Ved hjælp af en Oralt opløse Strip for farmakologiske og toksikologiske studier: En enkel og Humane Alternativ til oral sonde for Animals

Summary

Følgende protokol beskriver en hidtil ukendt fremgangsmåde til kronisk oral lægemiddelindgivelse under anvendelse af et oralt opløse strimmel (ODS) i stedet for de mere almindeligt anvendte oral gavage metode. Vi viser, at prækliniske, oral drug delivery hjælp ODS metode repræsenterer en sikker, praktisk og human alternativ til oral sonde.

Abstract

Forud for at teste nye lægemidler på mennesker, kort og lang sigt præklinisk (dvs. dyr), gentagne farmakologiske og toksikologiske test. I de fleste tilfælde er den foretrukne indgivelsesvej er via oral levering. På nuværende tidspunkt er oral levering meste gennemføres ved anvendelse af en oral sonde procedure, delvis fordi det kan opnå en konsekvent og præcis dosering i dyremodel. Selv om denne metode er veletableret det har komplikationer, der kan resultere i en høj grad af animalsk nedslidning. Med henblik herpå proceduren indføres her beskriver et alternativ til den oral sondeernæring fremgangsmåde, hvor den ønskede lægemiddel er inkorporeret i en smagsstoffet oralt opløse strimmel (ODS), der kan simpelthen blive forelagt forsøgsdyret hvor den derefter hurtigt taget op med minimal manipulation af testpersonen. Heri, vi viser, at prækliniske, oral drug delivery hjælp ODS metode repræsenterer en sikker, bekvem, og human alternative til oral sonde.

Introduction

For en vellykket oversættelse af et lægemiddel fra præklinisk (dyreforsøg) til klinisk udvikling, en række veldefinerede, akutte og kroniske farmakologiske og toksikologiske undersøgelser skal udføres i dyremodeller ved anvendelse af påtænkte kliniske indgivelsesvej (som er normalt den orale vej). For at opnå dette mål, de fleste prækliniske studier øjeblikket anvende en oral sondeernæring procedure eftersom denne metode resulterer i en konsistent og præcis levering af testforbindelsen til dyret. Men i mange tilfælde, oral sondeernæring ikke tåles af dyret og opsamler tyder på, at metoden er forbundet med en betydelig mængde af stress induktion ^1.

Dette gælder især i forbindelse med udviklingen af ​​behandlinger for kroniske livslange tilstande, der kræver mere langsigtede prækliniske undersøgelser, såsom det er tilfældet med, men ikke begrænset til, næsten hver neuropsykiatrisk lidelse. For insafstand, i en transgen musemodel for Alzheimers sygdom, det blev for nylig foreslået, at sonde metoden selv kunne forvirre eksperimentelle resultater grundet dosering induceret stress ^2. Tilsvarende i en musemodel af alkoholforbruget, upublicerede resultater fra vores eget laboratorium har vist, at den gentagne indføring af sonde rør - i sig selv - kan reducere niveauet af alkohol indtag til det går integriteten af ​​den eksperimentelle paradigme (se figur 1).

I betragtning af de førnævnte begrænsninger forbundet med oral sondeernæring procedure, har betydelig indsats blevet lagt på at udvikle nye fremgangsmåder til præklinisk oral lægemiddeladministration. Aktuelle alternative fremgangsmåder indbefatter inkorporering testforbindelsen i jordnøddesmør blandinger ^3, gelatinøse forme ^4-5, chokolade pellets ^6, drikkevand ^7, og wafer kiks ^8, som alle er associeredeated med varierende grader af spørgsmål, herunder den manglende evne til at blive brugt pålideligt i dyremodel, manglende vedtagelse af forsøgsforbindelse optagelse af forsøgspersonen eller individuelle præferencer for smag, der gør stoffet mindre let forbruges ^9.

Proceduren indført heri beskriver en fremgangsmåde, hvor den ønskede medikament er inkorporeret i en aromatiseret, oralt opløse strimmel (ODS), der kan være let og let anvendes til oral administration af testforbindelsen til forsøgsdyret. Dette papir fokuserer på at dokumentere effektiviteten af ​​ODS metode bruger mus. Imidlertid er der ingen grund til at forvente, at den samme metode ikke også ville være anvendelige i andre gnavere såvel som større pattedyr. Klinisk er brugen af ozonlagsnedbrydende stoffer begynder at blive vedtaget i pædiatriske og geriatriske patienter, som en måde at overvinde synkebesvær ^10. Vi foreslår, at ODS også kan bruges med succes i prækliniske forskningsprogrammer som en sikker, bekvem, Og human alternativ til oral sonde.

Protocol

Alle beskrevne procedure er blevet godkendt af Institutional Animal Care og brug Udvalg (IACUC) fra University of Southern California.

1. Animalske Håndtering og Tilvænning

1. Indledning
   1. Tillad mus at akklimatisere sig til de opdrætsbetingelser og håndtering teknik af forsøget for at mindske stress i løbet af de efterfølgende narkotika administrative procedurer. I dette tidsrum registreres kropsvægten og fødeindtagelse hos hver mus; om ønsket, kan de senere anvendes som en ikke-invasiv sammenligningsgrundlag for at vurdere lægemiddeltoksicitet (valgfrit). Førstnævnte kan også anvendes til at bestemme vægtbaseret dosering lægemiddel.
      Bemærk: Anekdotisk, bestemmes længden af ​​den tilvænningsperiode baseret på antallet af eksperimentatorer interagerer med dyret. Det er vores erfaring, er blevet observeret mus af C57BL / 6J-stammen at have problemer habituating håndtering med mere end ~ 5 personer i vores typiske uge-lange tilvænningsperiode. Hvis det er muligt,forsøgslederen (r) opfordres også til at afstå fra at bruge parfumerede cremer, sæber og parfumer før håndtering af dyrene som tidligere rapporter viser nye stimuli, såsom lugte, kan hindre tilvænningsperiode ^11.
2. Steps
   1. Begyndende mindst 5 dage forud for indledningen af ​​undersøgelsen, overføre dyrene til det rum, hvor vil forekomme de efterfølgende eksperimenter.
   2. Noterer vægten af ​​musen ved at holde godt fast i midten af ​​halen og forsigtigt løfte dyret ud af buret og ind i vægten båd.
      1. Placer musen på skalaen, så snart den er løftet ud af cagekeeping i tankerne at korrekt forstå den mediale / proximale aspekt af halen, for at undgå degloving skader, der kan opstå, når gribning af distale aspekt af halen ^12.
      2. Noterer vægten værdi, når musen er blevet sikkert placeret i vejebåd.
   3. Noterer vægten af ​​fødevaren for en recombødet 2 på hinanden følgende dage, for at etablere baseline fødevareforbrug niveauer, der vil hjælpe fange potentielle toksiciteter under eksperimentet ^13.

2. Udarbejdelse af Fodring Needle, Saccharose Solution, og Individual ODS

1. Brug en autoklave til sterilisering af rustfrit stål gavage nåle som forberedelse til eksperimentet. Forbered 2 nåle / gruppe og 1 yderligere nål, der skal anvendes som back-up, hvis nødvendigt.
   Bemærk: Denne undersøgelse anvendte en 1,5 inches, buede, 18 g, rustfrit stål fodring nål med en 2,25 mm kugle for enden af ​​nålen.
2. Der tilsættes 20 ml vand til 0,85 g saccharose for at skabe en 4,25% (vægt / volumen) sucroseopløsning.
   Bemærk: Afhængig af parametrene under vurdering andre lave doser af saccharose kan potentielt også bruges ^14.
3. Forbered oral opløsende strimmel (ODS) for hvert dyr ved at skære standard rektangulære teststrimmel i et stykke, der er 0,5 cm inches i diameter osing en kommercielt tilgængelig enkelt kvartal tommer hul-puncher. Den rektangulære teststrimmel anvendes i denne demonstration blev formuleret til at indeholde 6 mg ivermectin (IVM), og når det er skåret til denne størrelse, allokerer en 0,21 mg dosis til hver enkelt rundt stykke tilnærme en 10 mg / kg dosis for hvert dyr (vores ønskede dosis / dyr). Denne dosis kan justeres ved at koncentrere / fortynde den samlede formulering på den rektangulære strimmel og / eller skæring af strimlen i forskellig størrelse.

3. Drug - Delivery

1. Noterer vægten værdier som tidligere beskrevet i trin 1,1-1,2.
2. Efter registrering af vægten, flyt musen til metalgitteret bur top. Når der, ved hjælp af den dominerende tommelfinger, pegefinger, og ^3. finger, forsigtigt trække sig tilbage på halen. Dette vil få musen til uforvarende greb wiren buret toppen og strække ryggen, strække sin krop væk fra forsøgslederen.
3. Tag fat i nakkeskindet med den ikke-dominant tommelfinger, pegefinger, og ^3. finger til komfortabelt begrænse dyret med et greb, der er sikker.
   Bemærk: En forsøgslederen med en mindre hånd kan også bruge ^4. finger på den samme hånd, at trække sig tilbage harmoniske af ryggen og få et mere sikkert greb på musen. Derudover afhængig af individuel præference, ringfinger, og / eller lillefinger kan også anvendes til at fastgøre halen men dette er ikke nødvendigt ^12.
4. Hold musen i en oprejst position.
5. Advarsel: Vær opmærksom på farven på slimhinder med musen. En lilla / blå udseende er en indikation af, at forsøgslederen er cinching harmoniske for stramt og musen kan ikke trække vejret.
   1. Hvis dette sker, omgående sætte musen tilbage ned på metallet buret toppen og lad det hvile i ~ 2-3 min før igen forsøger at begrænse dyret.
6. Sænk pæren spidsen af ​​gavagenål i 4,25% sucroseopløsning for at tjene som et smagsstofklæbemiddel til ODS.
7. Tryk ned på en pre-cut ODS med pæren spidsen af ​​sonde nål til at fastgøre mundtligt opløse strimler.
8. Præsenter ODS til musen ved at placere det i nærheden næseborene og / eller mund, og så dyret kan forbruge filmen. Alternativt ODS kan leveres topisk på mundhulen ved at placere den tynde strimmel direkte på tungen for musene at sluge.
9. Udskift nålen mid-gruppe under lægemiddel-dosering session for at forhindre spredning af infektionen.

Representative Results

I de følgende repræsentative undersøgelser blev social drikke modelleret ved hjælp af en 24 timers to flasker valg (TBC) paradigme som tidligere beskrevet ^15. Kort beskrevet mus havde adgang til to flasker opløsning, hvoraf den ene indeholdt vand, og den anden en 10% (v / v) ethanol-opløsning. Forsøgspersonerne blev efterfølgende overdraget til narkotikabehandling grupper således at den gennemsnitlige 10E (10% ethanol / 90% vand v / v) indtag var ens på tværs af grupperne.

Figur 1 illustrerer virkningerne af ivermectin (IVM) på præference drikke ved oral indgivelse ved anvendelse af en sonde køretøj. Denne pilotundersøgelse havde 3 grupper: N / A, placebo, og IVM repræsenterer ingen sonde, majsolie (køretøj) sonde, og IVM (10 mg / kg, fortyndet i majsolie) gavage hhv. Mus blev behandlet i 10 dage, 5 på hinanden følgende dage om ugen i 2 uger. Som det kan se nedenfor, IVM var i stand til at reducere 10E intake tværs undersøgelsen sammenlignet med placebogruppen. Sammenlignet med N / A, de ethanolindtag værdier placebogruppen (~ 5 g / kg), er alt for lavt (48% lavere end den ikke-tvangsfodret N / A gruppe), og derfor kan ikke være en nøjagtig repræsentation eller "model", social drikke adfærd (~ 10-15 g / kg). Hvilket betyder, at en ukendt faktor i forbindelse med sonde procedure lykkedes at bringe integriteten af ​​drikkevand paradigme.

Figur 2 illustrerer det samme forsøg efterfølgende udført under anvendelse af ODS afgivelsessystem ^15. Undersøgelsen havde 3 grupper: 1) ingen oral film, 2) centrale kalk aromatiseret oral film uden IVM og 3) centrale kalk aromatiseret oral film med IVM (0,21 mg, hvilket svarer til de 10 mg / kg administreret i ovennævnte undersøgelse ) omtalt som kontrol, placebo og IVM hhv. Mus blev behandlet i 20 dage, 5 dage i træk om ugen i 4 uger. Der var ingen signifikant diffeærbødighed i ethanol indtag mellem N / A og placebo-behandlede mus, hvilket indikerer, at ODS placebogruppen repræsenterede en gyldig kontrol med hvilken en sammenligning med IVM gruppen derefter kunne foretages. Efter aftale med tidligere arbejde ^13,15, IVM markant og konsekvent reduceret 10E indtag.

En grafisk gengivelse af teknikken er vist i figur 3.

Figur 1. tvangsfodret Kontrol Mus er stand til at opretholde Ethanol indtagelse repræsentant 24 hr TBC Paradigm. Male C57BL / 6J mus blev behandlet i 10 dage (5 på hinanden følgende dage om ugen i 2 uger). Køretøj sondeernæring behandling af placebogruppen væsentligt ændret ethanolindtag værdier med 48% sammenlignet med den ikke-sonde N / A gruppe. Selvom IVM reducerede 10E indtag væsentligt i forhold tilplacebo, de lave 10E indtagelse værdier for placebogruppen tilføjet en anden forvirre til studiet, som kunne have den virkning, at gå på kompromis nytten af ​​gruppen som en passende drikke kontrol for undersøgelsen. Indsatser grafer illustrerer den gennemsnitlige 10E indtag i de 10 dages behandling. Værdier repræsenterer middel ± SEM for n = 6-8 mus / gruppe. +++ P <0,001 versus placebo, og *** P <0,001 versus N / A, Tyrkiet Post-hoc test. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 2. ODS Behandling af IVM. C57BL / 6J mus blev behandlet i 20 dage (5 dage i træk om ugen i 4 uger). Placebo ODS behandling ikke havde nogen signifikant virkning på 10E indtagelse, i forhold til den ubehandlede N / A gruppe og fastholde den validity of placebo ODS som en passende social drikke kontrol. IVM reducerede 10E indtag væsentligt i forhold til placebo-kontrol. Indsatser grafer illustrerer den gennemsnitlige 10E indtag over hele den 20 dages behandling. Værdier repræsenterer middel ± SEM for n = 6-8 mus / gruppe. *** P <0,001 versus placebo, Tyrkiet Post-hoc test .. Dette tal er blevet ændret fra Yardley et al. ¹⁵ Klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 3. Pictorial repræsentation ODS Delivery. Fotografisk skildring af proceduren. Klik her for at se en større version af dette tal.

Discussion

Oral sondeernæring er forbundet med en række komplikationer, der resulterer i potentielt kompromitteret dataindsamling og høje animalsk nedslidning ^1. Her indføres en enkel metode til oral lægemiddelafgivelse hvorigennem mus (og potentielt andre dyr) let og pålideligt kan forbruge det foretrukne stof gennem en oralt opløse strimmel (ODS). Især brugen af ​​denne metode repræsenterer en sikker, praktisk og human alternativ til oral sonde.

Andre løbende alternativer til oral sonde, selv om noget lovende, er forbundet med forskellige begrænsninger, som udelukker dem fra dækker hele spektret af behov i forbindelse med narkotikarelaterede dosering undersøgelser såsom en manglende evne til at blive brugt i mus, eller individuel præference for smag, der gør lægemiddel mindre let indtages ^9. I modsætning hertil kan ODS formuleres i en bred række varianter, som er vigtigt som individuelle præferencer for smag kan ændre sig over tid og smagpræferencer kan variere på tværs af forskellige stammer og arter.

Korrekt håndtering af dyr er en vigtig bestanddel af denne teknik. Fremhæver betydningen af ​​den tilvænningsperiode, skal det bemærkes, at en given mus kan være vanskeligere at begrænse hvis det er særligt unge eller vant til håndteringen. Enhver vanskelighed gribe musen skulle stilne efterhånden som dyret bekendt til håndtering og bliver mindre bange for forsøgslederen (r). Den C57 musestamme eksemplificeret i de repræsentative resultater er blevet observeret at vænne til håndteringsprocedurer relativt hurtigt (inden for ca. 1-3 håndtering sessioner). Selv om denne varighed kan udskyde tværs af forskellige arter og stammer, er der ingen grund til at antage, akklimatisering tidsramme ville eskalere betydeligt. Uerfarne teknikere med gnavere bør være bevidste, at når suspenderet og dingler i luften i mere end et par sekunder, mus er modtagelige for udvikling af en deglovingskade på halen ^12. Chancerne for at dette sker stiger med vægten af ​​musen samt med placeringen af ​​hånden, med en forståelse tættere på spidsen af ​​halen mere tilbøjelige til at forårsage en skade. Specifikt til omfanget af denne protokol, er det bydende nødvendigt, at musen er placeret på metalgitteret bur top, eller i et alternativt apparat, når der overføres fra bur til at skalere, samt som forberedelse til lægemiddel-levering. Tilbageholdenhed under lægemiddel-levering proces er endnu et afgørende skridt i protokollen. ODS forbrug kan forekomme ved at placere den tynde film nær næseborene og / eller mund på musen, i hvilket tilfælde emnet vil læne sig frem til at forbruge filmen. Alternativt ODS kan leveres topisk på mundhulen ved manuelt at placere filmen direkte på tungen for musen til at sluge.

Undersøgelser, der involverer vurdering af stress-sensitive parametre kan forvirret af brugen af ​​standard mandkan nemt gøres ual fastholdelsesanordninger teknikker afbildet i denne protokol og enkle justeringer til den metode til at rumme undersøgelser, hvor tilbageholdenhed er forbudt. I denne modificerede fremgangsmåde kunne ODS placeres direkte i buret for dyret at forbruge. Observationer udledes pilotundersøgelser i vores eget laboratorium indikerer, at dette bedst kan udføres ved at placere dyrene i et bur uden strøelse / redemateriale, bare for varigheden af ​​proceduren afgivelsesenheden, for at øge den lethed, hvormed ODS forbrug kan visuelt overvåges ved eksperimentatoren (s). Desuden kunne det være hensigtsmæssigt at indlede en uddannelse periode, hvor tid dyrene introduceret til ODS, så de kan overvinde den indledende medfødte undgåelse af nye fødevarer ^4. Selvfølgelig ville være behov for yderligere undersøgelser for at optimere en tilbageholdenhed-fri protokol til ODS levering, men der er ingen grund til at tro, at en sådan procedure ikke kunne gøres med lethed.

Især med hensyn til data reproducerbarhed, ODS kan formuleres til at klæbe til tungen eller kinden af ​​dyret og med henblik på hurtig oral disintegration til hurtigt frigive lægemidlet, hvilket sikrer opnås korrekt dosering. Og med ODS administration, er behovet for sondeernæring og andre ubehagelige invasive oplevelser for dyret elimineret. Ikke alene er denne mere humant men det minimerer også virkningerne af stress som en variabel i eksperimentet. Det skal bemærkes thpå ODS fremgangsmåde kan optimeres yderligere, som i mange nye produktionsmetoder, som yderligere kan forbedre farmakokinetikken af ​​testforbindelsen som ODS udvides for yderligere terapier. En begrænsning, der bør påpeges angår den omstændighed, at udviklingen af ​​ODS er i de tidlige stadier af udvikling. Spørgsmål vedrørende lastning af forskellige fysisk-kemisk egenskab lægemidler over smagsstoffet / ODS platform er fortsat en udfordring for alsidighed og generalisering af denne teknik. Dette er et område af igangværende efterforskning.

Den foreslåede teknik er en enkel og ny teknik, der kan godkendt til brug i kort- og langsigtede prækliniske dyreforsøg og for levering af lægemidler til dyr (f.eks hunde). Drug delivery gennem ODS repræsenterer en ny, hurtig, praktisk og human tilgang i forhold til de eksisterende traditionelle tilgange som tabletter, kapsler, væsker, pulvere og geler, og oral sonde.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Orally Dissolving Strip	Cure Pharmaceutical		Available upon special request. Alternatively, ODS may also be prepared in-house.
Gavage Feeding Needle	VWR	7912	Our rodent studies utilized a 18 gauge feeding needle. This size may need to be adjusted for use in other mammilian species.
Sucrose	Sigma Aldrich	S0389-500G