Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Chemistry
Click here for the English version

Chemistry

Иммунное окрашивание фосфо-эпитопы в мерцательного органах вся гора эмбрионов данио

Published: February 19, 2016 doi: 10.3791/53747
Automatic Translation
1, 2, 1
1Department of Biology, Virginia Commonwealth University, 2Center for Human Disease Modeling, Duke University Medical Center

Summary

Методы описаны в immunostain фосфо-эпитопы в целых эмбрионов данио, а затем провести двухцветную локализацию флуоресцентного конфокальной в клеточных структурах, как малые, как первичных ресничек. Методики фиксации и обработки изображений может определять местоположение и кинетику появления или активации специфических белков.

Abstract

Быстрое распространение клеток, выражение тканеспецифическая генов и появление сигнальных сетей характеризуют раннее эмбриональное развитие всех позвоночных. Кинетика и расположение сигналов - даже в пределах одной клетки - в развивающемся эмбрионе дополняет идентификацию важных генов в развитии. Иммунное окрашивание методы описаны, что, как было показано, чтобы определить кинетику внутриклеточных и целых сигналов животных в структурах, как малые, как первичных ресничек. Методы для фиксации, визуализации и обработки изображений с использованием лазерно-сканирующей конфокальной сложный микроскоп может быть завершена в качестве всего лишь 36 часов.

Данио рерио (Danio rerio) является желательным организм для исследователей, которые стремятся проводить исследования в видах позвоночных, что является доступным и отношение к болезни человека. Генетические нокауты или нокдаунов должна быть подтверждена потерей фактического белкового продукта. Такое подтверждение потери белкаможет быть достигнуто с помощью методов, описанных здесь. Ключи в сигнальных путей также могут быть расшифрованы с использованием антител, которые реагируют с белками, которые были посттрансляционно модифицированных путем фосфорилирования. Сохранение и оптимизацию фосфорилированный состояние эпитопом Поэтому крайне важно, чтобы это определение и осуществляется этим протоколом.

Это исследование описывает методы, чтобы исправить эмбрионов в течение первого 72 ч развития и сотрудничества, локализовать различные соответствующих эпитопов с ресничек в Купфера везикул (кВ), почку и внутреннее ухо. Эти методы являются простыми, не требуют рассечение и может быть завершена в течение относительно короткого периода времени. Проектирование стеки конфокальной изображения в одно изображение является полезным средством представления этих данных.

Protocol

Данио процедуры этого протокола были утверждены животных уходу и использованию комитета Institutional (IACUC) в Университете Содружества Вирджинии мимо.

1. Подготовка реагентов

  1. 4% PFA / PBS. Взвесьте 8 г параформальдегида (PFA) в вытяжном шкафу. Хотя до сих пор в вытяжном шкафу, растворить сухой PFA в ~ 80 мл дистиллированной H 2 O при перемешивании и нагревании до 50 ° C. При перемешивании добавить 3 - 10 капель свежего 1N NaOH до PFA полностью не растворится и раствор уточняет. Снять с огня и добавить 100 мл 2x фосфатно-солевой буфер (PBS). Принесите объем до 200 мл дистиллированной H 2 O. Охлаждают до комнатной температуры и подтверждения рН 7,4 перед использованием. Хранить в темном месте при температуре 4 ° С, но использовать в течение одной недели.
  2. Используйте 100% метанола без каких-либо добавок. Используйте 95% этанола без каких-либо добавок.
  3. Подготовьте с фосфатным буфером Tween (РВТ). Дополнение фосфатно-солевом буфере (PBS) с 0,1% твина-20. Добавить 0.5 мл 20% -ного твина-20 маточного раствора до 100 мл 1X PBS. Хранить при комнатной температуре.
  4. Подготовьте с фосфатным буфером Triton-X (PBTx). Дополнение PBS с 0,1% Triton X-100. Добавить 0,5 мл 20% Triton X-100 на складе в 100 мл PBS. Хранить при комнатной температуре.
  5. Подготовьте 10% NGS / PBTx. Нормальной козьей сыворотки (NGS) блокирует неспецифические сайты связывания. Хранить NGS в аликвотах при -20 ° C. Чтобы использовать, добавьте 1 мл до 9 мл PBTx.
  6. Подготовьте 50% глицерина / PBS. Тщательно перемешать в равных частях 2x PBS и 100% глицерина. Хранить при комнатной температуре.

2. Эмбрион Фиксация

  1. . (. Например, β-актина: CAAX-GFP) Разведение Получить дикого типа (АВ и WIK) или трансгенные эмбрионы через естественные спариваний. При желании, придать эмбрионов с конструкциями или Morpholinos, как описано. 15,16
  2. Повысить эмбрионов. Collect эмбрионов и инкубировать при 28,5 ° C в присутствии 0,003% 1-фенил-2-тиомочевины (ПТУ), чтобы блокировать пигментацию, как описано. 17 р>
  3. Фикс. Когда эмбрионы достигли желаемого стадию развития, 18,   обезболить эмбрионов с использованием MESAB, удалить как можно больше водной системы насколько это возможно и добавить свежий 4% PFA / PBS в течение 3 - 4 ч при комнатной температуре. Примечание: в разы меньше, чем 20 ч после оплодотворения (ФВЧ), исправить до dechorionation. Порой после 20 часов после оплодотворения, dechorionate до фиксации с использованием двух пар тонких точечных щипцов при вскрытии микроскопом.
  4. Изменение решения. Передача эмбрионы, используя широким отверстием пипетки, как описано. 17 Изменить решения в 1,5 мл микроцентрифужных крышками трубки, просто позволяя эмбрионов урегулировать под действием силы тяжести без центрифугирования.
  5. Пост-фиксатор Через 3 - 4. Ч удалить PFA / PBS, заменить 100% метанола и хранят при -20 ° С в течение по меньшей мере 48 ч. Примечание: Для максимального P-CaMK-II иммунореактивности, ограничить общее время хранения метанола до одной недели.
"> 3. Иммунологическое Всего Эмбрионы

  1. Поместите минимум 10 эмбрионов для каждой экспериментальной состоянии в ограничен 1,5 мл микроцентрифужных трубки, и обозначить их.
  2. Разрешить эмбрионы урегулировать. Удаляют метанол и увлажняет с прогрессивными стирок содержащий 0,5 мл уменьшением концентрации этанола, как указано в следующей стадии. Каждый шаг является 5 мин промывка качалки.
  3. Постепенно увлажняет с этими 5 решений: 66% этанол / 33% PBTx, 33% этанол / 66% PBTx, 100% PBTx, 100% PBTx (это первое повторение PBTx), 100% PBTx (это второй повтор PBTx).
  4. Удалить последней промывки PBTx. Добавить 0,5 мл 10% NGS / PBTx. Выдержите в течение по крайней мере 1 час при комнатной температуре при осторожном качания, а затем удалить и выбросить решение.
  5. Получают раствор первичного антитела путем разбавления в 10% NGS / PBTx. Если со-иммунное, использовать более высокое сродство антитела первым. Для этого исследования, инкубировать с мышиным анти-ацетилированный тубулина моноклонального антитела, разбавленного 1: 500. Для examplе, если есть 10 образцов, сочетающие 6 мкл раствора складе антитела с 3 мл 10% NGS / PBTx а затем распределяют 0,3 мл этого в каждую пробирку.
  6. Добавить 0,2 - 0,5 мл разбавленного первичного антитела в каждую пробирку погрузить все эмбрионы. Выдержите с нежным качалке O / N при комнатной температуре.
  7. Утром снимите и выбросьте раствор антител. Добавить 0,5 мл 2% NGS / PBTx чтобы смыть лишнюю первичное антитело. Осторожно покачайте в течение 5 мин. Удаляют решение. Повторите дважды.
  8. Дим верхний свет и разбавить соответствующий флуоресцентно-конъюгированного вторичного антитела в 10% NGS / PBTx так что каждое условие содержит, по меньшей мере, 0,5 мл. С мышиного антитела против ацетилированного тубулина первичного антитела, используйте зеленый флуоресцентный краситель козий анти-мыши IgG при разведении 1: 500.
  9. Выдержите вторичного антитела в течение 4 часов с нежным качалки при комнатной температуре в темноте. С этого момента, процесс образцы под приглушенное освещение и инкубировать в темном контейнере или путем обертывания в алюминиевую фольгу.
  10. В конце инкубации, удалить и выбросить решение вторичное антитело. Добавить 0,5 мл 2% NGS / PBTx мыть. Осторожно покачайте в течение 5 мин. Удаляют решение. Повторите дважды.
  11. Если со-иммунное, получим второе первичное антитело из различных видов, чем первый первичного антитела. В этих исследованиях, следуют кроличье анти-фосфо CaMK-II антитела красным-флуоресцентный краситель, конъюгированных козьих антител против кроличьего IgG вторичного антитела.
  12. Развести кроличье анти-фосфо CaMK-II антитела 1:20. Для каждой трубки эмбрионов, приостанавливать в 0,3 мл 10% -ного NGS / PBTx, затем добавляют 15 мкл раствора складе антител.
  13. Убедитесь, что эмбрионы погружаются и фонари затемнены. Выдержите при осторожном качалки O / N при комнатной температуре в темноте.
  14. Утром под приглушенный свет, снимите и выбросьте раствор антител. Добавить 0,5 мл 2% NGS / PBTx. Осторожно покачайте в течение 5 мин. Удаляют решение. Повторите дважды.
  15. Держите верхний свет тусклый и разбавить достаточное количество соответствующего флуоресцентно-conjuзакрытый вторичное антитело, так что каждое условие содержит, по меньшей мере, 0,5 мл. В этом исследовании, разбавить красную-флуоресцентный краситель, конъюгированных козьих антител против кроличьего IgG вторичного антитела (красный канал) 1: 500 в 10% NGS / PBTx.
  16. Выдержите вторую вторичные антитела в течение 4 часов с нежным качалки при комнатной температуре в темноте.
  17. В конце этой инкубации и под приглушенным светом, удалить и выбросить решение вторичное антитело. Добавить 0,5 мл PBTx. Осторожно покачайте в течение 5 мин. Удаляют решение. Повторите дважды. Хранить в любом PBTx или 50% глицерина / PBS в зависимости от процедуры визуализации.

4. конфокальной микроскопии и обработки

  1. Маунт эмбрионов для работы с изображениями. 1 место - 5 эмбрионов на предметное стекло. Создание камеру между главной покровное и ползуна с использованием фрагментов покровного стекла в каждую сторону от камеры. Как правило, четыре # 1 покровные используются, чтобы сделать эти разделительные стеки без герметизации.
    Примечание: Нет гистологическая среда не является необходимым.
  2. Используйте масло погружения 100XЦель довести одного эмбриона в фокусе использованием проходящего света. Выключить свет. Включите конфокальной микроскопии. Убедитесь, что соответствующие лазеры (зеленый и / или красный) и включены дистанционного внимание соучастником занимается.
  3. Включите конфокальной программы. В "Снимок панели", выбрать нужный цели. В баре "XY Basic", установить размер изображения 1024 нажав кнопку 1,024.
  4. В "лазерных и детектор" бар, нажмите на красную 488 коробка и зеленой 568 коробки, чтобы включить лазер и детектор для каждого канала. Установите обскура до среднего и регулировать усиление в "Gain" строке каждого канала, чтобы визуализировать.
  5. В "приобретают Настройки" панели, нажмите кнопку "Live", чтобы начать получения изображений. В "View Settings" панели, снимите флажок "Force Integral Zoom" до центра в "Живом" окна.
  6. В баре "Приобретение Настройки" на вкладке "Z", шаг через слои изображения. После выбора NUmber оптических секций включить в образ, перейти к какой-то момент в «центра» г-плоскости.
  7. На вкладке "Z", нажмите на маленькую красную "ссылка" окно. Это нулю RFA в точке, выбранной в качестве «центра». В поле "Размер шага", выберите толщину слоев (от 0,25 мкм и 2,0 мкм идеально подходит). Обратите внимание на поле "Размер файла" и пытаются ограничить до 1 Гб.
    Примечание: Как правило, до 40 оптических секций 0,5 - 1,0 мкм, получают, но количество секций может быть определена эмпирически.
  8. Чтобы найти верхнюю крайнюю изображения, нажмите круг рядом с "Top" и двигаться через г слоев. Теперь нажмите круг рядом с "Bottom", то компьютер будет принимать изображение обратно к слою в качестве центра. Опять двигаться сквозь слои найти нижнюю крайнюю изображения.
  9. Нажмите на кнопку "Live" снова в "Снимок Настройки" поле, чтобы остановить лазерполучение. В этой панели, нажмите красные коробки помечены средних и Z-Stack. Эти коробки станет зеленым.
  10. В поле "приобретают Настройки", нажмите кнопку "Single", чтобы приобрести всю серию изображений. Вы можете следить за ходом, как он сканирует в обоих каналах и через весь г-стека.
  11. Чтобы сохранить, нажмите на окне тома и нажмите "Сохранить как" и имя файла. Сохранить в виде файла ".ids". Для объема обработать файл в то время как г-стек по-прежнему открыт, выберите данные выпадающего меню и нажмите на кнопку "объема оказания". Сохранить оказанных файл в виде файла TIFF. Это проецируемое изображение, которые показаны в данной публикации.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Оптимальные условия для визуализации фосфо-эпитопы

Методы, описывающие иммунолокализации белковых эпитопов в эмбрионов данио были относительно редкими по сравнению с теми для локализации мРНК с помощью гибридизация. Фиксаторы, используемые в локализации белка эпитопы в ресничных клетках эмбрионов данио включили 4% PFA / PBS и фиксатором Дента, который представляет собой смесь метанола и ДМСО. 19 Локализация РНК с помощью целого гору гибридизация (WISH) обычно достигается использованием PFA с последующим хранением в 100% -ном метаноле. 20,21 Наши исследования показали, что сочетание WISH фиксатор, когда ограничение времени в метаноле с двух до семи дней, был значительно превосходит любой другой фиксатором в течение иммунолокализации с антителом Р-CaMK-II , Сигнал достигается с этим PFA / комбинации метанола ALSО значительно больше, чем когда фиксатор Дента, 4% PFA / PBS или метанол были использованы в одиночку, в зависимости от времени развития и месте внутри эмбриона.

При оптимизации способа, описанного здесь, и для каждого фиксирующего и развития времени, используемого, контрольный образец был подготовлен в котором наблюдались все шаги, за исключением того, что первичное антитело было опущено. Такие контрольные образцы не имели флуоресцентный сигнал, когда получено при тех же условиях, описанных выше. Этот контроль рекомендуется для других исследователей реплицирующимися этот подход с любого антитела.

Сочетание / метанол фиксатор PFA давала сильный сигнал P-CaMK-II, а также был совместим с использованием иммунной для ацетилированного тубулина, который является стандартным маркером для ресничек. Зрения развития, первый мерцательный орган, который возникает и был отображены в этих исследованиях является пузырек Купфера (KV), К.В. находится на заднем конце хорды как показано на 12 сомитов (15 HPF) этапа (рисунок 1). К.В. является переходным органом и несет ответственность за лево-правой асимметрии. Она возникает на 2-сомитов (12 часов после оплодотворения) и исчезает вокруг 18 сомитов. Избиение первичные реснички генерировать круговой поток жидкости, что приводит к высоте Ca 2+ в ресничных клеток, выстилающих кВ и активацию CaMK-II в отдельных местах (рис 1). P-CaMK-II реактивность появляется и исчезает на одной стороне КВ тех пор, пока бьют реснички. 12 На этой ранней стадии, общий уровень эмбриональные CaMK-II все еще ​​только половина уровень по состоянию на 24 часов после оплодотворения и одну десятую от уровня на 3 дня развития. 11 Возможно, потому суммарном выражении CaMK-II является относительно низким на 15 часов после оплодотворения, любое улучшение в технике иммуноокрашивания на данном этапе особенно важно.

Betweан 24 и 72 часов после оплодотворения развития, Р-CaMK-II на апикальной поверхности клеток, выстилающих мерцательного конкретных регионах pronephric протоков (рис 2,3) появляется. Иммунореактивности общего CaMK-II вдоль всей pronephric протока и всей соседних сомитов (рисунок 2) показывает, что только подмножество эмбрионального CaMK-II активирована (P-CaMK-II).

Фиксация условия совместимы с сохранением GFP флуоресценции

Эти методы фиксации также совместимы с сохранением зеленого флуоресцентного белка (GFP) флуоресценцию без повышения (рисунок 3). В GFP-меченый CaMK-II построить, который используется на этой фигуре, GFP сохраняет достаточную флуоресценции хотя PFA / крепление метанол и последующего иммунное. В целях большом увеличении клеток, выстилающих pronephric канал (Рисунок 3), йе мозаика выражение GFP-CaMK-II можно рассматривать в клетках, которые также были иммуноокрашиванию для P-CaMK-II.

Данио эмбриональных ухо, другую ткань, в которой возвышение Ca 2+, действующий через CaMK-II, влияет на его развитие. 14 рыбок данио уши обычно появляются на уровне около одного дня развития. В это время, CaMK-II интенсивно активируется на базе киноцилии и на более низких уровнях вдоль киноцилии (рисунок 4). Этот набор изображений показывает, что эта фиксация и Иммунолокализация методика может обнаружить окрашиванием пределах ресничек, строение которого поперечное сечение меньше, чем 1 мкм. Эти реснички сохраняют свою структуру на протяжении всего этого фиксация и иммуноокрашивания процесса.

Дополнительный пример двухцветного counterstaining во внутреннем ухе в более позднее время развития было достигнуто за счет окрашивания с обоими Alexa 488фаллоидином и анти-ацетилированный тубулина сопровождается Alexa 568 помечены вторичных антител (рисунок 5). Стоит отметить, что метод / метанол фиксации PFA сохраняет и F-актин и тубулин, которая не относится ко всем фиксаторов. Этот пример показан в виде объединенного цветного изображения на весь ухо, а затем в течение подобластей. 14

Окончательное типичным примером двухцветной counterstaining была достигнута со штаммом рыбы, которая произвела эмбрионов с мембраной целевой GFP (рисунок 6). Мембрана направлена ​​GFP не прикреплен к какой-либо другой белок и теряется, когда экстрагировали метанолом, поэтому это изображение было получено из рыбы, которые были фиксированной с PFA одиночку. Этот результат позволяет предположить, что лечение метанол извлекает мембраны, поэтому она не рекомендуется для белков, которые могут быть исключительно мембраносвязанными. Сигнал Р-CaMK-II на этой фигуре, уменьшается по сравнению с той достигнуто, если метанол также были использованы, но это показывает, что на данном этапе и местонахождения (почки) развивающегося эмбриона, сигнал достаточно силен, чтобы быть обнаружены без лечения метанола. Это не верно на этапе кВ; т. Е, метанол требуется визуализировать P-CaMK-II иммунное окрашивание. Этот пример показан только в качестве объединенного изображения, где pronephric канал почки находится рядом с комплексом ствола мышцы.

Таким образом, / метанол Способ фиксации PFA описано здесь совместим с сохранением GFP и с окрашиванием для F-актина, ацетилированного тубулина, общей CaMK-II и P-CaMK-II.

Рисунок 1
Рисунок 1. Р-CaMK-II контрастному для ацетилированный тубулина (ресничек) в данио рерио кВ. Виды одной живой стадии 12 сомитов (12 сс) эмбрион показывает заднюю расположение кВ от АРrowhead (вид сбоку, А) и круг, внутри коробки (вид снизу, B). Эмбрионы на данном этапе были установлены с помощью PFA / метанол. Эмбрионы подвергали иммунному для ацетилированного тубулина сопровождаемого Alexa 488 меченным вторичным антителом (зеленый канал). Далее, кроличьи поликлональные антитела против Р-CaMK-II последовал Alexa 568- меченого вторичного антитела (красный канал). Двухканальные флуоресцентные проекции изображения были приобретены как описано в прогрессивно больших увеличениях (C, D). Измерительная линейка = 10 мкм. Эта цифра изменяется от предыдущей публикации. 12 Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуре.

фигура 2
Рисунок 2. Р-CaMK-II контрастному дляОбщая CaMK-II вдоль данио почки. Один dechorionated эмбрион на 30 часов после оплодотворения была зафиксирована с помощью PFA / метанол. Эмбрионы затем окрашивали для общего CaMK-II с последующим Alexa 488 меченых вторичных антител (зеленый). Далее, первичное антитело P-CaMK-II последовал Alexa 568 меченых вторичных антител (красный). Окрашивание показывает обогащение активированного CaMK-II (красные) вдоль апикальной поверхности клеток, которые выстилают протоки pronephric данио почки, тогда как общая CaMK-II обогащается на сомитных границ соседнего мышечной ткани и по всей саркомеров. Измерительная линейка = 50 мкм. Эти изображения были получены при меньшем увеличении, чем описано в тексте, чтобы визуализировать всю почку. Эта цифра изменяется от предыдущей публикации. 13 Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуре.


Рисунок 3. Р-CaMK-II Счетчик распечатанных для GFP в данио рерио клеток почки. Это 30 HPF эмбрион вводили кДНК, кодирующей доминантный негативный GFP-CaMK-II. 13 Такие инъекции обычно показывают мозаичную экспрессию. Эмбрион был зафиксирован с помощью PFA / метанол, а затем иммуноокрашиванию для P-CaMK-II с использованием Alexa 568 меченого вторичного антитела. Изображений показывает, что GFP сохраняется после PFA / метанол фиксации, регидратации, блокируя и иммунной окраски. Измерительная линейка = 10 мкм. Эта цифра изменяется от предыдущей публикации. 13 Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуре.

Рисунок 4
Рисунок 4 Р-CaMK-II контрастному ацетилированный тубулина в данио рерио внутреннего уха. Это 30 HPF эмбрион был зафиксирован с помощью PFA / метанол. Анти-ацетилированный антитела тубулина последовал в порядке по Alexa 488 меченных вторичных антител, антитела P-CaMK-II и Alexa 568 меченых вторичных антител. Окрашивание показывает, что P-CaMK-II присутствует наряду внутренней ресничек уха и совместно локализуется с ацетилированного тубулина. Измерительная линейка = 5 мкм. Эта цифра изменяется от предыдущей публикации. 14 Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуре.

Рисунок 5
Рисунок 5. Актина и ацетилированный тубулина в данио рерио внутреннего уха. Трехдневный старый А (72 HPF) данио эмбрион был зафиксирован и иммуноокрашиванию для ацетилированный тubulin использованием Alexa 568 меченных вторичных антител, с последующим визуализации актина с использованием Alexa 488 фаллоидина. Реснички, а также аксонов иннервации уха раскрывается ацетилированного тубулина (красный) и F-актин структуры включают мышечные волокна (зеленый цвет). Два ресничные сенсорные регионы данио уха показаны более подробно: передний макулы (AM) и задней Crista (PC). Измерительная линейка = 10 мкм. Эта цифра изменяется от предыдущей публикации. 14 Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуре.

Рисунок 6
. Рисунок 6 С-CaMK-II Счетчик распечатанных для мембранных GFP в данио рерио почки Это единый объединенный изображение, в котором β-актина:. CAAX-GFP эмбрион (30 HPF) был фиксировали и окрашивали для P-CaMK-II с последующим Alexa 568 меченых вторичных антител. Окрашивание показывает обогащение активированного CaMK-II (красные) вдоль апикальной поверхности клеток, которые выстилают протоки pronephric данио почки. Эти почки протоков клетки расположен прямо под мышечной ткани и оба отмечены выражением мембранного целевых GFP (зеленый цвет). Измерительная линейка = 50 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуре.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Способ / метанол PFA был разработан в этой лаборатории с основной целью оптимизации иммунолокализации в -CaMK-II эпитопа фосфо-T 287 во данио развития. Этот метод успешно локализованы P-CaMK-II при образовании нескольких ресничных органов, включая данио К.В., 12 внутреннего уха 14 и почки. 13 В частности, на этапе кВ, эта техника была необходима. Успех этого метода, скорее всего из-за комбинации) минимизации флуоресценции, б) сохранение эпитопа фосфо-CaMK-II и С) расширения доступности эпитопа антител.

Первичный ограничением этого подхода является время хранения в метаноле. В то время как иммунореактивность P-CaMK-II максимальна после двух дней в метаноле при -20 ° С, реакционная способность этого эпитопа теряется после одной недели хранения в метаноле. Это не ясно, будет ли в это время группа фосфат HYdrolyzed или дополнительно денатурации происходит, что снижает иммунореактивность. Метанол / EGTA при -20 ° С является традиционно быстрым фиксатором для сохранения тубулина богатых структур во время развития ранних эмбрионов. 22 Тем не менее, одна метанол не желательно для сохранения морфологии или даже структур, таких как актинового цитоскелета и должна предшествовать PFA.

Дополнительные преимущества этого подхода в том, что он также сохраняет другие эпитопы, такие как F-актина и ацетилированного тубулина и не исключает родной флуоресценции GFP. Другие фиксаторы, такие как фиксатором Дента, превосходят другие эпитопов 13 и остаются совместимыми с окрашиванием P-CaMK-II, хотя Р-CaMK-II окрашивание слабее фиксатором Дента чем PFA / метанол. Так фосфо-белки широко распространены в сигнальных путей, которые являются активными во время раннего развития, закрепляющий Дента и PFA / метанол рекомендуются в качестве двух фиксаторов для других фосфо-эпитопов в Зебаrafish эмбрионов. При разработке приложений с этой техникой для других белков и антител к ним, это было полезно иметь антитела, которые также реактивной на иммуноблотах и клонировали и избыточно экспрессируется белки, с которыми антитела могут быть проверены. 12

Это стоит того, чтобы оптимизировать методы иммунолокализации, потому что а) можно проверить подавление генов на уровне белка и б) позволяет разрабатывать модели действий. В этой лаборатории, результаты этих анализов позволили сформулировать моделей через который функционирует CaMK-II. Например, его расположение в КВ является временным и асимметричные, как роль этого органа. В почках, его расположение на апикальной стороне pronephric протоков клеток предполагает роли, которые реагируют на сигналы из канала. Наконец, активация этого фермента в конкретном интенсивного Puncta у основания уха киноцилий предполагает локализованная сигнал Ca 2+. Методы описаны здесьтакже должны быть полезны для любого исследователя, который стремится получать изображения с высокой разрешающей способностью любого эмбрионального типа клеток в двух флуоресцентных каналов.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Авторы заявляют, что у них нет конкурирующих финансовых интересов.

Acknowledgments

Эта работа была поддержана грантом Национального научного фонда IOS-0817658.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1-phenyl-2-thiourea (PTU) Sigma P-7629 0.12% Stock solution. Dilute 1:40 in system water
Alexa488 anti-mouse IgG Life Technologies A11001 Goat polyclonal, use at 1:500
Alexa488 anti-rabbit IgG Life Technologies A11008 Goat polyclonal, use at 1:500
Alexa488 phalloidin Life Technologies A12379 Preferentially binds to F-actin
Alexa568 anti-mouse IgG Life Technologies A11004 Goat polyclonal, use at 1:500
Alexa568 anti-rabbit IgG Life Technologies A11011 Goat polyclonal, use at 1:500
anti-acetylated α-tubulin Sigma T7451 Mouse monoclonal, use at 1:500
anti-phospho-T287 CaMK-II EMD Millipore 06-881 Rabbit polyclonal, use at 1:20
anti-total CaMK-II BD Biosciences 611292 Mouse monoclonal, use at 1:20
Ethanol Fisher S96857 Lab grade, 95% denatured
Forceps Fine Science Tools 11252-20 Dumont #5
Glass coverslips VWR 16004-330 #1  thickness
Glass microscope slides Fisher 12-550-15 Standard glass slides
Methanol Fisher A411 Store in freezer
Microcentrifuge tubes VWR 20170-038 capped tubes, not sterile
Normal goat serum Life Technologies 16210-064 Aliquot 1 ml tubes, store in freezer
Paraformaldehyde Sigma P-6148 Reagent grade, crystalline
Phosphate buffered saline (PBS) Quality Biological 119-069-131 10x stock solution or made in lab
Triton X-100 Sigma BP-151 10% solution in water, store at RT
Tween-20 Life Technologies 85113 10% solution in water, store at RT
Compound microscope Nikon E-600 Mount on vibration-free table
C1 Plus two-laser scanning confocal Nikon C1 Plus Run by EZ-C1 program, but upgrades use "Elements"

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Webb, S. E., Miller, A. L. Calcium signalling during embryonic development. Nat Rev Mol Cell Biol. 4, 539-551 (2003).
  2. Webb, S. E., Miller, A. L. Ca2+ signalling and early embryonic patterning during zebrafish development. Clin Exp Pharmacol Physiol. 34, 897-904 (2007).
  3. Whitaker, M. Calcium at fertilization and in early development. Physiol. Rev. 86, 25-88 (2006).
  4. Yuen, M. Y., et al. Characterization of Ca(2+) signaling in the external yolk syncytial layer during the late blastula and early gastrula periods of zebrafish development. Biochim Biophys Acta. 1833, 1641-1656 (2013).
  5. Tombes, R. M., Borisy, G. G. Intracellular free calcium and mitosis in mammalian cells: anaphase onset is calcium modulated, but is not triggered by a brief transient. J. Cell Biol. 109, 627-636 (1989).
  6. Hudmon, A., Schulman, H. Neuronal Ca2+/Calmodulin-Dependent Protein Kinase II: The Role of Structure and Autoregulation in Cellular Function. Annu. Rev. Biochem. 71, 473-510 (2002).
  7. Tombes, R. M., Faison, M. O., Turbeville, C. Organization and Evolution of Multifunctional Ca2+/CaM-dependent Protein Kinase (CaMK-II). Gene. 322, 17-31 (2003).
  8. Braun, A. P., Schulman, H. The Multifunctional Calcium/Calmodulin-Dependent Protein Kinase: From Form to Function. Annu. Rev. Physiol. 57, 417-445 (1995).
  9. Rich, R. C., Schulman, H. Substrate-directed function of calmodulin in autophosphorylation of Ca2+/calmodulin-dependent protein kinase II. J Biol Chem. 273, 28424-28429 (1998).
  10. Rothschild, S. C., et al. Tbx5-mediated expression of Ca2+/calmodulin-dependent protein kinase II is necessary for zebrafish cardiac and pectoral fin morphogenesis. Dev Biol. 330, 175-184 (2009).
  11. Rothschild, S. C., Lister, J. A., Tombes, R. M. Differential expression of CaMK-II genes during early zebrafish embryogenesis. Dev Dyn. 236, 295-305 (2007).
  12. Francescatto, L., Rothschild, S. C., Myers, A. L., Tombes, R. M. The activation of membrane targeted CaMK-II in the zebrafish Kupffer's vesicle is required for left-right asymmetry. Development. 137, 2753-2762 (2010).
  13. Rothschild, S. C., Francescatto, L., Drummond, I. A., Tombes, R. M. CaMK-II is a PKD2 target that promotes pronephric kidney development and stabilizes cilia. Development. 138, 3387-3397 (2011).
  14. Rothschild, S. C., et al. CaMK-II activation is essential for zebrafish inner ear development and acts through Delta-Notch signaling. Dev Biol. 381, 179-188 (2013).
  15. Yuan, S., Sun, Z. Microinjection of mRNA and morpholino antisense oligonucleotides in zebrafish embryos. J Vis Exp. , e1113 (2009).
  16. Rosen, J. N., Sweeney, M. F., Mably, J. D. Microinjection of zebrafish embryos to analyze gene function. J Vis Exp. , e1115 (2009).
  17. Westerfield, M. The Zebrafish Book: A guide for the laboratory use of zebrafish (Brachydanio rerio). , University of Oregon Press. (1993).
  18. Kimmel, C. B., Ballard, W. W., Kimmel, S. R., Ullmann, B., Schilling, T. F. Stages of embryonic development of the zebrafish. Dev. Dyn. 203, 253-310 (1995).
  19. Obara, T., et al. Polycystin-2 immunolocalization and function in zebrafish. J Am Soc Nephrol. 17, 2706-2718 (2006).
  20. Chitramuthu, B. P., Bennett, H. P. High resolution whole mount in situ hybridization within zebrafish embryos to study gene expression and function. J Vis Exp. , e50644 (2013).
  21. Thisse, C., Thisse, B. High-resolution in situ hybridization to whole-mount zebrafish embryos. Nature. 3, 59-69 (2008).
  22. Harris, P., Osborn, M., Weber, K. Distribution of tubulin-containing structures in the egg of the sea urchin Strongylocentrotus purpuratus from fertilization through first cleavage. J Cell Biol. 84, 668-679 (1980).

Tags

Химия выпуск 108 Фиксация фосфо-эпитопы кальций реснички микроскопия Купфера везикул почек уха данио
Иммунное окрашивание фосфо-эпитопы в мерцательного органах вся гора эмбрионов данио
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Rothschild, S. C., Francescatto, L., … More

Rothschild, S. C., Francescatto, L., Tombes, R. M. Immunostaining Phospho-epitopes in Ciliated Organs of Whole Mount Zebrafish Embryos. J. Vis. Exp. (108), e53747, doi:10.3791/53747 (2016).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter