Abstract
in vitroで初代海馬神経細胞を培養し、神経発達の多くの側面の機構的な尋問を容易にします。解離胚の海馬ニューロンは、多くの場合、無血清条件下で高密度にカバーガラス上で正常に成長することができますが、低密度培養は、通常、グリアフィーダー層でそれらを共培養することにより、栄養因子の供給を必要とする、の準備には時間がかかることがあります骨の折れます。また、グリアの存在は、ニューロン特異的メカニズムに関する結果と排除して研究の解釈を混乱させることができます。ここでは、簡略化された方法は、無血清条件下およびグリア細胞のサポートなしで、超低密度（〜2000ニューロン/ cm 2）で、長期（> 3ヶ月）初代海馬神経細胞培養のために提示されています。低密度ニューロンをポリ-D-リシン被覆カバーガラス上で増殖させ、24ウェルプレート中で増殖させた高密度ニューロンに反転されます。代わりにbetweeスペースを作成するために、パラフィンドットを使用してのnは2ニューロン層、実験者は、単に低密度ニューロンの成長を助長する微小空間を作成するには、高密度のニューロンが存在する上、ウェルのプラスチック製の底をエッチングすることができます。共培養は、容易に、従って、これらのニューロンの形態学的および生理学的な研究を促進する、低密度ニューロンの有意な損失なし> 3ヶ月間維持することができます。この成功した培養条件を説明するために、データは、長期培養後の低密度細胞における多量のシナプス形成を示すために提供されます。この共培養系はまた、ポリ-D-リジン基質したがってautaptic接続の形成の島で増殖させたスパース個々のニューロンの生存を促進します。
Introduction
インビトロ条件下での海馬神経細胞を成長させることは、観察し、 生体内で他の方法では不可能な、これらのニューロンの実験的操作を可能にします。この実験的なアプローチは、広く成長、極性、神経突起の仕様、輸送およびタンパク質の細胞内局在、シナプス形成および機能的成熟1の神経メカニズムを明らかにするために使用されます。後期胚期から採取するとき、これらのインビトロ培養海馬ニューロンは、錐体の形態2の比較的純粋な（> 90％）グルタミン酸細胞です。ニューロンがインビトロ条件下で2-D表面で増殖させたため、この方法は、単一の焦点面3を介して染色ライブイメージングまたは免疫細胞化学（ICC）のように、容易に観察できます。または、そのような薬物治療やトランスフェクション3-6のような操作、。高い密度で増殖させた場合、ニューロンがあるため、より高い共同の生存率が高い傾向にあります増殖培地から栄養支持に加えて、またために、神経突起接触依存性機構7の分泌された成長因子のncentrations。しかし、低密度海馬ニューロンは、個々のニューロンは、その全体が撮像されたまたはICC分析のために染色することができる形態学的研究のために望ましいです。低密度ニューロンが原因パラクリンサポートの欠如に培養中で維持するのは難しいですので、多くの場合、前の神経細胞培養の2に用意する必要があるグリア（典型的には皮質アストロサイト）フィーダー層からの栄養サポートを必要とします。時共培養グリア細胞フィーダー層を有する、低密度ニューロンをカバーガラス上で増殖させ、かつ低密度ニューロンおよびグリアが互いに対向するように、その後グリア層の上に反転されます。グリア細胞と神経細胞の間に小さな限られた空間は、「サンドイッチ」レイアウト2,8,9を作成するため、カバースリップの隅にパラフィンワックスのドットを配置することによって作成されます。低密度ニューロンはワット成長しますニューロンとグリアによって分泌された濃厚な要因と寛容な微小環境を作成し、グリア細胞とカバーガラスの間の限られた空間を、ithin。このアプローチは、したがって、ICC標識やライブイメージング研究を促進する、合理的に離れている低密度、完全に発達神経細胞が得られます。
ニューロン - グリア共培養の見かけ上の欠点は、脇に時間がかかり、面倒であることから、それはニューロン特異的、または細胞自律的、機構の研究を防ぐことです。このシステムははるかに複雑なin vivoでの神経組織よりもですが、分泌され、未完全に定義された要素を介してニューロンの発生にグリアの影響は実験10を混乱することができます。したがって、ニューロン特異的なメカニズムの研究、血清およびグリア支持層が必要で除去定義培養条件を必要とする実験です。以前の研究では、目を使用して（〜9000細胞/ cm 2）のニューロンの低濃度を培養することに成功しましたREE次元ヒドロゲルマトリクス11。比較的純粋な神経細胞集団は、グリアサポートなしで無血清条件下で高密度に培養することができるので、我々は、海馬神経細胞の超低密度で、高密度ニューロンでそれらを共培養することによって、無血清規定された培養培地中で増殖させることができるという仮説を立て従来採用ニューロン - グリア共培養に類似した方法。実際、「サンドイッチ」構成で高密度海馬ニューロン培養物は、最近、特殊な大細胞内分泌ニューロン12の小さな数をサポートするために使用されています。
したがって、高密度の神経細胞との共培養は、低密度ニューロンが長期生存を可能にするのに十分である栄養因子のサポートを受けることを可能にします。超低密度ニューロンを培養するこのプロトコルは、このように配合し、検証しました。プロトコルは、高密度を調製することにより、単一の実験内で実施することができる（〜250,000細胞/ ml）をDISsociated海馬ニューロンは、最初に、その後密度〜万ニューロンを得るために希釈を行う/ mLの（〜3,000の神経細胞/カバースリップ、または〜2,000の神経細胞/ cm 2）で大部分が低密度培養物を報告したよりもはるかに低い、2,3,9 、11,13。この培養条件は緩く「超低密度」培養と呼ばれ、「低密度」相互交換可能で使用されています。高密度ニューロンをポリ-D-リジンコートした24ウェルプレート上にプレーティングされます。低密度ニューロンをポリ-D-リシン被覆した12mmのガラスカバースリップ上に播種され、一方、別の24ウェルプレートの内側に配置されます。ニューロンが下降し、カバーグラスに添付された後に低密度ニューロンを付着させるとカバーガラスを2時間後に高密度ニューロンの上に反転しています。また、代わりに高密度ニューロン層、上記カバーガラスを上昇させるためにパラフィンワックスのドットを使用する、18 Gの注射針は、二つの平行なストライプで24ウェルプレートの底部をエッチングするために使用しました。その結果displプラスチックはガラスカバースリップのための高められたサポートを提供する隣接、出し抜か。このスペースは、一貫して濃縮された栄養因子との微小環境を提供しながら、十分な酸素と培地交換を可能にする150〜200ミクロンで測定されます。この状態で、低密度ニューロンが広範囲に成長し、培養3ヶ月を超えて生き残ることができます。これらのニューロンは、培養3週間後にGFPプラスミドでトランスフェクトされる場合には、樹状突起は、やたらと樹状突起棘がちりばめられています。原理の証明として、データは、この共培養系は、神経細胞が細胞の調査を容易にすることができるautaptic接続を形成し、ポリ-D-リジン「マイクロアイランド '上に播種した海馬神経細胞の超低密度培養物をサポートすることを示すために提示されています-autonomous、ネットワークに依存しないメカニズム。
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Protocol
マウスを含むすべての実験手順は、アリゾナ大学の施設内動物管理使用委員会によって承認され、NIHガイドラインに準拠しました。
海馬ニューロン文化1.組織源
- 海馬神経細胞培養のための出生前仔マウスを生成するには、家17で飼育されている時間が妊娠マウス（のC57Bl6 / J）を使用します。膣プラグ検出で一日をE0.5と指定されています。文化の計画収穫時期は、E16.5-E17.5です。
注意：このプロトコルは、低密度ニューロンと共培養する二つの高濃度のニューロンの2つの24ウェルプレートの培養を記載（48カバーガラス合計）。以上のプレートのために、材料および試薬は、対応してスケーリングすることができます。
2. 24ウェルプレート高密度ニューロン培養物の準備
注：胚の計画収穫前日（2-3）は、次の手順を実行します。
- 2 24ウェルを持参細胞培養フードにプレートは、個々のパッケージを開きます。
- 1ミリリットルのプラスチック製の使い捨ての注射器に18 G注射針を接続します。
- 注射器を持ち、井戸の底の中央に左〜1ミリメートルで針の先端を目指しています。ウェル（〜1ミリメートルの長さ）の底部をエッチングするために適度な力（〜250グラム）を適用します。溝が形成され、変位プラスチック材料は、平底ウェル表面上高められた支持体を形成します。同様に底部中央の右側にある〜1ミリメートルで別〜1ミリメートルの長さの平行溝をエッチングします。
- 2つの24ウェルプレートのすべてのウェルにこの手順を繰り返します。高密度培養に使用される2つの24ウェルプレート（ステップ下記3.8参照）は、ポリ-D-リジンで被覆するための準備ができています。
低密度ニューロン培養物3.カバースリップの準備
- 12 mmの直径＃1ラウンドガラスを使用してください。
- 直径100mm滅菌プラスチックシャーレの内部50カバースリップを置き、カバースリップを沈めます20 mlの70％エタノール溶液です。時間の中程度（70回転）高速回転で回転プラットフォーム上でこのペトリ皿を置きます。 70％のエタノールを除去した後、70％エタノールの新鮮なバッチと交換してください。回転させ、さらに1時間洗浄します。
- 70％エタノール洗浄液を捨てます。 （0.2μmのフィルターユニットを通して濾過し）、滅菌水を追加します。手でシャーレを回転させることにより、厳密にカバースリップをすすぎます。 3回、新鮮な滅菌水で交換するたびにすすいでください。
- 層流無菌細胞培養フード内側カバースリップでペトリ皿を置きます。真空ラインを通ってすすぎ水を吸引し、カバースリップを浸すために滅菌濾過水を10ミリリットルを追加します。カバースリップは、無菌であるべきで、表面はポリ-D-リジンコーティングのために十分にきれいにする必要があります。
- 個々の梱包から2つの24ウェルプレートを開き、フード内に配置します。
- フード内の真空ラインをオンにします。真空ラインに200μlのピペットチップを接続し、SCISを使用SORは、より大きな開口部を作成するために、先端をカットします。
- シャーレ、一度に1からカバースリップをピックアップし、完全にカバーガラスを乾燥させるために真空ラインを使用するように先の細い＃5ピンセットを使用してください。その後、24ウェルプレートのウェルのそれぞれに1カバースリップを配置。 50洗浄カバーガラスを2つの24ウェルプレートのウェルのそれぞれを満たすのに十分であるべきです。
- ホウ酸塩緩衝液（pH 8.5）で希釈標準溶液（0.1 mg / mlで）にポリ-D-リシンストック溶液（1mg / ml）を希釈します。 （エッチングされた底部と2高密度プレートを含む）4 24ウェルプレートの場合は、総労働溶液30mlを準備します。
- カバーガラスで各ウェルに300μlの0.1 mg / mlでポリ-D-リジン作業溶液を加えます。カバースリップが完全に溶液に浸漬していることを確認します。ない場合は、ウェルの底に対してカバースリップを下に押すように＃5ピンセットチップを使用し、カバーグラスのすべての表面を覆うようにポリ-D-リジンソリューションを導くためにチップを使用しています。視覚のsuを作るために、すべてのカバースリップを点検無空気再プレートとカバースリップの間に閉じ込められました。
- 300μlの0.1ミリグラム/エッチングされた底面を有する高密度培養プレートの各ウェルにmlのポリ-D-リジン作業溶液を加えます。ウェルの底面全体をカバーするソリューションを広めるために手で回します。
- 培養インキュベーターにポリ-D-リジンとのすべての4枚のプレートを戻し、O / Nインキュベートします。
文化4.洗浄及びプレコンディショニングプレート
注：次の手順（4-9）は、組織の収穫の日に実施されます。
- カバースリップ、24ウェルプレートO / Nのインキュベーション/コーティングした後、培養フードの中にすべての4つのプレート（ドナーカバースリップを持つ2つの、エッチングされたプラスチック製の底部と2アクセプタ高密度プレート）を持参。ポリ-D-リジン溶液を除去するために真空ラインを使用してください。
- 直ちに各ウェルプラスチック製トランスファーピペットを使用すること約1 mlの滅菌水を加え、ポリ-D-リジン溶液の除去後。すべてのウェルが満たされた後水で、10分間放置しました。 （またはカバーガラスなし）ウェルの底をカバーするために、各ウェルに300μlの洗浄媒体を追加し、真空によって水を除去します。ポリ-D-リジンコーティングを乾燥させないでください。
- 細胞インキュベーターにすべての4枚のプレートを返します。プレートは、分散した海馬ニューロンが用意されると使用できるようになります。
酵素消化のための5の完全培養培地の調製、およびトリプシンソリューション
- （材料を参照してください）成分を混合することによって60ミリリットルを完全培地を準備します。 2 50mlコニカルチューブに完全培地をフィルタリングし、0.2μmの孔径のシリンジフィルターに接続された50ミリリットル注射器を使用してください。各チューブは30ミリリットル完全培地が含まれています。
- 独立した50ミリリットルの円錐管では、〜30ミリリットル洗浄媒体（材料を参照）、37°Cにそれをウォームアップに追加します。これは、酵素消化後の組織を洗浄するために使用されます。
- 酵素消化媒体を準備します。 15メートルでリットルのコニカルチューブに4.5 mlの洗浄培地0.5mlの2.5％トリプシン溶液、および50μlの100倍のDNase Iを追加します
- 完全培地、洗浄媒体を配置し、そして37℃の水浴中で消化培地酵素。
手術器具の6準備
- 二つの小さなはさみ、鉗子と2＃5ピンセット：滅菌袋内のすべての手術器具を滅菌します。
E16.5-E17.5マウス胚、および海馬の解剖から脳の7.取り外し
- 氷のように冷たい、滅菌ハンクス平衡塩溶液（HBSS）で充填された2つの10cmのペトリ皿を準備します。
- フェノバルビタールナトリウムの腹腔内注射（〜0.5ミリリットルの容量では100mg / kg）を持つマウスダムを安楽死させます。ダムは、つま先のピンチへの応答を失った後に注射した後、頚椎脱臼で犠牲に。
- 70％エタノールでダムの腹部領域をスプレーし、公開するために、腹部の正中線に沿って長さ2cmの切開を作ります子宮。
- 胚を取り出して、冷たい解剖HBSS緩衝液で10 cmの直径のペトリ皿に個々のものを置きます。
- 鉗子を使用して首胚を持ち、脳組織全体で小脳レベルとセクションの下に正中線での最初のカットの権利を作るために、小さなはさみを使用しています。胚を首を切るしないでください。
- 胚の脳の吻側部を介して、切り開かれる尾部領域からのすべての方法を小さなハサミの右側の先端を挿入（正中線を交差しない）、および頭蓋底のレベルで左側にカットをします。
- 右側のカットを作るために、再び左サイドシザー先端を挿入します。脳全体が容易に抽出するために脇に反転することができるように、吻側端部で切断されていない頭蓋骨と皮膚組織の狭帯域のままにしておきます。
- HBSS溶液に胚の脳をかき出すために鋏の先端を使用してください。解剖顕微鏡下で脳を検査します。脳は肉眼カット-oが無傷でなければなりませんffの地域。
- すべての胚の脳を収集するためにこれらのステップを繰り返します。
- 20ミリリットルの冷HBSS緩衝液を含む新しいペトリ皿内のすべての無傷の脳を収集します。解剖顕微鏡下でペトリ皿を置きます。
- 腹側から脳を表示します。尾側端に鉗子で脳を押しながら、中央の吻側ポイントと尾 - 時間領域との間のカットを作るために斜めに鋭い＃5ピンセットを挿入します。他の半球のためにこれを繰り返します。脳幹組織の残りの部分から無傷の海馬で、独立した2つの半球を切断した後。
- 脳のそれぞれについて、この手順を繰り返します。
- プールのすべての解剖半球、及び＃5ピンセットの2ペアを使用して髄膜を除去します。
- 側頭葉の内側に折り畳まれている湾曲した構造としての現像海馬を識別します。皮質組織に隣接するから海馬を分離するためにピンセットの2組を交互に。すべてhippocamを収集し、プールπ組織（ 図1参照）。
8.酵素消化、単一ニューロンに分離
- プラスチック製のトランスファーピペットを用いて、15ミリリットルコニカルチューブ中の0.25％トリプシン+ 1X DNアーゼIで5ミリリットル洗浄媒体を含む酵素消化液中にすべての解剖海馬を転送します。
- 水浴の内側にチューブを置き、一回ごとに5分でチューブの断続的な穏やかな反転で、25分間37℃でインキュベートします。
- 25分後、慎重に吸引により手持ちプラスチックピペットを用いて、酵素液を除去します。 10ミリリットルに暖かい洗浄媒体を加え、穏やかにゆっくりチューブを5回反転させて組織を洗います。洗浄培地を除去し、10ミリリットルを追加し、追加の洗浄のために再びメディアを洗ってください。
- 洗浄培地を除去し、再び新鮮な暖かいウォッシュ培地の3ミリリットルを追加します。組織から消化された神経細胞を取り除くために、15回の厳密手でチューブを振ります。培地を細胞Aを一度濁るべき再洗浄媒体への組織から分離しました。チューブ内の残りの組織を残しながら、新しい15ミリリットルコニカルチューブに細胞懸濁液を収集します。
- 組織に別の2ミリリットル洗浄培地を追加し、穏やか〜15倍のためのプラスチック製のピペットを介して粉砕することにより、残りの組織を分離します。 5分間座ってみましょう。プール '振り切り'細胞を集め含む新しい15ミリリットルコニカルチューブに細胞懸濁液。
- 血球計数器を持つ神経細胞の密度を数えます。典型的に、マイクロリットルあたり3,000〜5,000細胞を解剖胚の数に応じて取得することができます。 6胚と仮定すると切開された場合、2.5×10 7個のニューロンの平均数が推定されます。
- 30 mlの完全培地に添加した場合25万神経細胞/ mlの密度を得るために、この細胞懸濁液の必要量を計算します。メディアメッキ高密度ニューロンを得るために完全培地30ミリリットルを含む2コニカルチューブの一つにこのボリュームを追加します。 <LI>さらに30 mlのこの高密度ニューロン溶液の移送1.2 mlの完全培地は〜万ニューロン/ mlの濃度を得ました。低密度カバースリップをシードするこの希釈液を使用してください。
ニューロンと長期共培養の9めっき
- 細胞培養フード内に高密度のニューロンのためのエッチングされた底部と2つの24ウェルプレートを持参してください。真空により300μlの前提条件培地を除去します。 25万ニューロン/ mlで0.6ミリリットル高密度細胞懸濁液をプレート。
- 培養フードにカバースリップを持つ他の2つの24ウェルプレートを持参し、真空により300μlの前提条件培地を除去します。 2つの24ウェルプレートの内側カバースリップ1万ニューロン/ mlでプレート0.6 mlの低密度細胞懸濁液。
- インキュベーターにすべての4つの24ウェルプレートを返します。 2時間座ってみましょう。
- 高密度培養するために、ニューロンを付着させると、低密度のカバースリップを反転します。ニューロンは（ すなわち 、nは、互いに対向していることを確認します）カバーガラスで区切られたOT。その後、インキュベーターに共培養を持つ2つのプレートを返します。
10.共培養支えます
- 他の多くの研究によって報告されているように、元の完全培地の50％を除去する必要はありません5 in vitroで一日で（材料を参照）300μlの新鮮なフィード培地を添加することにより、共培養物フィード（DIV）。給紙媒体はまた、15μMシトシンアラビノシド（Ara-C、5μMの最終濃度を得た）グリア汚染および増殖の可能性を最小限にするために含まれています。
- この最初の給餌の後、毎週ウェルにアラCなしで300μlの新鮮なフィード培地を追加します。文化が一ヶ月以上放置されるべきである、（DIV33で第1媒体の半交換で）1ヶ月の時点を超えて毎週新鮮なフィード培地で培地の半分を交換してください。形態学的には、高密度および低密度の両方のニューロンはEXPERで観測された3ヶ月（最長時まで健康に見えますimenters）。
実験操作・低密度ニューロンのトランスフェクションの11イラスト
注：低密度ニューロンでのトランスフェクションが所望される場合には、単純なリン酸カルシウムプロトコールを採用することができます。我々は、低密度培養物をDIV12前リン酸カルシウムプロトコルより良いトランスフェクション効率を有することを見出したが、それらは樹状突起棘が顕著でその間、DIV21以前にはるかに低い効率でトランスフェクトすることができます。培養された低密度ニューロンのトランスフェクションの実現可能性は（以下を参照）をpEGFP-C3プラスミドでニューロンをトランスフェクトすることによって示されています。
- DIV21では、共培養の各ウェルから馴化600μlの培地を除去し、新しい24ウェルプレートに移します。その後、元のボリュームにそれを持って来るために共培養に600μlの新鮮なフィード培地を追加します。
- 条件培地600μlの新しい24ウェルプレートにカバースリップを転送します。ていることを確認します低密度ニューロンが上向きに直面しています。高密度プレートとバックインキュベーターでカバースリップを使用して新しいプレートを置きます。
- 2 1.5ミリリットルに滅菌チューブを準備します。 1チューブでは、600μlの2X HEPESは、生理食塩水（HBS）緩衝溶液を追加。プラスミド濃度に基づいて、12μgのをpEGFP-C3 DNAの量を計算します。他のチューブでは、74μlの塩化カルシウム（2 M株）とプラスミドを追加した後に600μLを行うことを水の量を追加します。ピペットでよく混合した後、プラスミドDNAを追加します。ゆっくりとよく混ぜます。両方の管を室温で5分間座ってみましょう。
- 2X HBSのチューブを手で保持し、適度にミキサーのソリューションを攪拌しながら、600μlの2X HBSのチューブにドロップすることによりDNA-のCaCl 2溶液ドロップμlの600のすべてを追加します。形成された沈殿物が「細かい砂」顆粒の形状であることが重要です。それはwhic大きな「雪のflake'のような析出物を、より多くの可能性が生成されますので、強すぎると速すぎて混合することは、望ましいことではありません時間は、私たちの観察に基づいて劇的に低いトランスフェクション効率を持っています。
- 沈殿物を30分間室温で暗所で形成するように継続させます。
- 均等に、カバースリップ上の低密度ニューロンを含む各ウェルに100μlの沈殿物を加える滴ずつと。プレートをインキュベーターに戻し、2時間インキュベートします。 CaCl 2の大部分が遊離体であると仮定すると、これは、長期のインキュベーション後、ニューロンに対して毒性であり得る、〜17.6ミリモルの Ca 2+の濃度をもたらします。
- 37°Cにそれをウォームアップ、〜50ミリリットル洗浄培地で50 mLのコニカルチューブを準備します。
- 2時間の終わりには、フード内に沈殿DNA、リン酸カルシウム低密度ニューロンをもたらします。シャープ＃5ピンセットでそれぞれ個別のカバーガラスをピックアップし、簡単にそれを洗浄するために50ミリリットル洗浄培地で3回にそれを浸します。そして、低密度ニューロンが下向きで、元の共培養プレートに高密度ニューロンにそれを返します。
- まで文化を続けますカバースリップ上の低密度培養神経細胞は、研究のために収穫されます。
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Representative Results
ここで説明するプロトコルは、フィーダー層としてのグリア細胞を必要とせずに成功した超低密度、純粋なグルタミン酸作動性ニューロンの長期培養を可能にします。プロトコルは、缶別々 （ポリ-D-リジンコーティングされたガラスカバースリップ上）（24ウェルをコーティングしたポリ-D-リジンで）高密度の調製および低密度ニューロンを含む図1に図解され、その後の共培養されます3ヶ月まで維持されます。
図2Aおよび2Bは、プレーティング後5日目に、高密度および低密度ニューロンの図です。低密度培養物は、密度の約30倍以下です。 Kaechとバンカー（2006）によって概説されるように、両方の神経細胞は、典型的な発達段階を経ます。 DIC画像（ 図2Cによって明らかにされるように14日目に、高密度および低密度ニューロンの両方が、精巧な樹枝状構造を示し、D、エッチの位置によって示されるように、両方のパネルは、異なる焦点面と同じフィールドからのものであるに注意してください）。これらのニューロンは、樹状突起を明らかにするためにMAP2抗体で染色していない樹状突起の数に有意な差（T 13 = 1.27、P> 0.05;樹状チップ数で測定）されたときに、総樹状長さ（T 16 = 1.41、P> 0.05 ）、高密度および低密度ニューロン間のニューロンあたりは（ 図2E、F）発見されました。
免疫細胞化学標識は、機能的なグルタミン酸作動性シナプスを明らかにするために使用されます。我々は、NMDA受容体サブユニットNR1およびAMPA受容体サブユニットのGluR1（ 図3A）、および容易に識別することができる機能的シナプス（ 黄色で共局在涙点）を標識するために二重染色を使用して、ImageJのを使用して定量。低密度ニューロンはまた、樹状タンパク質マーカーMAP2に対する抗体で標識されています軸索タンパク質マーカーのpタウと組み合わせて含みます。この二重標識は、樹状突起と軸索（ 図3B）の明確な区別を可能にします。 （DIV21でトランスフェクトされた場合、<0.2％の神経細胞）のトランスフェクション率は、後の段階で、典型的には非常に低いが、低密度培養物も成功、リン酸カルシウム法を用いて、DNAプラスミドでトランスフェクトすることができる。 図3Cは、EGFPのトランスフェクションは、ニューロンの形態を明らかにすることができることを示し、そして目に見える細かい樹状突起棘の構造をレンダリングします。最後に、概念の証明として、超低密度ニューロンはautapse形成（ 図3D）を促進する条件下で増殖させることができます。ポリ-D-リジンコーティングした「マイクロ島の上に成長させたこれらの超低密度autapticニューロンは、この共培養プロトコルで2ヶ月を超えてに高密度フィーダニューロンによって持続させることができます。
<強い>図高密度および低密度共培養プロトコルの1模式図。（A）E16.5-E17.5マウス胚の脳が収集され、海馬を摘出し、トリプシンで消化されています。 （B）消化さ海馬単一ニューロンに分離し、洗浄し、24ウェルプレート（250,000細胞/ ml）を高い密度でプレーティングします。一方、低密度（10,000細胞/ ml）でニューロンをカバーガラス上にプレーティングします。高密度培養用ウェルをカバースリップのために高められたサポートを提供するために、18 Gの注射針を用いてエッチングされます。 （C）共培養のイラスト。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
図2.高密度および低密度の両方のニューロンは共同を持っています共培養でmparable形態的発展。（A、B）、高密度および低密度層の両方の播種密度を示す顕微鏡写真。広範囲高い（C）の両方において神経突起の成長および低密度（D）ニューロンを示す（C、D）DIC画像。カバーガラス上に低密度ニューロンは右高密度ニューロンの上に休んでいます。隆起したプラスチック支持体の位置に注意してください。樹状タンパク質MAP2の（E）免疫細胞化学標識。総樹状突起の長さとニューロンあたりの樹状突起先端数の（F）定量（平均±SEM）。有意差（NS）は、高密度の共培養で増殖させた低密度ニューロン間見られませんでした。 （B、D）でのスケールバーは100μmが。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
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図 共培養で増殖させた低密度ニューロンの 3 実験操作低密度培養物中の（A）免疫細胞化学標識は、のGluR1（ 緑 ）、NR1（ 赤色 ）の共標識により定義された機能的シナプスの同定を可能にします。 （B）、ニューロンの樹状タンパク質MAP2（ マゼンタ ）、軸索タンパク質p型タウ（ 緑 ）の同時標識。 （C）のpEGFP-C3プラスミドでトランスフェクトされた低密度の海馬ニューロン、多量の樹状突起棘を示します。 （D）低密度ニューロンをポリ-D-リジン「マイクロ島」を用意し、高密度ニューロンの上に成長させました。記録パッチ電極は、ニューロンの形態を明らかにするのAlexa-555ヒドラジドとニューロンを埋めます。 ADにおけるスケールバーは20μm。7fig3large.jpg "ターゲット=" _空白 ">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
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Discussion
私たちは、無血清条件下での超低密度海馬グルタミン酸作動性ニューロンの長期培養のための詳細なプロトコルを提示します。 / cm 2の〜2000ニューロンでは、密度は、少なくとも2つの既存の文献2,3,11,13,14によって報告されたグリアサポートの有無にかかわらず、ほとんどの「低密度「文化の準備よりも倍低いです。超低密度であることに加えて、このプロトコルは、新規で2つの点で重要です。低密度ニューロンがないシナプス結合または異なる密度で培養ニューロン間の直接の接触がなくても、物理的に近接内にある高密度のニューロンからの栄養因子のサポートを得るように、まず、何のグリアフィーダー層は必要ありません。このプロトコルは、先に計画された培養実験のグリア単層を調製する必要がなくなり、高密度および低密度培養物を同時に成長することを可能にします。グリア単層の調製は時間がかかり、Lであることができますaborious、最も文献は新生ラット仔の皮質2を使用しています。したがって、マウスのみで作業ラボのために、これは重要な追加の努力が必要です。それは、ニューロン、グリア、または2つの細胞型10との間の相互作用に特異的に帰属観察された効果を防止するために、より重要なことには、ニューロン特異的なメカニズムを調査する実験において、共培養におけるグリアの存在は、望ましくありません。また、グリア培養のために、血清サプリメントは2,15必須であり、これはグリアニューロン共培養を汚染し、付加的な交絡因子を導入することができます。我々のプロトコルの1つの重要な特徴は、共培養は、定義された培地条件下であることです。我々は、厳密実験の大半を満たす必要がある、血清サプリメントなしで完全培地を使用し、培地交換スケジュールが厳しく続く場合、共培養は、3ヶ月を超えて持続させることができることがわかります。ノー事実があるのでグリア存在は、この技術の一つの制限は、グリア神経細胞の共培養を使用した文献の結果と比較する場合には注意が行使されるべきであることです。
このプロトコルの別の新規態様は、我々は24ウェルプレートの底上に成長した高密度ニューロン間の効果的なマイクロスペース、および真上に座ってカバーガラスに付着した低密度ニューロンを作成する簡単な方法を使用することです。以前の研究では、グリアフィーダー層2,8,9上記〜500ミクロンでカバースリップを高めるために、コーティングされたカバースリップに適用されるパラフィンドットを使用しています。パラフィンドットの調製は努力と練習の合理的な金額を要求する適切なサイズと適切な温度を必要とします。比較では、18 G針でウェル底プラスチック上の単純なエッチングは、ニューロンの2つの層の間のカバーグラスのサポートだけでなく、良好な分離を提供します。我々は、LINを決定するために、デジタルZ計でパッチクランプ記録リグを使用しています耳高密度にした後、60X水浸対物レンズを用いて低密度層に着目して、ニューロンの2層の間のスペース、およびスペースは、通常、150〜200ミクロン（179.4 +/- 25.3μmであり、n = 5であることがわかりました）。 （ワックスドットによって生成されたものと比較して）、この狭い空間したがって成長する低密度ニューロンのための十分な支持を提供し、より速く上昇、および神経栄養因子のより高い濃度に変換する可能性があります。この狭い空間は培地交換のレートについて、より小さなスペースが酸素と栄養補給を取得からニューロンを妨げるかどうかの質問を提起することができるが、我々の結果は、これはおそらく問題ではないことを示しています。逆に、我々はカバースリップの下で高密度ニューロンはまた、より良い成長することを見出した（NR1染色により高い生存率、より精巧な樹状突起とより多くのシナプス点を、データは示していない）と同じ準備からではなくせずに高密度ニューロンと比較しますオーバーレイCOVerslips。したがって、この単純なプロトコルだけではなく、高速、シンプルなだけでなく、高密度と低密度ニューロンの両方を維持する上で非常に有効です。
in vitroでの海馬神経細胞を培養し、ポリ-D-リジンおよび/ またはラミニン/コラーゲン5,16のような基材を、成長促進のコーティングを必要とします。細心の選択およびガラスカバースリップの調製は、有効ニューロンの生存のために重要であるが、我々は、我々が選択したカバーガラスを、70％エタノールで徹底的に洗浄、したがって厳しい治療の必要性を否定する、十分であることを見出した（ 例えば 、酸中で煮沸）カバースリップの。カバーガラスをエタノールで洗浄し、真空乾燥させた後、ガラスは、元のコーティングのために疎水性であると思われます。しかし、0.1ミリグラムの成功コーティング/カバースリップを洗浄水、水の均一な層からピックアップされた場合には、均一になるように、ガラス表面を親水性にすべきであるホウ酸緩衝液中のmlのポリ-D-リジン全体のガラス表面を横切って拡散することを観察することができます。これは非常に重要であることを見出しました。そうしないとニューロンは、最も可能性の高い不十分コーティングによるめっき後死んでしまいます。唯一の低密度の海馬ニューロンは、このプロトコルで試験されているが、他のニューロンのタイプ（ 例えば 、皮質ニューロン、小脳顆粒ニューロン、または専門の神経集団）も高密度ニューロンフィーダの存在下で、低密度で維持できることが期待されます層。この単純なプロトコルが続いているときに最後に、1は、健康的な超低密度ニューロンを収穫することを期待することができます。このような免疫細胞化学標識などの幅広いアプリケーション、ライブイメージング、形態学的研究および電気生理学的記録は、すべての標準的な手順16,17を以下のこれらのニューロンに行うことができます。
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Neurobasal medium | Life Technologies | 21103-049 | Protect from light |
| B27 supplement | Life Technologies | 17504-044 | aliquot, store in 0.6ml size |
| GlutaMAX-I | Life Technologies | 35050-061 | dilute 100X |
| antibiotic-antimycotic (AA) | Life Technologies | 15240-096 | dilute 100X |
| Complete Culture medium | Neurobasal medium with 1X B27, 1X AA, 1X GlutaMAX-I | ||
| Wash medium | same as 'Neurobasal medium' | ||
| Feed medium | Neurobasal with 1X B27 supplement | ||
| DNAse I | Sigma-Aldrich | D5025 | prepare 100X stock at 0.6mg/ml |
| poly-D-lysine | Sigma-Aldrich | P6407 | M.W. 70000-150000 |
| borate buffer | Sigma-Aldrich | B6768 (boric acid); 71997(borax) | 1.24g boric acid & 1.9g borax in 400ml H2O, pH to 8.5 use HCl |
| 12-mm round glass coverslips | Glasswarenfabrik Karl Hecht GmbH | 1001/12 | No. 1 glass, purchase from Carolina Biological Supply |
| proFection transfection kit | Promega | E1200 | see protocol for details |
| 2X HEPES buffered saline (HBS) | Promega | E1200 | see protocol for details |
| Syringe filter | Pall Corporation | 4192 | 0.2um pore size |
| Endofree plasmid prep kit | Qiagen | 12362 | for preparation of transfection grade plasmid DNA |
| anti-MAP2 antibody | Millipore | MAB3418 | mouse antibody, clone AP20 |
| anti-p-Tau antibody | Millipore | AB10417 | rabbit polyclonal antibody |
| anti-NR1 antibody | Millipore | MAB1586 | mouse antibody, clone R1JHL |
| anti-GluR1 antibody | Millipore | AB1504 | rabbit polyclonal antibody |
| Hank's balanced salt solution | ThermoFisher | 14025092 | 500ml size |
References
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