In Situ caracterización de proteínas hidratadas en agua por Salvi y TOF-SIMS
Summary
Este trabajo presenta un protocolo para el manejo de líquidos y de introducción de muestra a un microcanal para in situ de iones secundarios análisis de espectrometría de masas de tiempo de vuelo de biomoléculas de proteínas en una solución acuosa.
Abstract
Este trabajo demuestra la caracterización in situ de biomoléculas de proteínas en la solución acuosa utilizando el Sistema de Análisis de la interfaz de líquido de vacío (SALVI) y espectrometría de masas de tiempo de vuelo de iones secundarios (SIMS-TOF). La película de proteína fibronectina se inmoviliza sobre la membrana de nitruro de silicio (SiN) que forma el área de detección SALVI. Durante el análisis ToF-SIMS, se llevaron a cabo tres modos de análisis que incluye alta espectrometría de masas de alta resolución espacial, las imágenes de dos dimensiones (2D), y perfiles de profundidad. Los espectros de masas se adquirieron en los modos tanto positivos como negativos. agua desionizada también se analizó como una muestra de referencia. Nuestros resultados muestran que la película de la fibronectina en agua tiene picos de racimo de agua más distintos y más fuertes en comparación con el agua sola. picos característicos de fragmentos de aminoácidos también son observables en la proteína hidratada ToF-SIMS espectros. Estos resultados ilustran que la adsorción molécula de proteína en una superficie puede ser estudiado dynamicaLLY usando Salvi y ToF-SIMS en el medio líquido para la primera vez.
Introduction
La hidratación es crucial para la estructura, conformación 1, 2 y 3 actividad biológica de las proteínas. Las proteínas sin moléculas de agua que rodean ellos no tendrían actividades biológicas viables. En concreto, las moléculas de agua interaccionan con la superficie y la estructura interna de las proteínas, y diferentes estados de hidratación de las proteínas hacen que tales interacciones distinta. 4 La interacción de las proteínas con las superficies sólidas es un fenómeno fundamental con implicaciones en la nanotecnología, biomateriales y procesos de ingeniería de tejidos. Los estudios han indicado durante mucho tiempo que se pueden producir cambios conformacionales como una proteína se encuentra con una superficie. ToF-SIMS se ha previsto como la técnica que tiene el potencial para estudiar la interfaz de proteína-sólido. 5-7 Es importante entender la hidratación de las proteínas sobre superficies sólidas, que potencialmente proporciona una comprensión fundamental del mecanismo de su estructura, conformación y biológicaactividad al.
Sin embargo, las técnicas analíticas superficie principal son en su mayoría basados en vacío y aplicaciones directas para los estudios de líquidos volátiles son difíciles debido a la rápida evaporación del líquido volátil en el entorno de vacío. Hemos desarrollado un vacío interfaz de microfluidos compatible, Sistema de Análisis en la interfaz de líquido de vacío (SALVI), para permitir la observación directa de superficies de líquido y de las interacciones líquido-sólido utilizando el tiempo de vuelo espectrometría de masas de iones secundarios (ToF-SIMS). 8- 11 los aspectos únicos incluyen los siguientes: 1) la ventana de detección es una abertura de 2-3 micras de diámetro que permita imagen directa de la superficie del líquido, 2) la tensión superficial se utiliza para mantener el líquido dentro de la abertura, y 3) es SALVI portables entre múltiples plataformas analíticas 11,12.
SALVI se compone de una membrana de nitruro de silicio (SiN) como el área de detección y un microcanal hecho de polidimetilsiloxano (PDMS). Es fabricated en la sala limpia, y los factores de fabricación y de diseño se han detallado en los documentos y patentes anteriores. 8-12 Las aplicaciones de TOF-SIMS como una herramienta analítica se demostró usando una variedad de soluciones acuosas y las mezclas líquidas complejas, algunas de las que contenía nanopartículas. 13-17 en concreto, SALVI líquido TOF-SIMS dinámico permite sondeo de la interfase líquido-sólido de los sistemas biológicos vivos (es decir, los biofilms), células individuales, y la interfaz de electrolito sólido, la apertura de nuevas oportunidades para la fase in situ condensada Los estudios incluyendo líquidos utilizando TOF-SIMS. Sin embargo, el diseño actual no permite interacciones gas-líquido todavía. Esta es una dirección de desarrollo futuro. SALVI se ha utilizado para estudiar la película de proteína hidratado en este trabajo para la primera vez.
La fibronectina es un dímero de proteína de uso común, que consiste en dos monómeros casi idénticos unidos por un par de enlaces de disulfuro, 18 que iEs bien conocido por su capacidad para unirse a las células 19,20. Fue elegido como un sistema modelo para ilustrar que la película de proteína hidratado podía palpar de forma dinámica utilizando el líquido SALVI TOF-SIMS enfoque. La solución de proteína se introdujo en el microcanal. Después de incubar durante 12 horas, una película de proteína hidratado formado en el lado posterior de la membrana SiN. Agua desionizada (DI) se utilizó para enjuagar el canal después de la introducción de proteínas. Se recolectó información de las moléculas de proteína fibronectina hidratados en el microcanal SALVI usando dinámica TOF-SIMS. DI agua también se estudió como un control para comparar con los resultados obtenidos a partir de película delgada fibronectina hidratado. No se observaron diferencias claras entre la película de proteína hidratado y agua DI. Este trabajo demuestra que la adsorción de proteínas en la superficie en el medio líquido puede ser estudiada usando la novela Salvi y enfoque TOF-SIMS líquido. El protocolo de vídeo está destinado a proporcionar orientación técnica para las personas que están interesadasen la utilización de esta nueva herramienta analítica para diversas aplicaciones de SALVI con TOF-SIMS y reducir errores innecesarios en el manejo de líquidos, así como la adquisición de datos TOF-SIMS y análisis.
Protocol
Representative Results
Discussion
SALVI es una interfaz de microfluidos que permite superficie del líquido dinámico y el análisis de la interfaz líquido-sólido por instrumentos basados en el vacío, como ToF-SIMS y microscopía electrónica de barrido (SEM). Debido al uso de pequeñas aberturas para exponer líquido directamente en el vacío, SALVI es adecuado para muchas técnicas de espectroscopia e imagen finamente enfocada, sin ninguna modificación; 22 la portabilidad y versatilidad de microfluidos que sea una verdadera plataf…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We are grateful to the Pacific Northwest National Laboratory (PNNL) Chemical Imaging Initiative-Laboratory Directed Research and Development (CII-LDRD) and Materials Synthesis and Simulation across Scales (MS3) Initiative LDRD fund for support. Instrumental access was provided through a W. R. Wiley Environmental Molecular Sciences Laboratory (EMSL) Science Themed Proposal. EMSL is a national scientific user facility sponsored by the Office of Biological and Environmental Research (BER) at PNNL. The authors thank Mr. Xiao Sui, Mr. Yuanzhao Ding, and Ms. Juan Yao for proof reading the manuscript and providing useful feedback. PNNL is operated by Battelle for the DOE under Contract DE-AC05-76RL01830.
Materials
| ToF-SIMS | IONTOF | TOF.SIMS 5 | Resolution: > 10,000 m/Δm for mass resolution; > 4,000 m/Δm for high spatial resolution |
| System for Analysis at the Liquid Vacuum Interface (SALVI) | Pacific Northwest National Laboratory | N/A | SALVI is a unique, self-contained, portable analytical tool that, for the first time, enables vacuum-based scientific instruments such as time-of-flight secondary ion mass spectrometry (ToF-SIMS) to analyze liquid surfaces in their natural state at the molecular level. |
| PEEK Union | Valco | ZU1TPK | for connecting the inlet and outlet of SALVI |
| 5 Axes Sample Stage | IONTOF | N/A | Stage is self-made for mounting SALVI in ToF-SIMS |
| Barnstead Nanopure Water Purification System | Thermo Fisher Scientific | D11921 | ROpure LP Reverse Osmosis filtration module (D2716) |
| Syringe | BD | 309659 | 1 mL |
| Pipette | Thermo Fisher Scientific | 21-377-821 | Range: 100 to 1000 mL |
| Pipette Tip | Neptune | 2112.96.BS | 1000 µL |
| Centrifuge Tube | Corning | 430791 | 15 mL |
| Fibronectin | Sigma-Aldrich | F1141 | 1 mg/mL |
| Ethanol | Thermo Fisher Scientific | S25310A | 95% Denatured |
| Gibco PBS | Thermo Fisher Scientific | 10010-023 | pH 7.4 |
References
- Tompa, K., Bokor, M., Verebelyi, T., Tompa, P. Water rotation barriers on protein molecular surfaces. Chem. Phys. 448, 15-25 (2015).
- Maruyama, Y., Harano, Y. Does water drive protein folding?. Chem. Phys. Lett. 581, 85-90 (2013).
- Chaplin, M. Opinion – Do we underestimate the importance of water in cell biology. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 7 (11), 861-866 (2006).
- Zhang, L., et al. Mapping hydration dynamics around a protein surface. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 104 (47), 18461-18466 (2007).
- Xia, N., May, C. J., McArthur, S. L., Castner, D. G. Time-of-flight secondary ion mass spectrometry analysis of conformational changes in adsorbed protein films. Langmuir. 18 (10), 4090-4097 (2002).
- Gray, J. J. The interaction of proteins with solid surfaces. Curr. Opin. Struct. Biol. 14 (1), 110-115 (2004).
- Wagner, M. S., Horbett, T. A., Castner, D. G. Characterization of the structure of binary and ternary adsorbed protein films using electron spectroscopy for chemical analysis, time-of-flight secondary ion mass spectrometry, and radiolabeling. Langmuir. 19 (5), 1708-1715 (2003).
- Yang, L., Yu, X. -. Y., Zhu, Z., Iedema, M. J., Cowin, J. P. Probing liquid surfaces under vacuum using SEM and and ToF-SIMS. Lab Chip. 11 (15), 2481-2484 (2011).
- Yang, L., Yu, X. -. Y., Zhu, Z. H., Thevuthasan, T., Cowin, J. P. Making a hybrid microfluidic platform compatible for in situ imaging by vacuum-based techniques. J. Vac. Sci. Technol. A. 29 (6), 061101 (2011).
- Yu, X. -. Y., Yang, L., Zhu, Z. H., Cowin, J. P., Iedema, M. J. Probing aqueous surfaces by ToF-SIMS. LC GC N. Am. (Oct), 34-38 (2011).
- Yu, X. -. Y., Yang, L., Cowin, J., Iedema, M., Zhu, Z. Systems and methods for analyzing liquids under vacuum. US patent. , (2013).
- Yu, X. -. Y., Liu, B., Yang, L., Zhu, Z., Marshall, M. J. Microfluidic electrochemical device and process for chemical imaging and electrochemical analysis at the electrode-liquid interface in situ. US patent. , (2014).
- Yang, L., Zhu, Z., Yu, X. -. Y., Thevuthasan, S., Cowin, J. P. Performance of a microfluidic device for in situ ToF-SIMS analysis of selected organic molecules at aqueous surfaces. Anal. Methods. 5 (10), 2515-2522 (2013).
- Yang, L., et al. In situ SEM and ToF-SIMS analysis of IgG conjugated gold nanoparticles at aqueous surfaces. Surf. Interface Anal. 46 (4), 224-228 (2014).
- Hua, X., et al. In situ molecular imaging of hydrated biofilm in a microfluidic reactor by ToF-SIMS. Analyst. 139 (7), 1609-1613 (2014).
- Hua, X., et al. Two-dimensional and three-dimensional dynamic imaging of live biofilms in a microchannel by time-of-flight secondary ion mass spectrometry. Biomicrofluidics. 9 (3), 031101 (2015).
- Liu, B., et al. In situ chemical probing of the electrode-electrolyte interface by ToF-SIMS. Lab Chip. 14 (5), 855-859 (2014).
- Pankov, R., Yamada, K. M. Fibronectin at a glance. J. Cell Sci. 115 (20), 3861-3863 (2002).
- Pierschbacher, M. D., Hayman, E. G., Ruoslahti, E. Location of the cell-attachment site in fibronectin with monoclonal antibodies and proteolytic fragments of the molecule. Cell. 26 (2), 259-267 (1981).
- Engvall, E., Ruoslahti, E. Binding of soluble form of fibroblast surface protein, fibronectin, to collagen. Int. J. Cancer. 20 (1), 1-5 (1977).
- Green, F. M., Gilmore, I. S., Seah, M. P. TOF-SIMS: Accurate mass scale calibration. J. Am. Soc. Mass Spectrom. 17 (4), 514-523 (2006).
- Yu, X. -. Y., Liu, B., Yang, L. Imaging liquids using microfluidic cells. Microfluid. Nanofluid. 15 (6), 725-744 (2013).
- Shi, H., Lercher, J. A., Yu, X. -. Y. Sailing into uncharted waters: recent advances in the in situ monitoring of catalytic processes in aqueous environments. Catal. Sci. Technol. 5 (6), 3035-3060 (2015).
- Deleu, M., Crowet, J. M., Nasir, M. N., Lins, L. Complementary biophysical tools to investigate lipid specificity in the interaction between bioactive molecules and the plasma membrane: A review. Biochim. Biophys. Acta-Biomembr. 1838 (12), 3171-3190 (2014).
- Kraft, M. L., Klitzing, H. A. Imaging lipids with secondary ion mass spectrometry. Biochim. Biophys. Acta Mol. Cell Biol. Lipids. 1841 (8), 1108-1119 (2014).
- Gilmore, I. S. SIMS of organics-Advances in 2D and 3D imaging and future outlook. J. Vac. Sci. Technol. A. 31 (5), 050819 (2013).
- Muramoto, S., et al. ToF-SIMS Analysis of Adsorbed Proteins: Principal Component Analysis of the Primary Ion Species Effect on the Protein Fragmentation Patterns. J. Phys. Chem. C. 115 (49), 24247-24255 (2011).
- Brüning, C., Hellweg, S., Dambach, S., Lipinsky, D., Arlinghaus, H. F. Improving the interpretation of ToF-SIMS measurements on adsorbed proteins using PCA. Surf. Interface Anal. 38 (4), 191-193 (2006).
- Gustavsson, J., et al. Surface modifications of silicon nitride for cellular biosensor applications. J. Mater. Sci.-Mater. Med. 19 (4), 1839-1850 (2008).
- Deng, J., Ren, T. C., Zhu, J. Y., Mao, Z. W., Gao, C. Y. Adsorption of plasma proteins and fibronectin on poly(hydroxylethyl methacrylate) brushes of different thickness and their relationship with adhesion and migration of vascular smooth muscle cells. Regen Biomater. , 17-25 (2014).
