Abstract
La coltura neuroni dell'ippocampo primari in vitro facilita interrogatori meccanicistica di molti aspetti dello sviluppo neuronale. Dissociati neuroni dell'ippocampo embrionali possono spesso crescere con successo su vetrini ad alta densità in condizioni di libero-siero, ma le culture a bassa densità in genere richiedono una fornitura di fattori trofici da loro co-coltura con uno strato alimentatore glia, preparazione che può richiedere molto tempo e laborioso. Inoltre, la presenza di cellule gliali può confondere l'interpretazione dei risultati e degli studi ostino sui meccanismi specifici neuroni. Qui, un metodo semplificato è presentato per ultra-bassa densità (~ 2.000 neuroni / cm 2), a lungo termine (> 3 mesi) cultura neurone dell'ippocampo primaria che è in condizioni di libero siero e senza supporto di cellule gliali. neuroni a bassa densità sono coltivate su vetrini rivestiti di poli-D-lisina, e capovolte sui neuroni ad alta densità coltivate in una piastra da 24 pozzetti. Invece di utilizzare punti paraffina per creare uno spazio between i due strati neuronali, gli sperimentatori possono semplicemente incidere il fondo in plastica del pozzo, in cui i neuroni alta densità risiedono, per creare un microspazio favorevole alla crescita neurone bassa densità. Il co-coltura può essere facilmente mantenuta per> 3 mesi senza significativa perdita di neuroni bassa densità, facilitando così lo studio morfologico e fisiologico di questi neuroni. Per illustrare questa condizione culturale di successo, i dati vengono forniti per mostrare la formazione di sinapsi profusa nelle celle a bassa densità dopo la cultura prolungato. Questo sistema di co-coltura facilita anche la sopravvivenza dei neuroni individuali sparse coltivate in isole di substrati poli-D-lisina e quindi la formazione di connessioni autaptic.
Introduction
Crescita neuroni ippocampali in condizioni in vitro consente osservazione e manipolazione sperimentale di questi neuroni che altrimenti non sarebbero possibili in vivo. Questo approccio sperimentale è ampiamente usato per rivelare i meccanismi neuronali della crescita, della polarità, le specifiche dei neuriti, il traffico e localizzazione subcellulare delle proteine, formazione di sinapsi e la maturazione funzionale 1. Questi in vitro in coltura neuroni dell'ippocampo, quando raccolto dalle fasi tardo embrionali, sono relativamente puro (> 90%), le cellule glutamatergiche della morfologia piramidale 2. Poiché i neuroni sono stati coltivati in una superficie 2-D in condizioni in vitro, questo metodo permette una facile osservazione, come ad esempio l'imaging dal vivo o immunocitochimica (ICC) colorazione attraverso un unico piano focale 3; o manipolazioni, come ad esempio il trattamento farmacologico e trasfezioni 3-6. Quando coltivate ad alta densità, i neuroni tendono ad avere alti tassi di sopravvivenza a causa di una maggiore cooperazionencentrations di fattori di crescita secreti in aggiunta al supporto alimentare da parte dei media di crescita, e anche a causa di neuriti meccanismi di contatto-dipendente 7. Tuttavia, a bassa densità neuroni dell'ippocampo sono desiderabili per gli studi morfologici, in cui un singolo neurone può essere ripreso nella sua interezza o tinto per l'analisi ICC. I neuroni a bassa densità sono difficili da mantenere in cultura a causa della mancanza di sostegno paracrino e quindi spesso richiedono il supporto trofico da un gliale (tipicamente corticale astrociti) feeder layer, che deve essere preparato prima la cultura neurone 2. Quando co-coltura con uno strato alimentatore cellule gliali, neuroni bassa densità sono coltivate su vetrini e quindi capovolto sopra dello strato glia in modo che i neuroni e glia bassa densità di fronte all'altra. Un piccolo spazio chiuso tra glia e neuroni viene creato inserendo punti paraffina sugli angoli dei vetrini, creando così un 'sandwich' di layout 2,8,9. I neuroni a bassa densità cresceranno well'ambito lo spazio confinato tra glia e il vetrino, che crea un microambiente permissivo con fattori concentrati secreti dai neuroni e glia. Questo approccio produce a bassa densità, i neuroni completamente sviluppati che sono distanziati ragionevolmente a parte, quindi, facilitando l'etichettatura ICC o studi di imaging dal vivo.
Un inconveniente apparente di neuroni-glia co-coltura, oltre ad essere in termini di tempo e laborioso, è che impedisce lo studio di specifici neuroni, o cellule autonome, meccanismi. Anche se questo sistema è molto meno complessa di in vivo tessuto neurale, impatto glia sullo sviluppo neuronale attraverso secrete, fattori non ancora completamente definiti possono confondere gli esperimenti 10. Pertanto, in esperimenti che richiedono l'indagine dei meccanismi specifici di neuroni, condizioni di coltura definite che rimuovono siero e strato di supporto gliali sono necessari. Un precedente studio è riuscito a coltura basse concentrazioni di neuroni (~ 9.000 cellule / cm 2) utilizzando un esimoree matrice idrogel dimensionale 11. Dal momento che una popolazione neuronale relativamente pura può essere coltivato ad alta densità in condizioni di libero siero senza supporto gliali, ipotizziamo che ultra-bassa densità di neuroni dell'ippocampo può essere coltivata nel siero libera definito terreno di coltura da loro co-coltura con i neuroni ad alta densità, in un modo che è analogo al neurone-glia co-coltura convenzionale adottato. In effetti, ad alta densità di ippocampo culture di neuroni in una configurazione a 'sandwich' sono stati recentemente utilizzati per sostenere un piccolo numero di neuroni endocrini magnocellulari specializzati 12.
Pertanto, la co-coltura con neuroni alta densità possono consentire neuroni bassa densità di ricevere trofico supporto fattori che è sufficiente a consentire la sopravvivenza a lungo termine. Questo protocollo di neuroni ultra-bassa densità di coltura è stata quindi formulata e convalidato. Il protocollo può essere implementato all'interno di un singolo esperimento, preparando ad alta densità (~ 250.000 cellule / ml) DISciato neuroni dell'ippocampo, e poi facendo una diluizione per produrre una densità di ~ 10.000 neuroni / mL (~ 3.000 neuroni / vetrino, o ~ 2.000 neuroni / cm 2), che è molto più basso rispetto alla maggior parte riferito culture a bassa densità 2,3,9 , 11,13. Questa condizione cultura è genericamente indicato come la cultura 'ultra-bassa densita' e utilizzato con 'bassa densità' inter-changeably. I neuroni ad alta densità sono placcati in poli-D-lisina rivestite piastre da 24 pozzetti; mentre i neuroni a bassa densità vengono seminate su vetrini da 12 mm rivestite poli-D-lisina che vengono inseriti all'interno di un altro 24-pozzetti. I vetrini con aderendo neuroni a bassa densità sono capovolte sulla parte superiore dei neuroni ad alta densità di 2 ore più tardi, dopo i neuroni sono discesi e attaccati alle lamelle. Inoltre, invece di utilizzare punti paraffina per elevare i coprioggetti sopra lo strato neurone alta densità, un ago di siringa 18 G è stato usato per incidere il fondo delle piastre da 24 pozzetti con due strisce parallele. La risultante displACED, adiacenti plastiche forniscono un supporto elevato per i coprioggetti di vetro. Questo spazio è costantemente misurato a 150-200 micron, che permette lo scambio di ossigeno e terreno di coltura sufficiente mentre fornisce un microambiente con fattori trofici concentrati. In questa condizione, i neuroni a bassa densità crescere molto, e possono sopravvivere oltre tre mesi in coltura. Quando questi neuroni sono trasfettate con GFP plasmide dopo tre settimane di cultura, i dendriti sono abbondantemente costellate di spine dendritiche. Come prova di principio, i dati vengono presentati per dimostrare che questo sistema di co-coltura supporta culture ultra-bassa densità di neuroni dell'ippocampo seminate su poli-D-lisina 'micro-isole', in cui i neuroni si formano le connessioni autaptic che possono facilitare indagini di cellula , meccanismi indipendenti dalla rete -autonomous.
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Protocol
Tutte le procedure sperimentali di topi sono stati approvati dal Comitato Cura e uso istituzionale degli animali della University of Arizona, e conformi alle linee guida NIH.
1. Tissue sorgente per ippocampale Neuron Cultura
- Per generare cuccioli di topo prenatali per la cultura neuroni dell'ippocampo, usare i topi tempo in stato di gravidanza (C57Bl6 / J) che vengono allevati in casa 17. La giornata con rilevazione spina vaginale è designato come E0.5. Il tempo del raccolto previsto per la cultura è E16.5-E17.5.
Nota: Questo protocollo descrive le culture di due piastre da 24 pozzetti di due neuroni ad alta densità co-coltura di neuroni con bassa densità (48 lamelle in totale). Per altri piatti, materiali e reagenti può essere scalata di conseguenza.
2. piastre da 24 pozzetti di preparazione per alta densità Neuron Culture
Nota: eseguire le seguenti operazioni (2-3) il giorno prima del raccolto previsto di embrioni.
- Portare due 24 benepiastre nella cappa di coltura cellulare, aprire la confezione singola.
- Collegare un ago 18 G siringa per una siringa monouso 1 ml di plastica.
- Tenere la siringa, e puntare la punta dell'ago a ~ 1 mm a sinistra al centro del fondo del pozzo. Applicare moderata forza (~ 250 g) per incidere il fondo del pozzo (~ lunga 1 mm). Una scanalatura sarà formata e materie plastiche spostato formerà un supporto elevata sopra la superficie ben fondo piatto. Etch un'altra scanalatura parallela ~ 1 mm di lunghezza a ~ 1 mm a destra del centro del fondo in un modo simile.
- Ripetere questo passaggio per tutti i pozzi delle due piastre da 24 pozzetti. Le due piastre da 24 pozzetti utilizzati per la cultura alta densità sono ora pronti per il rivestimento con poli-D-lisina (vedi punto 3.8 qui di seguito).
3. Coprioggetto Preparazione per la bassa densità Neuron Culture
- Usare 12 mm di diametro # 1 di vetro rotondo.
- Mettere 50 vetrini all'interno di un diametro di 100 mm di plastica sterile capsula di Petri, e immergere coprioggettoin soluzione di etanolo 20 ml 70%. Posizionare questa capsula di Petri su una piattaforma rotante con moderata (70 rpm) velocità di rotazione per un'ora. Rimuovere etanolo al 70% e quindi sostituire con un nuovo lotto di 70% di etanolo. Ruotare e lavare per un'altra ora.
- Scartare soluzione di pulizia etanolo al 70%. Aggiungere acqua sterile (filtrata attraverso unità di filtro da 0,2 micron). Lavare i coprioggetti rigorosamente facendo ruotare la piastra di Petri a mano. Risciacquare tre volte, ogni volta sostituendo con acqua fresca sterile.
- Porre la capsula di Petri con vetrini all'interno di una cappa di coltura cellulare sterile con flusso laminare. Aspirare l'acqua di risciacquo attraverso la linea del vuoto, e aggiungere 10 ml di acqua sterile filtrata per immergere i vetrini. I vetrini devono essere sterili e la superficie dovrebbe essere abbastanza pulita per il rivestimento poli-D-lisina.
- Aprire due piastre da 24 pozzetti dal loro imballaggio specifico, e metterli nella cappa.
- Attiva la linea del vuoto nella cappa. Collegare un puntale 200 pl alla linea del vuoto, e utilizzare un SICsor per tagliare la punta per creare una maggiore apertura.
- Utilizzare un fine-tip # 5 pinzetta per prendere vetrini dalla capsula di Petri, uno alla volta, e utilizzare la linea del vuoto per asciugare completamente il vetrino. Poi posto un coprioggetto in ciascuno dei pozzetti della piastra da 24 pozzetti. I 50 coprioggetti puliti dovrebbe essere sufficiente per riempire ciascun pozzetto delle due piastre da 24 pozzetti.
- Diluire la soluzione madre poli-D-lisina (1 mg / ml) in soluzione di lavoro (0,1 mg / ml) con tampone borato (pH 8,5). Per i quattro piastre da 24 pozzetti (tra cui due piastre ad alta densità con fondo inciso), preparare 30 ml di soluzione di lavoro totale.
- Aggiungere 300 microlitri soluzione lavoro 0,1 mg / ml di poli-D-lisina ad ogni pozzetto con vetrino. Assicurarsi che i coprioggetti sono completamente immersi in soluzione. In caso contrario, utilizzare la punta # 5 pinzetta a premere verso il basso vetrini contro il fondo del pozzo, e usare la punta per guidare soluzione poli-D-lisina per coprire tutta la superficie delle lamelle. Ispezionare visivamente tutti i coprioggetti per fare sure senza aria era intrappolata tra la piastra e lamelle.
- Aggiungere 300 microlitri 0,1 mg / soluzione lavoro poli-D-lisina ml in ciascun pozzetto della piastra di coltura ad alta densità con fondo inciso. Ruotare a mano per diffondere la soluzione per coprire l'intero fondo del pozzo.
- Restituire tutti i quattro piatti con poli-D-lisina per l'incubatore di cultura, e incubare O / N.
4. il lavaggio di piatti e di pre-condizionamento per la cultura
Nota: Le seguenti operazioni (4-9) vengono eseguite il giorno della raccolta del tessuto.
- Dopo l'incubazione / rivestimento di vetrini e piastre da 24 pozzetti O / N, portare tutti i quattro piastre (due con vetrini donatori, due piastre ad alta densità accettore con fondo in plastica inciso) nel cofano cultura. Utilizzare la linea del vuoto per rimuovere la soluzione di poli-D-lisina.
- Subito dopo la rimozione della soluzione di poli-D-lisina, aggiungere ~ 1 ml di acqua sterile a ciascun pozzetto usando una pipetta di plastica trasferimento. Dopo che tutti i pozzetti vengono riempiticon acqua, lasciare riposare per 10 minuti. Rimuovere l'acqua sotto vuoto, quindi aggiungere 300 microlitri medio lavaggio in ogni pozzetto per coprire il fondo del pozzo (con o senza vetrino). Non lasciate che il rivestimento poli-D-lisina asciugare.
- Rientro tutte e quattro le piastre per l'incubatore delle cellule. Le piastre sono pronte per l'uso una volta che i neuroni dell'ippocampo dispersi sono preparati.
5. Preparazione di Complete terreno di coltura, e tripsina soluzione per digestione enzimatica
- Preparare 60 ml di mezzo di coltura completo mescolando gli ingredienti (vedi Materiali). Utilizzare una siringa da 50 ml collegata con un filtro dimensioni della siringa 0,2 micron-pori, filtrare il mezzo di coltura completo in due provette da 50 ml coniche. Ogni tubo contiene 30 ml di terreno di coltura completo.
- In un tubo da 50 ml a parte, aggiungere ~ 30 ml di lavaggio medio (vedi Materiali) e riscaldarlo fino a 37 ° C. Questo verrà utilizzato per lavare il tessuto dopo digestione enzimatica.
- Preparare il mezzo di digestione enzimatica. In un 15 ml tubo conico, aggiungere 4,5 ml di mezzo di lavaggio e la soluzione di tripsina 0,5 ml 2,5%, e 50 ml 100X DNasi I.
- Posizionare il mezzo di coltura completo, media Lavare e enzima media digestione in un bagno d'acqua a 37 ° C.
6. Preparazione di strumenti chirurgici
- Sterilizzare tutti gli strumenti chirurgici in un sacchetto di sterilizzazione: due piccole forbici, un paio di pinze e due # 5 pinzette.
7. La rimozione dei cervelli da E16.5-E17.5 embrioni di topo, e la dissezione di Hippocampi
- Preparare due 10 cm petri piatti pieni di soluzione ghiacciata di Hank sterile salina bilanciata (HBSS).
- Euthanize diga mouse con un'iniezione intraperitoneale di fenobarbital sodio (100 mg / kg in un volume di ~ 0,5 ml). Dopo l'iniezione, una volta che la diga perde risposta a pizzico punta, sacrificare con dislocazione cervicale.
- Spruzzare zona addominale della diga con il 70% di etanolo, e fare una incisione lungo 2 cm lungo la linea mediana dell'addome per esporrel'utero.
- Rimuovere gli embrioni e posizionare quelli individuali in 10 cm di diametro petri piatto con dissezione a freddo tampone HBSS.
- Tenere l'embrione per il collo con una pinza, e utilizzare una piccola forbice per fare la prima a destra taglio sulla linea mediana al di sotto del livello del cervelletto e la sezione attraverso il tessuto cerebrale. Non decapitare il dell'embrione.
- Inserire la punta lato destro della piccola forbice da regione caudale che è tagliato aperto, tutto il percorso attraverso la parte rostrale del cervello embrionale (non farlo linea mediana croce), e fare un taglio sul lato sinistro a livello della base cranica.
- Inserire di nuovo la punta forbice lato sinistro per fare un taglio sul lato destro. Lascia una stretta fascia di ossa del cranio non tagliato e tessuto cutaneo alla fine rostrale, in modo che l'intero cervello può essere capovolto da parte per una facile estrazione.
- Utilizzare la punta di forbice per scavare il cervello embrionale nella soluzione HBSS. Controllare il cervello sotto un microscopio da dissezione. Il cervello deve essere intatto, senza lordo cut-oregioni ff.
- Ripetere questi passaggi per raccogliere tutti i cervelli embrione.
- Raccogliere tutti i cervelli intatti in un nuovo piatto di Petri contenente 20 ml di tampone HBSS freddo. Porre la capsula di Petri al microscopio dissezione.
- Visualizza il cervello dal lato ventrale. Tenendo premuto il cervello con una pinza alla fine caudale, inserire un brusco # 5 pinzetta diagonale per fare un taglio tra il punto rostrale centrale e la regione caudale-temporale. Ripetere questa operazione per l'altro emisfero. Dopo il taglio, separati due emisferi con ippocampo intatta dal resto dei tessuti del tronco cerebrale.
- Ripetere questo per ciascuno dei cervelli.
- Piscina tutto gli emisferi sezionati, e rimuovere le meningi con due paia di pinzette # 5.
- Identificare l'ippocampo sviluppare una struttura curva piegata all'interno del lobo temporale. Alternate le due coppie di pinze per separare l'ippocampo dalla adiacente tessuti corticali. Raccogliere e piscina tutto dell'ippocampotessuto pi (vedi Figura 1).
8. digestione enzimatica, separato in singoli neuroni
- Usando una pipetta di trasferimento di plastica, trasferire tutto il ippocampi sezionato nella soluzione digestione enzimatica contenente 5 ml di mezzo Lavare con 0,25% tripsina + 1X DNasi I in un tubo da 15 ml.
- Mettere la provetta in un bagno di acqua e incubare a 37 ° C per 25 min, con intermittente invertente dolce del tubo una volta ogni 5 min.
- Dopo 25 minuti, rimuovere con attenzione la soluzione enzimatica utilizzando una mano tesa pipetta di plastica per aspirazione. Aggiungere mezzo caldo Lavare a 10 ml e lavare delicatamente il tessuto lentamente invertendo il tubo di 5 volte. Rimuovere il supporto di lavaggio, e aggiungere di nuovo 10 ml di mezzo di lavaggio per un lavaggio supplementare.
- Rimuovere il supporto di lavaggio, e aggiungere 3 ml di mezzo fresco caldo Lavare nuovamente. Agitare il tubo a mano rigorosamente per 15 volte per rimuovere i neuroni digeriti dal tessuto. Il mezzo dovrebbe diventare torbida volta che le cellule di unri separato dal tessuto nel mezzo di lavaggio. Raccogliere la sospensione cellulare in un nuovo tubo 15 ml conica, lasciando il tessuto rimanente nel tubo.
- Aggiungere un altro mezzo 2 ml di lavaggio al tessuto, e separare delicatamente il tessuto rimanente triturando con una pipetta di plastica per ~ 15 volte. Lasciate riposare per 5 minuti. PISCINA La sospensione cellulare nel nuovo tubo da 15 ml conica che contiene raccolte le cellule 'Shake-off'.
- Contare la densità di neuroni con un emocitometro. Tipicamente, 3.000-5.000 cellule per microlitro possono essere ottenuti a seconda del numero di embrioni sezionati. Un numero medio di 2,5 x 10 7 neuroni sono stimati se ipotizzando sei embrioni vengono sezionati.
- Calcolare il volume necessario di questa sospensione cellulare per produrre una densità di 250.000 neuroni / ml quando aggiunti al mezzo di coltura completo 30 ml. Aggiungere questo volume ad uno dei due tubi conici contenenti 30 ml di mezzo di coltura completo per fornire il mezzo neurone placcatura di alta densità. <li> Trasferimento 1,2 ml di questa soluzione neurone ad alta densità per altri 30 ml di mezzo di coltura completo per ottenere una concentrazione di ~ 10.000 neuroni / ml. Utilizzare questa diluizione per seminare i coprioggetti a bassa densità.
9. placcatura di neuroni e lungo termine Co-cultura
- Portare le due piastre da 24 pozzetti con fondo inciso per neuroni alta densità nella cappa di coltura cellulare. Rimuovere il supporto di 300 microlitri precondizione per il vuoto. Piastra 0,6 ml sospensioni di cellule ad alta densità a 250.000 neuroni / ml.
- Portare le altre due piastre da 24 pozzetti con vetrini nella cappa della cultura, e rimuovere il supporto di 300 microlitri precondizione per il vuoto. Piastra 0,6 ml sospensioni cellulari a bassa densità a 10.000 neuroni / ml sui vetrini all'interno delle due piastre da 24 pozzetti.
- Rientro tutte e quattro le piastre da 24 pozzetti per l'incubatore. Lasciate riposare per 2 ore.
- Capovolgere i coprioggetti a bassa densità con aderendo neuroni alla cultura alta densità. Assicurarsi che i neuroni sono una di fronte all'altra (ad esempio, nOt separati dal vetrino di vetro). Per poi tornare le due piastre con co-coltura per l'incubatore.
10. Co-cultura Sustaining
- Feed co-colture aggiungendo 300 pl medio Flux fresco (vedi Materiali) al giorno in vitro (DIV) 5. Non vi è alcuna necessità di rimuovere il 50% delle medie originale di coltura completo, come riportato da molti altri studi. Il mezzo di alimentazione contiene inoltre 15 pM citosina arabinoside (Ara-C, per ottenere una concentrazione finale di 5 mM) per minimizzare la possibilità di contaminazione glia e la proliferazione.
- A seguito di questa alimentazione iniziale, aggiungere 300 ml di media carica fresca senza Ara-C per il bene ogni settimana. Se la coltura è mantenuta per più di un mese, sostituire la metà del mezzo con il mezzo Flux fresco ogni settimana oltre un punto volta al mese (con la prima metà di sostituzione medio a DIV33). Morfologicamente, sia ad alta densità e bassa densità di neuroni aspetto sano fino a tre mesi (il più lungo tempo osservato dalla experimenters).
11. Illustrazione di un Sperimentale Manipolazione a bassa densità Neuron Trasfezione
Nota: Quando transfezione in neuroni bassa densità è desiderato, un semplice protocollo di fosfato di calcio può essere adottato. Abbiamo scoperto che le culture a bassa densità hanno una migliore efficienza di trasfezione con protocollo fosfato di calcio prima DIV12, ma possono essere transfettate con molto più bassa efficienza a DIV21 o più, durante i quali spine dendritiche sono prominenti. La fattibilità di trasfezione della coltura neurone bassa densità è illustrato dalla trasfezione neuroni con un plasmide pEGFP-C3 (vedi sotto).
- A DIV21, togliere 600 ml mezzo condizionato da ciascun pozzetto della co-coltura, e trasferirlo ad un nuovo 24-pozzetti. Quindi aggiungere 600 ml mezzo fresco di avanzamento per la co-coltura per riportarlo al volume originale.
- Trasferire i vetrini nel nuovo 24-pozzetti con 600 microlitri mezzo condizionato. Assicurarsi che laneuroni a bassa densità sono rivolti verso l'alto. Posizionare le piastre ad alta densità ei nuovi piatti con lamelle posteriori nell'incubatrice.
- Preparare due provette da 1,5 ml sterili. In un tubo, aggiungere 600 ml 2X tamponata con HEPES soluzione salina (HBS). Calcolare il volume di 12 mcg pEGFP-C3 DNA basato sulla concentrazione plasmide. In l'altro tubo, aggiungere 74 ml CaCl 2 (2 m stock) e il volume di acqua che dopo l'aggiunta plasmide farà 600 microlitri. Mescolare bene pipettando e quindi aggiungere DNA plasmidico. Lentamente mescolare bene. Lasciate che entrambi i tubi riposare per 5 minuti a temperatura ambiente.
- Mentre mano che tiene il tubo 2X HBS e moderatamente agitando la soluzione su un mixer, aggiungere tutti i 600 microlitri della soluzione goccia DNA-CaCl 2 goccia a 600 microlitri tubo 2X HBS. È fondamentale che il precipitato formatosi è in forma di granuli 'sabbia fine. Mescolando troppo forte e troppo in fretta non è auspicabile, dal momento che sarà più probabile produrre grandi 'precipitati flake'-come la neve, which ha notevolmente più bassa efficienza di trasfezione in base alle nostre osservazioni.
- Sia il precipitato continuano a formarsi al buio a temperatura ambiente per 30 min.
- Aggiungere 100 microlitri precipitato a ciascun pozzetto contenente neurone bassa densità sulle coprioggetto, goccia a goccia ed uniformemente. Riportare la piastra per incubatore e incubare per 2 ore. Supponendo che la maggior parte del CaCl 2 è in forma libera, questo si traduce in una concentrazione di ~ 17,6 mM Ca 2+, che può essere tossico per i neuroni seguenti incubazione prolungata.
- Preparare una provetta da 50 ml con il mezzo ~ 50 ml di lavaggio, scaldare a 37 ° C.
- Alla fine di 2 h, portare il neurone bassa densità con fosfato di DNA-calcio precipitati nella cappa. Pick up ogni singolo vetrino con un forte # 5 pinzetta, e immergerlo tre volte nel medio Wash 50 ml di lavarlo brevemente. Poi restituirlo ai neuroni ad alta densità nelle sue tavole originali co-coltura, con i neuroni a bassa densità rivolto verso il basso.
- Continuare fino a quando la culturai neuroni cultura bassa densità su vetrini sono raccolte per gli studi.
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Representative Results
Il protocollo qui descritto consente successo densità ultra-bassa, coltura a lungo termine di neuroni glutamatergici puri senza la necessità di cellule gliali che servono come strato alimentatore. Il protocollo è diagramed in Figura 1, che prevede la preparazione di alta densità (su poli-D-lisina rivestite 24 pozzetti) e neuroni bassa densità (su poli-D-lisina vetrini rivestiti) separatamente, e successiva co-coltura che possono essere mantenuta fino a tre mesi.
Le figure 2A e 2B sono illustrazioni dei neuroni alta densità e bassa densità a 5 giorni dopo la placcatura. cultura bassa densità è di circa 30 volte meno della densità. Entrambi i neuroni sottoposti a fasi tipiche di sviluppo come indicato dalla Kaech e Banker (2006). Al giorno 14, sia ad alta densità e bassa densità di neuroni mostrano strutture dendritiche elaborate, come rivelato dalle immagini DIC (figure 2C,D, nota entrambi i pannelli sono dallo stesso campo con differenti piani focali, come mostrato dalla posizione etch). Quando questi neuroni sono macchiati con l'anticorpo MAP2 per rivelare i dendriti, differenze significative nel numero di dendriti (t 13 = 1,27, p> 0,05; si calcola dal numero dendritiche punta) e la lunghezza dendritiche totale (t 16 = 1,41, p> 0.05 ) per neurone tra l'alta densità e bassa densità di neuroni si trovano (Figura 2E, F).
etichettatura Immunocitochimica viene utilizzato per rivelare sinapsi glutammatergica funzionali. Usiamo doppia colorazione per etichettare il recettore NMDA subunità NR1 e la subunità del recettore AMPA GluR1 (figura 3A), e sinapsi funzionali (puncta co-localizzate in giallo) può essere facilmente identificato e quantificato utilizzando ImageJ. neuroni bassa densità sono anche etichettati con anticorpi contro dendritiche MAP2 proteina marker,in combinazione con proteina marker assonale p-Tau. Questa doppia etichettatura permette chiara distinzione dei dendriti e degli assoni (figura 3b). Culture a bassa densità possono anche essere transfettate con successo con i plasmidi di DNA utilizzando metodi di fosfato di calcio, anche se il tasso di trasfezione è in genere molto bassa nelle fasi successive (<0,2% neuroni quando trasfettate a DIV21). La figura 3C mostra che EGFP trasfezione può rivelare la morfologia neuronale, e render belle strutture dendritiche visibile della colonna vertebrale. Infine, come una prova di concetto, i neuroni ultra-bassa densità possono essere coltivate in condizioni che favoriscono la formazione di autapse (Figura 3D). Questi ultra-bassa densità neuroni autaptic coltivati in poli-D-lisina rivestite 'micro-isole' possono essere sostenuti dal alimentatore neurone ad alta densità per oltre 2 mesi con questo protocollo co-coltura.
<strong> Figura 1. Illustrazione schematica del protocollo ad alta densità e basso co-coltura densità. (A) del mouse E16.5-E17.5 cervello embrionali sono raccolti, ippocampi sono sezionati fuori e digeriti con tripsina. (B) ippocampi digerito vengono lavati, separati in singoli neuroni, e placcato ad alta densità (250.000 cellule / ml) a 24 pozzetti; nel frattempo, bassa densità (10.000 cellule / ml) neuroni sono placcati su vetrini. I pozzi per la cultura alta densità sono incise con un ago da siringa 18 g di fornire un sostegno elevato per i coprioggetti. (C) Illustrazione del co-coltura. Fai clic qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 2. Sia alta densità e bassa densità neuroni hanno comparable sviluppo morfologico in co-coltura. (A, B) microfotografie mostrano densità di placcatura sia ad alta densità e lo strato a bassa densità. Immagini (C, D) DIC mostrano ampia la crescita dei neuriti sia in alto (C) e bassa densità (D) i neuroni. I neuroni a bassa densità su vetrino si riposano proprio sopra i neuroni ad alta densità. Nota la posizione del supporto plastico in rilievo. L'etichettatura (E) Immunocytochemistry di MAP2 proteine dendritiche. (F) Quantificazione (media ± SEM) di lunghezza dendritiche totale e il numero punta dendritiche per neurone. Nessuna differenza significativa (ns) è stata osservata tra i neuroni ad alta densità e bassa densità coltivate in co-coltura. Barra della scala a (B, D), 100 micron. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.
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Figura 3. manipolazioni sperimentali di neuroni a bassa densità coltivate in co-coltura. (A) etichettatura Immunocitochimica nella cultura bassa densità consente l'identificazione di sinapsi funzionale definito dalla co-etichettatura dei GluR1 (verde) e NR1 (rosso). (B) Co-etichettatura dei neuroni dendritiche proteine MAP2 (magenta) e proteine assonale p-Tau (verde). (C) A bassa densità dei neuroni dell'ippocampo transfettate con pEGFP-C3 plasmide, mostrando spine dendritiche abbondanti. (D) Un neurone bassa densità preparate su poli-D-lisina 'micro-island', e cresciuto sopra i neuroni ad alta densità. Un elettrodo di patch registrazione riempie il neurone con Alexa-555 hydrazide per rivelare la morfologia del neurone. barra della scala in AD, 20 micron.7fig3large.jpg "target =" _ blank "> Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.
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Discussion
Vi presentiamo un protocollo dettagliato per la cultura a lungo termine di ultra-bassa densità di neuroni dell'ippocampo glutamatergici in condizioni di libero siero. A ~ 2000 neuroni / cm 2, la densità è almeno due volte inferiore rispetto maggior parte dei preparati 'basse densita' di cultura, con o senza il supporto glia riportato dalla letteratura esistente 2,3,11,13,14. Oltre ad essere ultra-bassa densità, questo protocollo è nuovo e significativo altri due modi. In primo luogo, non è necessario alcun alimentatore strato glia come i neuroni a bassa densità ottenere supporto fattore trofico dai neuroni ad alta densità che si trovano nelle immediate vicinanze fisico, anche se non ci sono connessioni sinaptiche o il contatto diretto tra i neuroni coltivati in diverse densità. Questo protocollo elimina la necessità di preparare glia monostrato prima degli esperimenti di coltura previste, e consente sia alta densità e bassa densità culture di crescere simultaneamente. Preparazione del monostrato glia può richiedere molto tempo e lletteratura aborious, e la maggior parte utilizza neonatale dei ratti cortecce 2. Pertanto, per i laboratori che lavorano solo con i topi, questo richiede notevoli sforzi supplementari. Ancora più importante, in esperimenti in cui vengono studiati meccanismi specifici neuronali, la presenza della glia nella co-coltura può essere indesiderabile, perché impedisce attribuendo osservati effetti specificamente ai neuroni, glia o l'interazione tra i due tipi di cellule 10. Inoltre, per la cultura glia, supplemento di siero è obbligatoria 2,15, e questo può contaminare la co-coltura glia-neuroni e di introdurre ulteriori fattori confondenti. Una caratteristica importante del nostro protocollo è che la co-coltura è in condizioni medie definite. Usiamo rigorosamente il mezzo completo di coltura senza supplemento di siero, e scoprire che se il programma di mezzo di scambio culturale è strettamente seguita, la co-coltura può essere sostenuta oltre i tre mesi, che dovrebbe soddisfare la maggior parte degli esperimenti. Poiché non vi è praticamente alcunpresenza glia, una limitazione di questa tecnica è che si deve usare cautela quando si confrontano con i risultati della letteratura che usano co-culture glia-neuroni.
Un altro aspetto innovativo di questo protocollo è che si usa un metodo semplice per creare un efficace micro-spazio tra i neuroni alta densità coltivate sul fondo della piastra a 24 pozzetti, e il neurone bassa densità aderito ai vetrini seduta proprio sopra. Studi precedenti utilizza punti di paraffina applicati ai vetrini rivestiti di aumentare i vetrini a ~ 500 micron al di sopra dello strato di alimentatore glia 2,8,9. Preparazione di punti di paraffina richiede la giusta dimensione e la temperatura giusta, che richiede una quantità ragionevole di sforzi e pratica. In confronto, un semplice attacco sulle plastiche dei pozzetti con un ago G 18 fornisce supporto per i coprioggetti e buona separazione tra i due strati di neuroni. Abbiamo utilizzato un impianto di patch clamp con Z tester digitale per determinare la linspazio dell'orecchio tra i due strati di neuroni concentrandosi sul alta densità e quindi sugli strati a bassa densità utilizzando un obiettivo 60X immersione in acqua, e ha scoperto che lo spazio è tipicamente 150-200 micron (179,4 +/- 25,3 micron, n = 5 ). Questo spazio ristretto (rispetto a quello generato da punti di cera) è probabile che si traducono in un aumento più rapido e più alta concentrazione di fattori neurotrofici, fornendo quindi un sostegno sufficiente per il neurone bassa densità di crescere. Anche se questo spazio ristretto può sollevare le questioni circa il tasso di cambio medio della cultura e che la parte più piccola impedisce neuroni da ottenere ossigeno e supporto nutrizionale, i nostri risultati mostrano che questo non è probabilmente una preoccupazione. Al contrario, abbiamo scoperto che i neuroni ad alta densità sotto i coprioggetti anche crescere meglio (tasso di sopravvivenza più alto, più elaborata albero dendritiche e più puncta sinaptica da NR1 colorazione, dati non riportati) rispetto ai neuroni ad alta densità della stessa preparazione, ma senza il COV sovrapponendoerslips. Pertanto, questa semplice protocollo non è solo veloce, semplice, ma anche molto efficace nel sostenere sia ad alta densità e bassa densità neuroni.
Coltura neuroni ippocampali in vitro richiede rivestimento di substrati di promotori della crescita, come poli-D-lisina e / o laminina / collagene 5,16. Sebbene meticolosa selezione e preparazione dei vetrini sono fondamentali per un efficace sopravvivenza neuronale, abbiamo trovato che con il vetro di copertura abbiamo selezionato, un accurato lavaggio con etanolo al 70% è sufficiente, vanificando in tal modo la necessità di un trattamento più duro (ad esempio, bollitura in acidi) delle lamelle. Dopo i coprioggetti sono puliti in etanolo ed essiccato sotto vuoto, il vetro sembra essere idrofobiche causa del rivestimento originale. Tuttavia, il rivestimento di successo di 0,1 mg / ml di poli-D-lisina in tampone borato dovrebbe rendere idrofila superficie di vetro, in modo che quando i coprioggetti vengono prelevati dall'acqua di lavaggio, uno strato uniforme di acqua che è uniformementela diffusione su tutta la superficie del vetro può essere osservato. Abbiamo trovato che questo è di fondamentale importanza. In caso contrario, i neuroni saranno molto probabilmente morirà dopo la placcatura grazie al rivestimento insufficiente. Anche se solo bassa densità neuroni ippocampali sono testati in questo protocollo, si prevede che altri tipi di neuroni (ad esempio, i neuroni corticali, neuroni granulari cerebellari, o popolazioni neuronali specializzati) possono inoltre essere sostenute a bassa densità in presenza di un alimentatore neurone alta densità strato. Infine, quando questo semplice protocollo è seguito, ci si può aspettare di raccogliere neuroni sani densità ultra-bassi. Applicazioni di massima per le quali l'etichettatura immunocitochimica, l'imaging dal vivo, studi morfologici e la registrazione elettrofisiologia possono essere condotte su questi neuroni seguenti procedure standard 16,17.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Neurobasal medium | Life Technologies | 21103-049 | Protect from light |
| B27 supplement | Life Technologies | 17504-044 | aliquot, store in 0.6ml size |
| GlutaMAX-I | Life Technologies | 35050-061 | dilute 100X |
| antibiotic-antimycotic (AA) | Life Technologies | 15240-096 | dilute 100X |
| Complete Culture medium | Neurobasal medium with 1X B27, 1X AA, 1X GlutaMAX-I | ||
| Wash medium | same as 'Neurobasal medium' | ||
| Feed medium | Neurobasal with 1X B27 supplement | ||
| DNAse I | Sigma-Aldrich | D5025 | prepare 100X stock at 0.6mg/ml |
| poly-D-lysine | Sigma-Aldrich | P6407 | M.W. 70000-150000 |
| borate buffer | Sigma-Aldrich | B6768 (boric acid); 71997(borax) | 1.24g boric acid & 1.9g borax in 400ml H2O, pH to 8.5 use HCl |
| 12-mm round glass coverslips | Glasswarenfabrik Karl Hecht GmbH | 1001/12 | No. 1 glass, purchase from Carolina Biological Supply |
| proFection transfection kit | Promega | E1200 | see protocol for details |
| 2X HEPES buffered saline (HBS) | Promega | E1200 | see protocol for details |
| Syringe filter | Pall Corporation | 4192 | 0.2um pore size |
| Endofree plasmid prep kit | Qiagen | 12362 | for preparation of transfection grade plasmid DNA |
| anti-MAP2 antibody | Millipore | MAB3418 | mouse antibody, clone AP20 |
| anti-p-Tau antibody | Millipore | AB10417 | rabbit polyclonal antibody |
| anti-NR1 antibody | Millipore | MAB1586 | mouse antibody, clone R1JHL |
| anti-GluR1 antibody | Millipore | AB1504 | rabbit polyclonal antibody |
| Hank's balanced salt solution | ThermoFisher | 14025092 | 500ml size |
References
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