Summary
موصوفة التقنيات لimmunostain الفوسفات-الحواتم في الأجنة الزرد بأكملها ثم إجراء اللونين متحد البؤر الفلورسنت التعريب في الهياكل الخلوية صغيرة مثل أهداب الابتدائي. يمكن للتقنيات لتحديد والتصوير تحديد الموقع وحركية مظهر أو تنشيط بروتينات معينة.
Abstract
انتشار السريع للخلايا، والتعبير عن الأنسجة محددة من الجينات وظهور شبكات يشير تميز التطور الجنيني المبكر من جميع الفقاريات. حركية والمكان من الإشارات - حتى داخل الخلايا واحد - في الجنين النامي تكمل التعرف على الجينات التنموية الهامة. ووصف التقنيات المناعية التي ثبت لتحديد حركية إشارات الحيوان داخل الخلايا وكلها في هياكل صغيرة مثل أهداب الابتدائي. ويمكن الانتهاء من التقنيات لتحديد والتصوير ومعالجة الصور باستخدام ليزر المسح المجهر المركب متحد البؤر في عدد قليل من 36 ساعة.
الزرد (دانيو rerio) هو كائن مرغوب فيه للمحققين الذين يسعون إلى إجراء دراسات في أنواع الفقاريات تكون في متناول وصلة الأمراض التي تصيب البشر. يجب تأكيد بالضربة القاضية وراثية أو knockdowns من فقدان البروتين المنتج الفعلي. هذا التأكيد من فقدان البروتينيمكن تحقيق ذلك باستخدام الأساليب المذكورة هنا. ويمكن أيضا أن القرائن إلى مسارات إشارات فك شفرتها باستخدام الأجسام المضادة التي هي رد الفعل مع البروتينات التي تم تعديلها بعد translationally من الفسفرة. الحفاظ على وتحسين حالة فسفرته من حاتمة يعد أمرا حيويا بالنسبة لهذا القرار ويتم إنجاز هذا البروتوكول.
توضح هذه الدراسة تقنيات لإصلاح الأجنة خلال ساعة 72 الأولى من تطوير وشارك في توطين مجموعة متنوعة من الحواتم ذات الصلة مع أهداب في كوبفر في الحويصلة (KV)، والكلى والأذن الداخلية. هذه التقنيات هي واضحة، لا تحتاج إلى تشريح ويمكن الانتهاء في فترة قصيرة نسبيا من الزمن. إسقاط مداخن صورة متحد البؤر في صورة واحدة هو وسيلة مفيدة لتقديم هذه البيانات.
Protocol
وقد تمت الموافقة على الإجراءات الزرد في هذا البروتوكول من قبل اللجنة المؤسسية رعاية الحيوان واستخدام (IACUC) في جامعة فرجينيا كومنولث.
1. إعداد الكواشف
- 4٪ PFA / برنامج تلفزيوني. تزن 8 غرام من بارافورمالدهيد (PFA) في غطاء الدخان. في حين لا يزال في غطاء الدخان، ويحل الجافة PFA في ~ 80 مل المقطر H 2 O مع التحريك والتدفئة إلى 50 درجة مئوية. مع التحريك، إضافة 3-10 قطرات من جديد 1N هيدروكسيد الصوديوم حتى يذوب تماما PFA ويوضح الحل. إزالة من الحرارة وإضافة 100 مل 2X الفوسفات مخزنة المالحة (PBS). ليصل حجم 200 مل مع المقطر H 2 O. تبريد لRT وتأكيد الرقم الهيدروجيني من 7.4 قبل الاستخدام. مخزن في الظلام في 4 درجات مئوية ولكن استخدام في غضون أسبوع واحد.
- استخدام الميثانول بنسبة 100٪ دون أي ملاحق. استخدام الايثانول 95٪ دون أي ملاحق.
- إعداد مخزنة الفوسفات توين (PBT). تكملة مخزنة المالحة الفوسفات (PBS) مع 0.1٪ توين-20. إضافة 0.5 مل من 20٪ توين 20 المحلول الى 100 مل برنامج تلفزيوني 1X. تخزين في RT.
- إعداد مخزنة الفوسفات تريتون-X (PBTx). تكملة برنامج تلفزيوني مع 0.1٪ تريتون X-100. إضافة 0.5 مل من 20٪ تريتون X-100 سهم إلى 100 مل من برنامج تلفزيوني. تخزين في RT.
- إعداد 10٪ خ ع / PBTx. مصل الماعز العادي (خ ع) كتل مواقع الربط غير محددة. متجر خ ع في aliquots في -20 درجة مئوية. للاستخدام، إضافة 1 مل إلى 9 مل PBTx.
- تجهيز 50٪ الجلسرين / برنامج تلفزيوني. مزيج من أجزاء متساوية تماما من 2X في برنامج تلفزيوني و 100٪ الجلسرين. تخزين في RT.
2. الأجنة التثبيت
- . (. على سبيل المثال، بيتا الأكتين: CAAX-GFP) تربية الحصول على النوع البري (AB وويك) أو المعدلة وراثيا الأجنة من خلال التزاوج الطبيعية. إذا رغبت في ذلك، حقن الأجنة مع بنيات أو morpholinos، كما هو موضح. 15،16
- رفع الأجنة. جمع الأجنة واحتضان عند 28.5 درجة مئوية في وجود من 0.003٪ 1-فينيل-2-ثيوريا (PTU) لمنع تصبغ كما هو موضح. 17 P>
- إصلاح، وعندما وصلت الأجنة المرحلة التنموية المرجوة، 18 عاما، تخدير الأجنة باستخدام MESAB، وإزالة الكثير من الماء نظام ممكن، وإضافة جديدة 4٪ PFA / برنامج تلفزيوني لمدة 3-4 ساعة على RT. ملاحظة: في بعض الأحيان أقل من 20 ساعة بعد الإخصاب (HPF)، وتحديد مسبق لdechorionation. في بعض الأحيان بعد 20 HPF، dechorionate قبل تثبيت باستخدام اثنين من أزواج من الملقط نقطة غرامة تحت المجهر تشريح.
- تغيير الحلول. نقل الأجنة باستخدام تتحمل الماصة واسعة، كما هو موضح 17 حلول تغيير في 1.5 مل توج أنابيب microcentrifuge، وذلك ببساطة عن طريق السماح للأجنة لتسوية عن طريق الجاذبية دون الطرد المركزي.
- بعد تثبيتي بعد 3 - 4 ساعات، وإزالة PFA / برنامج تلفزيوني، مع استبدال 100٪ الميثانول ومخزن في -20 درجة مئوية لمدة لا تقل عن 48 ساعة. ملاحظة: للحصول على أقصى مناعية ف CaMK-II، والحد من إجمالي وقت تخزين الميثانول لمدة أسبوع واحد.
- وضع ما لا يقل عن 10 الأجنة لكل حالة تجريبية في توج أنبوب microcentrifuge 1.5 مل، والتسمية عليها.
- السماح للأجنة ليستقر. إزالة والتخلص الميثانول وترطيب مع يغسل التقدمية التي تحتوي على 0.5 مل من خفض تركيزات الإيثانول، كما هو مبين في الخطوة التالية. كل خطوة هي غسل 5 دقائق مع هزاز.
- ترطيب تدريجيا مع هذه الحلول 5: 66٪ من الإيثانول / 33٪ PBTx، 33٪ من الإيثانول / 66٪ PBTx، 100٪ PBTx، 100٪ PBTx (وهذا هو تكرار الأول من PBTx)، و 100٪ PBTx (هذا هو تكرار الثاني من PBTx).
- إزالة غسل PBTx الماضي. إضافة 0.5 مل 10٪ خ ع / PBTx. احتضان لمدة لا تقل عن 1 ساعة على RT مع هزاز لطيف ثم إزالة وتجاهل الحل.
- يعد حل الأجسام المضادة الأولية عن طريق تمييع في 10٪ خ ع / PBTx. إذا شارك في المناعية، واستخدام أعلى تقارب الأجسام المضادة لأول مرة. لهذه الدراسة، واحتضان مع الماوس مكافحة الأسيتيل الأجسام المضادة وحيدة النسيلة تويولين المخفف 1: 500. لالامثلهالبريد، إذا كان هناك 10 عينة، والجمع بين 6 ميكرولتر من محلول المخزون الأجسام المضادة مع 3 مل من 10٪ خ ع / PBTx ثم توزيع 0.3 مل من هذا إلى كل أنبوب.
- إضافة 0،2-0،5 مل من الأجسام المضادة الأولية المخفف إلى كل أنبوب لتزج جميع الأجنة. احتضان مع طيف هزاز O / N في RT.
- في الصباح، وإزالة وتجاهل حل الأجسام المضادة. إضافة 0.5 مل 2٪ خ ع / PBTx ليغسل الأجسام المضادة الأولية الزائدة. صخرة بلطف لمدة 5 دقائق. إزالة والتخلص حل. كرر مرتين.
- خافت الأضواء العلوية وتمييع الأجسام المضادة الثانوية fluorescently مترافق المناسبة في 10٪ خ ع / PBTx بحيث تحتوي كل حالة على الأقل 0.5 مل. مع الأجسام المضادة الأولية تويولين الماوس مكافحة الأسيتيل، استخدم الأخضر الفلورسنت صبغة الماعز المضادة الماوس مفتش في التخفيف 1: 500.
- احتضان الضد الثانوية لمدة 4 ساعة مع هزاز لطيف في RT في الظلام. من الآن فصاعدا، عملية العينات تحت أضواء خافتة واحتضان في وعاء مظلم أو التفاف في رقائق الألومنيوم.
- في نهاية الحضانة، وإزالة والتخلص من حل الضد الثانوية. إضافة 0.5 مل 2٪ خ ع / PBTx لغسل. صخرة بلطف لمدة 5 دقائق. إزالة والتخلص حل. كرر مرتين.
- إذا شارك في المناعية، يجب الحصول على الأجسام المضادة الأولية الثاني من الأنواع المختلفة من أول الأجسام المضادة الأولية. في هذه الدراسات، اتبع الأرنب مكافحة الفوسفات CaMK-II الأجسام المضادة من قبل صبغ مترافق الماعز المضادة للأرنب مفتش الأضداد الثانوية أحمر فلوري.
- تمييع أرنب مكافحة الفوسفات CaMK-II الأجسام المضادة 01:20. لكل أنبوب للأجنة أو تعليق في 0.3 مل 10٪ خ ع / PBTx، ثم إضافة 15 ميكرولتر من محلول المخزون الأجسام المضادة.
- ضمان أن الأجنة مغمورة وخافتة الأضواء. احتضان مع طيف هزاز O / N في RT في الظلام.
- في الصباح تحت الأضواء الخافتة، وإزالة وتجاهل حل الأجسام المضادة. إضافة 0.5 مل 2٪ خ ع / PBTx. صخرة بلطف لمدة 5 دقائق. إزالة والتخلص حل. كرر مرتين.
- إبقاء الأضواء العلوية قاتمة وتمييع ما يكفي من fluorescently-conju المناسبالأجسام المضادة الثانوية مسور بحيث تحتوي كل حالة على الأقل 0.5 مل. في هذه الدراسة، يخفف من صبغ مترافق الماعز المضادة للأرنب مفتش الأضداد أحمر فلوري الثانوي (القناة الحمراء) 1: 500 في 10٪ خ ع / PBTx.
- احتضان الضد الثانوية الثانية لمدة 4 ساعة مع هزاز لطيف في RT في الظلام.
- في نهاية هذه الحضانة وتحت الأضواء الخافتة، إزالة والتخلص من حل الضد الثانوية. إضافة 0.5 مل PBTx. صخرة بلطف لمدة 5 دقائق. إزالة والتخلص حل. كرر مرتين. متجر في أي PBTx أو 50٪ الجلسرين / PBS تبعا لإجراء التصوير.
4. متحد البؤر التصوير والمعالجة
- جبل الأجنة للتصوير. ضع 1-5 الأجنة على شريحة زجاجية. إنشاء غرفة بين ساترة الرئيسية وشريحة باستخدام شظايا ساترة على كل جانب من الغرفة. عادة، يتم استخدام أربعة # 1 coverslips لجعل هذه المداخن هل دون الختم.
ملاحظة: لا المتوسطة المتزايدة ضروري. - استخدام الغمر النفط 100Xهدف لجلب جنين واحد إلى التركيز باستخدام الضوء النافذ. إيقاف ضوء. تشغيل المجهر متحد البؤر. تأكد من أن أشعة الليزر المناسبة (الأخضر و / أو حمراء) قيد التشغيل، وتعمل عن بعد ثانوي التركيز.
- تشغيل برنامج متحد البؤر. في "شريط اكتساب"، حدد الهدف الصحيح. في شريط "XY الأساسية"، وضبط حجم الصورة ل1024 من خلال النقر على زر 1024.
- في "ليزر وكشف عن" شريط، انقر على أحمر 488 مربع والأخضر 568 مربع لتشغيل الليزر وكاشف لكل قناة. تعيين الثقب إلى متوسطة وضبط الزيادة في شريط "كسب" من كل قناة لتصور.
- في شريط "اكتساب الإعدادات"، انقر فوق "لايف" لبدء الحصول على الصور. في شريط "عرض الإعدادات"، قم بإلغاء تحديد خانة "فرض متكاملة تكبير" إلى مركز في إطار "لايف".
- في شريط "اكتساب الإعدادات"، ضمن علامة التبويب "Z"، خطوة من خلال طبقات من الصورة. بعد تحديد نوmber من المقاطع البصرية على أن تدرج في الصورة، والانتقال إلى مرحلة ما في "مركز" للض الطائرة.
- تحت علامة التبويب "Z"، انقر فوق حمراء صغيرة مربع "مرجع". وهذا الصفر دأب على النقطة المختارة باسم "مركز". في المربع المسمى "الخطوة الحجم"، حدد سمك طبقات (بين 0.25 ميكرون و 2،0 ميكرون هو المثل الأعلى). الالتفات إلى مربع "حجم الملف" ومحاولة للحد من 1GB.
ملاحظة: عادة، تصل إلى 40 المقاطع البصرية من 0،5-1،0 ميكرون ويتم الحصول على، ولكن يمكن تحديد عدد الأقسام تجريبيا. - للعثور على أقصى العلوي من الصورة، انقر فوق الدائرة بجانب "الأعلى" والتحرك من خلال طبقات ض. الآن انقر فوق الدائرة بجانب "القاع"، الكمبيوتر سوف يستغرق الصورة مرة أخرى إلى طبقة والمركز. نقل مرة أخرى من خلال طبقات للعثور على أقصى السفلي من الصورة.
- انقر على "لايف" مرة أخرى في "اكتساب الإعدادات" مربع لوقف الليزراستحواذ. في هذه اللوحة، انقر فوق مربعات حمراء وصفت متوسط وZ-المكدس. وهذه الصناديق يتحول إلى اللون الأخضر.
- في مربع "اكتساب الإعدادات"، انقر فوق "واحدة" للحصول على سلسلة كاملة من الصور. يمكنك مراقبة التقدم كما يمسح في كل القنوات وخلال كامل ض المكدس.
- لحفظ، انقر على نافذة حجم وانقر على "حفظ باسم" واسم الملف. حفظ كملف ".ids". إلى حجم جعل ملف بينما كومة ض لا يزال مفتوحا، اختر سحب البيانات القائمة المنسدلة وانقر على "حجم تجعل". حفظ الملف كما تصدر ملف شجار. هذه هي الصورة المتوقعة التي يتم عرضها في هذا المنشور.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
الظروف المثلى لتصور الفوسفات-الحواتم
وكانت وسائل اصفا immunolocalization الحواتم البروتين في الأجنة الزرد متفرق نسبيا بالمقارنة مع تلك التي للتوطين من mRNAs عبر التهجين في الموقع. وشملت المثبتات المستخدمة في توطين الحواتم بروتين في الخلايا المهدبة الأجنة الزرد 4٪ PFA / برنامج تلفزيوني وتثبيتي دنت، والذي هو خليط من الميثانول وDMSO 19 توطين RNA التي كتبها جبل بأكمله في الموقع التهجين (WISH) ويتحقق عادة ما تستخدم PFA تليها تخزين في الميثانول بنسبة 100٪. وكشفت 20،21 دراساتنا أن الجمع WISH تثبيتي، عندما الحد من الوقت في الميثانول تتراوح بين عامين وسبعة أيام، وكان يتفوق على أي تثبيتي آخر لimmunolocalization مع الأجسام المضادة ف CaMK-II . كانت إشارة يتحقق مع هذا PFA مجموعة / الميثانول المرضس أكبر بكثير مما كانت عليه عندما كانت تستخدم تثبيتي دنت، 4٪ PFA / برنامج تلفزيوني أو الميثانول وحدها، وهذا يتوقف على وقت التنموية وموقع داخل الجنين.
عند تحسين تقنية الموضحة هنا وفي كل مرة تثبيتي والتنموي المستخدمة، تم إعداد العينة الضابطة التي تم اتباع جميع الخطوات، إلا أنه تم حذف الأجسام المضادة الأولية. تفتقر هذه العينات السيطرة إشارة الفلورسنت عند تصوير تحت نفس الشروط المذكورة أعلاه. ويوصي هذا التحكم لباحثين آخرين تكرار هذا النهج مع أي الأجسام المضادة.
حقق مزيج / الميثانول تثبيتي PFA أقوى إشارة P-CaMK-II وكان أيضا متوافق مع المناعية لتويولين الأسيتيل، الذي هو علامة قياسية للأهداب. تنمويا، وهو أول جهاز مهدبة التي تبرز وتم تصويرها في هذه الدراسات هو حويصلة في كوبفر (KV). يقع KV في نهاية الخلفي من الحبل الظهري كما هو مبين في المرحلة 12 الجسيدة (15 HPF) (الشكل 1). وKV هو الجهاز عابرة وهو المسؤول عن عدم التماثل بين اليسار واليمين. يتضح في مرحلة 2-الجسيدة (12 HPF) ويختفي حول المرحلة 18 الجسيدة. الضرب أهداب الابتدائي توليد تدفق دائري من السوائل، الأمر الذي يؤدي إلى ارتفاع الكالسيوم 2+ في الخلايا المهدبة التي تبطن KV وتفعيل CaMK-II في مواقع منفصلة (الشكل 1). يبدو P-CaMK-II التفاعل ويختفي على جانب واحد من KV طالما الأهداب والضرب. 12 وفي هذه المرحلة المبكرة، مجموع الجنينية مستويات CaMK-II لا تزال سوى نصف المستوى الذي كان عليه في 24 HPF والعاشرة واحدة من مستوى في 3 أيام من التنمية. 11 ربما لأن مجموع التعبير CaMK-II منخفض نسبيا في 15 HPF، أي تحسين في تقنية المناعية في هذه المرحلة أهمية خاصة.
Betweأون 24 و 72 HPF التنمية، يبدو P-CaMK-II على سطح قمية من الخلايا المهدبة بطانة مناطق معينة من القنوات سليفة الكلوة (أرقام 2،3). ومناعية من إجمالي CaMK-II على طول قناة سليفة الكلوة بأكمله وجميع أنحاء القطع البدنية النمطية المجاورة (الشكل 2) يدل على أنه ليس هناك سوى مجموعة فرعية من الجنينية CaMK-II يتم تنشيط (P-CaMK-II).
شروط التثبيت هي متوافقة مع الحفاظ على GFP مضان
هذه التقنيات التثبيت هي أيضا متوافقة مع الاحتفاظ الأخضر بروتين فلوري (GFP) مضان دون تعزيز (الشكل 3). في CaMK-II-GFP الموسومة بناء التي يتم استخدامها في هذا الرقم، GFP يحتفظ مضان كافية على الرغم من PFA / الميثانول تثبيت والمناعية لاحق. في طريقة عرض عالية التكبير من الخلايا المبطنة للقناة سليفة الكلوة (الشكل 3)، الالبريد التعبير فسيفساء من GFP-CaMK-II يمكن أن ينظر إليها في الخلايا التي تم أيضا immunostained لف CaMK-II.
الأذن الجنينية الزرد هي نسيج آخر وهو ارتفاع الكالسيوم 2+، من خلال CaMK-II، يؤثر تطورها. تظهر 14 آذان الزرد عادة في حوالي يوم واحد للتنمية. في هذا الوقت، يتم تنشيط CaMK-II بشكل مكثف في قاعدة الأهداب المحركة وفي المستويات الدنيا على طول الهدب المحرك (الشكل 4). هذه مجموعة من الصور تبين أن هذا التثبيت وimmunolocalization تقنية يمكن الكشف عن تلطيخ داخل الأهداب، هيكل الذي المقطع العرضي هو أقل من 1 ميكرون. هذه الأهداب تحتفظ بنيتها خلال هذه العملية تثبيت والمناعية.
وقد تحقق مثال إضافي من counterstaining اللونين في الأذن الداخلية في وقت لاحق من التنمية من خلال تلطيخ مع كل اليكسا 488phalloidin ومكافحة الأسيتيل تويولين تليها اليكسا 568 الموسومة الضد الثانوية (الشكل 5). ومن الجدير بالذكر أن طريقة / الميثانول تثبيت PFA يحفظ كل من F-الأكتين وتويولين، وهو ما لا ينطبق على جميع المثبتات. ويظهر هذا المثال كصورة اللون المدمجة للأذن كامل ومن ثم للمناطق الفرعية (14).
وتحققت مثال ممثل النهائي من counterstaining اللونين مع سلالة من الأسماك التي تنتج أجنة مع GFP المستهدفة غشاء (الشكل 6). لا يتم إرفاق غشاء المستهدفة GFP إلى أي بروتين آخر، وفقدت عندما انتزعت مع الميثانول، وبالتالي حصلت هذه الصورة من الأسماك التي تم إصلاحها مع PFA وحدها. هذه النتيجة تشير إلى أن العلاج الميثانول مقتطفات الأغشية، لذلك لا ينصح للبروتينات التي قد تكون حصرا غشاء ملزمة. تضاءلت إشارة P-CaMK-II في هذا الرقم نسبة إلى أن يتحقق إذا methanاستخدمت را أيضا، ولكن هذا يدل على أن في هذه المرحلة، والمكان (الكلى) من الجنين النامي، إشارة قوية بما فيه الكفاية ليتم الكشف دون علاج الميثانول. هذا ليس صحيحا في مرحلة KV؛ أي مطلوب الميثانول لتصور ف CaMK-II المناعية. ويظهر هذا المثال فقط كصورة المدمجة حيث قناة سليفة الكلوة الكلى هو مجاور للعضلة الجذع.
وباختصار، فإن / الميثانول طريقة تثبيت PFA الموصوفة هنا متوافق مع الحفاظ على GFP ومع تلطيخ لF-الأكتين، تويولين الأسيتيل، ومجموع CaMK-II و ف CaMK-II.
الشكل 1. ف CaMK-II Counterstained لالأسيتيل تويولين (أهداب) في KV الزرد. آراء حية مرحلة 12 الجسيدة واحدة (12 ق ق) الجنين يكشف عن المكان الخلفي من KV التي عrowhead (عرض الوحشي، A) والدائرة داخل مربع (عرض بطني، B). الأجنة في هذه المرحلة تم إصلاحها باستخدام PFA / الميثانول. و immunostained الأجنة لتويولين الأسيتيل تليها اليكسا 488 الضد الثانوية -labelled (قناة خضراء). بعد ذلك، تم اتباع بولكلونل الأجسام المضادة أرنب ضد P-CaMK-II من قبل اليكسا 568- الضد الثانوية المسمى (القناة الحمراء). تم الحصول على اثنين من قناة التوقعات صورة الفلورسنت كما هو موضح في أعلى تكبير تدريجيا (C، D). شريط النطاق = 10 ميكرون. تم تعديل هذا الرقم من منشور السابق 12 الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الرقم 2. ف CaMK-II Counterstained ل تم إصلاح عدد CaMK-II على طول الكلى الزرد. والجنين dechorionated واحد في 30 HPF باستخدام PFA / الميثانول. وبعد ذلك الملون الأجنة لمجموع CaMK-II تليها اليكسا 488 الضد الثانوية المسمى (الخضراء). بعد ذلك، وأعقب الأجسام المضادة الأولية P-CaMK-II من قبل اليكسا 568 الضد الثانوية المسمى (الحمراء). تلطيخ يكشف عن تخصيب تنشيط CaMK-II (باللون الأحمر) على سطح قمية من الخلايا التي تبطن القنوات الناقلة لالكلى الزرد سليفة الكلوة في حين الكلي CaMK-II هو المخصب في حدود الجسيدة من الأنسجة العضلية المجاورة وجميع أنحاء ساركومير. شريط النطاق = 50 ميكرون. تم الحصول على هذه الصور في التكبير أقل مما هو موضح في النص من أجل تصور الكلى بأكمله. تم تعديل هذا الرقم من منشور السابق 13 الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
FO: المحافظة على together.within الصفحات = "1"> 
الشكل (3). ف CaMK-II مكافحة تصويرها لGFP في خلايا الكلى الزرد. تم حقن هذا الجنين 30 HPF مع كدنا] ترميز المهيمنة السلبية GFP-CaMK-II. 13 هذه الحقن عادة ما تظهر التعبير الفسيفساء. تم إصلاح الجنين باستخدام PFA / الميثانول ثم immunostained لف CaMK-II باستخدام اليكسا 568 الضد الثانوية المسمى. التصوير يكشف عن أن GFP استمر خلال PFA تثبيت / الميثانول، ومعالجة الجفاف، ومنع والمناعية. شريط النطاق = 10 ميكرون. تم تعديل هذا الرقم من منشور السابق 13 الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل (4) ف CaMK-II Counterstained مع الأسيتيل تويولين في الأذن الداخلية الزرد. تم إصلاح هذا الجنين 30 HPF باستخدام PFA / الميثانول. وأعقب الأجسام المضادة لمكافحة الأسيتيل تويولين في النظام عن طريق اليكسا 488 الضد الثانوية -labeled، الأجسام المضادة ف CaMK-II واليكسا 568 الضد الثانوية المسمى. تلطيخ يكشف عن أن P-CaMK-II موجودا جنبا الى جنب أهداب الأذن الداخلية، وشارك في يموضع مع تويولين الأسيتيل. شريط مقياس = 5 ميكرون. تم تعديل هذا الرقم من منشور السابق 14 الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل (5). أكتين والأسيتيل تويولين في الأذن الداخلية الزرد. وعلى مدى ثلاثة أيام من العمر (72 HPF) تم إصلاح الجنين الزرد وimmunostained لالأسيتيل رubulin باستخدام اليكسا 568 الأجسام المضادة الثانوية -labeled، تليها التصور الأكتين باستخدام اليكسا 488 phalloidin. وكشفت أهداب فضلا عن تعصيب محور عصبي في الأذن قبل تويولين الأسيتيل (باللون الأحمر) وتشمل الهياكل F-أكتين الألياف العضلية (باللون الأخضر). وتظهر منطقتين الحسية مهدبة من الأذن الزرد في مزيد من التفاصيل: البقعة الأمامية (صباحا) وعرف الخلفي (الكمبيوتر). شريط النطاق = 10 ميكرون. تم تعديل هذا الرقم من منشور السابق 14 الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
. الرقم 6 ف CaMK-II مكافحة تصويرها لغشاء GFP في الكلى الزرد هذه الصورة المدمجة واحدة فيها β-الأكتين: CAAX-GFP الجنين (30 HPF) تم إصلاح وملطخة للف CaMK-الثاني تليها اليكسا 568 الضد الثانوية المسمى. تلطيخ يكشف عن تخصيب تنشيط CaMK-II (باللون الأحمر) على سطح قمية من الخلايا التي تبطن القنوات الناقلة لالكلى الزرد سليفة الكلوة. وتقع هذه الخلايا الأقنية الكلى فقط تحت الأنسجة العضلية ويتم وضع علامة على حد سواء عن طريق التعبير عن غشاء المستهدفة GFP (باللون الأخضر). شريط النطاق = 50 ميكرون. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
تم تطوير طريقة / الميثانول PFA في هذا المختبر مع الهدف الرئيسي لتحقيق الاستفادة المثلى من immunolocalization من الفوسفات-T 287 -CaMK-II حاتمة خلال تطوير الزرد. هذه الطريقة المترجمة بنجاح ف CaMK-II خلال تشكيل عدة أجهزة مهدبة بما في ذلك KV الزرد، 12 الأذن الداخلية 14 والكلى. 13 ولا سيما في مرحلة KV، وكانت هذه التقنية اللازمة. ومن المرجح نجاح هذه الطريقة نتيجة لمزيج من أ) التقليل من تألق ذاتي، ب) الحفاظ على حاتمة الفوسفات-CaMK-II وج) تعزيز إمكانية الوصول إلى حاتمة إلى الأجسام المضادة.
والقيد الرئيسي لهذا النهج هو الوقت المناسب للتخزين في الميثانول. في حين مناعية من P-CaMK-II هو القصوى بعد يومين في الميثانول في -20 درجة مئوية، يتم فقدان التفاعل من هذا حاتمة بعد أسبوع واحد من التخزين في الميثانول. وليس من الواضح ما إذا كان في هذا الوقت مجموعة الفوسفات هي محطاdrolyzed أو يحدث مزيد من تمسخ أن يقلل مناعية. الميثانول / EGTA في -20 درجة مئوية هو مثبت سرعة تقليديا للحفاظ على هياكل تويولين الغنية أثناء وضع الأجنة في وقت مبكر. 22 ومع ذلك، والميثانول وحده غير مرغوب فيه للحفاظ على مورفولوجيا أو حتى هياكل مثل الهيكل الخلوي الأكتين ويجب أن تسبقه PFA.
مزايا إضافية لهذا النهج هي أنه يحفظ أيضا الحواتم أخرى مثل F-أكتين تويولين والأسيتيل ولا يلغي مضان الأصلي من GFP. مثبتات أخرى، مثل تثبيتي دنت، تعلو عن الحواتم أخرى 13 وتبقى متوافقة مع P-CaMK-II تلطيخ، على الرغم من P-CaMK-II تلطيخ هو الأضعف في تثبيتي دنت من PFA / الميثانول. منذ الفوسفات البروتينات هي السائدة في مسارات الإشارات التي تنشط خلال التنمية في وقت مبكر، وينصح تثبيتي دنت وPFA / الميثانول عن اثنين من مثبتات لغيرها من الفوسفات-الحواتم في زيبالأجنة rafish. في تطوير التطبيقات مع هذه التقنية لالبروتينات وغيرها من الأجسام المضادة، فقد كان من المفيد أن يكون الأجسام المضادة التي هي أيضا رد الفعل على immunoblots وقد المستنسخة وoverexpressed البروتينات التي الأجسام المضادة يمكن التحقق من صحة. 12
فمن يستحق كل هذا الجهد لتحسين تقنيات immunolocalization لأنه أ) يمكن أن تحقق قمع الجينات في مستوى البروتين وب) تمكن من تطوير نماذج العمل. في هذا المختبر، وقد سمحت نتائج هذه المقايسات صياغة نماذج من خلالها وظائف CaMK-II. على سبيل المثال، وموقعها في KV هو عابر وغير المتماثلة، مثل دور هذا الجهاز. في الكلى، وموقعها على الجانب قمية من الخلايا الأقنية سليفة الكلوة تشير الأدوار التي تستجيب لإشارات من القناة. وأخيرا، فإن تفعيل هذا الإنزيم في نقاط ومكثفة محددة في قاعدة الأهداب المحركة الأذن تشير المترجمة الكالسيوم 2+ إشارة. الطرق وصفت هناوينبغي أيضا أن تكون مفيدة لأي محقق الذي يسعى للحصول على صور عالية الدقة من أي نوع من الخلايا الجنينية في قناتين الفلورسنت.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
الكتاب تعلن أنه ليس لديهم مصالح مالية المتنافسة.
Acknowledgments
وأيد هذا العمل من قبل منحة المؤسسة الوطنية للعلوم IOS-0817658.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1-phenyl-2-thiourea (PTU) | Sigma | P-7629 | 0.12% Stock solution. Dilute 1:40 in system water |
| Alexa488 anti-mouse IgG | Life Technologies | A11001 | Goat polyclonal, use at 1:500 |
| Alexa488 anti-rabbit IgG | Life Technologies | A11008 | Goat polyclonal, use at 1:500 |
| Alexa488 phalloidin | Life Technologies | A12379 | Preferentially binds to F-actin |
| Alexa568 anti-mouse IgG | Life Technologies | A11004 | Goat polyclonal, use at 1:500 |
| Alexa568 anti-rabbit IgG | Life Technologies | A11011 | Goat polyclonal, use at 1:500 |
| anti-acetylated α-tubulin | Sigma | T7451 | Mouse monoclonal, use at 1:500 |
| anti-phospho-T287 CaMK-II | EMD Millipore | 06-881 | Rabbit polyclonal, use at 1:20 |
| anti-total CaMK-II | BD Biosciences | 611292 | Mouse monoclonal, use at 1:20 |
| Ethanol | Fisher | S96857 | Lab grade, 95% denatured |
| Forceps | Fine Science Tools | 11252-20 | Dumont #5 |
| Glass coverslips | VWR | 16004-330 | #1 thickness |
| Glass microscope slides | Fisher | 12-550-15 | Standard glass slides |
| Methanol | Fisher | A411 | Store in freezer |
| Microcentrifuge tubes | VWR | 20170-038 | capped tubes, not sterile |
| Normal goat serum | Life Technologies | 16210-064 | Aliquot 1 ml tubes, store in freezer |
| Paraformaldehyde | Sigma | P-6148 | Reagent grade, crystalline |
| Phosphate buffered saline (PBS) | Quality Biological | 119-069-131 | 10x stock solution or made in lab |
| Triton X-100 | Sigma | BP-151 | 10% solution in water, store at RT |
| Tween-20 | Life Technologies | 85113 | 10% solution in water, store at RT |
| Compound microscope | Nikon | E-600 | Mount on vibration-free table |
| C1 Plus two-laser scanning confocal | Nikon | C1 Plus | Run by EZ-C1 program, but upgrades use "Elements" |
References
- Webb, S. E., Miller, A. L. Calcium signalling during embryonic development. Nat Rev Mol Cell Biol. 4, 539-551 (2003).
- Webb, S. E., Miller, A. L. Ca2+ signalling and early embryonic patterning during zebrafish development. Clin Exp Pharmacol Physiol. 34, 897-904 (2007).
- Whitaker, M. Calcium at fertilization and in early development. Physiol. Rev. 86, 25-88 (2006).
- Yuen, M. Y., et al. Characterization of Ca(2+) signaling in the external yolk syncytial layer during the late blastula and early gastrula periods of zebrafish development. Biochim Biophys Acta. 1833, 1641-1656 (2013).
- Tombes, R. M., Borisy, G. G. Intracellular free calcium and mitosis in mammalian cells: anaphase onset is calcium modulated, but is not triggered by a brief transient. J. Cell Biol. 109, 627-636 (1989).
- Hudmon, A., Schulman, H. Neuronal Ca2+/Calmodulin-Dependent Protein Kinase II: The Role of Structure and Autoregulation in Cellular Function. Annu. Rev. Biochem. 71, 473-510 (2002).
- Tombes, R. M., Faison, M. O., Turbeville, C. Organization and Evolution of Multifunctional Ca2+/CaM-dependent Protein Kinase (CaMK-II). Gene. 322, 17-31 (2003).
- Braun, A. P., Schulman, H. The Multifunctional Calcium/Calmodulin-Dependent Protein Kinase: From Form to Function. Annu. Rev. Physiol. 57, 417-445 (1995).
- Rich, R. C., Schulman, H. Substrate-directed function of calmodulin in autophosphorylation of Ca2+/calmodulin-dependent protein kinase II. J Biol Chem. 273, 28424-28429 (1998).
- Rothschild, S. C., et al. Tbx5-mediated expression of Ca2+/calmodulin-dependent protein kinase II is necessary for zebrafish cardiac and pectoral fin morphogenesis. Dev Biol. 330, 175-184 (2009).
- Rothschild, S. C., Lister, J. A., Tombes, R. M. Differential expression of CaMK-II genes during early zebrafish embryogenesis. Dev Dyn. 236, 295-305 (2007).
- Francescatto, L., Rothschild, S. C., Myers, A. L., Tombes, R. M. The activation of membrane targeted CaMK-II in the zebrafish Kupffer's vesicle is required for left-right asymmetry. Development. 137, 2753-2762 (2010).
- Rothschild, S. C., Francescatto, L., Drummond, I. A., Tombes, R. M. CaMK-II is a PKD2 target that promotes pronephric kidney development and stabilizes cilia. Development. 138, 3387-3397 (2011).
- Rothschild, S. C., et al. CaMK-II activation is essential for zebrafish inner ear development and acts through Delta-Notch signaling. Dev Biol. 381, 179-188 (2013).
- Yuan, S., Sun, Z. Microinjection of mRNA and morpholino antisense oligonucleotides in zebrafish embryos. J Vis Exp. , e1113 (2009).
- Rosen, J. N., Sweeney, M. F., Mably, J. D. Microinjection of zebrafish embryos to analyze gene function. J Vis Exp. , e1115 (2009).
- Westerfield, M. The Zebrafish Book: A guide for the laboratory use of zebrafish (Brachydanio rerio). , University of Oregon Press. (1993).
- Kimmel, C. B., Ballard, W. W., Kimmel, S. R., Ullmann, B., Schilling, T. F. Stages of embryonic development of the zebrafish. Dev. Dyn. 203, 253-310 (1995).
- Obara, T., et al. Polycystin-2 immunolocalization and function in zebrafish. J Am Soc Nephrol. 17, 2706-2718 (2006).
- Chitramuthu, B. P., Bennett, H. P. High resolution whole mount in situ hybridization within zebrafish embryos to study gene expression and function. J Vis Exp. , e50644 (2013).
- Thisse, C., Thisse, B. High-resolution in situ hybridization to whole-mount zebrafish embryos. Nature. 3, 59-69 (2008).
- Harris, P., Osborn, M., Weber, K. Distribution of tubulin-containing structures in the egg of the sea urchin Strongylocentrotus purpuratus from fertilization through first cleavage. J Cell Biol. 84, 668-679 (1980).
