Summary
Teknikker er beskrevet i immunfarging av fosfo-epitoper i hele sebrafisk embryo og deretter gjennomføre to-farge fluorescerende confocal lokalisering i cellulære strukturer så små som primær flimmerhårene. Teknikkene for reparasjon og avbildning kan definere plasseringen og kinetikken til forekomsten eller aktivering av spesifikke proteiner.
Abstract
Den raske proliferasjon av celler, vev-spesifikk ekspresjon av genene og fremveksten av signaleringsnettverk karakter tidlig embryoutvikling av alle virveldyr. De kinetikk og plassering av signaler - også innenfor enkeltceller - i utvikling av embryo utfyller identifisering av viktige utviklings gener. Immunfarging teknikker er beskrevet som har vist seg å definere kinetikken av intracellulære og hele dyre signaler i konstruksjoner så små som primær cilia. Teknikkene for feste, bilde- og prosesserings bilder ved hjelp av en laser-scanning confocal sammensatt mikroskop kan gjennomføres på så få som 36 timer.
Sebrafisk (Danio rerio) er en ønskelig organisme for etterforskere som ønsker å gjennomføre studier i en virveldyrarter som er rimelig og relevant for sykdom hos mennesker. Genetiske knockouts eller knockdowns må bekreftes av tapet av selve proteinprodukt. En slik bekreftelse av proteintapkan oppnås ved hjelp av teknikker som er beskrevet her. Nøkkelen til signalveier kan også påvist ved hjelp av antistoffer som er reaktive med proteiner som er post-translatorisk modifisert ved fosforylering. Bevare og optimalisere den fosforylerte tilstanden til en epitop er derfor kritisk for denne bestemmelse, og oppnås ved denne protokollen.
Denne studien beskrives teknikker for å løse embryoene i løpet av første 72 timer for utvikling og samtidig lokalisere en rekke relevante epitoper med cilier i Kupffer s Vesikkel (KV), nyrene og det indre øret. Disse teknikkene er enkel, krever ikke disseksjon og kan gjennomføres på en relativt kort tidsperiode. Prosjektering konfokal bildestakker inn et enkelt bilde er et nyttig middel til å presentere disse dataene.
Protocol
Sebrafisk prosedyrer i denne protokollen er godkjent av Institutional Animal Care og bruk Committee (IACUC) ved Virginia Commonwealth University.
1. Utarbeidelse av reagenser
- 4% PFA / PBS. Vei 8 g paraformaldehyde (PFA) i avtrekksskap. Mens de fortsatt i avtrekksskap, oppløse det tørre PFA i ~ 80 ml destillert H2O med omrøring og oppvarming til 50 ° C. Under omrøring, tilsett 3 - 10 dråper frisk 1N NaOH til PFA er helt oppløst og løsningen klargjør. Fjern fra varme og tilsett 100 ml 2x fosfatbufret saltvann (PBS). Bringe volumet til 200 ml med destillert H2O Avkjøl til romtemperatur og bekrefte pH på 7,4 før bruk. Oppbevares i mørke ved 4 ° C, men bruk innen en uke.
- Bruk 100% metanol uten kosttilskudd. Bruk 95% etanol uten kosttilskudd.
- Forbered Fosfatbufret Tween (PBT). Supplement Fosfat-buffered saltoppløsning (PBS) med 0,1% Tween-20. Legg 0.5 ml av en 20% Tween-20 stamløsning til 100 ml, 1 x PBS. Oppbevar ved romtemperatur.
- Forbered Fosfatbufret Triton-X (PBTx). Supplere PBS med 0,1% Triton X-100. Tilsett 0,5 ml av en 20% Triton X-100 lager til 100 ml av PBS. Oppbevar ved romtemperatur.
- Forbered 10% NGS / PBTx. Normalt geiteserum (NGS) blokkerer ikke-spesifikke bindingsseter. Oppbevar NGS i delmengder ved -20 ° C. Hvis du vil bruke, tilsett 1 ml til 9 ml PBTx.
- Forbered 50% glycerol / PBS. Bland grundig like deler av 2 x PBS og 100% glyserol. Oppbevar ved romtemperatur.
2. Embryo Fixation
- . (. F.eks β-actin: CAAX-GFP) Avl Skaff villtype (AB og WIK) eller transgene embryoer gjennom naturlige parringer. Dersom det er ønskelig, injisere embryoer med konstruksjoner eller morpholinos, som beskrevet. 15,16
- Heve embryoer. Samle embryoer og inkuber ved 28,5 ° C i nærvær av 0,003% 1-fenyl-2-tiourea (PTU) for å blokkere pigmentering som beskrevet. 17 p>
- Fix. Når embryoer har nådd den ønskede utviklingsstadiet, 18, bedøve embryoene bruker MESAB, fjerne så mye system vann som mulig og legg frisk 4% PFA / PBS i 3-4 timer ved romtemperatur. MERK: Noen ganger mindre enn 20 timer etter befruktning (HPF), fikse før dechorionation. Til tider etter 20 HPF, dechorionate før fiksering ved hjelp av to par fin spiss pinsett under et dissekere mikroskop.
- Endre løsninger. Overfør embryoer med et bredt boring pipette, som beskrevet. 17 Endre løsninger i 1,5 ml avkortet mikrosentrifugerør, rett og slett ved at befruktede egg for å gjøre opp av tyngdekraften uten sentrifugering.
- Post-fiksativ Etter 3 - 4 t., Fjerne PFA / PBS, erstatte med 100% metanol og oppbevares ved -20 ° C i minst 48 timer. MERK: For maksimal P-CaMK-II immunoreaktivitets, begrense total metanol lagringstiden til en uke.
- Plassere minimum 10 embryoer for hver eksperimentell tilstand avkortet 1,5 ml mikrosentrifugerør, og merke dem.
- Tillat embryoene å bosette seg. Fjern og kast metanol og rehydrere med progressive vask inneholdende 0,5 ml av avtagende konsentrasjoner av etanol, som angitt i det neste trinn. Hvert trinn er en 5 min vask med rock.
- Progressivt rehydrere med disse 5 oppløsninger: 66% etanol / 33% PBTx, 33% etanol / 66% PBTx, 100% PBTx, 100% PBTx (dette er den første gjentagelse av PBTx), 100% PBTx (dette er den andre gjentagelse av PBTx).
- Fjern siste PBTx vask. Tilsett 0,5 ml 10% NGS / PBTx. Inkuber i minst en time ved RT med milde rocking og fjern og kast løsning.
- Forbered primær antistoff løsning ved å fortynne i 10% NGS / PBTx. Hvis co-farging, bruke høyere affinitet antistoffet først. For denne studien, inkuber med mus anti-acetylert tubulin monoklonalt antistoff fortynnet 1: 500. for example, hvis det er 10 eksempler, kombinerer 6 pl av lagerantistoffløsning med 3 ml 10% NGS / PBTx og deretter fordele 0,3 ml av denne inn i hvert rør.
- Legg til 0,2 - 0,5 ml av den fortynnede primære antistoff til hvert rør for å dyppe alle embryoer. Inkuber med milde rocking O / N på RT.
- I morgen, fjern og kast antistoff løsning. Tilsett 0,5 ml 2% NGS / PBTx å vaske bort overflødig primært antistoff. Rist forsiktig i 5 minutter. Fjern og kast løsning. Gjenta to ganger.
- Dim lys og fortynne passende fluorescens-konjugert sekundært antistoff i 10% NGS / PBTx slik at hver tilstand inneholder minst 0,5 ml. Med mus anti-acetylert tubulin primært antistoff ved å bruke den grønne fluorescerende fargestoff-geit-anti-mus IgG ved en 1: 500 fortynning.
- Inkuber sekundært antistoff i 4 timer med forsiktig gynging ved romtemperatur i mørket. Fra nå av, prosessen de prøvene under nedtonet lys og inkuberes i en mørk beholder eller ved å pakke inn i aluminiumsfolie.
- Ved slutten av inkubasjonen fjernes og kastes det sekundære antistoffoppløsning. Tilsett 0,5 ml 2% NGS / PBTx å vaske. Rist forsiktig i 5 minutter. Fjern og kast løsning. Gjenta to ganger.
- Hvis co-farging, få den andre primære antistoff fra en annen art enn den første primære antistoffet. I disse studiene følger kanin anti-fosfo CaMK-II antistoff ved den rød-fluorescerende fargestoff-konjugert geit-anti-kanin-IgG sekundært antistoff.
- Fortynn kanin anti-fosfor CaMK-II antistoff 01:20. For hvert rør av embryoer, suspendere i 0,3 ml 10% NGS / PBTx, og deretter legge 15 mL av lager antistoff løsning.
- Sørg for at embryoer er nedsenket og lysene er nedtonet. Inkuber med milde rocking O / N ved RT i mørket.
- I morgen er svakt lys, og ta bort antistoff løsning. Tilsett 0,5 ml 2% NGS / PBTx. Rist forsiktig i 5 minutter. Fjern og kast løsning. Gjenta to ganger.
- Hold indirekte lys dim og fortynne nok av den riktige fluorescensmerket-conjugated sekundært antistoff, slik at hver tilstand inneholder minst 0,5 ml. I denne studien, fortynne den rød-fluorescerende fargestoff-konjugert geit-anti-kanin-IgG sekundært antistoff (rød kanal) 1: 500 i 10% NGS / PBTx.
- Inkuber andre sekundært antistoff i 4 timer med forsiktig gynging ved romtemperatur i mørket.
- Ved slutten av denne inkubasjon og under dempet lys, fjern og kast sekundært antistoff løsning. Tilsett 0,5 ml PBTx. Rist forsiktig i 5 minutter. Fjern og kast løsning. Gjenta to ganger. Oppbevares i enten PBTx eller 50% glycerol / PBS avhengig av avbildningsprosedyren.
4. Confocal Imaging og prosessering
- Mount embryoer for bildebehandling. Sett 1 - 5 embryo på et objektglass. Skape et kammer mellom hoveddekkglass og objektglasset ved hjelp av dekk fragmenter på hver side av kammeret. Vanligvis er fire # 1 Dekk brukes til å gjøre disse avstands stabler uten forsegling.
MERK: Ingen monteringsmedium er nødvendig. - Bruk en 100X oljeneddyppingsobjektivetmål å bringe enkelt embryo i fokus ved hjelp overført lys. Slå av lys. Slå på konfokal mikroskop. Sørge for at nødvendige lasere (grønne og / eller røde) er slått på og fjern fokus accessary er engasjert.
- Slå på konfokal programmet. I "Acquire bar", velg riktig mål. I "XY Basic" bar, sett bildestørrelsen til 1024 ved å klikke på 1024-knappen.
- I "Laser og Detector", klikk på den røde 488 boksen og den grønne 568 boksen for å slå på laser og detektor for hver kanal. Sett pinhole til middels og justere forsterkningen i "Gain" bar for hver kanal for å visualisere.
- I "Acquire Settings" bar, klikk på "live" for å begynne å skaffe bilder. I "Vis innstillinger" bar, fjern "Tving Integral Zoom" boksen for å senter i «Live" -vinduet.
- I "Acquire Settings" bar, under "Z" fanen, gå gjennom lag av bildet. Når du har valgt number av optiske seksjoner for å innlemme inn i bildet, flytte til et punkt i "midten" av det z-planet.
- Under "Z" fanen, klikk den lille røde "Reference" boksen. Dette vil nullstille RFA på valgt som "sentrum" punkt. I boksen merket "Step Size", velg tykkelsen av lagene (mellom 0,25 mikrometer og 2,0 mikrometer er ideelt). Vær oppmerksom på "File Size" boksen og prøve å begrense til 1 GB.
MERK: Vanligvis opp til 40 optiske deler av 0,5 til 1,0 um ble oppnådd, men det antall seksjoner kan bestemmes empirisk. - For å finne den øverste ekstreme av bildet, klikker du på sirkelen ved siden av "Top" og gå gjennom z lag. Nå klikker du på sirkelen ved siden av "Bottom", vil datamaskinen ta bildet tilbake til laget som sentrum. Igjen beveger seg gjennom lagene for å finne bunnen ekstreme av bildet.
- Klikk på "Live" igjen i "Acquire Settings" boksen for å stoppe laseroppkjøp. I dette panelet, klikk på den røde boksene merket Gjennomsnittlig og Z-stack. Disse boksene vil bli grønn.
- I "Acquire Settings" boksen, klikk på "Single" for å skaffe seg hele serien av bilder. Du kan følge med på fremdriften som den skanner i begge kanaler og gjennom hele z-stack.
- For å lagre, klikk på volumet vinduet og klikk "lagre som" og navnet på filen. Lagre som ".ids" fil. Til volum gjengi filen mens z-stack er fortsatt åpen, velger du Data nedtrekksmenyen og klikk på "volum gjengi". Lagre gjengitt filen som en tiff-fil. Dette er det projiserte bildet som er vist i denne publikasjonen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Optimale forhold for å visualisere fosfor-epitoper
Metoder som beskriver immunolocalization av protein epitoper i sebrafisk embryoer har vært relativt sparsom i forhold til de for lokalisering av mRNA via in situ hybridisering. Fiksativ som brukes i å lokalisere protein-epitoper i cilierte celler av sebrafisk embryoer har tatt med 4% PFA / PBS og Dent fikseringsmiddel, som er en blanding av metanol og DMSO. 19 Lokalisering av RNA ved hel montere in situ hybridisering (WISH) oppnås typisk ved hjelp av PFA etterfulgt av lagring i 100% metanol. 20,21 Våre undersøkelser viste at WISH fiksativ kombinasjonen, når begrenser den tid i metanol, mellom to og syv dager, var langt bedre enn hvilket som helst annet bindemiddel for immunolocalization med P-CaMK-II antistoff . Signalet oppnås med denne PFA / metanol kombinasjonen var also betydelig større enn når Dent fikseringsmiddel, 4% PFA / PBS eller metanol ble anvendt alene, avhengig av utviklings tid og sted innenfor embryoet.
Når optimalisere teknikken som er beskrevet her, og for hvert bindemiddel og utviklingsmessige tid brukt, ble en kontrollprøve fremstilt der alle trinnene ble fulgt, bortsett fra at det primære antistoff ble utelatt. Slike kontrollprøver manglet et fluorescerende signal når avbildes under de samme betingelser som beskrevet ovenfor. Denne kontrollen er anbefalt for andre forskere replikerende denne tilnærming med en hvilken som helst antistoff.
PFA / metanol fiksativ kombinasjonen ga den sterkeste P-CaMK-II-signal og var også kompatibel med immunofarging for acetylert tubulin, som er en standard markør for cilia. Utviklingshemmede, den første ciliated organ som fremkommer og har blitt avbildet i disse studiene er Kupffer sin vesikkel (KV). KV er plassert ved den bakre ende av ryggstreng, som vist ved 12-somitt (15 HPF) trinn (figur 1). KV er en forbigående organ og er ansvarlig for venstre-høyre asymmetri. Det fremkommer ved 2-trinns somitt (12 HPF) og forsvinner rundt 18-somitt stadium. Slo primære cilia generere en sirkulær strøm av fluid, noe som fører til en heving av Ca 2+ i cilierte celler som kler KV og aktivering av CaMK-II på adskilte steder (figur 1). P-CaMK-II reaktivitet vises og forsvinner på den ene siden av KV så lenge flimmerhårene blir å slå. 12 På dette tidlige stadiet, totalt embryonale CaMK-II er fortsatt bare halvparten nivå som ved 24 HPF og en tiendedel av nivået 3 dager etter utvikling. 11 kanskje fordi total CaMK-ll ekspresjon er forholdsvis lav ved 15 HPF, er enhver forbedring i immunfarging teknikk på dette stadiet spesielt viktig.
betweno 24 og 72 HPF utvikling, vises P-CaMK-II på den apikale overflaten av ciliated cellene lining spesifikke regioner av pronephric kanaler (Tall 2,3). Immunreaktiviteten av den totale CaMK-II langs hele pronephric kanalen og gjennom tilstøtende somites (figur 2) viser at bare en delmengde av embryonale CaMK-II er aktivert (P-CaMK-II).
Fiksering Forholdene er kompatibel med Sikrer GFP fluorescens
Disse festeteknikker er også kompatible med feste grønt fluorescerende protein (GFP) fluorescens uten ekstrautstyr (figur 3). I GFP-merket CaMK-II konstruksjon som er brukt i denne figur, beholder GFP tilstrekkelig fluorescens skjønt PFA / metanol fiksering og etterfølgende immunfarging. I en høy forstørrelse riss av celler som kler pronephric kanal (figur 3), the mosaikk ekspresjon av GFP-CaMK-II kan sees i celler som også er blitt immunofarget for P-CaMK-II.
Sebrafisk embryonale øret er et annet vev der heving av Ca 2+, som handler gjennom CaMK-II, påvirker dens utvikling. 14 sebrafisk ører normalt vises på rundt en dag av utviklingen. På dette tidspunkt blir CaMK-II intenst aktivert ved foten av kinocilia og ved lavere nivåer langs kinocilium (figur 4). Dette sett med bilder viser at denne fiksering og immunolocalization teknikk kan detektere flekker i løpet av flimmerhårene, en struktur hvis tverrsnitt er mindre enn 1 um. Disse cilia beholde sin struktur gjennom hele denne fiksering og farging prosessen.
Et ytterligere eksempel på en to-farge kontra i det indre øret på et senere tidspunkt i utviklingen ble oppnådd ved farging med både Alexa 488phalloidin og anti-acetylert tubulin, etterfulgt av en Alexa 568 merket sekundært antistoff (figur 5). Det er bemerkelsesverdig at PFA / metanol-fikseringsfremgangsmåten bevarer både F-aktin og tubulin, som ikke er sann for alle fiksativ. Dette eksempelet er vist som et fusjonert fargebilde for hele øret og deretter for sub-regioner. 14
Et siste representativt eksempel på to-farge kontra ble oppnådd med en stamme av fisk som produseres embryoer med membran-målrettede GFP (figur 6). Membran målrettede GFP er ikke tilknyttet noe annet protein og går tapt når ekstraheres med metanol, derfor dette bilde ble oppnådd fra fisk som ble fiksert med PFA alene. Dette resultatet tyder på at metanol behandling ekstrakter membraner, så det er ikke anbefalt for proteiner som kan være utelukkende membranbundne. P-CaMK-II signal i denne figur er redusert i forhold til det som oppnås hvis methanol ble også brukt, men dette viser at på dette stadium og plassering (nyre) av utvikling av embryo, er sterk nok til å bli detektert uten metanol behandling signalet. Det er ikke sant på KV stadium,. Dvs. methanol er nødvendig for å visualisere P-CaMK-II-immunfarging. Dette eksemplet vises bare som en sammenslåtte bildet der nyrenes pronephric kanalen er i tilknytning til trunk muskler.
Oppsummert PFA / metanol fiksering metoden beskrevet her er forenlig med bevaring av GFP og med farging for F-aktin, acetylert tubulin, total CaMK-II og P-CaMK-II.
Figur 1. P-CaMK-II kontra for acetylert Tubulin (cilier) i Sebrafisk KV. Utsikt mot en enkelt levende 12 somitt scenen (12 ss) embryo avslører den bakre plasseringen av KV av arrowhead (lateral view, A) og sirkelen inne i boksen (ventral visning, B). Embryoer på dette stadiet ble løst ved hjelp av PFA / metanol. Embryoene ble immunostained for acetylert tubulin etterfulgt av en Alexa 488-merket sekundært antistoff (grønn kanal). Deretter ble kanin polyklonalt antistoff mot P-CaMK-II, fulgt av en Alexa 568- merket sekundært antistoff (rød kanal). To-kanals fluorescerende bildeprojeksjoner ble ervervet som beskrevet i stadig høyere forstørrelser (C, D). Scale bar = 10 mikrometer. Dette tallet er endret fra forrige publisering. 12 Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 2. P-CaMK-II kontra forTotal CaMK-II sammen Sebrafisk Nyre. En enkelt dechorionated embryo ved 30 HPF ble løst ved hjelp av PFA / metanol. Embryoene ble deretter farget for total CaMK-II fulgt av Alexa 488 merket sekundært antistoff (grønn). Deretter ble P-CaMK-II primært antistoff, etterfulgt av Alexa 568 merket sekundært antistoff (rød). Farging avslører en berikelse av aktivert CaMK-II (i rødt) langs den apikale overflaten av cellene som linje kanalene av pronephric sebrafisk nyre, mens total CaMK-II er beriket på somitt grensene for tilstøtende muskelvev og hele sarcomeres. Scale bar = 50 mikrometer. Disse bildene ble kjøpt til en lavere forstørrelse enn det som er beskrevet i teksten for å se hele nyre. Dette tallet er endret fra forrige publisering. 13 Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 3. P-CaMK-II Counter avbildes for GFP i sebrafisk nyreceller. Denne 30 HPF embryo ble injisert med en cDNA som koder for en dominant negative GFP-CaMK-II. 13 Slike injeksjoner vanligvis viser mosaikk uttrykk. Embryoet ble løst ved hjelp av PFA / metanol og deretter immunostained for P-CaMK-II ved hjelp av en Alexa 568 merket sekundært antistoff. Imaging avslører at GFP vedvarer gjennom PFA / metanol fiksering, rehydrering, blokkering og farging. Scale bar = 10 mikrometer. Dette tallet er endret fra forrige publisering. 13 Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 4 P-CaMK-II kontra med acetylert Tubulin i Sebrafisk indre øret. Denne 30 HPF embryo ble løst ved hjelp av PFA / metanol. Den anti-acetylert tubulin antistoff ble fulgt i rekkefølge etter Alexa 488 -merket sekundært antistoff, P-CaMK-II antistoff og Alexa 568 merket sekundært antistoff. Farging avslører at P-CaMK-II er til stede langs indre øret flimmerhårene og co-lokaliserer med acetylert tubulin. Scale bar = 5 mikrometer. Dette tallet er endret fra forrige publisering. 14 Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 5. Actin og acetylert Tubulin i Sebrafisk Inner Ear. En tre dagers gammel (72 HPF) sebrafisk embryo ble løst, og immunostained for acetylert tubulin bruker Alexa 568 -merkede sekundære antistoffer, etterfulgt av aktin visualisering ved hjelp av Alexa 488 phalloidin. Cilia samt aksonal innervasjon av øret er avslørt av acetylert tubulin (i rødt) og F-aktin strukturer inkluderer muskelfibre (i grønt). To cilierte sensoriske regioner av sebrafisk øre er vist i mer detalj: fremre makula (am) og bakre crista (pc). Scale bar = 10 mikrometer. Dette tallet er endret fra forrige publisering. 14 Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
. Figur 6 P-CaMK-II Counter avbildes for Membrane GFP i Sebrafisk Kidney Denne singelen sammenslåtte bildet der β-aktin. CAAX-GFP embryo (30 HPF) ble fiksert og farget for P-CaMK-II etterfulgt av Alexa 568 merket sekundært antistoff. Farging avslører en berikelse av aktivert CaMK-II (i rødt) langs den apikale overflaten av cellene som linje kanalene av pronephric sebrafisk nyre. Disse nyre duktale cellene er plassert like under muskelvev og begge er preget av uttrykket av membranen målrettet GFP (grønt). Scale bar = 50 mikrometer. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
PFA / metanol-metoden ble utviklet i dette laboratoriet med hovedmål å optimalisere immunolocalization av fosfor-T 287 -CaMK-II epitop i sebrafisk utvikling. Denne metoden med hell lokaliserte P-CaMK-II under dannelsen av flere cilierte organer, inkludert sebrafisk KV, 12 indre øret 14 og nyre. 13 Spesielt ved KV stadium, denne teknikken var nødvendig. Suksessen med denne metoden er sannsynligvis på grunn av en kombinasjon av a) minimalisering av autofluorescens, b) bevaring av fosfo-CaMK-II-epitop og c) forbedret tilgjengelighet av epitopen til antistoffer.
En primær begrensning av denne tilnærmingen er tiden for lagring i metanol. Mens immunoreaktivitet av P-CaMK-II er maksimal etter to dager i metanol ved -20 ° C, blir reaktiviteten av denne epitopen tapt etter en ukes lagring i metanol. Det er ikke klart om på dette tidspunktet fosfatgruppen er hydrolyzed eller videre denaturering oppstår som reduserer immunoreaktivitets. Metanol / EGTA ved -20 ° C er et tradisjonelt hurtig fikseringsmiddel for konservering av tubulin-rike strukturer under utviklingen av tidlige embryoer. 22 Det er imidlertid metanol alene ikke er ønskelig for å bevare morfologien eller strukturer slik som aktin cytoskjelettet og skal anføres PFA.
Andre fordeler med denne tilnærmingen er at det også bevarer andre epitoper som F-aktin og acetylert tubulin og eliminerer ikke innfødte fluorescens av GFP. Andre fiksativ, som Dent fiksativ, er overlegen andre epitoper 13 og forbli kompatibel med P-CaMK-II flekker, selv om P-CaMK-II farging er svakere i Dent fiksativ enn PFA / metanol. Siden fosfo-proteiner er utbredt i signalveier som er aktive under tidlig utvikling, Dent fiksativ og PFA / metanol anbefalt som to fiksativ for andre fosfo-epitoper i Zebrafish embryoer. I utviklingen av applikasjoner med denne teknikken for andre proteiner og deres antistoffer, har det vært nyttig å ha antistoffer som er reaktive også på immunoblot og for å ha klonet og overuttrykkes proteiner med hvilke antistoffer kan bli validert. 12
Det er verdt innsatsen for å optimalisere teknikker for immunolocalization fordi det a) kan bekrefte gensuppresjon på proteinnivå og b) muliggjør utvikling av modeller for handling. I dette laboratoriet, har resultatene av disse analysene er tillatt formulering av modeller gjennom hvilken CaMK-II-funksjoner. For eksempel, dets plassering i KV er forbigående og asymmetrisk, som rollen til dette organ. I nyrene, sin plassering på den apikale siden av pronephric duktale celler antyder rollene som reagerer på signaler fra kanalen. Til slutt aktivering av dette enzym i bestemte intens puncta ved bunnen av øret kinocilia antyder en lokalisert Ca2 + signal. Metodene som beskrives herbør også være nyttig for noen etterforsker som søker å få høyoppløselige bilder av alle embryonale celletype i to fluorescerende kanaler.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne hevder at de ikke har noen konkurrerende økonomiske interesser.
Acknowledgments
Dette arbeidet ble støttet av National Science Foundation tilskudd IOS-0817658.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1-phenyl-2-thiourea (PTU) | Sigma | P-7629 | 0.12% Stock solution. Dilute 1:40 in system water |
| Alexa488 anti-mouse IgG | Life Technologies | A11001 | Goat polyclonal, use at 1:500 |
| Alexa488 anti-rabbit IgG | Life Technologies | A11008 | Goat polyclonal, use at 1:500 |
| Alexa488 phalloidin | Life Technologies | A12379 | Preferentially binds to F-actin |
| Alexa568 anti-mouse IgG | Life Technologies | A11004 | Goat polyclonal, use at 1:500 |
| Alexa568 anti-rabbit IgG | Life Technologies | A11011 | Goat polyclonal, use at 1:500 |
| anti-acetylated α-tubulin | Sigma | T7451 | Mouse monoclonal, use at 1:500 |
| anti-phospho-T287 CaMK-II | EMD Millipore | 06-881 | Rabbit polyclonal, use at 1:20 |
| anti-total CaMK-II | BD Biosciences | 611292 | Mouse monoclonal, use at 1:20 |
| Ethanol | Fisher | S96857 | Lab grade, 95% denatured |
| Forceps | Fine Science Tools | 11252-20 | Dumont #5 |
| Glass coverslips | VWR | 16004-330 | #1 thickness |
| Glass microscope slides | Fisher | 12-550-15 | Standard glass slides |
| Methanol | Fisher | A411 | Store in freezer |
| Microcentrifuge tubes | VWR | 20170-038 | capped tubes, not sterile |
| Normal goat serum | Life Technologies | 16210-064 | Aliquot 1 ml tubes, store in freezer |
| Paraformaldehyde | Sigma | P-6148 | Reagent grade, crystalline |
| Phosphate buffered saline (PBS) | Quality Biological | 119-069-131 | 10x stock solution or made in lab |
| Triton X-100 | Sigma | BP-151 | 10% solution in water, store at RT |
| Tween-20 | Life Technologies | 85113 | 10% solution in water, store at RT |
| Compound microscope | Nikon | E-600 | Mount on vibration-free table |
| C1 Plus two-laser scanning confocal | Nikon | C1 Plus | Run by EZ-C1 program, but upgrades use "Elements" |
References
- Webb, S. E., Miller, A. L. Calcium signalling during embryonic development. Nat Rev Mol Cell Biol. 4, 539-551 (2003).
- Webb, S. E., Miller, A. L. Ca2+ signalling and early embryonic patterning during zebrafish development. Clin Exp Pharmacol Physiol. 34, 897-904 (2007).
- Whitaker, M. Calcium at fertilization and in early development. Physiol. Rev. 86, 25-88 (2006).
- Yuen, M. Y., et al. Characterization of Ca(2+) signaling in the external yolk syncytial layer during the late blastula and early gastrula periods of zebrafish development. Biochim Biophys Acta. 1833, 1641-1656 (2013).
- Tombes, R. M., Borisy, G. G. Intracellular free calcium and mitosis in mammalian cells: anaphase onset is calcium modulated, but is not triggered by a brief transient. J. Cell Biol. 109, 627-636 (1989).
- Hudmon, A., Schulman, H. Neuronal Ca2+/Calmodulin-Dependent Protein Kinase II: The Role of Structure and Autoregulation in Cellular Function. Annu. Rev. Biochem. 71, 473-510 (2002).
- Tombes, R. M., Faison, M. O., Turbeville, C. Organization and Evolution of Multifunctional Ca2+/CaM-dependent Protein Kinase (CaMK-II). Gene. 322, 17-31 (2003).
- Braun, A. P., Schulman, H. The Multifunctional Calcium/Calmodulin-Dependent Protein Kinase: From Form to Function. Annu. Rev. Physiol. 57, 417-445 (1995).
- Rich, R. C., Schulman, H. Substrate-directed function of calmodulin in autophosphorylation of Ca2+/calmodulin-dependent protein kinase II. J Biol Chem. 273, 28424-28429 (1998).
- Rothschild, S. C., et al. Tbx5-mediated expression of Ca2+/calmodulin-dependent protein kinase II is necessary for zebrafish cardiac and pectoral fin morphogenesis. Dev Biol. 330, 175-184 (2009).
- Rothschild, S. C., Lister, J. A., Tombes, R. M. Differential expression of CaMK-II genes during early zebrafish embryogenesis. Dev Dyn. 236, 295-305 (2007).
- Francescatto, L., Rothschild, S. C., Myers, A. L., Tombes, R. M. The activation of membrane targeted CaMK-II in the zebrafish Kupffer's vesicle is required for left-right asymmetry. Development. 137, 2753-2762 (2010).
- Rothschild, S. C., Francescatto, L., Drummond, I. A., Tombes, R. M. CaMK-II is a PKD2 target that promotes pronephric kidney development and stabilizes cilia. Development. 138, 3387-3397 (2011).
- Rothschild, S. C., et al. CaMK-II activation is essential for zebrafish inner ear development and acts through Delta-Notch signaling. Dev Biol. 381, 179-188 (2013).
- Yuan, S., Sun, Z. Microinjection of mRNA and morpholino antisense oligonucleotides in zebrafish embryos. J Vis Exp. , e1113 (2009).
- Rosen, J. N., Sweeney, M. F., Mably, J. D. Microinjection of zebrafish embryos to analyze gene function. J Vis Exp. , e1115 (2009).
- Westerfield, M. The Zebrafish Book: A guide for the laboratory use of zebrafish (Brachydanio rerio). , University of Oregon Press. (1993).
- Kimmel, C. B., Ballard, W. W., Kimmel, S. R., Ullmann, B., Schilling, T. F.
- Obara, T., et al. Polycystin-2 immunolocalization and function in zebrafish. J Am Soc Nephrol. 17, 2706-2718 (2006).
- Chitramuthu, B. P., Bennett, H. P. High resolution whole mount in situ hybridization within zebrafish embryos to study gene expression and function. J Vis Exp. , e50644 (2013).
- Thisse, C., Thisse, B. High-resolution in situ hybridization to whole-mount zebrafish embryos. Nature. 3, 59-69 (2008).
- Harris, P., Osborn, M., Weber, K. Distribution of tubulin-containing structures in the egg of the sea urchin Strongylocentrotus purpuratus from fertilization through first cleavage. J Cell Biol. 84, 668-679 (1980).
