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Chemistry

Inmunotinción fosfo-epítopos en ciliadas Órganos de todo el montaje embriones de pez cebra

Published: February 19, 2016 doi: 10.3791/53747
Automatic Translation
1, 2, 1
1Department of Biology, Virginia Commonwealth University, 2Center for Human Disease Modeling, Duke University Medical Center

Summary

Se describen las técnicas de inmunotinción fosfo-epítopos en embriones de pez cebra enteros y luego llevar a cabo la localización de dos colores confocal de fluorescencia en las estructuras celulares tan pequeños como los cilios primarios. Las técnicas para la fijación y formación de imágenes pueden definir la ubicación y la cinética de la aparición o la activación de proteínas específicas.

Abstract

La rápida proliferación de las células, la expresión específica de tejido de genes y la aparición de las redes de señalización caracterizan el desarrollo embrionario temprano de todos los vertebrados. La cinética y la ubicación de las señales - incluso dentro de las células individuales - en el embrión en desarrollo complementa la identificación de genes de desarrollo importantes. técnicas de inmunotinción se describen que se han demostrado para definir la cinética de señales intracelulares y animales enteros en estructuras tan pequeñas como cilios primarios. Las técnicas de fijación, de imágenes y procesamiento de imágenes utilizando un microscopio compuesto confocal de escaneo láser se puede completar en tan sólo 36 horas.

El pez cebra (Danio rerio) es un organismo deseable para los investigadores que buscan llevar a cabo estudios en una especie de vertebrados que es asequible y relevante para las enfermedades humanas. knockouts o caídas genéticos deben ser confirmadas por la pérdida de la proteína producto real. Dicha confirmación de la pérdida de proteínasse puede lograr usando las técnicas descritas aquí. Pistas sobre las vías de señalización también se pueden descifrar mediante el uso de anticuerpos que son reactivos con proteínas que han sido modificados después de la traducción mediante fosforilación. Preservar y optimizar el estado fosforilado de un epítopo tanto, es crítico para esta determinación y se logra mediante este protocolo.

Este estudio describe las técnicas para solucionar los embriones durante las primeras 72 h de desarrollo y co-localizar una variedad de epítopos relevantes con los cilios en la vesícula Kupffer (KV), el riñón y el oído interno. Estas técnicas son sencillas, no requieren de disección y se puede completar en un período relativamente corto de tiempo. Proyección de pilas de imágenes confocal en una sola imagen es un medio útil para la presentación de estos datos.

Protocol

Los procedimientos de pez cebra en este protocolo han sido aprobados por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales (IACUC) de la Universidad de Virginia Commonwealth.

1. Preparación de los reactivos

  1. PFA al 4% / PBS. Pesar 8 g de paraformaldehído (PFA) en la campana de humos. Aunque todavía en la campana de humos, se disuelve el PFA seco en ~ 80 ml ​​de H 2 O destilada con agitación y calentamiento a 50 ° C. Mientras se agita, añadir 3 - 10 gotas de NaOH 1N fresco hasta PFA se haya disuelto completamente y la solución se aclara. Retirar del fuego y añadir 100 ml de solución salina tamponada 2x con fosfato (PBS). Se ajusta el volumen a 200 ml con H2O destilada Enfriar a ta y confirmar pH de 7,4 antes de su uso. Almacenar en la oscuridad a 4 ° C, pero el uso dentro de una semana.
  2. Utilizar el 100% de metanol sin ningún tipo de suplementos. Utilizar etanol al 95% sin ningún tipo de suplementos.
  3. Preparar tamponada con fosfato Tween (PBT). Suplemento solución salina tamponada con fosfato (PBS) con 0,1% de Tween-20. Añadir 0.5 ml de una solución de Tween-20 de la 20% a 100 ml de 1x PBS. Almacenar a temperatura ambiente.
  4. Preparar tamponada con fosfato Triton-X (PbTx). Suplemento PBS con 0,1% de Triton X-100. Añadir 0,5 ml de un 20% de Triton X-100 en el almacén a 100 ml de PBS. Almacenar a temperatura ambiente.
  5. Preparar 10% NGS / PbTx. suero de cabra (NGS) bloquea normales sitios de unión no específicos. NGS almacenar en alícuotas a -20 ° C. Para utilizar, añadir 1 ml a 9 ml PbTx.
  6. Preparar 50% de glicerol / PBS. Mezcle partes iguales de fondo 2x PBS y 100% de glicerol. Almacenar a temperatura ambiente.

2. Fijación de embriones

  1. . (. Por ejemplo, β-actina: CAAX-GFP) Obtener la cría de tipo salvaje (AB y Wik) o transgénicos embriones a través de la monta natural. Si se desea, inyectar embriones con constructos o morfolinos, como se describe 15,16.
  2. Elevar embriones. Recoger los embriones y se incuba a 28,5 ° C en presencia de 0,003% de 1-fenil-2-tiourea (PTU) para bloquear la pigmentación como se describe. 17 p>
  3. Fijar. Cuando los embriones han alcanzado la etapa de desarrollo deseado, 18,   anestesiar a los embriones utilizando MESAB, eliminar tanta agua como sea posible del sistema y añadir fresca PFA al 4% / PBS durante 3 - 4 horas a temperatura ambiente. NOTA: En tiempos de menos de 20 h después de la fecundación (HPF), antes de fijar dechorionation. A veces después de 20 hpf, dechorionate antes de la fijación utilizando dos pares de pinzas de punta fina bajo un microscopio de disección.
  4. Cambio de soluciones. Transferencia de embriones utilizando una amplia pipeta de diámetro interior, tal como se describe. 17 Cambio de soluciones en 1,5 ml tapados tubos de microcentrífuga, simplemente permitiendo que los embriones se asienten por gravedad y sin centrifugación.
  5. Después de post-fijador. 3 - 4 horas, retire PFA / PBS, reemplace con metanol al 100% y se almacena a -20 ° C durante al menos 48 horas. NOTA: Para la máxima inmunorreactividad P-CaMK-II, limitar el tiempo total de almacenamiento de metanol a una semana.
"> 3. La inmunotinción Total embriones

  1. Coloque un mínimo de 10 embriones para cada condición experimental en cubiertas tubo de microcentrífuga de 1,5 ml, y etiquetarlos.
  2. Permitir que los embriones se asienten. Retirar y desechar el metanol y rehidratar con lavados progresivas que contiene 0,5 ml de concentraciones decrecientes de etanol, como se indica en el siguiente paso. Cada paso es un lavado de 5 min con agitación.
  3. Progresivamente rehidratar con estos 5 soluciones: 66% de etanol / 33% PbTx, 33% de etanol / 66% PbTx, 100% PbTx, 100% PbTx (esta es la primera repetición de PbTx), 100% PbTx (esta es la segunda repetición de PbTx).
  4. Retire último lavado PbTx. Añadir 0,5 ml de 10% NGS / PbTx. Incubar durante al menos 1 hora a temperatura ambiente con agitación suave y luego retirar y desechar la solución.
  5. Preparar la solución de anticuerpo primario mediante la dilución en el 10% de NGS / PbTx. Si co-inmunotinción, utilice anticuerpo de afinidad más alta primero. Para este estudio, se incuba con el anticuerpo de la tubulina monoclonal de ratón anti-acetilado diluido 1: 500. Por ejemploe, si hay 10 muestras, combinar 6 l de la solución madre de anticuerpo con 3 ml de 10% NGS / PbTx y luego distribuir 0,3 ml de esta en cada tubo.
  6. Añadir 0,2 - 0,5 ml del anticuerpo primario diluido a cada tubo para sumergir todos los embriones. Incubar con suave O / N de balanceo a temperatura ambiente.
  7. Por la mañana, retirar y desechar la solución de anticuerpo. Añadir 0,5 ml de 2% NGS / PbTx para quitar el exceso de anticuerpo primario. Agite suavemente durante 5 minutos. Retire y deseche la solución. Repetir dos veces.
  8. Dim las luces del techo y diluir el anticuerpo secundario conjugado con fluorescencia apropiada en el 10% de NGS / PbTx de manera que cada condición contiene al menos 0,5 ml. Con el anticuerpo primario anti-tubulina de ratón acetilado, utilizar el colorante fluorescente verde cabra anti-IgG de ratón en una dilución 1: 500.
  9. Incubar anticuerpo secundario durante 4 h con agitación suave a temperatura ambiente en la oscuridad. A partir de ahora, se procesan las muestras bajo las luces se apagaron y se incuban en un recipiente oscuro o envolviéndolos en papel de aluminio.
  10. Al final de la incubación, retirar y desechar la solución de anticuerpo secundario. Añadir 0,5 ml de 2% NGS / PbTx para lavar. Agite suavemente durante 5 minutos. Retire y deseche la solución. Repetir dos veces.
  11. Si co-inmunotinción, obtener el segundo anticuerpo primario de una especie diferente que el primer anticuerpo primario. En estos estudios, seguir el anticuerpo CaMK-II de conejo anti-fosfo por el tinte conjugado de cabra anti-IgG de conejo anticuerpo secundario rojo fluorescente.
  12. Diluir conejo anti-fosfo-II CaMK anticuerpo 1:20. Para cada tubo de embriones, suspender en 0,3 ml 10% NGS / PbTx, a continuación, añadir 15 l de la solución madre de anticuerpo.
  13. Asegúrese de que los embriones se sumergen y luces se atenúan. Incubar con suave balanceo O / N a temperatura ambiente en la oscuridad.
  14. Por la mañana bajo luces tenues, retirar y desechar la solución de anticuerpo. Añadir 0,5 ml 2% NGS / PbTx. Agite suavemente durante 5 minutos. Retire y deseche la solución. Repetir dos veces.
  15. Mantenga las luces del techo tenue y diluir lo suficiente de la fluorescencia apropiada conjuanticuerpo secundario cerrada de modo que cada condición contiene al menos 0,5 ml. En este estudio, se diluye el colorante conjugado de cabra anti-conejo IgG anticuerpo rojo fluorescente secundario (canal rojo) 1: 500 en 10% NGS / PbTx.
  16. Incubar segundo anticuerpo secundario durante 4 h con agitación suave a temperatura ambiente en la oscuridad.
  17. Al final de esta incubación y bajo luces tenues, retirar y desechar la solución de anticuerpo secundario. Añadir 0,5 ml PbTx. Agite suavemente durante 5 minutos. Retire y deseche la solución. Repetir dos veces. Tienda, ya sea en PbTx o 50% de glicerol / PBS, dependiendo del procedimiento de formación de imágenes.

4. Imagen confocal y Procesamiento

  1. Monte embriones para la imagen. Coloque 1 - 5 embriones en un portaobjetos de vidrio. Crear una cámara entre el cubreobjetos y el portaobjetos principal utilizando fragmentos cubreobjetos en cada lado de la cámara. Típicamente, cuatro # 1 cubreobjetos se utilizan para hacer estas pilas spacer sin sellar.
    NOTA: No es necesario un medio de montaje.
  2. Use un aceite de inmersión 100Xobjetivo de poner solo embrión en el foco con luz transmitida. Apaga la luz. Encienda el microscopio confocal. Asegurarse de que los láseres apropiados (verde y / o rojo) se enciende y se accessary enfoque remoto está empeñada.
  3. Encienda el programa confocal. En la "barra Adquirir," seleccionar el objetivo adecuado. En la barra de "XY Básica", establecer el tamaño de la imagen para 1024 haciendo clic en el botón de 1.024.
  4. En el "láser y el detector" barra, haga clic en el cuadro 488 de color rojo y verde de la caja 568 para activar el láser y el detector para cada canal. Conjunto del agujero de alfiler a medio y ajustar la ganancia en la barra de "ganancia" de cada canal de visualizar.
  5. En el bar "Adquirir Configuración", haga clic en "vivo" para iniciar la adquisición de imágenes. En la barra de "Configuración de la vista", desmarca la casilla "fuerza integral Zoom" para el centro de la ventana "en vivo".
  6. En la barra de "Obtener configuración", en la pestaña "Z", el paso a través de las capas de la imagen. Después de seleccionar el numbre de secciones ópticas para incorporar en la imagen, se mueve a un punto en el "centro" del plano z.
  7. En la pestaña "Z", haga clic en el cuadro pequeño "de referencia" de color rojo. Esto cero la RFA en el punto elegido como el "centro". En la casilla "Tamaño Paso", seleccionar el espesor de las capas (entre 0,25 micras y 2,0 micras es lo ideal). Prestar atención a la casilla "Tamaño de archivo" y tratar de limitar a 1 GB.
    NOTA: Por lo general, hasta 40 secciones ópticas de 0,5 a 1,0 micras se obtienen, pero el número de secciones puede ser determinada empíricamente.
  8. Para encontrar el extremo superior de la imagen, haga clic en el círculo al lado de "Inicio" y moverse a través de las capas z. Ahora haga clic en el círculo al lado de "inferior", el equipo tomará la imagen a la capa como el centro. moverse de nuevo a través de las capas de encontrar el extremo inferior de la imagen.
  9. Haga clic en "Live" de nuevo en el "Obtener parámetros del" cuadro para detener el láseradquisición. En este panel, haga clic en las casillas de rojos marcados media y Z-pila. Estas cajas se volverá verde.
  10. En el cuadro "Obtener parámetros", haga clic en "Single" para adquirir la serie completa de imágenes. Usted puede controlar el progreso ya que revisa en ambos canales ya través de todo el z-pila.
  11. Para guardar, haga clic en la ventana del volumen y haga clic en "guardar como" y el nombre del archivo. Guardar como un archivo ".ids". Para hacer que el archivo de volumen mientras que el z-pila está todavía abierta, seleccione el menú desplegable de datos y haga clic en "volumen de render". Guarde el archivo renderizado como un archivo TIFF. Esta es la imagen proyectada que se muestran en esta publicación.

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Representative Results

Condiciones óptimas para la visualización de fosfo-epítopos

Métodos que describen la inmunolocalización de epítopos de proteínas en embriones de pez cebra han sido relativamente escaso en comparación con aquellos para la localización de los ARNm mediante hibridación in situ. Los agentes de fijación utilizados en la localización de los epítopos de la proteína en las células ciliadas de embriones de pez cebra han incluido 4% PFA / PBS y fijador de Dent, que es una mezcla de metanol y DMSO. 19 La localización de RNA por todo el montaje hibridación in situ (desea) típicamente se consigue utilizando PFA seguido de almacenamiento en 100% de metanol. 20,21 Nuestros estudios revelaron que la combinación de WISH fijador, al limitar el tiempo en metanol a entre dos y siete días, fue muy superior a cualquier otro fijador para inmunolocalización con el anticuerpo P-CaMK-II . La señal logrado con esta combinación PFA / metanol era del also significativamente mayor que cuando se utilizaron fijador de Dent, 4% PFA / PBS o metanol solo, dependiendo del tiempo de desarrollo y la ubicación dentro del embrión.

Cuando la optimización de la técnica descrita aquí y para cada tiempo de fijación y de desarrollo utilizado, una muestra de control se preparó en el que se siguieron todos los pasos, excepto que se omitió el anticuerpo primario. Tales muestras de control carecían de una señal fluorescente cuando reflejado en las mismas condiciones descritas anteriormente. Se recomienda utilizar este control para otros investigadores que replican este enfoque con cualquier anticuerpo.

La combinación / metanol fijador PFA dio la señal de P-CaMK-II más fuerte y también era compatible con la inmunotinción para la tubulina acetilada, que es un marcador estándar para cilios. Desarrollo, el primer órgano ciliado que emerge y se ha reflejado en estos estudios es vesícula de la Kupffer (KV). El KV se encuentra en el extremo posterior de la notocorda como se muestra en la etapa 12 somitas (15 HPF) (Figura 1). El KV es un órgano transitorio y es responsable de la asimetría izquierda-derecha. Emerge en la etapa 2 somitas (12 HPF) y desaparece por el escenario 18 somitas. Beating cilios primarios generar un flujo circular de líquido, lo que conduce a una elevación de Ca 2 + en las células ciliadas que recubren el KV y la activación de CaMK-II en lugares discretos (Figura 1). P-CaMK-II reactividad aparece y desaparece en un lado del KV, siempre y cuando los cilios laten. 12 En esta primera etapa, los niveles totales de embriones CaMK-II siguen siendo sólo la mitad del nivel que a las 24 HPF y una décima parte del nivel a los 3 días de desarrollo. 11 Tal vez porque la expresión total de CaMK-II es relativamente bajo en 15 HPF, cualquier mejora en la técnica de inmunotinción en esta etapa es especialmente importante.

between 24 y 72 hpf de desarrollo, P-CaMK-II aparece en la superficie apical de las células ciliadas que recubren regiones específicas de los conductos pronéfricos (Figuras 2,3). La inmunorreactividad del total CaMK-II a lo largo de todo el conducto pronephric ya lo largo de somitas adyacentes (Figura 2) demuestra que sólo un subconjunto de embrionario CaMK-II se activa (P-CaMK-II).

Condiciones de fijación son compatibles con la preservación de la fluorescencia de GFP

Estas técnicas de fijación también son compatibles con la retención de la fluorescencia verde de la proteína fluorescente (GFP) sin mejora (Figura 3). En la CaMK II-GFP-tagged construcción que se utiliza en esta figura, GFP conserva suficiente fluorescencia aunque PFA / fijación con metanol y posterior inmunotinción. En una vista de gran aumento de las células que recubren el conducto pronephric (Figura 3), THe expresión mosaico de GFP-CaMK-II se puede ver en las células que también han sido inmunoteñidas para P-CaMK-II.

El oído de embriones de pez cebra es otro tejido en el que la elevación de Ca 2+, actuando a través de CaMK-II, influye en su desarrollo. 14 oídos de pez cebra aparecen normalmente en torno a un día de desarrollo. En este momento, CaMK-II se activa intensamente en la base de los cinetocilios y a niveles más bajos a lo largo de la cinocilio (Figura 4). Este conjunto de imágenes muestra que esta técnica de fijación e inmunolocalización puede detectar la tinción dentro de los cilios, una estructura cuya sección transversal es menor que 1 m. Estos cilios conservan su estructura a través de este proceso de fijación y la inmunotinción.

Un ejemplo adicional de la contratinción de dos colores en el oído interno en un momento posterior de desarrollo se logró mediante la tinción tanto con Alexa 488faloidina y anti-acetilado tubulina seguido de un Alexa 568 etiquetados anticuerpo secundario (Figura 5). Es de destacar que el método de fijación / metanol PFA preserva tanto F-actina y tubulina, lo cual no es cierto en todos los fijadores. En este ejemplo se muestra una imagen en color resultante de la fusión para toda la oreja y luego como para los sub-regiones. 14

Un ejemplo representativo final del contratinción de dos colores se logró con una cepa de pescado que produjo embriones con GFP a la membrana objetivo (Figura 6). Membrana GFP objetivo no está unido a cualquier otra proteína y se pierde cuando se extrajo con metanol, por lo tanto, esta imagen se obtuvo de peces que se fijaron con PFA solo. Este resultado sugiere que el tratamiento con metanol extractos de membranas, por lo que no se recomienda para las proteínas que pueden ser exclusivamente unida a la membrana. La señal P-CaMK-II en esta figura se ve disminuida en relación con la que se consigue si methanol también se utilizaron, pero esto demuestra que en esta etapa y la ubicación (riñón) del embrión en desarrollo, la señal es lo suficientemente fuerte como para ser detectado sin tratamiento metanol. Eso no es cierto en la fase KV;. Es decir, se requiere metanol para visualizar P-CaMK-II inmunotinción. Este ejemplo sólo se muestra como una imagen fusionada donde conducto pronephric del riñón es adyacente a los músculos del tronco.

En resumen, el método de fijación / metanol PFA descrito aquí es compatible con la conservación de la GFP y con tinción de F-actina, tubulina acetilada, el total de CaMK-II y P-CaMK-II.

Figura 1
Figura 1. P-CaMK-II counterstained de tubulina acetilada (cilios) en el pez cebra KV. Vistas de una sola etapa 12 somitas en vivo (12 ss) de embriones revela la localización posterior del KV por el arrowhead (vista lateral, A) y el círculo dentro de la caja (vista ventral, B). Los embriones en esta etapa fueron fijadas mediante PFA / metanol. Los embriones fueron immunostained para tubulina acetilada seguido de un Alexa 488 anticuerpo secundario -etiquetados (canal verde). A continuación, el anticuerpo policlonal de conejo contra P-CaMK-II fue seguido por un Alexa 568 anticuerpo secundario marcado (canal rojo). De dos canales proyecciones de imágenes fluorescentes se adquirieron como se describe a ampliaciones progresivamente más altas (C, D). Barra de escala = 10 micras. Esta cifra se modificó a partir de una publicación anterior. 12 Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 2
Figura 2. P-CaMK-II para counterstainedTotal CaMK-II a lo largo de riñón de pez cebra. Un embrión dechorionated solo a 30 HPF se fijó utilizando PFA / metanol. Los embriones fueron teñidas para el total de CaMK-II seguido por el Alexa 488 anticuerpo secundario marcado (verde). A continuación, el anticuerpo primario P-CaMK-II fue seguido por el Alexa 568 anticuerpo secundario marcado (rojo). Tinción revela un enriquecimiento de activado CaMK-II (en rojo) a lo largo de la superficie apical de las células que recubren los conductos de los riñones pez cebra pronephric mientras totales CaMK-II se enriquece en los límites somite de tejido muscular adyacente ya lo largo de los sarcómeros. Barra de escala = 50 micras. Estas imágenes fueron adquiridas a un aumento menor de lo que se describe en el texto con el fin de visualizar todo el riñón. Esta cifra se modificó a partir de una publicación anterior. 13 Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.


Figura 3. P-CaMK-II Contador Imaged para GFP en células de riñón de pez cebra. Este embrión 30 hpf se inyectó con un ADNc que codifica una dominantes negativos GFP-CaMK-II. 13 Tales inyecciones típicamente muestran expresión mosaico. El embrión se fija mediante PFA / metanol y luego se immunostained para P-CaMK-II utilizando un Alexa 568 anticuerpo secundario marcado. Las imágenes revelan que la GFP persiste a través de la fijación PFA / metanol, rehidratación, el bloqueo y la inmunotinción. Barra de escala = 10 micras. Esta cifra se modificó a partir de una publicación anterior. 13 Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 4
Figura 4 P-CaMK-II de contraste con acetilado tubulina en el oído interno de pez cebra. Este embrión 30 HPF se fijó utilizando PFA / metanol. El anticuerpo anti-tubulina acetilado fue seguida en orden por la Alexa 488 anticuerpo secundario marcado con, el anticuerpo P-CaMK-II y el Alexa 568 anticuerpo secundario marcado. La tinción revela que P-CaMK-II está presente a lo largo de los cilios oído interno y co-localiza con la tubulina acetilada. Barra de escala = 5 micras. Esta cifra se modificó a partir de una publicación anterior. 14 Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 5
Figura 5. La actina y la tubulina acetilada en el oído interno de pez cebra. Un niño de tres días de edad (72 HPF) embrión de pez cebra se fijó y immunostained para acetilado tubulin utilizando Alexa 568 marcado con anticuerpos secundarios, seguido por la visualización de actina utilizando Alexa 488 faloidina. Los cilios, así como la inervación axonal de la oreja se pone de manifiesto por la tubulina acetilada (en rojo) y las estructuras de actina F incluyen fibras musculares (en verde). Dos regiones sensoriales ciliadas del oído pez cebra se muestran en más detalle: la mácula anterior (am) y crista posterior (pc). Barra de escala = 10 micras. Esta cifra se modificó a partir de una publicación anterior. 14 Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 6
. Figura 6-P-CaMK II Contador Imaged de membrana GFP en riñón pez cebra Esta imagen fusionada único en el que la β-actina:. CAAX-GFP embriones (30 HPF) se fijó y se tiñó para P-CaMK-II seguido por el Alexa 568 anticuerpo secundario marcado. Tinción revela un enriquecimiento de activado CaMK-II (en rojo) a lo largo de la superficie apical de las células que recubren los conductos de los riñones pez cebra pronephric. Estas células ductales riñón están ubicadas justo debajo de tejido muscular y ambos se caracterizan por la expresión de membrana específica de GFP (en verde). Barra de escala = 50 micras. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Discussion

El método / metanol PFA fue desarrollado en este laboratorio con el objetivo principal de la optimización de la inmunolocalización de la fosfo-T 287 -CaMK-II epítopo durante el desarrollo de pez cebra. Este método localiza con éxito P-CaMK-II durante la formación de varios órganos incluyendo el ciliadas KV pez cebra, 12 oído interno 14 y el riñón. 13 En particular, en la etapa de KV, esta técnica era necesario. El éxito de este método es probablemente debido a una combinación de a) reducción al mínimo de la autofluorescencia, b) la conservación del epítopo fosfo-CaMK-II y c) la accesibilidad mejorada de la epítopo para anticuerpos.

Una limitación principal de este enfoque es el tiempo de almacenamiento en metanol. Mientras que la inmunorreactividad de P-CaMK-II es máxima después de dos días en metanol a -20 ° C, la reactividad de este epítopo se pierde después de una semana de almacenamiento en metanol. No está claro si en este momento el grupo fosfato es hydrolyzed o más desnaturalización se produce que disminuye la inmunorreactividad. Metanol / EGTA a -20 ° C es un fijador rápido tradicionalmente para la conservación de estructuras de tubulina rica durante el desarrollo de los embriones tempranos. 22 Sin embargo, el metanol por sí sola no es deseable para la conservación de estructuras de morfología o incluso como el citoesqueleto de actina y irá precedido de PFA.

Otras ventajas de este enfoque son que también conserva otros epítopos tales como F-actina y tubulina acetilada y no elimina la fluorescencia de la GFP nativa. Otros fijadores, tales como fijador de Dent, son superiores para otros epítopos 13 y siguen siendo compatibles con la tinción de P-CaMK-II, aunque P-CaMK-II tinción es más débil en fijador de Dent de PFA / metanol. Desde fosfoproteínas son frecuentes en las vías que son activos durante el desarrollo temprano de señalización, el fijador de la abolladura y PFA / metanol se recomiendan como dos fijadores para otros fosfo-epítopos en Zebrafish embriones. En el desarrollo de aplicaciones con esta técnica para otras proteínas y sus anticuerpos, que ha sido muy útil tener anticuerpos que también son reactivos en inmunotransferencias ya han clonado y proteínas con las que los anticuerpos pueden ser validados sobreexpresado. 12

Vale la pena el esfuerzo para optimizar las técnicas de inmunolocalización porque a) se puede verificar la supresión génica a nivel de proteínas y b) permite el desarrollo de modelos de acción. En este laboratorio, los resultados de estos ensayos han permitido la formulación de modelos a través de la cual las funciones de CaMK II. Por ejemplo, su ubicación en el KV es transitoria y asimétrica, como el papel de este órgano. En el riñón, su ubicación en el lado apical de las células ductales pronéfricos sugiere papeles que responden a las señales del conducto. Finalmente, la activación de esta enzima en puntos lagrimales intensa específico en la base de cinetocilios oído sugiere una señal de Ca 2+ localizada. Los métodos descritos aquíTambién debería ser útil para cualquier investigador que busca la obtención de imágenes de alta resolución de cualquier tipo de célula embrionaria en dos canales fluorescentes.

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Disclosures

Los autores declaran que no tienen intereses financieros en competencia.

Acknowledgments

Este trabajo fue apoyado por la beca de la Fundación Nacional de Ciencia IOS-0817658.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1-phenyl-2-thiourea (PTU) Sigma P-7629 0.12% Stock solution. Dilute 1:40 in system water
Alexa488 anti-mouse IgG Life Technologies A11001 Goat polyclonal, use at 1:500
Alexa488 anti-rabbit IgG Life Technologies A11008 Goat polyclonal, use at 1:500
Alexa488 phalloidin Life Technologies A12379 Preferentially binds to F-actin
Alexa568 anti-mouse IgG Life Technologies A11004 Goat polyclonal, use at 1:500
Alexa568 anti-rabbit IgG Life Technologies A11011 Goat polyclonal, use at 1:500
anti-acetylated α-tubulin Sigma T7451 Mouse monoclonal, use at 1:500
anti-phospho-T287 CaMK-II EMD Millipore 06-881 Rabbit polyclonal, use at 1:20
anti-total CaMK-II BD Biosciences 611292 Mouse monoclonal, use at 1:20
Ethanol Fisher S96857 Lab grade, 95% denatured
Forceps Fine Science Tools 11252-20 Dumont #5
Glass coverslips VWR 16004-330 #1  thickness
Glass microscope slides Fisher 12-550-15 Standard glass slides
Methanol Fisher A411 Store in freezer
Microcentrifuge tubes VWR 20170-038 capped tubes, not sterile
Normal goat serum Life Technologies 16210-064 Aliquot 1 ml tubes, store in freezer
Paraformaldehyde Sigma P-6148 Reagent grade, crystalline
Phosphate buffered saline (PBS) Quality Biological 119-069-131 10x stock solution or made in lab
Triton X-100 Sigma BP-151 10% solution in water, store at RT
Tween-20 Life Technologies 85113 10% solution in water, store at RT
Compound microscope Nikon E-600 Mount on vibration-free table
C1 Plus two-laser scanning confocal Nikon C1 Plus Run by EZ-C1 program, but upgrades use "Elements"

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

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Rothschild, S. C., Francescatto, L., Tombes, R. M. Immunostaining Phospho-epitopes in Ciliated Organs of Whole Mount Zebrafish Embryos. J. Vis. Exp. (108), e53747, doi:10.3791/53747 (2016).

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