Gebruik makend van een oraal Oplossen Strip voor farmacologische, toxicologische studies: Een eenvoudige en humaan alternatief voor orale sondevoeding for Animals

Summary

Het volgende protocol beschrijft een nieuwe werkwijze voor chronische orale toediening met een oraal oplossende strook (ODS) in plaats van de meer gebruikelijke orale gavage methode. We tonen aan dat preklinische, orale toediening van geneesmiddelen met behulp van de ODS-methode staat voor een veilige, gemakkelijke en humaan alternatief voor orale sondevoeding.

Abstract

Voorafgaand aan het testen van nieuwe therapieën bij de mens, op korte en lange termijn preklinische (dat wil zeggen, dier), repetitieve farmacologisch en toxicologisch onderzoek nodig is. In de meeste gevallen is de voorkeursroute van toediening is via orale afgifte. Momenteel, wordt orale toediening meestal bewerkstelligd onder toepassing van een orale gavage procedure gedeeltelijk omdat consistente en nauwkeurige dosering in het diermodel kan bereiken. Hoewel deze methode is goed ingeburgerd het heeft complicaties die kunnen leiden tot een hoge mate van dierlijke verloop. Daartoe de hier geïntroduceerde beschrijft een alternatief voor de orale gavage werkwijze waarbij het gewenste geneesmiddel in een tastant opgenomen, oraal oplossende strook (ODS) die eenvoudig kunnen worden gepresenteerd aan het proefdier waar het vervolgens snel beslag genomen minimale manipulatie van de proefpersoon. Hierin tonen we aan dat preklinische, orale toediening van geneesmiddelen met behulp van de ODS-methode staat voor een veilige, gemakkelijke en humane alternative tot orale sondevoeding.

Introduction

Om de succesvolle translatie van een geneesmiddel uit preklinische (dierproeven) klinische ontwikkeling, een reeks van goed gedefinieerde, acute en chronische farmacologische en toxicologische studies moeten worden uitgevoerd in diermodellen met de beoogde klinische toedieningsweg (wat normaal gesproken is de orale route). Om dit doel te bereiken, de meeste pre-klinische studies die momenteel gebruik maken van een orale sondevoeding procedure aangezien deze methode resulteert in een consistente en nauwkeurige levering van de testverbinding aan het dier. In veel gevallen, orale gavage niet goed wordt verdragen door het dier en accumuleren aanwijzingen dat de werkwijze wordt geassocieerd met een significante hoeveelheid stressinductie ^1.

Dit geldt vooral voor de ontwikkeling van behandelingen voor chronische levenslange omstandigheden die langere termijn preklinische studies nodig, zoals het geval is met, maar niet beperkt tot, bijna elke neuropsychiatrische stoornis. voor insafstand, in een transgeen muismodel van de ziekte van Alzheimer, werd onlangs gesuggereerd dat de werkwijze gavage zelf experimentele resultaten kunnen verwarren door dosering biotische ^2. Ook in een muismodel van alcoholconsumptie, ongepubliceerde resultaten uit ons eigen laboratorium hebben gevonden dat de herhaalde insertie van de maagsonde tube - op zichzelf - kan aanzienlijke vermindering van de mate van alcoholgebruik tot het punt van de integriteit van de experimentele gevaar paradigma (zie figuur 1).

Gezien voornoemde beperkingen verbonden aan de orale gavage procedure aanzienlijke inspanning aan de ontwikkeling van nieuwe werkwijzen voor preklinische orale geneesmiddelafgifte zetten. Huidige alternatieve benaderingen omvatten het opnemen van de testverbinding in pindakaas mengsels ³ gelatineus matrijzen ^4-5, chocolade pellets ^6, drinkwater ⁷ en ⁸ wafer crackers, die allemaal Associated met verschillende mate van problemen zoals het onvermogen betrouwbaar voor gebruik in het diermodel, gebrek waarop testverbinding opname door de proefpersoon of individuele voorkeur voor smaak maakt dat het geneesmiddel minder gemakkelijk verteerd ^9.

De werkwijze hierin ingebracht beschrijft een werkwijze waarbij het gewenste geneesmiddel wordt opgenomen in een op smaak, oraal oplossende strook (ODS) die gemakkelijk kunnen worden en gemakkelijk worden gebruikt om oraal toedienen van de testverbinding aan het proefdier. Dit document is gericht op het aantonen van de effectiviteit van de methode met ODS muizen. Er is echter geen reden om te verwachten dat dezelfde methode niet ook bruikbaar bij andere knaagdieren evenals grotere zoogdieren zou zijn. Klinisch, het gebruik van ODS begint bij pediatrische en geriatrische patiënten aan te nemen, als een manier om te overwinnen slikproblemen ^10. Wij stellen voor dat ODS kan ook met succes in preklinische drug discovery programma's gebruikt als een veilige, gemakkelijkeEn humaan alternatief voor orale sondevoeding.

Protocol

Alle beschreven procedure zijn goedgekeurd door de Institutional Animal Care en gebruik Comite (IACUC) van de University of Southern California.

1. Dierlijke Behandeling en Gewenning

1. Invoering
   1. Sta muizen te acclimatiseren aan de houderijomstandigheden en behandeling techniek van het experiment om stress te verminderen tijdens de daaropvolgende toediening procedures. Gedurende deze tijd, noteer lichaamsgewicht en voedselinname van elke muis; indien gewenst, kan deze later worden gebruikt als een niet-invasieve vergelijkingspunt beoordelen geneesmiddelentoxiciteit (optioneel). De eerste kan ook worden gebruikt om gewicht gebaseerde geneesmiddel dosering te bepalen.
      Noot: Anecdotally, moet de lengte van de gewenningsperiode worden bepaald op basis van het aantal onderzoekers interactie met het dier. In onze ervaring, zijn muizen van de C57BL / 6J stam is waargenomen dat de problemen habituating om behandeling door meer dan ~ 5 personen binnen onze typische week-lange gewenningsperiode hebben. Indien mogelijk,experimentator (s) worden ook aangemoedigd om zich te onthouden van het gebruik van geparfumeerde lotions, zepen en parfums voor de behandeling van de dieren als eerdere rapporten geven aan nieuwe stimuli, zoals geuren, kan de gewenningsperiode ¹¹ belemmeren.
2. Stappen
   1. Aanvangt ten minste 5 dagen vóór het begin van de studie, brengen de dieren naar de ruimte waar de volgende experimenten zal optreden.
   2. Noteer het gewicht van de muis door stevig grijpen het midden van de staart en voorzichtig op te tillen het dier uit de kooi en in het gewicht boot.
      1. Plaats de muis in de schaal zodra het uit de cagekeeping rekening wordt opgetild goed grijpen de mediale / proximale aspect van de staart, bedoeld degloving verwondingen, die kunnen ontstaan ​​bij het ​​grijpen van het distale aspect van de staart ¹² voorkomen.
      2. Registreer het gewicht waarde zodra de muis is veilig in de weging boot geplaatst.
   3. Registreer het gewicht van het voedsel voor een Recomherstelde 2 opeenvolgende dagen, met het oog op de baseline voedselconsumptie levels die je zullen helpen capture potentiële toxiciteit tijdens het experiment ¹³ vast te stellen.

2. Voorbereiding van Feeding Naald, sucrose-oplossing, en de individuele ODS

1. Gebruik een autoclaaf roestvrij staal maagsonde naalden gesteriliseerd ter voorbereiding van het experiment. Bereid 2 naalden / groep en 1 extra naald te worden gebruikt als een back-up indien nodig.
   Opmerking: Deze studie gebruikte een 1,5 inch, gebogen, 18 G, roestvrijstalen voedingsnaald met een 2,25 mm kogel aan het einde van de naald.
2. Voeg 20 ml water om 0,85 g sucrose tot een 4,25% te maken (w / v) sucrose-oplossing.
   Opmerking: Afhankelijk van de parameters die ter beoordeling andere lage doses van sucrose kan mogelijk ook worden gebruikt ^14.
3. Bereid de mondelinge oplossende strook (ODS) voor elk dier door het snijden van de standaard rechthoekige teststrip in een stuk dat is 0,5 cm inch in diameter onsing een commercieel verkrijgbare enkele kwart inch hole-puncher. De rechthoekige teststrip die in deze demonstratie werd geformuleerd tot 6 mg ivermectine (IVM) bevat, en wanneer deze grootte gesneden, wijst een 0,21 mg dosis voor elke bijzondere cirkelvormig stuk benaderen van een 10 mg / kg dosis voor elk dier (onze wensen dosis / dier). Deze dosis kan worden aangepast door het concentreren / verdunning van de totale formulering op de rechthoekige strip en / of snijden van de strook in verschillende grootte.

3. Drug - Levering

1. Noteer de gewichtswaarden zoals eerder beschreven in stap 1,1-1,2.
2. Na het opnemen van het gewicht, beweeg de muis naar de top metalen rooster kooi. Eenmaal daar, met behulp van de dominante duim, wijsvinger en ^3e vinger voorzichtig terug te trekken op de staart. Dit zorgt ervoor dat de muis per ongeluk greep de kooi top en strekken zich uit zijn rug, stretching zijn lichaam uit de buurt van de experimentator.
3. Pak het nekvel met de niet-dominant duim, wijsvinger en ^3e vinger om comfortabel vastzit het dier met een grip die veilig is.
   Opmerking: Een onderzoeker met een kleinere kant kan ook gebruik maken van de 4 ^e vinger van dezelfde hand, aan de scruff van de rug terug te trekken en het verkrijgen van een meer veilige greep van de muis. Bovendien, afhankelijk van de individuele voorkeur ringvinger en / of pink kan ook worden gebruikt om de staart te beveiligen dit is echter niet noodzakelijk ^12.
4. Houd de muis rechtop.
5. Let op: Let op de kleur van de slijmvliezen van de muis. Een paars / blauw uiterlijk is een indicatie dat de experimentator wordt cinching het nekvel te strak en de muis kan niet ademen.
   1. Als dit gebeurt, onmiddellijk de muis weer op de top metalen kooi en laat het rusten voor ~ 2-3 minuten voordat opnieuw probeert om het dier te beperken.
6. Dompel de lamp punt van de sondenaald in 4,25% sucrose oplossing om te dienen als tastantlijm aan de ODS.
7. Druk naar beneden op een pre-cut ODS met de gloeilamp punt van de maagsonde naald om de oraal oplossende strip hechten.
8. Presenteer de ODS om de muis door het plaatsen van het in de buurt van de neus en / of mond, en laat het dier om de film te consumeren. Alternatief ODS kan topisch worden afgegeven aan de mondholte door het plaatsen van de dunne strip direct op de tong van de muizen te slikken.
9. Vervang de naald mid-groep tijdens de geneesmiddel dosering sessie om de verspreiding van infectie te voorkomen.

Representative Results

In de volgende representatieve onderzoeken, werd sociaal drinken gemodelleerd met behulp van een 24-uurs twee flessen keuze (TBC) paradigma zoals eerder beschreven ^15. Kort samengevat, muizen hadden toegang tot twee flessen oplossing, waarvan er een water en de andere een 10% (v / v) ethanol oplossing. De proefpersonen werden later aan medicatie groepen zodat de gemiddelde 10E (10% ethanol / 90% water v / v) intake was vergelijkbaar tussen de groepen.

Figuur 1 illustreert het effect van ivermectine (IVM) preferent drinken wanneer oraal toegediend via een maagsonde voertuig. Deze pilot studie had 3 groepen: N / A, placebo, en IVM vertegenwoordigen geen maagsonde, maïsolie (voertuig) maagsonde en IVM (10 mg / kg, verdund in maïsolie) maagsonde respectievelijk. De muizen werden gedurende 10 dagen, 5 opeenvolgende dagen per week gedurende 2 weken. Zoals hieronder te zien, IVM kon aanzienlijk verminderen 10E inPak over de studie in vergelijking met de placebogroep. Vergeleken met N / A, ethanol opgenomen hoeveelheid van de placebogroep (~ 5 g / kg), zijn veel te laag (48% onder de geen-gavaged N / A groep), en daardoor kan geen nauwkeurige representatie , of "model", van de sociale drinkgedrag (~ 10-15 g / kg). Wat betekent dat een onbekende factor geassocieerd met de maagsonde procedure heeft de integriteit van het drinkwater paradigma gevaar brengen.

Figuur 2 illustreert hetzelfde experiment vervolgens uitgevoerd onder toepassing van de ODS afgiftesysteem ^15. De studie had 3 groepen: 1) geen orale film, 2) limoen gearomatiseerde orale film zonder IVM en 3) limoen gearomatiseerde orale film IVM (0,21 mg, overeenkomend met de 10 mg / kg toegediend Bovengenoemde studies ) aangeduid als controle, placebo en IVM, respectievelijk. De muizen werden gedurende 20 dagen, 5 opeenvolgende dagen per week gedurende 4 weken. Er was geen significant difference in ethanol inname tussen de N / A en placebo behandelde muizen, wat aangeeft dat de ODS placebogroep weergegeven geldig control waarmee een vergelijking met de IVM-groep dan kan worden gemaakt. In overeenstemming met eerder werk ^13,15, IVM aanzienlijk en consequent verminderde 10E inname.

Een schema van de techniek wordt getoond in figuur 3.

Figuur 1. Gavaged controle muizen niet in staat zijn te onderhouden Ethanol innameniveaus Vertegenwoordiger van de 24 uurs TBC Paradigm. Man C57BL / 6J muizen werden behandeld gedurende 10 dagen (5 opeenvolgende dagen per week voor 2 weken). Voertuig maagsonde behandeling van de placebogroep significant gewijzigd ethanol opgenomen hoeveelheid van 48% in vergelijking met de niet-maagsonde N / A groep. Hoewel IVM aanzienlijk verminderd 10E inname vergelekenplacebo, de lage 10E opgenomen hoeveelheid van de placebogroep toegevoegd een tweede verwarren de studie die tot gevolg koste gaat van de bruikbaarheid van de groep als voldoende drinkwater controle voor de studie zou kunnen hebben. Inzet grafieken illustreren de gemiddelde 10E inname over de 10 dagen behandeling. De waarden geven het gemiddelde ± SEM van n = 6-8 muizen / groep. +++ P <0,001 versus placebo, en *** P <0,001 versus N / A, Turkije Post-Hoc Test. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 2. ODS Behandeling van IVM. Vrouwelijke C57BL / 6J muizen werden gedurende 20 dagen (5 opeenvolgende dagen per week gedurende 4 weken). Placebo ODS behandeling had geen significant effect op de inname 10E, ten opzichte van de onbehandelde N / A groep, handhaven de validity van placebo ODS als een adequaat sociaal drinken controle. IVM aanzienlijk verminderd 10E inname vergeleken met placebo control. Inzet grafieken illustreren de gemiddelde 10E inname over de 20 dagbehandeling. De waarden geven het gemiddelde ± SEM van n = 6-8 muizen / groep. *** P <0,001 versus placebo, Turkije Post-Hoc Test .. Dit cijfer is gewijzigd ten opzichte van Yardley et al. ¹⁵ Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 3. picturale representatie van ODS Delivery. Fotografische afbeelding van de procedure. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Discussion

Orale sondevoeding wordt in verband gebracht met tal van complicaties die leiden tot een verzameling potentieel gecompromitteerde gegevens en de hoge prijzen van dierlijke uitputtingsslag ^1. Hier een eenvoudige wijze van de orale toediening van geneesmiddelen geïntroduceerd waardoor muizen (en mogelijk andere dieren) gemakkelijk en betrouwbaar consumeren het middel van keuze door middel van een oraal oplossende strook (ODS). Met name de toepassing van deze methode is een veilig, gemakkelijk en humaan alternatief voor orale sondevoeding.

Andere huidige alternatieven voor orale sondevoeding, hoewel enigszins veelbelovend, worden in verband met diverse beperkingen die het zich niet met betrekking tot het volledige scala van behoeften in verband met drugs dosering studies, zoals een onvermogen om te worden gebruikt bij muizen, of de individuele voorkeur voor de smaak dat het te maken drug minder gemakkelijk verteerd ^9. Daarentegen kan ODS geformuleerd worden in een brede verscheidenheid aan smaken die belangrijk als individuele voorkeuren voor smaak en aroma in de tijd kunnen veranderenvoorkeuren kunnen verschillen tussen verschillende stammen en soorten.

Juiste hantering dier is een essentieel onderdeel van deze techniek. Het benadrukken van het belang van de gewenningsperiode, dient te worden opgemerkt dat een bepaalde muis moeilijker kan zijn om te beperken als het is bijzonder jong of niet gewend om te hanteren. Enige moeite grijpen de muis moet verdwijnen in de tijd als het dier vertrouwd te hanteren en wordt minder bang voor de onderzoeker (s). De C57 muizenstam toegelicht in de representatieve resultaten is waargenomen te wennen aan de behandeling van procedures relatief snel (binnen ongeveer 1-3 afhandeling sessies). Hoewel dit duur in verschillende soorten en stammen kunnen uitstellen, is er geen reden om de acclimatisering tijdschema aanzienlijk zou escaleren aannemen. Beginnende monteurs aan knaagdieren moet bewust zijn dat bij suspensie en hangt dat de lucht langer dan enkele seconden, muizen zijn gevoelig voor de ontwikkeling van een deglovingletsel aan de staart ^12. De kans dat dit gebeurt toenemen met het gewicht van de muis en met de plaatsing van de hand met een greep dichter bij het uiteinde van de staart meer kans op letsel veroorzaken. Specifiek voor het toepassingsgebied van dit protocol, is het noodzakelijk dat de muis op het metalen rooster kooi top, of een ander apparaat, bij het overladen van kooi op schaal, en in voorbereiding voor geneesmiddelafgifte. Terughoudendheid tijdens de drug-delivery-proces is een cruciale stap in het protocol. ODS verbruik kan plaatsvinden door het plaatsen van de dunne film bij de neus en / of mond van de muis, waarbij het voorwerp uit zal steunen op de film verbruikt. Alternatief ODS kan topisch worden afgegeven aan de mondholte door handmatig de film direct plaatsen op de tong van de muis te slikken.

Uit onderzoek dat de beoordeling van stress-gevoelige parameters te betrekken kan worden verstoord door het gebruik van de standaard manUAL terughoudendheid technieken beschreven in dit protocol en eenvoudige aanpassingen aan de methodologie kan gemakkelijk worden gemaakt om te onderzoeken waarin terughoudendheid is verboden tegemoet te komen. In deze gewijzigde benadering ODS kan direct in de kooi van het dier te consumeren geplaatst. Opmerkingen afgeleid van experimentele studies in ons eigen laboratorium geven aan dat dit het beste worden uitgevoerd door het plaatsen van de dieren in een kooi zonder strooisel / nestmateriaal, voor de duur van de geneesmiddelafgifte procedure, teneinde het gemak te vergroten waarmee ODS verbruik kan visueel worden gecontroleerd door de experimentator (s). Bovendien zou het wenselijk zijn een stage gedurende welke tijd de dieren worden ingevoerd om de ODS, zodat ze de eerste aangeboren vermijden van nieuwe voedingsmiddelen ⁴ kan overwinnen initiëren. Natuurlijk zou verdere studies nodig zijn om een ​​rem-free protocol voor ODS levering te optimaliseren, maar er is geen reden om te geloven dat een dergelijke procedure niet kon worden gedaan met gemak.

Met name wat betreft de gegevens reproduceerbaarheid, ODS kan worden geformuleerd om zich aan de tong of wang van het dier en zij snel orale desintegratie om het geneesmiddel snel weer los, waardoor zorgen voor adequate dosering wordt bereikt. En met ODS toediening, de noodzaak van sondevoeding en andere invasieve onplezierige ervaring voor het dier wordt geëlimineerd. Niet alleen is deze humane maar het minimaliseert ook de effecten van stress als variabele in het experiment. Opgemerkt thhet ODS werkwijze kan verder geoptimaliseerd worden, zoals in vele nieuwe productieprocessen, die verder de farmacokinetiek van de testverbinding zullen verbeteren ODS wordt geëxpandeerd aanvullende therapieën. Een beperking die dient te worden opgemerkt betreft het feit dat de ontwikkeling van ODS is in de vroege stadia van ontwikkeling. Kwesties met betrekking tot het laden van verschillende fysisch-chemisch kenmerk drugs over de tastant / ODS platform blijft een uitdaging om de veelzijdigheid en de veralgemening van deze techniek. Dit is een gebied van lopend onderzoek.

De voorgestelde techniek is een eenvoudige en nieuwe techniek die voor korte en lange termijn preklinische dierstudies en voor de levering van geneesmiddelen aan dieren (bijvoorbeeld honden) kan worden vastgesteld. toediening van geneesmiddelen door middel van ODS is een nieuwe, snelle, gemakkelijke en menselijke benadering in vergelijking met de bestaande traditionele benaderingen zoals tabletten, capsules, vloeistoffen, poeders, gels en orale sondevoeding.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Orally Dissolving Strip	Cure Pharmaceutical		Available upon special request. Alternatively, ODS may also be prepared in-house.
Gavage Feeding Needle	VWR	7912	Our rodent studies utilized a 18 gauge feeding needle. This size may need to be adjusted for use in other mammilian species.
Sucrose	Sigma Aldrich	S0389-500G