Med hjälp av ett oralt Upplösning Strip för farmakologiska och toxikologiska studier: En enkel och Humane alternativ till oral sondmatning för djur

Summary

Följande protokoll beskriver ett nytt förfarande för kronisk oral administrering av läkemedel med användning av en oralt upplösning av remsan (ODS) i stället för det mer vanligt förekommande oral sondmatning metod. Vi visar att prekliniska, oral drug delivery använder ODS metod utgör ett säkert, bekvämt och humant alternativ till oral sondmatning.

Abstract

Före testning av nya läkemedel hos människor, kort och lång sikt preklinisk (dvs djur), repetitiva farmakologiska och toxikologiska tester krävs. I de flesta fall är den föredragna administreringsvägen via oral tillförsel. För närvarande är oral tillförsel mestadels åstadkommas med hjälp av en oral sondmatning förfarande, delvis eftersom det kan uppnå konsekvent och exakt dosering i djurmodell. Även om denna metod är väl etablerat att det har komplikationer som kan resultera i en hög hastighet av animaliskt attrition. För detta ändamål, det förfarande som infördes här beskriver ett alternativ till oral sondmatning metod där det önskade läkemedlet införlivas i en tastant, oralt lösa band (ODS) som helt enkelt kan presenteras för försöksdjuret där det sedan snabbt tas upp med minimal manipulation av försöksperson. Häri visar vi att prekliniska, oral drug delivery använder ODS metod utgör ett säkert, bekvämt och human alternative till oral sondmatning.

Introduction

För att framgångsrikt översättning av ett läkemedel från preklinisk (djurförsök) för klinisk utveckling, en rad väl definierade, akuta och kroniska farmakologiska och toxikologiska studier behöver utföras i djurmodeller med den avsedda kliniska administrerings (som är normalt oralt). För att uppnå detta mål, de flesta prekliniska studier för närvarande utnyttjar ett sondmatning förfarande med tanke på att detta förfarande resulterar i en konsekvent och exakt leverans av testföreningen till djuret. Men i många fall, är oral sondmatning den inte tolereras väl av djuret och ackumulera bevis föreslår att metoden är förknippad med en betydande mängd av stressinduktion ^1.

Detta gäller särskilt i utvecklingen av behandlingar för kroniska livslånga förhållanden som kräver långsiktiga prekliniska studier, såsom är fallet med, men inte begränsat till, nästan varje neuropsykiatrisk störning. för insdelse, i en transgen musmodell av Alzheimers sjukdom, det var nyligen föreslagits att sondmatning själva metoden kunde förväxla experimentella resultat på grund av att dosering inducerad spänning ^2. På samma sätt, i en musmodell av alkoholkonsumtion har opublicerade resultat från vårt eget laboratorium funnit att upprepad insättning av sondmatning röret - i och för sig - kan avsevärt minska nivån på alkoholintag till det äventyrar integriteten av den experimentella paradigm (se figur 1).

Med tanke på de ovan nämnda begränsningar i samband med oral sondmatning förfarande har stora ansträngningar lagts på att utveckla nya metoder för preklinisk oral drug delivery. Aktuella alternativa tillvägagångssätt innefattar att införliva testföreningen in i jordnötssmör blandningar ^3, gelatinösa formar ^4-5, chokladpellets ^6, dricksvatten ^7, och oblat kex ^8, vilka alla är Associpade med varierande grad av frågor, bland annat oförmåga att användas på ett tillförlitligt sätt i djurmodell, brist på antagandet av testföreningen upptag av testpersonen eller individuell preferens för smak som gör läkemedlet mindre lätt konsumeras ^9.

Proceduren presenterad häri beskriver en metod i vilken det önskade läkemedlet är införlivat i en smaksatt, oralt upplösning av remsan (ODS) som kan lätt och enkelt användas för att oralt administrera testföreningen till försöksdjuret. Detta dokument är inriktat på att demonstrera effektiviteten av ODS metod som använder möss. Men det finns ingen anledning att förvänta sig att samma metod inte också skulle vara användbar i andra gnagare samt större däggdjur. Kliniskt är användningen av ozonnedbrytande ämnen börjar antas i pediatriska och geriatriska patienter, som ett sätt att övervinna svårigheter att svälja ^10. Vi föreslår att ODS också kan användas framgångsrikt i prekliniska läkemedelsutveckling program som ett säkert, bekvämtOch humant alternativ till oral sondmatning.

Protocol

Alla beskrivna förfarandet har godkänts av Institutional Animal Care och användning kommittén (IACUC) vid University of Southern California.

1. Djur Hantering och Tillvänjning

1. Introduktion
   1. Låt möss att acklimatisera sig till de driftsförhållanden och hantering teknik för försöket att minska stress under de följande läkemedel administrativa förfarandena. Under denna tid, registrera kroppsvikt och födointag hos varje mus; om så önskas, kan de senare användas som en icke-invasiv jämförelsepunkt för att bedöma läkemedelstoxicitet (tillval). Den förra kan också användas för att bestämma viktbaserad läkemedelsdosering.
      Obs: Anekdot, bör längden av tillvänjningsperiod bestämmas baserat på antalet praktiker som interagerar med djuret. I vår erfarenhet, har möss av C57BL / 6J stam visat sig ha problem habituerade hantering av mer än ~ 5 personer i vår typiska veckolång tillvänjningsperiod. Om möjligt,försöks (s) uppmuntras också att avstå från att använda doftande lotioner, tvålar och parfymer innan du hanterar djuren som tidigare rapporter visar nya stimuli, såsom lukter, kan hindra tillvänjningsperiod ^11.
2. Steg
   1. Inleds minst 5 dagar före inledandet av undersökningen, överföra djur till det rum där de efterföljande experimenten kommer att inträffa.
   2. Notera vikten av musen genom ordentligt tag i mitten av svansen och försiktigt lyfta djuret ut ur buren och in i vikt båten.
      1. Placera musen på skalan så snart det lyfts ut ur cagekeeping i åtanke att korrekt förstå den mediala / proximala aspekten av svansen, för att undvika degloving skador, som kan uppstå när du håller den distala aspekten av svansen ^12.
      2. Anteckna vikten värde när musen har säkert placerad i väga båten.
   3. Notera vikten av livsmedlet för en rekomlagade 2 dagar i följd, för att fastställa baslinjen livsmedelskonsumtion nivåer som hjälper fånga potentiella toxicitet under försöket ^13.

2. Framställning av matningsnål, sackaroslösning och Individuell ODS

1. Använd en autoklav för att sterilisera de rostfria stål sondmatning nålar i förberedelse för experimentet. Förbered två nålar / grupp och ytterligare en nål som skall användas som en back-up om det behövs.
   Notera: Denna studie utnyttjade en 1,5 inches, böjda, 18 G, rostfritt stål matning nål med en 2,25 mm kula i slutet av nålen.
2. Tillsätt 20 ml vatten till 0,85 g sackaros för att skapa en 4,25% (vikt / volym) sackaroslösning.
   Obs! Beroende på de parametrar som är föremål för bedömning andra låga doser av sackaros skulle kunna också användas ^14.
3. Förbered den orala upplösningslisten (ODS) för varje djur genom att skära standard rektangulär teststicka i ett stycke som är 0,5 cm inches i diameter ossing en kommersiellt tillgänglig enskilt kvartal tum hålslagare. Den rektangulära testremsa som används i denna demonstration formulerades att innehålla 6 mg ivermektin (IVM), och när skars till denna storlek, allokerar en 0,21 mg dos till varje enskild cirkulärt stycke approximerar en 10 mg / kg dos för varje djur (vår önskade dos / djur). Denna dos kan justeras genom att koncentrera / späda den övergripande formuleringen på den rektangulära remsan och / eller kapa bandet till olika storlek.

3. drug delivery -

1. Registrera viktvärden som tidigare beskrivits i steg 1,1-1,2.
2. Efter registrering av vikt, flytta musen till metallgallret buröverdelen. Väl där, med hjälp av den dominerande tummen, pekfingret, och ^{3: e} finger, försiktigt dra tillbaka på svansen. Detta kommer att orsaka musen för att oavsiktligt gripa trådburen topp och sträcka ut ryggen, sträcker sin kropp bort från försöks.
3. Ta tag i nackskinnet med icke-dominant tumme, pekfinger, och ^{3: e} finger för att bekvämt hålla djuret med ett grepp som är säker.
   Obs: En försöks med en mindre handen kan också använda den 4: ^e fingret, på samma hand, att dra tillbaka kragen på ryggen och få en säkrare tag i musen. Dessutom, beroende på individuella preferenser, ringfingret och / eller lillfingret kan även användas för att fästa svansen men detta är inte nödvändigt ^12.
4. Håll musen i en upprätt position.
5. Varning: Observera färgen på slemhinnor på musen. En lila / blå utseende är en indikation på att försöks är cinching i nackskinnet för hårt och musen kan inte andas.
   1. Om detta inträffar, omedelbart sätta musen tillbaka ner metall buröverdelen och låt den vila i ~ 2-3 min innan reattempting att hindra djuret.
6. Dränka glödlampa spetsen av sondmatning nål i 4,25% sackaroslösning för att tjäna som en tastantlim på ODS.
7. Tryck ned en färdigskurna ODS med glödlampa spets sondmatning nål för att fästa oralt lösa remsan.
8. Presentera ODS till musen genom att placera den nära näsborrarna och / eller mun, och tillåta djuret att konsumera filmen. Alternativt ODS kan levereras topiskt till munhålan genom att placera tunna band direkt på tungan för mössen att svälja.
9. Byt ut nålen i mitten av gruppen under läkemedelsdoserings session för att förhindra smittspridning.

Representative Results

I de följande representativa undersökningar, var socialt drickande modelleras med en 24 tim två flaskor val (TBC) paradigm som tidigare beskrivits ^15. Kortfattat, möss hade tillgång till två flaskor med lösning, en av vilken innehöll vatten, och den andra en 10% (vol / vol) etanollösning. Försökspersonerna därefter tilldelas läkemedelsbehandlingsgrupper så att den genomsnittliga 10E (10% etanol / 90% vatten v / v) Ingången var likartad i grupperna.

Figur 1 visar effekterna av ivermektin (IVM) på preferens dricka när de administreras oralt med hjälp av en sondmatning fordon. Denna pilotstudie hade 3 grupper: N / A, placebo, och IVM representerar ingen sondmatning, majsolja (fordon) sondmatning, och IVM (10 mg / kg, utspädd i majsolja) sondmatning respektive. Möss behandlades i 10 dagar, 5 på varandra följande dagar per vecka i 2 veckor. Som kan se nedan, var IVM kunna minska 10E iNtake tvärs studien jämfört med placebogruppen. Jämfört med N / A, de etanol intag värdena för placebogruppen (~ 5 g / kg), är alldeles för låg (48% lägre än den icke-sondmatades N / A grupp), och sålunda, inte kan vara en korrekt representation eller "modell" av socialt drickande beteende (~ 10-15 g / kg). Vilket innebär att en okänd faktor associerad med sondmatning förfarande lyckades äventyra integriteten av dricks paradigm.

Figur 2 illustrerar samma experiment därefter utförs med användning av ODS avgivningssystemet ^15. Studien hade 3 grupper: 1) ingen muntlig film, 2) key lime smaksatt oral film utan IVM och 3) key lime smaksatt oral film med IVM (0,21 mg, vilket motsvarar de 10 mg / kg administreras i ovan nämnda studie ) hänvisat till som kontroll, placebo och IVM, respektive. Möss behandlades i 20 dagar, 5 på varandra följande dagar per vecka i 4 veckor. Det fanns ingen signifikant diffeRENCE i etanol intag mellan N / A och placebobehandlade möss, vilket indikerar att ODS placebogruppen representeras en giltig kontroll med vilken en jämförelse med IVM gruppen sedan kunde göras. I överensstämmelse med tidigare arbete ^13,15, IVM avsevärt och minskar ständigt 10E intag.

En bildrepresentation av den teknik som visas i figur 3.

Figur 1. sondmatades kontrollmöss saknar förmåga att inta Etanol intag representant 24 hr TBC Paradigm. C57BL / 6J möss behandlades under 10 dagar (5 på varandra följande dagar i veckan för 2 veckor). Fordons sondmatning behandling av placebogruppen signifikant förändrade etanolvärden för intag med 48% i jämförelse med den icke-sondmatning N / A gruppen. Även IVM reducerade 10E intaget avsevärt jämfört medplacebo, de låga 10E intag värden för placebogruppen lagt till en andra FÖRVÄXLA studien, vilket kan få till följd att äventyra användbarheten av gruppen som en adekvat dricka kontroll för studien. Infällda grafer illustrerar den genomsnittliga 10E intaget under 10 dagars behandling. Värden representerar medelvärdet ± SEM för n = 6-8 möss / grupp. +++ P <0,001 jämfört med placebo, och *** P <0,001 versus N / A, Turkiet Post-Hoc Test. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figur 2. ODS Behandling av IVM. C57BL / 6J möss behandlades i 20 dagar (5 på varandra följande dagar i veckan under 4 veckor). Placebo ODS behandling hade ingen signifikant effekt på 10E intag, i förhållande till den icke behandlade N / A-grupp, bibehållande av Validity av de placebo ODS som en adekvat social kontroll drickande. IVM minskade signifikant 10E intag jämfört med placebokontroll. Infällda grafer illustrerar den genomsnittliga 10E intaget under 20 dagars behandling. Värden representerar medelvärdet ± SEM för n = 6-8 möss / grupp. *** P <0,001 jämfört med placebo, Turkiet Post-Hoc Test .. Denna siffra har ändrats från Yardley et al. ¹⁵ Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figur 3. bildrepresentation av ODS leverans. Fotografisk bild av förfarandet. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Discussion

Oral sondmatning är associerad med många komplikationer som resulterar i insamlingen potentiellt äventyras av data och höga hastigheter av animaliskt attrition ^1. Här en enkel metod för oral drug delivery införs genom vilken möss (och eventuellt andra djur) enkelt och tillförlitligt kan konsumera droger genom ett oralt lösa band (ODS). Noterbart är att användningen av denna metod utgör ett säkert, bekvämt och humant alternativ till oral sondmatning.

Övriga kortfristiga alternativ till oral sondmatning, även om något lovande, är förknippade med olika begränsningar som hindrar dem från att täcka hela skalan av behoven i samband med läkemedelsdoseringsstudier såsom en oförmåga att användas i möss, eller individuell preferens för smak som gör drogen mindre lätt konsumeras ^9. Däremot kan ODS formuleras i ett brett utbud av smaker som är viktigt eftersom individuella preferenser för smak kan förändras över tiden och smakpreferenser kan skilja sig mellan olika stammar och arter.

Korrekt hantering djur är en viktig del av denna teknik. Betonar vikten av tillvänjningsperiod, bör det noteras att en given mus kan vara svårare att hålla tillbaka, om det är särskilt unga eller ovana att hantera. Några svårigheter att ta tag i musen bör avta över tiden som djuret bekanta hantering och blir mindre rädda för försöks (s). Den C57 musstam exemplifieras i de representativa resultat har observerats att vänja till förfaranden för hantering av relativt snabbt (inom ungefär 1-3 hanterings sessioner). Även om denna varaktighet kan skjuta över olika arter och stammar, finns det ingen anledning att anta acklimatisering tidsram skulle eskalera avsevärt. Nybörjare tekniker som arbetar med gnagare bör vara medvetna om att, när de är suspenderade och dinglar i luften i mer än några sekunder, möss är känsliga för utvecklingen av en deglovingskada på svansen ^12. Chanserna att detta inträffar ökar med vikten hos mus samt med placeringen av handen, med ett grepp närmare spetsen av svansen mer benägna att orsaka en skada. Specifika för tillämpningsområdet för detta protokoll, är det viktigt att musen placeras på metallgallret buröverdelen, eller i en alternativ anordning, när den överförs från buren att skala, liksom förberedelse för läkemedelsleverans. Återhållsamhet under läkemedelsleveransprocessen är ett kritiskt steg i protokollet. ODS konsumtion kan ske genom att placera den tunna filmen nära näsborrarna och / eller munnen på musen, i vilket fall ämnet kommer att luta framåt för att konsumera film. Alternativt ODS kan levereras topiskt till munhålan genom att manuellt placera filmen direkt på tungan för musen att svälja.

Undersökningar som involverar bedömningen av stresskänsliga parametrar kan förväxlas med användning av standard mannenUAL fasthållningstekniker visas i detta protokoll och enkla justeringar av metoden kan lätt göras för att rymma studier där återhållsamhet är förbjuden. I denna modifierade metod, kunde ODS placeras direkt i buren för djuret att konsumera. Observationer utläsa från pilotstudier i vårt eget laboratorium indikerar att detta bäst skulle utföras genom att placera djuren i en bur utan strö / bomaterial, bara för den tid som drug delivery förfarande, i syfte att öka den lätthet med vilken ODS konsumtion kan övervakas visuellt av försöksledaren (er). Dessutom kan det vara lämpligt att inleda en utbildningsperiod under vilken tid djuren förs till ODS så att de kan övervinna den inledande medfödd undvikande av nya livsmedel ^4. Naturligtvis ytterligare studier skulle behövas för att optimera en återhållsamhet fritt protokoll för ODS leverans, men det finns ingen anledning att tro att ett sådant förfarande inte kan göras med lätthet.

Notably, i termer av reproducerbarheten uppgifter, ODS kan formuleras för att vidhäfta till tungan eller kinden av djuret och utformad för snabb oral sönderdelning för att snabbt frisätta läkemedlet, vilket garanterar en korrekt dosering uppnås. Och med ODS administrering behovet av sondmatning och andra obehagliga invasiva upplevelser för djuret elimineras. Detta är inte bara mer humant men den minimerar också effekterna av stress som en variabel i experimentet. Det bör noteras thpå ODS metod kan optimeras ytterligare, som i många nya tillverkningsprocesser, vilket ytterligare kan förbättra farmakokinetiken av testföreningen som ODS utökas för ytterligare behandlingar. En begränsning som bör påpekas gäller det faktum att utvecklingen av ozonnedbrytande ämnen är i ett tidigt utvecklingsskede. Frågor om lastning av olika fysikalisk-kemiska karakteristiska läkemedel över tastant / ODS plattform fortfarande en utmaning för mångsidighet och generalisering av denna teknik. Detta är ett område med pågående utredning.

Den föreslagna tekniken är en enkel och ny teknik som kan antas för användning på kort och lång sikt prekliniska djurstudier och för leverans av läkemedel till djur (t.ex. hundar). Drug delivery genom ODS representerar en ny, snabb, bekväm och human metod jämfört med de befintliga traditionella metoder som tabletter, kapslar, vätskor, pulver och geler, och oral sondmatning.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Orally Dissolving Strip	Cure Pharmaceutical		Available upon special request. Alternatively, ODS may also be prepared in-house.
Gavage Feeding Needle	VWR	7912	Our rodent studies utilized a 18 gauge feeding needle. This size may need to be adjusted for use in other mammilian species.
Sucrose	Sigma Aldrich	S0389-500G