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Biology

Isolierung von CD146 Published: June 17, 2016 doi: 10.3791/53782
Automatic Translation
1,2, 1,3,4, 1,2,5
1Sinclair Centre for Regenerative Medicine, Ottawa Hospital Research Institute, 2University of Ottawa, 3Department of Neonatology and Pediatric Critical Care Medicine, Medical Faculty and University Hospital Carl Gustav Carus, Technische Universität Dresden, 4DFG Research Center and Cluster of Excellence for Regenerative Therapies (CRTD), Technische Universität, Dresden, 5Children's Hospital of Eastern Ontario Research Institute

Summary

Dieses Protokoll beschreibt ein Isolationstechnik für primäre Lungen resident mesenchymalen Stromazellen von Ratten erhalten, durch die Verwendung von enzymatischen Verdauung, Dichtegradiententrennung, Kunststoff Haftung und CD146 + magnetisches Kügelchen Auswahl.

Abstract

Mesenchymalen Stromazellen (MSCs) werden zunehmend für ihr therapeutisches Potential in einem weiten Bereich von Krankheiten erkannt, einschließlich Lungenerkrankungen. Neben der Verwendung von Knochenmark und Nabelschnurblut MSCs für exogene Zelltherapie wird auch ein zunehmendes Interesse an der Reparatur und regenerative Potenzial ansässig Gewebe MSCs. Darüber hinaus haben sie wahrscheinlich eine Rolle bei der normalen Organentwicklung und haben Rollen in Krankheit zugeschrieben worden, insbesondere solche mit einer fibrotischen Natur. Die größte Hürde für das Studium dieser ansässig Gewebe MSCs ist das Fehlen einer klaren Marker für die Isolierung und Identifizierung dieser Zellen. Die Isolierung hier beschriebene Technik gilt mehrere Merkmale von Lungen ansässig MSCs (L-MSCs). Nach Opfer der Ratten, sind Lunge entfernt und mehrmals gewaschen, um Blut zu entfernen. Folgende mechanische Dissoziation von Skalpell werden die Lungen für 2-3 Stunden mit einer Mischung aus Collagenase Typ I, neutrale Protease und DNase Typ I. Die obtaine verdautd Einzelzellsuspension wird anschließend gewaschen und überlagert über Dichtegradienten-Medium (Dichte 1,073 g / ml). Nach der Zentrifugation werden die Zellen aus der Zwischenphase gewaschen und in Kulturflaschen behandelt plattiert. Die Zellen werden für 4-7 Tage in physiologischer 5% O 2, 5% CO 2 Bedingungen. Zu verarmen Fibroblasten (CD146 -) und eine Bevölkerung von nur L-MSCs (CD146 +), die positive Selektion für CD146 + Zellen gewährleistet ist, durch magnetische Perle Auswahl durchgeführt. Zusammenfassend ergibt dieses Verfahren zuverlässig eine Bevölkerung von Primär L-MSCs für weitere in vitro-Studie und Manipulation. Aufgrund der Natur des Protokolls kann es leicht zu anderen experimentellen Tiermodellen übersetzt werden.

Introduction

Mesenchymalen Stromazellen (MSCs) werden zunehmend für ihr therapeutisches Potential in einem weiten Bereich von Krankheiten erkannt, einschließlich Lungenerkrankungen. Neben der Verwendung von Knochenmark und Nabelschnurblut MSCs für exogene Zelltherapie wird auch ein zunehmendes Interesse an der Reparatur und regenerative Potenzial ansässig Gewebe MSCs. Während der Entwicklung, unter anderem in der Lunge ist das Mesenchym eine wichtige Quelle für Entwicklungsanzeichen und Bewohner MSCs sind ein aussichtsreicher Kandidat in der Mitte davon zu sein. Darüber hinaus wird immer mehr Anzeichen dafür, dass die Bewohner MSCs bei erwachsenen Krankheiten gestört werden, einschließlich Krebs 1,2 und Fibrose 3. Die größte Hürde für das Studium dieser ansässig Gewebe MSCs ist das Fehlen einer klaren Marker für die Isolierung und Identifizierung dieser Zellen 4. Stammzell-Antigen-1 (Sca-1) wurde in Mäusen als Marker für eine Vielzahl von Gewebestammzellen identifiziert und können für die Isolierung von L-MSCs 5 verwendet werden, hat aber leider6 Orthologe in anderen Spezies nicht bekannt. Forscher haben eine Vielzahl von verschiedenen Isolationsverfahren für die Isolierung von L-MSCs entweder von Lungengewebe oder Flüssigkeit berichtet. Diese reichen von Fluoreszenz-aktivierte Zellsortierung (FACS) basierte Verfahren für CD31 Auswahl - / CD45 - / CD90 + Zellen 7, CD31 - / CD45 - / epithelialen Zelladhäsionsmolekül (EpCAM) - / Sca-1 + Zellen 8, Multidrug-Resistenz-Transporter ATP-Bindungskassette G (ABCG2) positive Zellen 9 oder Hoechst 33342 Farbstoff Auslauf 10, Kunststoffadhärenz 11,12 und Migration von zerkleinerten Gewebes 13.

Die Vorteile der hier vorgestellten Verfahren sind mehrfach. Durch die Verwendung von 14 eine sanfte enzymatische Verdauung und Dichtegradienten erhält man alle Zellen des Dichtebereichs, die MSCs gehören, epithelialen oder endothelialen Zellen auszuschließen. Die anschließende Kunststoffadhärenz Schritt stellt sicher, dass nur die mesenchymal Zellen anhaften und in der Kultur bleiben, Leukozyten zu beseitigen. Vor allem aber erlaubt die CD146 + Selektionsschritt zur Beseitigung von Fibroblasten, da diese Zellen nicht CD146 exprimieren. Die Expression des Zelladhäsionsmolekül CD146 positiv mit Multipotenz korreliert, und ist daher eine gute Markierung Fibroblasten aus einer mesenchymalen Zellpopulation 15-19 auszusondern. Dies ist ein Vorteil gegenüber CD90 als Selektionsmarker verwendet, da sie nicht nur in MSCs exprimiert wird, sondern auch in lipofibroblasts 5,20. In diesem Protokoll haben wir ausdrücklich ein magnetisches bead Auswahl gewählt, da es auf die Zellen sanfter ist, und die gesamte Prozedur kann unter sterilen Bedingungen durchgeführt werden. Ein weiterer wichtiger Vorteil dieses Isolierungsverfahren wie zum Auswachsen Verfahren gegenüber, ist, dass es relativ schnell ist, als 6-10 Tage bis zu einem Monat oder mehr für den Auswuchs Verfahren gegenüber. Drei bis fünf Tage nach der ersten Isolierung der mesenchymalen Bevölkerung ist bereit für CD146 + Sele ction; Nach weiteren drei bis fünf Tagen die CD146 + Zellen sind bereit für Experimente verwendet werden oder kann für eine spätere Verwendung eingefroren werden. Die verringerte Zeit der Kultur verbessert die Qualität der Zellen als MSCs transdifferentiate Richtung Fibroblasten in Kultur verlängert ex vivo 19. Schließlich wegen der Art des Protokolls ist es möglich, dieses Verfahren auf andere Arten anzuwenden, indem einfach geeignete Antikörper oder sogar auf andere Organsysteme Auswahl durch die Wahl der Verdauungsenzyme und Inkubationszeit eingestellt wird.

Ein detailliertes Protokoll dieser Isolierungsmethode ist unten angegeben, und eine schematische Übersicht über die Isolierung und anschließende Auswahl der CD146 + Subpopulation ist in 1A und 1B vorgesehen. Zusätzlich werden Details für die Passage enthalten, Einfrieren und diese Zellen aufgetaut.

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Abbildung 1. Schematische Darstellung der Isolierung von Lungen mesenchymalen Zellen (A) und die anschließende CD146 + Zellauswahl (B) min = Minuten. EDTA = Ethylendiamintetraessigsäure; 2. Ab = Sekundärantikörpers; a-CD146 Ab = primäre anti-CD146-Antikörper; & ndash; ve Zellen = CD146-negativen Zellen; + ve Zellen = CD146-positiven Zellen. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

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Protocol

Alle Verfahren wurden von der Animal Care Committee der University of Ottawa (Tierethik Protokoll Ohri-1696) zugelassen. Tierbetreuung wurde gemäß den Richtlinien des Instituts durchgeführt.

1. Isolierung von Lung mesenchymalen Stromazellen

  1. Bereiten Sie die Enzymmischung in einer 50 ml Tube: wiegen 30 U neutrale Protease, 2.500 U Kollagenase I und 500 U DNAse I. ausreichen Diese Beträge für die Lunge eines erwachsenen Maus oder Ratte Welpen. Bereiten Sie am Tag der Isolierung und lagern bei 4 ° C bis zur Verwendung.
  2. Opfer Rattenjungen am Tag 13 durch eine intraperitoneale Injektion von Pentobarbital-Natrium (0,2 ml, 65 mg / ml). Verwenden Sie die Zehe Prise Reflex Bewusstlosigkeit zu etablieren. Tod des Tieres wird durch Öffnen des Brustgewährleistet, wie weiter unten beschrieben.
  3. Desinfizieren Sie die Haut durch das Tier mit 70% Ethanol Spritzen und vorsichtig öffnen den Brustkorb chirurgische Schere, bei der Membran ausgehend und in Richtung der rostralen Seitenschneider, sehr aufpassen, nichtdie Lunge zu beschädigen. Verbreiten Sie den Brustkorb geöffnet blutstillende Schellen, oder alternativ den Brustkorb aufgeschnitten Zugriff auf den Brustkorb zu schaffen.
  4. Exsanguinate das Tier durch das Herz zu entfernen. Um das Herz zu entfernen, fassen Sie die Thymusdrüse und Herzen mit kleinen Pinzette und schneiden Sie diese mit chirurgische Schere entfernt. Unmittelbar danach nehmen das Blut mit einer Gaze, bis kein Blut mehr aus der abgetrennten Aorta und Lungenarterie kommt.
  5. Entfernen Sie die Lungen aus dem Thorax wie folgt: Halten Sie die Luftröhre mit kleinen Zange, dann trennen die Luftröhre mit chirurgischer Schere auf dem rostralen Seite. Während sanft die Lunge Paket aus dem Brustkorb ziehen, geschnitten entlang der Brustkorb in die Lunge frei, jede Bindegewebe auf der Rückenseite entfernt.
  6. Sever die Lungen von der Aorta und der Speiseröhre, mit chirurgische Scheren entlang der Membran zu schneiden. Nun, da die Lungen aus dem Thorax völlig frei nehmen Sie verbleibendes Blut vorsichtig mit einem Gaze.
  7. Entfernen Sie die Luftröhre und Bronchien mit surgische Schere und sorgfältig die Lungenlappen zu einer 50-ml-Röhrchen übertragen haltige Kalt 35 ml 30% Citrat-Phosphat-Dextrose-Adenin (CPDA-1) Antikoagulans (26,30 g Trinatriumcitratdihydrat, 3,27 g Ascorbinsäure Monohydrat, 2,22 g Natriumhydrogenphosphat, 31,80 g D-Glucose, 0,275 g Adenin in 1 L gereinigtem H 2 O; Sterilfilter die Lösung ein 0,22 um Membranfilter vor der Verwendung) in phosphatgepufferter Salzlösung (PBS) Blut und Trümmer zu entfernen verwenden.
  8. Nach 5 min Spülen in 30% CPDA-1 / PBS, übertragen die Lunge auf eine neue 50-ml-Röhrchen 35 ml sterile phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS) (RT) enthält, vorsichtig umdrehen Citrat zu entfernen. Transfer in ein Rohr 35 ml Dulbeccos PBS + Natrium-Pyruvat + Glucose (DPBS ++) (RT) enthält. Jeder Waschschritt sollte ungefähr 5 Minuten dauern.
    Hinweis: DPBS ++ Handel bestellt werden kann oder sich wie folgt zusammen 21: Calciumchloriddihydrat 132,4 mg, Magnesiumchlorid-Hexahydrat 100 mg, Kaliumchlorid (wasserfrei) 200 mg, monobasisches Kaliumphosphat (wasserfrei) 200 mg, Natriumchlorid (wasserfrei) 8,000 mg, dibasisches Natriumphosphat (wasserfrei) betragen mit 1.144,5 mg, D-Glucose 1000 mg, Natriumpyruvat 36 mg in 1 L gereinigtem H 2 O, pH 7,3. Sterilfilter die Lösung einen 0,22 um Membranfilter vor dem Gebrauch verwenden.
  9. Man löst das Enzymgemisch durch Zugabe von 10 ml DPBS ++ (vorgewärmt auf 37 ° C) und dem invertierenden sanft bis gelöst.
  10. Übertragen Sie die Lunge zu einem neuen 50-ml-Tube und hacken die Lunge an der Wand der Röhre mit einem Skalpell, bis fein gehackt. In der Enzymmischung auf das Gewebe (10 ml Enzymmischung / pro Erwachsener Maus / Rattenjungen Lunge), schließen Sie das Rohr fest und Inkubation bei 38 ° C unter leichtem Schütteln (entweder in einem Thermomischer, einem Schüttelwasserbad, oder ein Wasser Bad mit regelmäßiger manueller Bewegung). Die Dauer hängt von der Art des Gewebes: fetalen Gewebes 60 min, juvenile / erwachsenem Gewebe 90-120 min, fibrotische erwachsenem Gewebe 120-150 min.
  11. Stoppen Sie die Verdauung von Chela die zweiwertigen Kationen with 200 & mgr; l Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA, 0,15 M, pH 7,4. Sterilfilter die Lösung ein 0,22 um Membranfilter vor der Verwendung verwendet wird).
  12. 20 ml 5% fötalem Rinderserum (FBS) / PBS und die gesamte Suspension durch 100 & mgr; m Zelle Sieb in eine neue 50-ml-Röhrchen übergeben. Spülen Sie das Rohr und Zellsieb mit 10 ml 5% FBS / PBS, um das Gesamtvolumen auf 40 ml zu bringen.
  13. Zentrifugieren Sie für 5 min bei 500 · g, RT.
  14. Entfernen Sie den Überstand (Pellet sollte gut sichtbar sein), Resuspension in 40 ml 5% FBS / PBS und wiederholen Zentrifugation Schritt 1.13.
  15. Resuspendieren in 4 ml 5% FBS / PBS (RT) und 14 vorsichtig auf 3 ml Dichtegradientenmedien (1,073 g / cm 3) in einem 15 ml Rohrschicht. Um eine gute Interphase erhalten, ist es entscheidend, dass die Schichtung der Einzelzellsuspension bei einer auftritt> 45 ° Winkel mit sehr geringer Geschwindigkeit.
  16. Zentrifuge 20 min bei 900 · g, Medium (5/10) Beschleunigung, keine Verzögerung, 19 ° C.
  17. Sammeln Sie die Zellen, die in der interphase und resuspendieren sie in 10 ml sterilem PBS.
  18. Zentrifuge für 5 Minuten bei 500 × g, 21 ° C.
  19. Entfernen Sie den Überstand und Zellpellet in 10 ml vorgewärmten abgeschlossen L-MSC-Kulturmedium (Minimum Essential Medium Eagle alpha-Modifikation (& agr; MEM), ergänzt mit 2 mmol L-Glutamin pro 500 ml & agr; MEM, 20% vol / vol FBS und 1% vol / vol Penicillin / Streptomycin / Amphotericin B.
  20. Wiederholen Zentrifugationsschritt 1,18. Anschließend entfernen Überstand und resuspendieren in 10 ml vorgewärmten frisches Kulturmedium.
  21. Zählen von Zellen mit einem Hämozytometer oder automatische Zellzähler und Platte mit einer hohen Dichte, da die Mehrzahl der Zellen in diesem Stadium sind nicht aus Kunststoff anhaftenden. Die genaue Beschichtungsdichte hängt von der Tierart und Alter, zB werden die Zellen eines erwachsenen Mauslunge bei 10 5 Zellen / cm 2, wohingegen Zellen, die aus einer Lungenrattenjungen ausreichend dicht sind bei einer Aussaatdichte von 1-2 x 10 4 Zellen / cm 2 2.
  22. Kultur L-MSCs in einer befeuchteten 5% O 2, 5% CO 2 -Atmosphäre bei 37 ° C.
  23. Ändern Medium 24 Stunden nach der ersten Aussaat und danach alle 3 Tage, nachdem er einmal mit PBS spülen. Zellen werden, bis 80-90% Konfluenz kultiviert werden, die in Abhängigkeit von dem Tier Ursprungs 3-5 Tage im Durchschnitt dauert. Höhere Zusammenfluss wird die Differenzierung in Fibroblasten fördern.

2. Auswahl der CD146 + Lung mesenchymalen Stromazellen

  1. Beschichtung von Magnetic Beads mit sekundärem Antikörper
    1. Beschichten der magnetischen Kügelchen mit biotinyliertem sekundärem Antikörper, bei einem Verhältnis von 10 ug sekundären Antikörper / 100 ul magnetischen Perlen in einem Rundboden sterile 2 ml Kryoröhrchen in sterilen Bedingungen. Verwenden Sie 10 ul sekundären Antikörper pro erwartet 0,5 x 10 6 Zellen, und mit einem Minimum von 100 ul magnetische Perlen und 10 ug Antikörper.
      Hinweis: das Verhältnis einestibodies pro Volumen der Kugeln verwendet wird, kann von Hersteller zu Hersteller unterscheiden, sollten Sie die Anweisungen des Herstellers für die Perlen der Wahl beraten. Aus diesem Protokoll finden Sie in Tabelle 1 für die Perlen und Antikörper, die bei der Optimierung von diesem Protokoll verwendet wurden.
    2. Inkubieren in einem rotierenden Probenmischer für 30 Minuten bei 30 Umdrehungen / min (rpm), bei RT.
    3. Resuspendieren der Kügelchen in 1,5 ml steriler 0,1% Rinderserumalbumin (BSA) / PBS und Transfer zu einem 3 ml Rundbodenrohr (Durchflusszytometrie Rohr). Spülen Sie die Kryoröhrchen mit einer zusätzlichen 1,5 ml 0,1% BSA / PBS und Transfer zum 3-ml-Tube.
    4. Das Röhrchen wird auf einem geeigneten Magnet und warten 2 Minuten, bis alle Perlen an der Rückwand der Röhre befestigt sind, und die Lösung bleibt klar. Entfernen Abfluss und wiederholen Waschen mit 3 ml 0,1% BSA / PBS zweimal.
    5. Resuspendieren der Kügelchen in 3 ml 0,1% BSA / PBS und lagern bei 4 ° C, vor Licht geschützt. Verwenden Sie innerhalb von 5 Tagen.
  2. Kennzeichnung CD146 + L-MSCs
    1. Ernten Sie die mesenchymalen Zellen nach Spülen mit PBS eine sanfte nicht-Trypsin-Lösung.
      Anmerkung: Volumes hängen von der Größe der Kulturflasche (0,2 ml / cm 2 Medium oder PBS).
      1. Kulturmedium entfernen und spülen Zellen dreimal mit sterilem PBS.
      2. Fügen Sie den entsprechenden Volumen von sanften Nicht-Trypsin-Lösung (siehe Tabelle 1). Im Brutschrank bei 37 ° C inkubieren, bis die Zellen abgelöst, etwa 10 min, wenn die Lösung in Tabelle 1 verwendet wird.
      3. Inaktivierung des Enzyms durch L-MSC Kulturmedium zugibt und Zentrifuge für 5 Minuten bei 500 x g.
    2. Überstand entfernen, resuspendieren Zellen in 0,1% BSA / PBS und die Zellen mit einem Hämozytometer oder automatische Zellzähler zählen.
      Hinweis: Das Volumen der 0,1% BSA / PBS auf die Größe der Kulturflasche abhängt: Ziel für 5 oder 10 ml 0,1% BSA / PBS.
    3. Wiederholen Sie Schritt 2.2.2 und resuspendieren engagierten Menge an Zellen in 3 ml 0,1% BSA / PBS (Blöcke unspezifischen Bindungsstellen und hält die Zellen am Leben). Halten Zellen auf Eis.
    4. Bereiten Sie eine 3 ml-Rundbodenröhrchen mit dem primären anti-CD146-Antikörper, und halten Sie auf dem Eis.
      Anmerkung: Die Konzentration an primären Antikörper, der an die spezielle Menge an Zellen hinzugefügt wird, hängt auf dem Antikörper, der verwendet wird. Für einen empfohlenen Anti-Ratten CD146-Antikörper siehe Tabelle 1.
    5. Hinzufügen des Gesamtvolumens der Zellen aus Schritt 2.2.3 auf das Rohr mit dem primären Antikörper. Dicht schließen und 4 ° C bei 15 rpm, 30 min auf einer rotierenden Probe Mischer inkubiert.
    6. Zentrifuge Zellen 5 min bei 500 × g, 4 ° C, Überstand und resuspendieren Zellpellet in 3 ml 0,1% BSA / PBS entfernen. Wiederholen Zentrifugenschritt.
    7. Resuspendieren der Zellen in der Lösung 3 ml sekundärem Antikörper beschichteten Kügelchen enthält, die 2,1 nach den Anweisungen in Abschnitt wurde hergestellt und inkubiert 30 min auf einer rotierenden Probe Mischer bei 15 Upm, 4 ° C.
  3. Auswählen von CD146 + L-MSCs
    1. Das Röhrchen wird das markierte CD146 + L-MSCs auf den Magnet enthält. Die positiven Zellen werden an der Rückseite des Rohres gezogen werden. Ohne das Rohr zu bewegen oder um die Perlen zu berühren, ernten den Überstand mit den negativen Zellen langsam mit einer sterilen Pasteurpipette (diese entweder auf der Grundlage der experimentellen Design gesammelt oder verworfen werden kann).
    2. Entfernen des Rohres aus dem Magneten und Resuspendieren der Zellen in 3 ml 10% BSA / PBS. Wiederholen Sie den Auswahlverfahrens beschrieben in Schritt 2.3.1. vier weitere Male (Σ 5 Stufen des Auswahlverfahrens).
    3. Resuspendieren CD146 + L-MSCs in vorgewärmte L-MSC Kulturmedium und zurück zum Magneten.
    4. Überstand entfernen, resuspendieren in L-MSC Kulturmedium und die Platte in einem passenden Kulturflasche (0,2 ml / cm 2). Als Faustregel gilt, aus denen Zellen Platte in derselben Größe Kulturflasche wurden die Zellen vor der Wulst-Auswahl aufgehoben. Die Zahl der CD146 + L-MSCs und damit die Beschichtungs-Dichte, wirdabhängig vom Alter, Art und Stamm des Quell Tier. Immer streben eine Plattierungsdichte von ~ 5.000 Zellen / cm 2.
      Hinweis: Die Perlen werden nicht das Zellwachstum stören und wird nach und nach verschwinden, wenn die Zellen vermehren.

3. Gefrierzellen

  1. Verwenden Sie das folgende Gefriermittel: 60% Pentastärke-Lösung (10% Pentastärke in 0,9% NaCl), 20% FBS, 12,5% CPDA-1, 2,5% NaCl (0,9%), 5% Dimethylsulfoxid (DMSO) 22.
    Hinweis: Wenn nicht alle Zutaten vorhanden sind, ist eine Lösung, die 5% DMSO, 30% FBS und 65% & agr; MEM ist eine gute Alternative.
  2. Die Zellen in 0,5 x 10 6 Zellen / ml aliquoten in Kryoröhrchen von jeweils 1 ml und O / N bei -80 ° C unter Verwendung eines Gefrierbehälters einfrieren.
  3. Transfer zu einem Flüssigstickstofflagertank am nächsten Tag.

4. Auftauen Cells

  1. Auftauen eine Ampulle von Zellen in einem 37 ° C Wasserbad für 5 min.
  2. Die Zellen in 10 mlvorgewärmtes Kulturmedium und Zentrifuge für 5 min bei 500 × g, 21 ° C.
  3. Überstand entfernen und Zellpellet in 10 ml Kulturmedium. Samenzellen in einem belüfteten Kappe Zellkultur behandelt Kolben bei 5.000 Zellen / cm 2 in 0,2 ml / cm2 Medien (zB 15 ml für einen 75 cm 2 Kolben).
  4. Kulturzellen in 5% O 2, 5% CO 2, bis 80-90% konfluent zum Ernten und / oder experimentelle Verwendung. Über Konfluenz wird die Differenzierung induzieren. Wenn bei 5.000 Zellen Aussaat / cm 2, L-MSCs werden 80-90% Konfluenz innerhalb von 3-4 Tagen Kultur erreichen.

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Representative Results

Zwei der zuverlässigsten physikalischen Eigenschaften von MSCs, Dichte und Kunststoffadhärenz werden im ersten Teil dieses Protokolls verwendet, um die mesenchymale Zellfraktion der Lunge zu erhalten, das L-MSCs enthält. Obwohl der Dichtegradient Interphase wird Monozyten und Makrophagen neben Lungen mesenchymalen Zellen, die Kunststoffadhärenz gefolgt von 3-5 Tagen Kultur gewährleistet sind, dass nur die Lunge mesenchymalen Zellen bleiben. Tatsächlich diese Zellpopulation drückt die klassischen MSC Oberflächenmarker CD73, CD90 und CD146 und ist negativ für die Marker CD34, CD45, Major Histocompatibility Complex Typ II (MHC II) -RT1B, CD11b und CD79a, was darauf hinweist, dass es keine mehr vorhanden Leukozyten in die Zellpopulation (2A). Von Interesse ist, dass aus der CD146 + Untergruppe, eine Reihe von 44,4-65,7% ist auch CD73 + und CD90 + (Daten nicht gezeigt). Darüber hinaus ist diese Zellpopulation ein fähigerkoloniebildende Einheit (CFU) Effizienz dass bei ~ 30% ist viel höher als im allgemeinen für die Knochenmark-MSCs gemeldet oder auch andere Arten MSC (2B), und differenziert entlang der drei klassischen MSC Linien (Abbildung 2C).

Figur 2
Abbildung 2. MSC Eigenschaften nach der enzymatischen Verdauung, Dichtegradiententrennung und Kunststoffadhärenz. (A) Expression von MSC bedingte Oberflächenmarker CD146, CD73 und CD90 vorhanden ist in einem Teil des Kunststoff adhärenten Zellpopulation, während die negativen Leukozyten-Marker CD11b, CD79a , CD34, CD45 und MHC II-RT1B wurden praktisch nicht zum Ausdruck gebracht. (B) koloniebildende Einheit-Assay durch Grenzverdünnungsassay (5 Zellen / cm 2) zeigte, dass ~ 30% der Kunststoff haftenden Zellen hatten eine klonale Kapazität, was auf MSCs. (C) Kunststoff anhaftenden cells der Lage osteogene Matrixproduktion (rot) waren, enthielten eine höhere Anzahl von kleinen Lipidvesikel (rot), wenn sie mit adipogenetische Differenzierungsmedium im Vergleich zu nicht-differenzierte Steuerung und gebildet chondrogene wie Kugeln enthält Chondrozyten (rot) induziert. Die Daten werden als Mittelwert ± Standardfehler des Mittelwerts (SEM) dargestellt. Alle Daten wurden mit Durchgang 1-3 Zellen erzeugt. NM = negativ Marker; CFU = koloniebildende Einheiten. Bitte hier klicken, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Allerdings ist der Haupt Vorbehalt, dass diese Population wahrscheinlich enthält sowohl L-MSCs und verschiedene Subtypen von Lungenfibroblasten, die L-MSCs Nachkommen differenziert 23. Da Multipotenz positiv mit CD146-Expression korreliert und Fibroblasten sollte keine Expression dieses Markers, positive Selektion der CD146 + Subpopulation o habenstensibly in einer Zellpopulation geführt, die hoch in L-MSCs angereichert ist. Dies wird deutlich durch einen höheren Prozentsatz der Zellpopulation exprimiert MSC verbunden Oberflächenmarker (3A) gezeigt, eine wesentlich höhere Koloniebildungspotential von ~ 80% (3B) und eine stärkere Differenzierung Reaktion in besonders der chondrogenen Linie (3C) verglichen mit der Gesamtbevölkerung, die vor mesenchymalen CD146 Auswahl erhalten wird. Bemerkenswert ist, dass diese L-MSCs Form nur sehr wenige echte Fettzellen, aber viele mehr spindelförmige Zellen zeigen, die mit kleinen Lipidbläschen gefüllt sind. Diese könnten die lipofibroblast Linie widerspiegeln, die beide entscheidend für die Lunge ist die Entwicklung und alveolären Typ II Zelle Unterstützung. Nach CD146 Auswahl können mehr Adipozyten wie mit großen Lipidbläschen gefüllten Zellen im Vergleich zu vor CD146 Auswahl beobachtet (3C) werden, aber die Mehrzahl der Zellen sind immer noch die lipofibroblasts artigen cells mit kleinen Lipidbläschen.

Abbildung 3
Abbildung 3. MSC Eigenschaften nach zusätzlichen CD146 + magnetisches Kügelchen Auswahl. Nach positive Selektion der CD146 + Subpopulation zeigten diese Zellen eine höhere Expression von MSC bedingte Oberflächenmarker CD73 insbesondere (A), einen deutlich höheren Wirkungsgrad CFU nach Einzelzell Beschichtung (B) und eine stärkere Differenzierung Reaktion insbesondere zur chondrogenen Linie und in einem geringeren Ausmaß der adipogenen Linie (C). Die Daten werden als Mittelwert ± SEM dargestellt. Alle Daten wurden mit dem Durchgang 3-Zellen erzeugt. NM = negativ Marker; CFU = koloniebildende Einheiten. Bitte klicken Sie hier to eine größere Version dieser Figur sehen.

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Discussion

Die Isolierung und Kultur von Primär L-MSCs stellt eine Chance zu einer besseren ihre Funktion und ihre Wechselwirkung mit anderen Zellpopulationen auf zellulärer Ebene zu verstehen und ihre Rolle in der Lungenentwicklung, Gesundheit und Krankheit. Dies ist besonders wichtig, da der Mangel an einem bestimmten einzigen Markierung dieser Zellen macht es nahezu unmöglich, diese Zellen in situ zu untersuchen. Wie bei allen primären Zellpopulationen, sollte man im Hinterkopf behalten, dass diese Zellen eher auf ihren Charakter ändern, je länger sie sind in Kultur gehalten werden 19 (Übersicht in 24). Zu halten L-MSCs in einem Zustand, der so nahe wie möglich an ihrem natürlichen Zustand ist, ist es sehr wichtig, dass sie kultiviert werden in 5% O 2, 5% CO 2, in einem 37 ° C befeuchteten Inkubator. In Atemphysiologie ist es im Allgemeinen, dass basierend auf Daltons Gesetz der Partialdrücke akzeptiert, der Sauerstoffpartialdruck der Umgebungsluft (21% O 2) 160 mmHg ist, und fällt auf ~ 101 mmHg in den Kiefer Luftraum 25-27. In einer reifen Lunge ist der Kieferarterielle PaO 2 Steigung ~ 3-4 mmHg, aber dies kann deutlich in einem erkrankten oder unreife Lunge erhöht werden, wenn der Kieferarterielle Abstand 25,28 erhöht. Im Inneren des Körpers ist die mesenchymalen Nische normalerweise auf eine Sauerstoffkonzentration von 2-8% 29,30 ausgesetzt. Lediglich wenige Papiere tatsächlich die PO 2 in der Lunge gemessen, aber eine Studie gemessen diese in der Lunge von 20 Patienten, PO eine Reihe in normalem Lungen finden 2 23-656 mmHg, mit einem Median von 42,8 mmHg 27,31. Dalton-Gesetz gemäß, einem befeuchteten Inkubator mit einer Temperatur von 37 ° C und 5% O 2 hat einen pO 2 von ~ 36 mmHg, die sich perfekt in den Bereich in normalem Lungengewebe gemessen fällt und ist sehr nah an dem Median. Darüber hinaus fördern niedrige Sauerstoffkulturbedingungen die Aufrechterhaltung der Vorläuferpopulationen in Kultur 29. Zusammengenommen es iist schwer genau zu sagen, was die Sauerstoffkonzentration L-MSCs zu während des normalen postnatalen Entwicklung oder Krankheit in verschiedenen Stadien in situ ausgesetzt sind, aber es scheint, dass 5-10% O 2 wahrscheinlich die genaueste aus physiologischer Sicht 27,31 ist. Basierend auf den Informationen zitiert, wählten wir 5% O 2 in unseren Kulturbedingungen zu erhalten, und wir fanden, dass, wenn diese Bedingungen in vitro gehalten werden, die L-MSCs schneller wachsen, zeigen weniger Stressfasern und einen kleineren Wahrscheinlichkeit spontaner Differenzierung oder Seneszenz. Zusätzliche Faktoren, die eine spontane Differenzierung oder andere Anomalien zu verhindern, wird durch eine schonende Nicht-Trypsin Dissoziierungsmittels für Passagieren Verwendung Passagieren L-MSCs, wenn sie 80-90% Konfluenz erreichen (dichten Bedingungen Fibroblasten Differenzierung fördern), und halten den Durchgang Zahl niedrig (<P4). In einer Studie von Hoffmann und Kollegen wurde Trypsin nachteilige Auswirkungen auf L-MSCs Funktion haben gezeigt undPhänotyp, während Trypsin-freien Dissoziation Mittel könnte diese 13 erhalten.

Um die Ausbeute bei der Isolierung Prozess zu optimieren, ist es wichtig, die Lungen so fein wie möglich zu zerkleinern, ohne zu vergessen, dass das Gewebe sollte trocknen nicht zugelassen werden. Während der enzymatischen Verdauung, ist es wichtig, dass die Rohre häufig bewegt werden, wenn nicht ein beheiztes Schütteln Gerät, wie die Gewebestücke sedimentieren und wird nicht optimale Belichtung für die Enzyme erhalten. Ein weiterer wichtiger Schritt ist die Dichtegradiententrennung: wenn die Schichtung nicht sehr langsam durchgeführt wird oder in einem Winkel <45 °, wird es zur Vermischung der beiden Flüssigkeiten statt Schichtung führen, was den Verlust der gesamten Zellpopulation. Darüber hinaus ist die Dichte des Dichtegradienten-Medium stark abhängig von der Umgebungstemperatur. Jede andere Temperatur als 19 ° C (oder RT), führt zu einer suboptimalen oder ohne Dichtegradienten-Trennung.

Von Interesse für fukunft Benutzer dieses Protokolls ist, dass wir erfolgreich lebensfähigen L-MSCs aus Lunge isoliert worden, die vor der Isolierung bis 24 h geerntet up wurden, sofern die Lungen werden in kalten L-MSC Medien nach der Ernte direkt gespeichert und aufbewahrt bei 4 ° C. Dies ermöglicht eine flexible Versuchsplanung oder sogar Sendung von Lunge zwischen verschiedenen Labors. Die Ausbeute ist im allgemeinen ähnlich zu der von frisch geernteten Lunge und Zellen wachsen gleich gut.

Eine weitere Modifikation, die möglich wäre, ist FACS zu verwenden anstelle von Magnetkügelchen Auswahl, obwohl dieses Verfahren die Zellen zu mehr Stress unterzieht wie das Verfahren mehr Zeit in Anspruch nimmt und als Zellen, die hohen Drücken und Geschwindigkeiten ausgesetzt werden, und birgt die Gefahr der Verunreinigung wenn nicht unter sterilen Bedingungen durchgeführt. Die magnetischen Kügelchen hier verwendet werden, nicht mit dem Zellwachstum, stören und innerhalb von wenigen Tagen der Kultur verschwinden. Eine Präferenz für FACS oder Magnetic-Bead-Sortierung kann auch von den vorhandenen Einrichtungenfür den Endbenutzer. Darüber hinaus wäre es möglich, dieses Protokoll zu modifizieren resident MSCs aus anderen Geweben zu isolieren. In diesem Fall wäre es wichtig, die Enzyme des Organs von Interesse anzupassen, da die Matrixzusammensetzung zwischen Organen variiert.

Eine wichtige Einschränkung von nur den Dichtegradienten und anschließender Kunststoffadhärenz mit mesenchymalen Zellen zu erhalten, ist, dass die sich ergebende Population sowohl L-MSCs und Fibroblasten enthält. Die Auswahl für CD146 + Zellen stark behebt dieses Vorbehalt, aber trotz der CD146 + Auswahlverfahren und die sorgfältige Kultivierungsbedingungen, die Art der L-MSCs und die Auswirkungen der in-vitro-Zellkultur machen es unmöglich, ein gewisses Maß an Differenzierung in Fibroblasten zu vermeiden. MSCs wurden allgemein eine Hierarchie von Multipotenz enthalten berichtet, bei denen Zellen weiter unten in der Hierarchie langsam ihre multilineage Potential verlieren, bis sie terminal differenzierten Fibroblasten werden <sup> 23. Aller Wahrscheinlichkeit tritt dies auch in der L-MSC Nische 4 und scheint in der kultivierten CD146 + Bevölkerung bereits einen Durchgang nach CD146 + Auswahl etwa 40% der Zellen CD146-Expression verloren haben, reflektiert werden. Darüber hinaus gibt es in dieser Population ist nur 80% CD73 und 40% CD90 Expression. Zum Teil kann dies von der MSC Hierarchie von Multipotenz erläutert. Es wäre möglich, dass CD146 + asymmetrische Proliferation unterziehen, sowohl CD146 positive MSCs Anlass zu geben und negative, differenziertere, Tochterzellen. Einwohner MSCs der Lunge könnte auch einigermaßen eine etwas andere Phänotyp und Funktion von Knochenmark-MSCs ausgegangen werden, der bei der Definition von CD73 und CD90 Expression wurde basierend. Die Internationale Gesellschaft für Zelltherapie hat erkannt, dass nicht alle MSCs die klassischen MSC Marker exprimieren, einschließlich CD73 und CD90, und das Oberflächenmarker Ausdruck ist nicht der beste Weg 32 MSCs zu definieren. die Exceptionally hohe Effizienz der CFU ~ 70% der CD146 + L-MSC Population unterstützt dies. Da die CD146 + Bevölkerung besser in Bezug auf MSC Eigenschaften führt als die unsortierten mesenchymalen Bevölkerung, haben die Autoren nicht weiter charakterisiert die CD146 - Bevölkerung. Wir strebten unsere mesenchymalen Bevölkerung mit MSCs zu bereichern und sie von Fibroblasten führen, aber wir behaupten nicht, dass dies die einzig wahre L-MSC Bevölkerung. L-MSCs sind wahrscheinlich sehr heterogen, sowohl in Herkunft, Phänotyp und Funktion.

Obwohl CD146 ist weithin eine Markierung der Multipotenz in MSCs und Perizyten 16,17,33,34, sehr wenig ist bekannt über die CD146 + MSC Bevölkerung in vivo zu sein anerkannt. CD146 ist ein Zelladhäsionsmolekül, die für die Angiogenese und Endothelzell-Funktion wichtig ist, und wird in Endothelzellen, glatten Muskelzellen, Perizyten, MSCs und T-Lymphozyten 15,16,35,36 ausgedrückt. In den vergangenen JahrenNachweis hat sich herausgestellt, dass MSCs die perivaskulären Nische in mehreren Organen bewohnen, als CD146 + Zellen Co-Fleck für MSC-Marker CD73 und CD105 37. Tatsächlich kultivierten Perizyten und MSCs haben eine sehr ähnliche Genexpressionsprofils 38, die Ansicht zu stärken, die MSCs aus Perizyten 4,39 abgeleitet werden. Obwohl wir nicht durchgeführt haben immunhistochemische Analysen die Position unseres CD146 + L-MSC Population zu bestimmen, ist es sehr wahrscheinlich, dass sie auch in einer perivaskulären Lage wäre. Künftige Studien sind erforderlich, um zu überprüfen, ob dies tatsächlich der Fall ist. Es ist möglich, dass ein Teil der Zellpopulation Perizyten sind, obwohl es, daß alle Zellen nach CD146 + Auswahl phänotypisch sehr ähnlich ist darauf hinzuweisen.

Mesenchymale Stromazellen sind notorisch schwierig aufgrund des Fehlens eines einzigen allumfassenden Marker zu identifizieren. Verschiedene Studien haben verschiedene Methoden zur Isolierung berichtetvon L-MSCs und sind einander ähnlich sind, dass diese Zellpopulationen in Bezug auf MSC Markerexpression zeugend dargelegt. Mit Stammzellen assoziiert Oberflächenmarker wie Sca basierend auf der Charakterisierung des CD146 + L-MSC wie hier dargestellt, die CD146 + L-MSC Bevölkerung sehr ähnlich ist bereits berichtet L-MSC-Populationen, wie durch Auswachsen oder verschiedene Formen von FACS erreicht -1, ABCG2 und CD90. Im Vergleich zu L-MSCs 13, CD146 + L-MSCs zu haben scheinen eine größere Fähigkeit zu verursachen Kolonien aus einzelnen Zellen, was darauf hinweist, dass unser Verfahren ergibt eine angereicherte multi L-MSC Bevölkerung Auswuchs. Dieser Vorteil gilt auch, wenn auf Verfahren verglichen, die basierend auf CD90 7 oder Thrombozyten-Wachstumsfaktor-Rezeptor α (PDGFRα) 40,41, da beide Oberflächenmarker auszuwählen, um weitere terminal differenzierten lipofibroblasts und alveolären / Struktur Fibroblasten auch L-MSCs isolieren und kann daher nur vernünftig bE wie Stromazellen 20,42 identifiziert. Im Gegensatz dazu sind sowohl Sca-1 und ABCG2 gut dokumentiert Marker, die mit 9,43-46 stemness und MSC Ausdruck korrelieren. ABCG2 + L-MSCs haben jedoch eine endotheliale Natur, da sie 99% positiv für CD31 46, während das Verfahren hier berichtet wählt gegen Endothelzellen durch die Ficoll-Gradienten und Kunststoffadhärenz. Der Hauptvorteil unserer Methode im Vergleich zu den Sca-1-Basis Isolierungsprotokoll von McQualter und Kollegen 5,8 ist, dass es auf andere Arten als Mäuse breit anwendbar ist, in denen Sca-1 nicht verwendet werden kann.

Obwohl es sehr schwierig ist, wohl nahezu unmöglich, einen "reinen" Population von L-MSCs aus einer späten Entwicklungs oder Erwachsener Lunge zu erhalten und sie in einem undifferenzierten Zustand halten, präsentiert das Protokoll hier bietet eine schnelle, konsistente und zuverlässige Methode der eine Zellpopulation erhalten in multipotenten selbst erneuernden Lungen res hochangereichertesident MSCs. Mit dieser Methode wird eine definierte Untersuchung der Rolle von L-MSCs in einer Vielzahl von Krankheitsmodellen und ihre Rolle in der Entwicklung von Lungen ermöglichen.

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
Neutral Protease Worthington Biochemical Corporation LS02104 Prepare on day of isolation and store at 4 °C until use
Collagenase I Worthington Biochemical Corporation LS004196 Prepare on day of isolation and store at 4 °C until use
DNAse I Sigma-Aldrich D5025 Prepare on day of isolation and store at 4 °C until use
Pentobarbital sodium (Euthanyl) Bimeda-MTC Animal Health Inc, Dublin, Ireland - Use 0.2 ml for rat pups between 20-30 g; larger animals may need more.
Dulbecco’s PBS + Sodium-pyruvate + Glucose Life Technologies 14287-072 Very crucial to use this type of D-PBS, as the calcium and magnesium that are present in this D-PBS facilitate facilitate the enzymatic digestion
Ficoll-Paque PREMIUM (1.073 g/cm3) GE Healthcare 17-5446-52 Density gradient media. To obtain a good interphase, it is crucial that the layering of the single cell suspension occurs at a >45° angle at very low speed, and that the subsequent centrifugation is done at 19 °C.
αMEM Sigma-Aldrich M8042 Warm in 37 °C water bath before use
200 mM L-Glutamine Life Technologies 25030-164
100x Antibiotic-Antimycotic Life Technologies 15240-062 Penicillin/Streptomycin/Fungizone
M-280 Dynabeads Life Technologies 11205D Magnetic beads
biotinylated polyclonal rabbit-anti-mouse IgG Dako, Agilent Technologies E0464 Biotinylated secondary antibody that matches with the anti-rat CD146 antibody described below
DynaMag5-magnet Life Technologies 12303D Magnet that is recommended for use with Dynabeads. NOTE: magnet should be chosen based on the manufacturer’s instructions of the magnet beads of choice.
TrypLE express  Life Technologies 12605-028 Gentle non-trypsin alternative, use 1 ml of TrypLE express/25 cm2 surface area. After detachment, 10 ml L-MSC culture medium is sufficient to inactivate 3 ml TrypLE
anti-rat CD146 antibody Lifespan Biosciences Inc. C35841 12.5 μl per 0.5 x 106 cells
Pentaspan (pentastarch solution) Bristol-Myers Squibb Canada - Can be obtained through local blood donation services or hematology departments. Alternatively, one could use the PSI 20% Pentastarch solution (Preservation Solutions, PST001) diluted 1:1 with 0.9% NaCl.
Mr. Frosty freezing container ThermoFisher Scientific 5100-0001 Improves viability when freezing L-MSCs overnight at -80 °C

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Stem Cell Biology Ausgabe 108 mesenchymale Stromazellen Gewebe ansässig Stamm- / Vorläuferzellen Lunge Ratte regenerative Medizin Magnetic-Bead-Auswahl
Isolierung von CD146<sup&gt; +</sup&gt; Resident Lung mesenchymalen Stromazellen aus Rattenlungen
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Collins, J. J. P., Möbius, M.… More

Collins, J. J. P., Möbius, M. A., Thébaud, B. Isolation of CD146+ Resident Lung Mesenchymal Stromal Cells from Rat Lungs. J. Vis. Exp. (112), e53782, doi:10.3791/53782 (2016).

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