In Situ karakterisering av Hydratiserade proteiner i vatten av Salvi och ToF-SIMS
Summary
Detta arbete presenteras ett protokoll för vätskehantering och provinför till en mikrokanal för in situ time-of-flight sekundär jon masspektrometrianalys av protein biomolekyler i en vattenlösning.
Abstract
Detta arbete visar in situ karakterisering av protein biomolekyler i vattenlösningen med hjälp av systemet för analys vid Liquid Vacuum Interface (SALVI) och tids of-flight sekundär jon masspektrometri (ToF-SIMS). Fibronektin proteinfilm immobiliserades på kiselnitrid (SiN) membran som bildar SALVI detektionsområdet. Under ToF-SIMS analys har tre lägen för analys utförs inklusive hög rumslig upplösning masspektrometri, tvådimensionell (2D) avbildning och djup profilering. Masspektra förvärvades i både positiva och negativa lägen. Avjoniserat vatten analyserades även som ett referensprov. Våra resultat visar att fibronektin filmen i vatten har mer distinkta och starkare vatten kluster toppar jämfört med enbart vatten. Karakteristiska toppar av aminosyrafragment är också observeras i den hydratiserade protein ToF-SIMS-spektra. Dessa resultat illustrerar att proteinmolekylen adsorption på en yta kan studeras Dynamically använder SALVI och ToF-SIMS i vätskemiljö för första gången.
Introduction
Hydration är avgörande för struktur, en konformation, 2 och biologisk aktivitet 3 av proteiner. Proteiner utan vattenmolekyler som omger dem skulle inte ha livskraftiga biologiska aktiviteter. Specifikt vattenmolekyler interagerar med ytan och inre strukturen av proteiner och olika vätsketillstånd proteiner göra sådana interaktioner distinkt. 4 Samspelet mellan proteiner med fasta ytor är en grundläggande fenomen med konsekvenser i nanoteknologi, biomaterial och vävnadstekniska processer. Studier har länge indikerade att konformationsändringar kan uppstå som ett protein påträffar en yta. ToF-SIMS har tänkt som den teknik som har potential för att studera protein-fasta gränssnittet. 5-7 Det är viktigt att förstå hydratiseringen av proteiner på fasta ytor, vilket potentiellt ger en grundläggande förståelse för mekanismen för deras struktur, konformation, och biological aktivitet.
huvudyta analytiska tekniker är emellertid mestadels vakuumbaserade och direkta applikationer för flyktiga flytande studier är svårt på grund av snabb avdunstning av flyktiga vätskan under vakuum. Vi utvecklade ett vakuum kompatibel mikroflödes gränssnitt, system för analys vid Liquid Vacuum Interface (SALVI), för att möjliggöra direkta observationer av flytande ytor och vätske fast interaktioner med hjälp av time-of-flight sekundär jon masspektrometri (ToF-SIMS). 8- 11 de unika aspekterna omfattar följande: 1) detektionsfönstret är en öppning av 2-3 mikrometer i diameter för att direkt avbildning av vätskeytan, 2) ytspänningen används för att hålla vätskan i öppningen, och 3) SALVI är portabel mellan flera analytiska plattformar. 11,12
SALVI består av ett kiselnitrid (SiN) membran som detekteringsområde och en mikrokanal tillverkad av polydimetylsiloxan (PDMS). Det är fabricated i renrummet och tillverknings och nyckeldesignfaktorer har i detalj i tidigare artiklar och patent. 8-12 Ansökningarna från ToF-SIMS som ett analytiskt verktyg visades med hjälp av olika vattenlösningar och komplexa vätskeblandningar, en del av som innehöll nanopartiklar. 13-17 Specifikt tillåter SALVI flytande ToF-SIMS dynamisk sondering av flytande och fast gränssnitt av levande biologiska system (dvs, biofilmer), enskilda celler och fast elektrolyt gränssnitt, öppnar nya möjligheter för in situ kondenserad fas studier inklusive vätskor med hjälp av ToF-SIMS. Men den nuvarande utformningen inte tillåta gas och vätska interaktioner ännu. Detta är en riktning för framtida utveckling. SALVI har använts för att studera den hydratiserade proteinfilmen i detta arbete för första gången.
Fibronektin är ett vanligt använt protein dimer, bestående av två nästan identiska monomerer kopplade genom ett par av disulfidbindningar, 18 som jags väl känd för sin förmåga att binda celler. 19,20 Det valdes som ett modellsystem för att illustrera att det hydratiserade proteinfilmen kan dynamiskt sonde använda SALVI vätska ToF-SIMS strategi. Proteinlösningen infördes i mikrokanalen. Efter inkubation under 12 h, en hydratiserad proteinfilm bildad på baksidan av SiN membranet. Avjoniserat (DI) vatten användes för att skölja bort kanalen efter protein introduktion. Uppgifterna samlades in från hydratiserade fibronektin proteinmolekyler i SALVI mikro med dynamisk ToF-SIMS. DI vatten studerades också som en kontroll för att jämföra med resultat från hydrerad fibronektin tunn film. Tydliga skillnader observerades mellan den hydratiserade proteinfilmen och DI vatten. Detta arbete visar att protein adsorption på ytan i vätskemiljön kan studeras med hjälp av nya SALVI och flytande ToF-SIMS strategi. Video protokollet är avsett att ge teknisk vägledning för personer som är intresseradeatt utnyttja denna nya analysverktyg för olika tillämpningar av SALVI med ToF-SIMS och minska onödiga misstag i vätskehantering samt ToF-SIMS datainsamling och analys.
Protocol
Representative Results
Discussion
SALVI är en mikroflödes gränssnitt som möjliggör dynamisk vätskeytan och gränssnittsanalys flytande och fast av vakuumbaserade styrmedel, såsom ToF-SIMS och svepelektronmikroskop (SEM). Tack vare användningen av små öppningar för att exponera vätskan direkt i vakuum, är SALVI lämplig för många fint fokuserade spektroskopi och avbildningstekniker utan några ändringar, 22 att överföra och mångsidighet mikrofluidik gör det en sann multimodal imaging plattform. Olika egenskaper och betydels…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We are grateful to the Pacific Northwest National Laboratory (PNNL) Chemical Imaging Initiative-Laboratory Directed Research and Development (CII-LDRD) and Materials Synthesis and Simulation across Scales (MS3) Initiative LDRD fund for support. Instrumental access was provided through a W. R. Wiley Environmental Molecular Sciences Laboratory (EMSL) Science Themed Proposal. EMSL is a national scientific user facility sponsored by the Office of Biological and Environmental Research (BER) at PNNL. The authors thank Mr. Xiao Sui, Mr. Yuanzhao Ding, and Ms. Juan Yao for proof reading the manuscript and providing useful feedback. PNNL is operated by Battelle for the DOE under Contract DE-AC05-76RL01830.
Materials
| ToF-SIMS | IONTOF | TOF.SIMS 5 | Resolution: > 10,000 m/Δm for mass resolution; > 4,000 m/Δm for high spatial resolution |
| System for Analysis at the Liquid Vacuum Interface (SALVI) | Pacific Northwest National Laboratory | N/A | SALVI is a unique, self-contained, portable analytical tool that, for the first time, enables vacuum-based scientific instruments such as time-of-flight secondary ion mass spectrometry (ToF-SIMS) to analyze liquid surfaces in their natural state at the molecular level. |
| PEEK Union | Valco | ZU1TPK | for connecting the inlet and outlet of SALVI |
| 5 Axes Sample Stage | IONTOF | N/A | Stage is self-made for mounting SALVI in ToF-SIMS |
| Barnstead Nanopure Water Purification System | Thermo Fisher Scientific | D11921 | ROpure LP Reverse Osmosis filtration module (D2716) |
| Syringe | BD | 309659 | 1 mL |
| Pipette | Thermo Fisher Scientific | 21-377-821 | Range: 100 to 1000 mL |
| Pipette Tip | Neptune | 2112.96.BS | 1000 µL |
| Centrifuge Tube | Corning | 430791 | 15 mL |
| Fibronectin | Sigma-Aldrich | F1141 | 1 mg/mL |
| Ethanol | Thermo Fisher Scientific | S25310A | 95% Denatured |
| Gibco PBS | Thermo Fisher Scientific | 10010-023 | pH 7.4 |
References
- Tompa, K., Bokor, M., Verebelyi, T., Tompa, P. Water rotation barriers on protein molecular surfaces. Chem. Phys. 448, 15-25 (2015).
- Maruyama, Y., Harano, Y. Does water drive protein folding?. Chem. Phys. Lett. 581, 85-90 (2013).
- Chaplin, M. Opinion – Do we underestimate the importance of water in cell biology. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 7 (11), 861-866 (2006).
- Zhang, L., et al. Mapping hydration dynamics around a protein surface. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 104 (47), 18461-18466 (2007).
- Xia, N., May, C. J., McArthur, S. L., Castner, D. G. Time-of-flight secondary ion mass spectrometry analysis of conformational changes in adsorbed protein films. Langmuir. 18 (10), 4090-4097 (2002).
- Gray, J. J. The interaction of proteins with solid surfaces. Curr. Opin. Struct. Biol. 14 (1), 110-115 (2004).
- Wagner, M. S., Horbett, T. A., Castner, D. G. Characterization of the structure of binary and ternary adsorbed protein films using electron spectroscopy for chemical analysis, time-of-flight secondary ion mass spectrometry, and radiolabeling. Langmuir. 19 (5), 1708-1715 (2003).
- Yang, L., Yu, X. -. Y., Zhu, Z., Iedema, M. J., Cowin, J. P. Probing liquid surfaces under vacuum using SEM and and ToF-SIMS. Lab Chip. 11 (15), 2481-2484 (2011).
- Yang, L., Yu, X. -. Y., Zhu, Z. H., Thevuthasan, T., Cowin, J. P. Making a hybrid microfluidic platform compatible for in situ imaging by vacuum-based techniques. J. Vac. Sci. Technol. A. 29 (6), 061101 (2011).
- Yu, X. -. Y., Yang, L., Zhu, Z. H., Cowin, J. P., Iedema, M. J. Probing aqueous surfaces by ToF-SIMS. LC GC N. Am. (Oct), 34-38 (2011).
- Yu, X. -. Y., Yang, L., Cowin, J., Iedema, M., Zhu, Z. Systems and methods for analyzing liquids under vacuum. US patent. , (2013).
- Yu, X. -. Y., Liu, B., Yang, L., Zhu, Z., Marshall, M. J. Microfluidic electrochemical device and process for chemical imaging and electrochemical analysis at the electrode-liquid interface in situ. US patent. , (2014).
- Yang, L., Zhu, Z., Yu, X. -. Y., Thevuthasan, S., Cowin, J. P. Performance of a microfluidic device for in situ ToF-SIMS analysis of selected organic molecules at aqueous surfaces. Anal. Methods. 5 (10), 2515-2522 (2013).
- Yang, L., et al. In situ SEM and ToF-SIMS analysis of IgG conjugated gold nanoparticles at aqueous surfaces. Surf. Interface Anal. 46 (4), 224-228 (2014).
- Hua, X., et al. In situ molecular imaging of hydrated biofilm in a microfluidic reactor by ToF-SIMS. Analyst. 139 (7), 1609-1613 (2014).
- Hua, X., et al. Two-dimensional and three-dimensional dynamic imaging of live biofilms in a microchannel by time-of-flight secondary ion mass spectrometry. Biomicrofluidics. 9 (3), 031101 (2015).
- Liu, B., et al. In situ chemical probing of the electrode-electrolyte interface by ToF-SIMS. Lab Chip. 14 (5), 855-859 (2014).
- Pankov, R., Yamada, K. M. Fibronectin at a glance. J. Cell Sci. 115 (20), 3861-3863 (2002).
- Pierschbacher, M. D., Hayman, E. G., Ruoslahti, E. Location of the cell-attachment site in fibronectin with monoclonal antibodies and proteolytic fragments of the molecule. Cell. 26 (2), 259-267 (1981).
- Engvall, E., Ruoslahti, E. Binding of soluble form of fibroblast surface protein, fibronectin, to collagen. Int. J. Cancer. 20 (1), 1-5 (1977).
- Green, F. M., Gilmore, I. S., Seah, M. P. TOF-SIMS: Accurate mass scale calibration. J. Am. Soc. Mass Spectrom. 17 (4), 514-523 (2006).
- Yu, X. -. Y., Liu, B., Yang, L. Imaging liquids using microfluidic cells. Microfluid. Nanofluid. 15 (6), 725-744 (2013).
- Shi, H., Lercher, J. A., Yu, X. -. Y. Sailing into uncharted waters: recent advances in the in situ monitoring of catalytic processes in aqueous environments. Catal. Sci. Technol. 5 (6), 3035-3060 (2015).
- Deleu, M., Crowet, J. M., Nasir, M. N., Lins, L. Complementary biophysical tools to investigate lipid specificity in the interaction between bioactive molecules and the plasma membrane: A review. Biochim. Biophys. Acta-Biomembr. 1838 (12), 3171-3190 (2014).
- Kraft, M. L., Klitzing, H. A. Imaging lipids with secondary ion mass spectrometry. Biochim. Biophys. Acta Mol. Cell Biol. Lipids. 1841 (8), 1108-1119 (2014).
- Gilmore, I. S. SIMS of organics-Advances in 2D and 3D imaging and future outlook. J. Vac. Sci. Technol. A. 31 (5), 050819 (2013).
- Muramoto, S., et al. ToF-SIMS Analysis of Adsorbed Proteins: Principal Component Analysis of the Primary Ion Species Effect on the Protein Fragmentation Patterns. J. Phys. Chem. C. 115 (49), 24247-24255 (2011).
- Brüning, C., Hellweg, S., Dambach, S., Lipinsky, D., Arlinghaus, H. F. Improving the interpretation of ToF-SIMS measurements on adsorbed proteins using PCA. Surf. Interface Anal. 38 (4), 191-193 (2006).
- Gustavsson, J., et al. Surface modifications of silicon nitride for cellular biosensor applications. J. Mater. Sci.-Mater. Med. 19 (4), 1839-1850 (2008).
- Deng, J., Ren, T. C., Zhu, J. Y., Mao, Z. W., Gao, C. Y. Adsorption of plasma proteins and fibronectin on poly(hydroxylethyl methacrylate) brushes of different thickness and their relationship with adhesion and migration of vascular smooth muscle cells. Regen Biomater. , 17-25 (2014).
