More

Yu, J., Zhou, Y., Hua, X., Zhu, Z., Yu, X. Y. In Situ Characterization of Hydrated Proteins in Water by SALVI and ToF-SIMS. J. Vis. Exp. (108), e53708, doi:10.3791/53708 (2016).

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