Abstract
In vitro birincil hipokampal nöronları Kültürleme nöronal gelişimi birçok yönlerini mekanik sorgulama kolaylaştırır. Ayrışmış embriyonik hippokampal nöronlar, genellikle, serum içermeyen koşullar altında, yüksek yoğunlukta cam lameller üzerine başarılı bir şekilde büyüyebilir, ancak düşük yoğunluklu kültürleri, tipik ederek trofik faktöre kaynağı gerektirir zaman alıcı olabilir hazırlanması bunun bir glia besleyici tabaka ile ortak kültür ve zahmetli. Buna ek olarak, glia varlığı nöron spesifik mekanizmalarına sonuçları ve preclude çalışmaların yorumlanmasına neden olabilecek. Burada basitleştirilmiş bir yöntem serumsuz koşullar altında ve glial hücre desteği olmadan bir ultra-düşük yoğunluklu (~ 2.000 nöronlar / cm2), uzun dönemli (> 3 ay) primer hipokampal nöron kültürü için sunulmuştur. Düşük yoğunluklu nöronlar poli-D-lizin kaplı lamelleri yetiştirilen ve 24 oyuklu bir plaka içerisinde yetiştirilen yüksek yoğunluklu nöronlar üzerinde ters çevrilmiş olan. Bunun yerine betwee bir alan oluşturmak için parafin nokta kullanarakn İki nöron katmanları, deneyci sadece düşük yoğunluklu nöron büyümeye elverişli bir MICROSPACE oluşturmak için, yüksek yoğunluklu nöronlar ikamet hangi kuyunun plastik altını, etch olabilir. ko-kültür böylece kolayca bu nöronların morfolojik ve fizyolojik çalışma kolaylaştıran düşük yoğunluklu nöronların önemli bir kayıp olmadan> 3 ay muhafaza edilebilir. Bu başarılı kültür koşulundaki göstermek için, veri uzun süreli kültürden sonra, düşük yoğunluklu hücrelerinde bol sinaps oluşumunu göstermek için verilmiştir. Bu eş-kültür sistemine, aynı zamanda, poli-D-lizin substratlar ve böylece autaptic bağlantıların oluşumu adaları yetiştirilen seyrek bireysel nöronların hayatta kalmasını kolaylaştırır.
Introduction
In vitro koşullarda hipokampal nöronlar Büyüyen gözlem ve in vivo olarak başka türlü mümkün olmayan bu nöronların deneysel manipülasyon sağlar. Bu deneysel yaklaşım yaygın büyüme, kutuplaşma, akson şartname, insan ticareti ve proteinlerin hücre içi lokalizasyonu, sinaps oluşumu ve işlevsel olgunlaşma 1 nöronal mekanizmaları ortaya çıkarmak için kullanılır. Geç embriyonik aşamada hasat zaman Bu in vitro kültür hipokampal nöronlar, piramidal morfoloji 2 (>% 90) glutamaterjik hücreler nispeten saf bulunmaktadır. Nöronlar in vitro koşullarda bir 2-D yüzeyinde yetişen Çünkü, bu yöntem tek bir odak düzlemi 3 ile boyama gibi canlı görüntüleme veya immünsitokimya (ICC) kolay gözlem, izin verir; Böyle ilaç tedavisi ve transfections 3-6 veya manipülasyonlar. yüksek yoğunlukta yetiştirilen zaman, nöronlar, çünkü daha yüksek co hayatta kalma yüksek oranlarına sahip olma eğilimibüyüme ortamından, ve aynı zamanda çünkü akson temas bağımlı mekanizmalar 7 sindirim desteğinin yanı sıra salgılanan büyüme faktörlerinin ncentrations. Bununla birlikte, düşük yoğunluklu hipokampal nöronlar bağımsız bir nöron bütünüyle görüntülenecek veya ICC analizi için boyandı morfolojik çalışmalar için de arzu edilir. Düşük yoğunluklu nöronlar nedeniyle parakrin destek eksikliği nedeniyle kültüründe korumak zor ve bu nedenle sık sık önceki nöron kültürü 2 hazırlıklı olmak olan bir glial (genellikle kortikal astrosit) besleyici tabaka, gelen trofik desteği gerektirir. Bir glial hücre besleyici tabaka ile kültürlü işbirliği yaparken, düşük yoğunluklu nöronlar lamelleri yetiştirilen ve düşük yoğunluklu nöronlar ve glia birbirine bakacak şekilde daha sonra glia tabakasının üstüne çevirdi. Glia ve nöronlar arasındaki küçük bir kapalı alan, bu nedenle bir 'sandviç' düzen 2,8,9 yaratma, lamelleri köşelerindeki parafin noktalar yerleştirerek oluşturulur. düşük yoğunluklu nöronlar w büyüyecekglia ve nöronlar ve glia tarafından salgılanan konsantre faktörler ile bir müsamahakar mikro oluşturur lamel arasında kapalı alana ithin. Bu yaklaşım, düşük yoğunluklu, makul aralıklı olan tam gelişmiş nöronlar, bu nedenle kolaylaştırma ICC etiketleme ya da canlı görüntüleme çalışmaları verir.
yana zaman alıcı ve zahmetli olmaktan nöron glia ortak-kültürünün bir görünür sakıncası, bu nörona özgü veya hücre-bağımsız, düzenekleri önlemesidir. Bu sistem çok daha az karmaşık daha olmasına rağmen in vivo sinir dokusu, deneyler 10 bulandırabilir salgılanan, zaman henüz tam olarak tanımlanmış faktörleri ile nöron gelişimi üzerindeki glia etkisi. Bu nedenle, nöron spesifik mekanizmaların soruşturma, serum ve glial destek tabakası gerekli kaldırmak tanımlanan kültür koşulları gerektiren deneylerde. Bir önceki çalışmada, bir inci kullanılarak nöronların düşük konsantrasyonlarda (~ 9.000 hücre / cm 2) kültüre başarmıştırree boyutlu hidrojel matrisi 11. nispeten saf nöronal popülasyon glial desteksiz serumsuz koşullar altında, yüksek yoğunlukta kültürlenebilir yana, hipokampal nöronlar ultra düşük yoğunluklu ile serumsuz tanımlanmış bir kültür ortamı içinde yetiştirilen Hipotezimize olarak, yüksek yoğunluklu nöronlar ile ko-kültür geleneksel olarak kabul nöron glia ko-kültür benzer bir şekilde. Gerçekten de, bir "sandviç" yapılandırmada, yüksek yoğunluklu hipokampal nöron kültürleri en son özel magnoselüler endokrin nöronlar 12 az sayıda destek kullanılmıştır.
Bu nedenle, yüksek yoğunluklu nöronlar ile ko-kültür düşük yoğunluklu nöronlar uzun süreli sağkalım sağlamak için yeterli trofik faktörler destek almak için izin verebilir. kültür ultra-düşük yoğunluklu nöronların Bu protokol, böylece formüle ve onaylanmıştır. protokol yüksek yoğunluklu hazırlayarak, tek bir deneyde içinde uygulanabilir (~ 250.000 hücre / ml) disBirlikte olan hippokampal nöronlar, önce ve sonra bir yoğunluğa ~ 10,000 nöronlar vermek üzere bir seyreltme yapılmadan / ml (~ 3000 nöronlar / lamel veya ~ 2.000 nöron / cm2), en düşük yoğunlukta kültür bildirilen daha düşüktür, 2,3,9 , 11,13. Bu kültür durum gevşek 'ultra-düşük yoğunluklu' kültür olarak adlandırılan ve 'düşük yoğunluklu' arası istikrarsızca kullanılır. yüksek yoğunluklu nöronlar, poli-D-lisin kaplı 24 oyuklu plakalar üzerine plakalanır; düşük yoğunluklu nöronlar poli-D-lizin kaplı 12 mm'lik cam lameller üzerine ekildi ise başka bir 24-çukurlu plaka içinde yerleştirilir. nöronlar indiler ve lamelleri bağlı sonra düşük yoğunluklu nöronları yapışmış olan lamelleri 2 saat sonra yüksek yoğunluklu nöronların üstünde çevrileceği. Buna ek olarak, bunun yerine yüksek yoğunluklu nöron katman üzerinde lamelleri yükseltmesine parafin noktalar kullanılarak, bir 18 G şırınga iğnesi, iki paralel çizgi 24 yuvalı plakalar alt aşındırma için kullanılmıştır. Ortaya çıkan displNahl.Acad, bitişik plastik cam lamelleri için yükseltilmiş bir destek sağlar. Bu alan sürekli konsantre trofik faktörler ile mikro sağlarken yeterli oksijen ve kültür ortamı alışverişini sağlayan 150-200 mikron, ölçülür. Bu durumda, düşük yoğunluklu nöronlar yoğun büyür ve kültürde üç ay ötesinde yaşayabilir. Bu nöronlar kültüründe üç hafta sonra GFP plazmid ile transfekte edildiğinde, dendritler bolca dendritik dikenler çivili. ilkesinin bir kanıtı olarak, veriler, bu ko-kültür sistemi nöronları hücre araştırma kolaylaştırabilir autaptic bağlantıları oluşturan poli-D-lizin mikro-adalar ", üzerine ekildi hipokampal nöronlar ultra düşük yoğunluklu kültürleri desteklediğini göstermek için sunulmuştur -autonomous, ağ-bağımsız mekanizmalar.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
fareler içeren tüm deneysel prosedürleri Arizona Üniversitesi Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Kurulu tarafından onaylanan ve NIH kurallarına uyduğu bulundu.
Hipokampal Nöron Kültürü 1. Doku Kaynağı
- Hipokampal nöron kültürü için prenatal fare yavrular üretmek için evi 17 yetiştirilen zaman gebe farelerin (C57BL6 / J) kullanın. vajinal fiş algılama ile gün E0.5 olarak belirlenmiştir. kültür için planlanan hasat zamanı E16.5-E17.5 olduğunu.
Not: Bu protokol, düşük yoğunluklu nöronlarla ko-kültür, iki yüksek yoğunluklu nöron iki 24-yuvalı plakalar kültürleri tarif (48 lamelleri toplam) hazırlandı. daha fazla levha, ancak malzeme ve reaktif için uygun şekilde ölçeklenebilir.
Yüksek Yoğunluklu nöron kültürleri 2. 24 oyuklu plakalar hazırlanması
Not: embriyoların planlanan hasattan önce aşağıdaki adımları (2-3) gün yapın.
- İki 24 kuyu getirhücre kültürü kaputu içine plakaları, bireysel ambalaj açın.
- 1 ml'lik plastik tek kullanımlık şırıngaya 18 G şırınga iğnesi bağlayın.
- şırınga tutun ve de alt merkezi sol ~ 1 mm iğne ucu amaçlamaktadır. kuyu (~ 1 mm uzunluğunda) alt etch orta kuvvet (~ 250 gr) uygulayın. Bir oluk oluşmuş ve plastik malzemeler düz dipli kuyu yüzeyi üzerinde yükseltilmiş bir destek oluşturacaktır yerinden edilecektir. Benzer bir şekilde alt merkezinin sağındaki ~ 1 mm bir yaklaşık 1 mm uzunluğunda paralel oluk Etch.
- İki 24 oyuklu plakaların tüm oyuklara için yineleyin. Yüksek yoğunluklu kültürü için kullanılan iki adet 24 oyuklu plakalar artık, poli-D-lisin (aşağıdaki adımı 3.8) ile kaplama için hazırdır.
Düşük Yoğunluklu Nöron Kültürler 3. Lameller Hazırlık
- 12-mm çaplı 1. tur camını kullanın.
- 100 mm çaplı steril plastik petri içinde 50 lamelleri yerleştirin ve lamelleri daldırın20 mi% 70 etanol çözeltisi içinde. bir saat boyunca, orta (70 rpm) dönüş hızı ile dönen bir platform üzerinde, bu petri yerleştirin. % 70 etanolü çıkarmak ve daha sonra% 70 etanol taze toplu ile değiştirin. Döndürün ve bir saat daha yıkayın.
- % 70 etanol temizleme solüsyonu atın. (0.2 mikron filtre birimi ile filtrelenmiştir) steril su ekle. elle petri çevirerek titizlikle lamelleri durulayın. üç kez taze steril su ile değiştirilmesi her zaman durulayın.
- laminer akış steril bir hücre kültürü kaput içinde lamelleri ile petri yerleştirin. Vakum hattı üzerinden durulama suyu aspire ve lamelleri sokmak için steril su filtrelenmiş 10 ml ekleyin. lamelleri steril olmalıdır ve yüzey poli-D-lisin kaplama için yeterince temiz olmalıdır.
- bireysel ambalaj açma iki adet 24 oyuklu plakalar ve başlık koyun.
- kaputu vakum hattında açın. vakum hattına 200 ul pipet bağlayın ve bir SCIS kullanınsor daha büyük bir açılış oluşturmak için ucu kesmek için.
- petri, bir anda birinden lamelleri pick up ve tamamen lamel kurumaya vakum hattını kullanmak için ince uçlu 5. cımbız kullanın. Daha sonra, 24 gözlü bir levhanın gözleri her birine, bir lamel. 50 temizlenmiş lamelleri, iki 24-çukurlu tablalara, her bir doldurmak için yeterli olmalıdır.
- borat tampon maddesi (pH 8.5) ile çalışma çözeltisi (0.1 mg / ml) içine poli-D-lizin stok çözeltisi (1 mg / ml) ile seyreltilir. (Kazınmış dipli, iki yüksek yoğunluklu plakaları dahil), dört 24 oyuklu plakalar için toplam çalışma çözeltisinin 30 ml hazırlar.
- cam kapak slipleri, her bir oyuğa 300 ul 0.1 mg / ml poli-D-lizin çalışma solüsyonu ekleyin. lamelleri solüsyon içinde tamamen batırılır emin olun. Değilse, kuyunun dibinde karşı lamelleri bastırın # 5 cımbız ucu kullanın ve lamelleri tüm yüzeyini kapsayacak şekilde poli-D-lizin çözüm rehberlik ucu kullanın. Görme Herhangi yüzeylerin olmak için tüm lamelleri incelemekHiçbir hava yeniden plaka ve lamelleri arasında sıkışıp edildi.
- Ekle 300 ul 0.1 mg / kazınmış dipli yüksek yoğunluklu kültür plakasının her bir oyuğuna ml poli-D-lizin çalışma çözeltisi. Kuyunun tüm alt kapağı çözüm yaymak için elle döndürün.
- kültürü inkübatör poli-D-lizin ile dört tabak dönün ve / N O kuluçkaya yatmaktadır.
Kültür 4. Yıkama ve Ön şartlandırma Tabaklar
Not: Aşağıdaki aşamalar (4-9), doku hasat gününde gerçekleştirilir.
- lamelleri ve 24 oyuklu plakalar göre O / N inkübasyon / Kaplamadan sonra, dört Levhalar, kültürün davlumbaz içine (donör lamelleri, kazınmış plastik dipli, iki alıcı yüksek yoğunluklu plakaları ile iki adet) getir. poli-D-lisin çözeltinin ayrılması için vakum hattı kullanın.
- Hemen her bir plastik bir transfer pipeti kullanılarak ~ 1 ml steril su ekle, poli-D-lisin çözeltisinin çıkarılmasını takiben. Tüm oyuklar sıkıldıktan sonrasu ile 10 dakika süreyle bekletin. Daha sonra, (ya da cam lameller olmadan) kuyunun alt kapak her bir 300 ul yıkama ortamı ekleyin vakumla su çıkarın. poli-D-lizin kaplama kurumasına izin vermeyin.
- Hücre inkübatör dört tabak dönün. Plakalar dağınık hipokampal nöronlar hazırlanır kez kullanıma hazırdır.
Enzimatik sindirme 5. tam kültür ortamı içinde hazırlanması ve Tripsin Çözeltisi
- malzemeler (Malzeme) karıştırarak 60 ml Komple Kültür ortamı hazırlayın. iki adet 50 ml konik tüp içine tam kültür ortamı filtre bir 0.2 mikron gözenek boyutunda bir şırınga filtresi ile birleştirilmiş bir 50 ml şırınga kullanın. Her tüp 30 mL tam kültür ortamı içerir.
- Ayrı bir 50 ml konik tüp, ~ 30 mi yıkama ortamı (Malzeme) ve 37 ° C'ye kadar ısıtmak ekleyin. Bu enzimatik sindirimden sonra doku yıkamak için kullanılır.
- enzimi sindirimi ortamı hazırlayın. 15 ml konik tüp, 4.5 mi yıkama ortamı ve 0.5 ml% 2.5 tripsin solüsyonu ve 50 ul 100X DNase ilave
- Tam kültür ortamı, yıkama ortamı yerleştirin ve 37 ° C su banyosu içinde sindirim ortam enzim.
Cerrahi Araçlar 6. hazırlanması
- Bir sterilizasyon kese tüm cerrahi aletleri sterilize: iki küçük makas, forseps bir çift ve iki 5. cımbız.
Hippocampi E16.5-E17.5 Fare Embriyolar ve Diseksiyon gelen Brain 7. Kaldırma
- Hazırlama iki adet 10 cm'lik petri buz soğukluğunda steril Hank dengeli tuz çözeltisi (HBSS) ile doldurulmuş kaplar.
- (Bir hacme ~ 0.5 ml, 100 mg / kg), sodyum fenobarbital ile karından bir enjeksiyonla fare baraj öldürülür. baraj ayak tutam yanıt kaybeder kez enjekte edildikten sonra, servikal dislokasyon ile kurban.
- % 70 etanol ile baraj karın alan sprey, ve ortaya çıkarmak için karın orta hat boyunca 2 cm uzunluğunda kesi yapmakrahim.
- embriyolar çıkarın ve soğuk kesme HBSS tamponu ile 10 cm çapında bir Petri tabağına bağımsız olanlar yerleştirin.
- Bir forseps kullanarak boynundan embriyo tutun ve beyin dokusu üzerinde beyincik düzeyi ve bölümünün altında orta hatta ilk kesim doğru yapmak için küçük bir makas kullanın. embriyoyu başını kesmek yok.
- tüm yol embriyonik beynin rostral kısmından, açık kesilerek kaudal bölgede küçük makas sağ tarafı ucu takın (çapraz orta hat yok) ve kafa tabanı düzeyinde sol tarafında bir kesim yapmak.
- Sağ tarafta bir kesim yapmak için tekrar sola yan makas ucu takın. tüm beyin kolay çıkarılması için bir kenara saygısız böylece, rostral sonunda kesilmemiş kafatası kemik ve cilt dokusunun dar bir bant bırakın.
- HBSS çözeltisi içine embriyonik beyin oymak için makas ucu kullanın. Diseksiyon mikroskobu altında beyin kontrol edin. Beyin hiçbir brüt kesme o ile sağlam olmalıdırff bölgeler.
- Tüm embriyo beyinleri toplamak için bu adımları tekrarlayın.
- 20 ml soğuk HBSS tamponu içeren yeni bir petri tüm bozulmamış beyin toplayın. Bir diseksiyon mikroskobu altında petri yerleştirin.
- ventral taraftan beyin görüntüleyin. kaudal ucunda forseps ile beyin basılı tutarken, orta rostral noktası ve kaudal-temporal bölge arasında bir kesim yapmak için çapraz keskin 5. cımbız yerleştirin. diğer yarımkürede için bu işlemi tekrarlayın. Beyin sapı dokuların geri kalanından bozulmamış hipokampus ile ayrı iki hemisfer kestikten sonra.
- beyinleri her biri için bu işlemi tekrarlayın.
- tüm disseke hemisferlerin havuz ve 5. cımbız iki çift kullanarak meninksler kaldırmak.
- temporal lob içinde katlanmış kavisli bir yapı olarak gelişen hipokampus tanımlayın. kortikal dokuları bitişik hipokampus ayırmak için cımbız iki çift alternatif. Toplayın ve tüm hippocam havuzpi doku (Şekil 1).
Tek Nöronlar içine ayrı 8. Enzimatik Sindirim,
- Plastik bir transfer pipeti kullanarak, 15 ml konik bir tüp içinde% 0.25 tripsin + 1X Dnaz I ile 5 ml yıkama ortamı içeren enzimatik sindirim çözeltisi içine tüm parçalara hippocampi aktarın.
- Bir su banyosu içinde Tüp ve her 5 dakikada bir kez tüpün kesikli yumuşak invertli, 25 dakika süreyle 37 ° C'de inkübe edin.
- 25 dakika sonra, dikkatli bir şekilde aspire edilerek bir el pipet kullanılarak enzim çözeltisi çıkarın. 10 ml ılık Yıkama orta ekleyin ve yavaşça yavaşça tüpü 5 kez ters yüz edilerek doku yıkayın. Yıkama ortamı çıkarın ve ilave bir yıkama için tekrar 10 mi yıkama ortamı ilave edin.
- Yıkama ortamı çıkarın ve tekrar taze sıcak Yıkama orta 3 ml ekleyin. dokudan sindirilmiş nöronlar çıkarmak için elle sıkı 15 kez tüp sallayın. Orta Hücreler, bir kez bulanık bir hale gelmelidirYıkama ortamı içine dokudan ayrılır yeniden. tüp içinde kalan doku bırakırken, yeni bir 15 ml konik bir tüp içinde bir hücre süspansiyonu toplanır.
- dokuya bir 2 mi yıkama ortamı ekleyin ve yavaşça ~ 15 kat için plastik bir pipet ile öğütülerek kalan doku ayırın. 5 dakika bekletin. 'Shake-off' hücreleri toplanır içeren yeni 15 ml konik tüp içine hücre süspansiyonu Havuz.
- Bir hemasitometre ile nöronların yoğunluğunun sayın. Tipik haliyle, mikrolitre başına 3.000-5.000 hücre parçalara embriyo sayısına bağlı olarak elde edilebilir. Altı embriyolar varsayılarak kesilir ise 2.5 x 10 7 nöronların arasında ortalama bir sayı olduğu tahmin edilmektedir.
- 30 mi kadar tam kültür ortamı ilave edildiğinde 250.000 nöron / ml'lik bir yoğunluğa elde etmek için, bu hücre süspansiyonunun gerekli hacmi hesaplayın. Yüksek yoğunluklu nöron kaplama ortam elde edilmesi için, 30 ml komple kültür ortamı içeren iki konik boruların biri için bu hacim. <li> başka bir 30 ml için bu yüksek yoğunluklu nöron çözeltisi Aktarım 1.2 mi tam kültür ortamı ~ 10,000 nöron / ml'lik bir konsantrasyon elde edilir. Düşük yoğunluklu lamelleri tohum Bu seyreltme kullanın.
Nöronlar ve Uzun Vadeli İşbirliği kültürünün 9. Kaplama
- Hücre kültürü davlumbaz içine yüksek yoğunluklu nöronların kazınmış tabanları iki 24-kuyu tabak getirin. vakum ile 300 ul önkoşulu orta çıkarın. 250.000 nöron / ml 0.6 ml yüksek yoğunluklu hücre süspansiyonları Plate.
- kültürü kaputu içine lamelleri ile diğer iki 24-kuyu plakaları getirin ve vakum ile 300 ul önkoşulu orta kaldırmak. İki 24 oyuklu plakalar içinde lamelleri 10.000 nöron / ml'de Levha 0.6 mi düşük yoğunluklu hücre süspansiyonları.
- inkübatör dört 24 oyuklu plakalar döndürür. 2 saat bekletin.
- yüksek yoğunluklu kültürü nöronlar kalarak düşük yoğunluklu lamelleri çevirin. Nöronlar (yani, n birbirine bakacak emin olun) Cam lamel ile ayrılmış ot. Daha sonra inkübatör ko-kültürü ile iki tabak döndürür.
10. Co-kültür Sürdürmek
- Diğer birçok çalışmalarda bildirilen orijinal Komple Kültür ortamı% 50 çıkarmak gerek yoktur 5. in vitro (DIV) 'de günde (Malzeme bakınız) 300 ul taze Besleme orta ekleyerek ortak kültürleri besleyin. besleme ortamı, aynı zamanda 15 uM sitosin arabinosid (ARA-C, 5 um bir son konsantrasyon elde etmek üzere), glia kirlenme ve çoğalma şansını en aza indirmek için içerir.
- Bu ilk beslenme ardından, her hafta kuyuya Ara-C olmadan 300 ul taze Yem orta ekleyin. Kültür birden fazla ay boyunca tutulmalıdır (DIV33 ilk ve orta yarım değiştirme ile) bir ay zaman noktasında ötesinde her hafta taze Yem orta orta yarısı değiştirin. Morfolojik olarak, yüksek ve düşük dansiteli nöronlar hem yukarı üç ay (exper tarafından gözlemlenen en uzun süre sağlıklı görünüyorsunimenters).
Deneysel Manipülasyon-düşük yoğunluklu Nöron Transfeksiyon 11. İllüstrasyon
Not: Düşük yoğunluklu nöronlarında transfeksiyon istendiğinde, basit bir kalsiyum fosfat protokolü kullanılabilir. Bu düşük yoğunluklu kültürleri DIV12 önce kalsiyum fosfat işlemi daha da transfeksiyon randımanına sahip olduğunu bulduk, ancak bu süre boyunca dendritik dikenler belirgin DIV21 veya daha büyük, çok daha düşük verimlilik ile transfekte edilebilir. kültürlenmiş düşük yoğunluklu nöron transfeksiyonu fizibilitesi bir pEGFP-C3 plasmidi ile transfekte nöronların gösterilmiştir (aşağıya bakınız).
- DIV21 da eş-kültür, her kuyudan orta Koşulları 600 ul çıkarın ve yeni bir 24 oyuklu plakaya transfer. Sonra geri orijinal hacminin getirmek için ko-kültür için 600 ul taze Yem orta ekleyin.
- orta durumunu 600 ul yeni 24-iyi plaka içine lamelleri aktarın. emin olundüşük yoğunluklu nöronlar yukarı bakacak şekilde. yüksek yoğunluklu plakaları ve inkübatör geri lamelleri ile yeni tabak yerleştirin.
- İki 1.5 ml steril tüpler hazırlayın. bir tüp içinde, 600 ul 2X HEPES tuz (HBA) çözümü tamponlu ekleyin. plazmid konsantrasyon dayalı 12 mikrogram pEGFP-C3 DNA hacmini hesaplayın. Diğer tüp içinde, 74 ul CaCl2 (2 M stok) ve plazmid ekledikten sonra 600 ul yapacak su hacmi ekleyin. Pipetleme ile iyice karıştırın ve daha sonra plazmid DNA ekleyin. Yavaşça iyice karıştırın. Her iki tüpler oda sıcaklığında 5 dakika bekletin.
- 2X HBS tüpü elle tutma ve orta bir mikserde çözüm ajite ederken, 600 ul 2X HBS tüpüne damla DNA CaCl2 çözüm damla ul 600 tüm ekleyin. Oluşan çökelti, 'ince kum "granül şeklinde olmasına özen gösterilmelidir. daha muhtemel büyük 'kar flake' benzeri çökeltileri üretecek beri çok güçlü ve çok hızlı karıştırma, yüklenebileceğini arzu değildirh bizim gözlemlerine dayalı önemli ölçüde daha düşük transfeksiyon verimine sahiptir.
- Çökelti, 30 dakika boyunca oda sıcaklığında karanlıkta oluşturulması için devam edelim.
- lamelleri düşük yoğunluklu nöron içeren her bir kuyunun 100 ul çökelti ekle, eşit damla ve damla. Plakaları kuluçka makinesine geri dönün ve 2 saat süreyle inkübe edin. CaCI2 en varsayarak bu uzun süreli kuluçkadan sonra nöronlar için toksik olabilir, ~ 17.6 mM Ca2 + konsantrasyonda sonuçlanır serbest formdadır.
- , ~ 50 ml yıkama ortamı ile 50 ml konik tüp hazırlanır, 37 ° C'ye ısıtın.
- 2 saat sonunda, davlumbaz içine çökelir DNA, kalsiyum fosfat ile düşük yoğunluklu nöron getir. keskin 5. cımbız ile her lamel Pick up ve kısaca yıkamak için 50 ml Yıkama ortamında bunu üç kez batırın. Sonra düşük yoğunluklu nöronlar aşağıya bakacak şekilde, özgün ko-kültür plakaları yüksek yoğunluklu nöronlar iade.
- kadar kültür Devamlamelleri düşük yoğunluklu kültür nöronları etütlerin yapılması için alınır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Burada açıklanan protokol besleyici tabakası olarak hizmet eden glial hücreler gerek olmadan başarılı ultra düşük yoğunluklu saf glutamaterjik nöronların uzun dönemli kültür sağlar. Protokol bu ayrı ayrı (poli-D-lizin kaplı cam lameller üzerine) (24 kuyu kaplanmış poli-D-lisin ile) yüksek yoğunluklu hazırlanmasını ve düşük yoğunluklu nöronları içeren, Şekil 1 'de diagramed, ve daha sonra eş-kültür edilir üç aya kadar muhafaza edilmelidir.
Şekiller 2A ve 2B, kaplama sonrası 5 gün, yüksek yoğunluklu ve düşük yoğunluklu nöronların gösterimleridir. Düşük yoğunluklu kültür yoğunluğu yaklaşık 30 kat daha azdır. KAECH ve Banker (2006) tarafından belirtildiği gibi, her iki nöronlar tipik gelişim aşamalarını geçmesi. DIC görüntüleri (Şekil 2C de ortaya koyduğu gibi 14. günde, yüksek yoğunluklu ve düşük yoğunluklu nöronlar, hem ayrıntılı dandritik yapılar gösterir,D) etch yeri gösterildiği gibi her iki paneller, farklı odak düzlemleri ile aynı alandan unutmayın. Ve toplam dendritik uzunluğu (t 16 = 1.41, p> 0.05; bu nöronlar dendrit, dendritler (dendritik uç sayısına göre ölçülen t 13 = 1.27, p> 0.05) sayısında anlamlı bir farklılık ortaya çıkarmak için map2 antikor ile boyandı zaman ) yüksek yoğunluklu ve düşük yoğunluklu nöronlar arasındaki nöron başı (Şekil 2E, K) bulunur.
Immünsitokimya etiketleme fonksiyonel glutamaterjik sinapsların ortaya çıkarmak için kullanılır. Biz, NMDA reseptör alt birimi de NR1 'i ve AMPA reseptör alt-birimi GluR1 (Şekil 3A), ve kolayca tespit edilebilir fonksiyonel sinaps (sarı eş lokalize puncta) etiketlemek için çift boyama kullanmak ImageJ kullanılarak ölçülür. Düşük yoğunluklu nöronlar, aynı zamanda, dendritik proteini markör MAP2'nin karşı antikor ile etiketleniraksonal protein işaretleyici p-Tau ile birlikte. Bu çift-etiketleme dendrit ve akson (Şekil 3B) net bir ayrım sağlar. Transfeksiyon oranı tipik olarak (DIV21 transfekte <% 0.2 nöronlar) sonraki aşamalarda çok düşük olmasına rağmen, düşük yoğunluklu kültürleri de başarılı bir şekilde, kalsiyum fosfat yöntemleri kullanılarak DNA plazmidleri ile transfekte edilebilir. Şekil 3C, EGFP transfeksiyon nöronal morfoloji ortaya edebileceğini ve görüntülemektedir ince dendritik omurga yapıları görünür kılmak. Son olarak, kavramının bir kanıtı olarak, ultra-düşük yoğunluklu nöronlar autapse oluşumunu (Şekil 3D) teşvik koşullar altında yetiştirilen olabilir. poli-D-lizin kaplı mikro-adalar 'üzerinde yetiştirilen Bu ultra-düşük yoğunluklu autaptic nöronlar bu ko-kültür protokolü ile 2 ay ötesinde yüksek yoğunluklu besleyici nöron tarafından sağlanabilir.
<strong> Şekil 1. Şematik yüksek yoğunluklu ve düşük yoğunluklu ko-kültür protokolünün illüstrasyon. (A) E16.5-E17.5 fare embriyonik beyinleri, toplanan hippocampi disseke ve tripsin ile sindirilir. (B) ile özümsenmektedir hipokampi tek nöronların ayrıldı, yıkandı ve 24 yuvalı plakalar üzerine (250,000 hücre / ml), yüksek yoğunlukta plakalanır; Bu arada, düşük yoğunluklu (10.000 hücre / mi) nöronları lamelleri kaplanmıştır. yüksek yoğunluklu kültürü için kuyu lamelleri için yükseltilmiş bir destek sağlamak için 18 G şırınga iğne ile kazınmış. Ko-kültür (C) Çizim. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Şekil 2. Hem yüksek ve düşük dansiteli nöronlar işbirliği varko-kültür mparable morfolojik gelişme. (A, B), yüksek yoğunluklu ve düşük yoğunluklu bir tabaka hem de kaplama yoğunluğu gösteren fotomikrograflardır. Genişletilmiş yüksek (C) hem de nörit büyüme ve düşük yoğunluklu (D) nöronları gösteren (C, D) DIC ve görüntüler. lamel düşük yoğunluklu nöronlar sağ yüksek yoğunluklu nöronlar üzerinde dinlenme. yükseltilmiş plastik destek konumunu not alın. Dendritik protein map2 (E) İmmünositokimya etiketleme. (F) Niceleme toplam dendritik uzunluğu ve nöron başına dendritik uç sayısı (ortalama ± SEM). Anlamlı bir fark (ns) yüksek yoğunluklu ve ko-kültür yetişen düşük yoğunluklu nöronlar arasında görüldü. (B, D), 100 mikron. Ölçek çubuğu bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayınız.
fo: keep-together.within-page = "1"> 
Şekil ko-kültür içinde büyütülebilir düşük yoğunluklu nöronların 3. Deneysel manipülasyonlar. Düşük yoğunluklu kültür (a) İmmünositokimya markalama GluR1 (yeşil) ve NR1 (kırmızı) ko-etiketlenmesi ile tanımlanan fonksiyonel bir sinaps belirlenmesini sağlar. (B) nöronal dendritik protein map2 (kırmızı) Eş-etiketleme ve aksonal protein p-Tau (yeşil). Bol dendritik dikenler gösteren (C) pEGFP-C3 plazmid ile transfekte edilmiş bir düşük yoğunluklu hipokampal nöron. (D), poli-D-lisin mikro-ada 'hazırlanmış düşük yoğunluklu bir nöron, ve yüksek yoğunluklu nöronların üstündeki büyütülür. Bir kayıt yama elektrot nöron morfolojisi ortaya çıkarmak için Alexa-555 hidrazit ile nöron doldurur. AD Ölçek çubuğu, 20 mikron.7fig3large.jpg "target =" _ blank "> bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Serum içermeyen koşullar altında, ultra düşük yoğunluklu hipokampal glutamaterjik nöronların uzun süreli kültür için ayrıntılı bir protokol mevcut. ~ 2000 nöronlar / cm 2, yoğunluk ya da mevcut literatüre 2,3,11,13,14 tarafından bildirilen glia desteği olmadan en 'düşük yoğunluklu' kültür hazırlıkları kat daha en az iki düşüktür at. ultra düşük yoğunluklu olmasının yanı sıra, bu protokol, yeni ve iki yönden önemlidir. düşük yoğunluklu nöronlar yakın fiziksel temas içinde olan yüksek yoğunluklu nöronlar trofik faktör destek almak Birincisi, hiçbir glia besleyici tabaka hiçbir sinaptik bağlantılar veya farklı yoğunluklarda kültüre nöronlar arasındaki doğrudan temas olsa bile, ihtiyaç vardır. Bu protokol öncesinde planlanan kültür deneyleri glia tek tabaka hazırlanması gereğini ortadan kaldırır ve yüksek yoğunluklu ve düşük yoğunluklu kültürleri hem eşzamanlı büyümesine izin verir. Glia tek tabaka hazırlanması zaman alıcı ve L olabiliraborious ve en literatür yenidoğan sıçan yavru korteks 2 kullanır. Bu nedenle, sadece fare ile çalışmak laboratuarlar için, bu önemli ek çaba gerektirir. Bu nöronlar, glia ya da iki hücre tipinde 10 arasındaki etkileşim için özel atfetme gözlenen etkileri önler Daha önemlisi, nöronal özel mekanizmalar incelenmiştir deneylerde, ko-kültür glia varlığı arzu edilmeyebilir. Buna ek olarak, glia kültürü için, serum takviyesi zorunlu 2,15 ve bu glia-nöron ko-kültür kirletebilir ve ek karıştırıcı faktörleri tanıtmak olabilir. Protokolde önemli bir özelliği, ko-kültür tanımlanmış ortam koşulları altında olmasıdır. Biz kesinlikle serum takviyesi olmadan Komple Kültür ortamını kullanmak ve deneyler çoğunluğu tatmin etmelidir, hangi kültür ortamı değişim programı sıkı takip eğer, ko-kültür üç ay ötesinde sürdürülebilir bulabilirsiniz. Resim hemen olduğu içinglia varlığı, bu tekniğin bir sınırlama glia-nöron ko-kültürler kullanın literatür sonuçları ile karşılaştırırken dikkatli olunmalıdır olmasıdır.
Bu protokolün bir başka yenilik ise, biz 24 plaka alt tarafında yetiştirilen yüksek yoğunluklu nöronlar arasında etkili bir mikro-boşluk ve sağ yukarıda oturan cam lamelleri yapışık düşük yoğunluklu nöron oluşturmak için basit bir yöntem kullanılmış olmasıdır. Önceki çalışmalar glia besleyici tabaka 2,8,9 üzerinde 500 mikron ~ at lamelleri yükseltmek kaplanmış lamelleri uygulanan parafin noktalar kullanır. parafin noktaların hazırlanması çabaları ve pratik makul bir miktar talep doğru boyut ve doğru sıcaklık gerektirir. Buna karşılık, bir 18 G iğne ile de taban plastik basit aşındırma nöron iki katı arasında lamelleri destek hem de iyi bir şekilde ayrılmasını sağlar. Biz lin belirlemek için dijital Z metre olan bir yama kelepçe kayıt teçhizat kullanmışKulak yüksek yoğunluklu ve daha sonra bir 60X suya daldırma objektif kullanarak düşük yoğunluklu tabakalar odaklanarak nöron iki tabaka arasındaki boşluk ve boşluk, tipik olarak 150-200 um (179.4 +/- 25.3 um, s = 5 olduğu bulunmuştur ). (Balmumu noktalar tarafından üretilen ile karşılaştırıldığında) Bu dar alan, bu nedenle büyüme düşük yoğunluklu bir nöron için yeterli bir destek sağlayan, daha hızlı bir artış ve nörotrofik faktörlerin daha yüksek bir konsantrasyonda çevirmek mümkündür. Bu dar alan kültür ortamı döviz kuru konusunda ve daha küçük uzay oksijen ve besin desteği elde nöronlar engel olmadığını soruları gündeme rağmen, sonuçlarımız bu büyük olasılıkla bir endişe olmadığını gösteriyor. Aksine, biz lamelleri altında yüksek yoğunluklu nöronlar da aynı hazırlıktan ancak olmadan yüksek yoğunluklu nöronlar ile karşılaştırıldığında daha iyi (yüksek hayatta kalma oranı, daha ayrıntılı dendritik ağaç ve NR1 boyama ile daha sinaptik puncta, veriler gösterilmemiştir) büyümek bulundu bindirilirken coverslips. Bu nedenle, bu basit bir protokol değil, sadece hızlı, basit, ama aynı zamanda yüksek yoğunluklu ve düşük yoğunluklu nöronlar hem sürdürülmesinde çok etkilidir.
In vitro olarak hipokampal nöronlar Kültürleme, poli-D-lisin ve / veya laminin / kollajen 5,16 gibi büyüme teşvik alt-tabakalar kaplanmasını gerektirir. Titiz seçimi ve cam lameller hazırlanması etkili bir nöronal hayatta kalma için kritik olan, ancak biz, seçilen kapak camı ile,% 70 etanol ile iyice temizleme, böylece sert bir tedaviye ihtiyacı ortadan yeterli olduğunu bulmuşlardır (örneğin, asitler kaynama) lamelleri. Lameller, etanol içinde temizlenmiş ve vakumla kurutulur sonra, cam nedeniyle, orijinal kaplamaya hidrofobik olduğu görülmektedir. Bununla birlikte, 0.1 mg başarılı bir şekilde kaplama / lamelleri yıkama suyu, bir su tek biçimli tabakası önceki kadar toplanır o zaman eşit olduğu şekilde, bir cam yüzeyi hidrofilik hale gerekir borat tampon maddesi içinde mi, poli-D-lizintüm cam yüzeyi boyunca yayılan görülebilir. Biz bu kritik önemli olduğunu gördük. Aksi takdirde nöronlar büyük olasılıkla yetersiz kaplama sayesinde kaplama sonrası ölecek. Sadece düşük yoğunluklu hipokampal nöronlar Bu protokolde test edilmiştir, ancak, diğer nöronal türleri (örneğin, kortikal nöronlar, beyincik granül nöronlar, veya özel nöral popülasyonu), bir yüksek yoğunluklu nöron besleyici mevcudiyetinde düşük yoğunluklu sürdürülebilir beklenmektedir katmanı. Bu basit bir protokol takip edildiğinde Son olarak, bir sağlıklı ultra-düşük yoğunluklu nöronlar hasat bekleyebilirsiniz. Böyle immünsitokimya etiketleme, canlı görüntüleme, morfolojik çalışmalar ve elektrofizyoloji kayıt gibi geniş uygulamaları tüm standart prosedürler 16,17 Aşağıda, bu nöronlar üzerinde yapılabilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Neurobasal medium | Life Technologies | 21103-049 | Protect from light |
| B27 supplement | Life Technologies | 17504-044 | aliquot, store in 0.6ml size |
| GlutaMAX-I | Life Technologies | 35050-061 | dilute 100X |
| antibiotic-antimycotic (AA) | Life Technologies | 15240-096 | dilute 100X |
| Complete Culture medium | Neurobasal medium with 1X B27, 1X AA, 1X GlutaMAX-I | ||
| Wash medium | same as 'Neurobasal medium' | ||
| Feed medium | Neurobasal with 1X B27 supplement | ||
| DNAse I | Sigma-Aldrich | D5025 | prepare 100X stock at 0.6mg/ml |
| poly-D-lysine | Sigma-Aldrich | P6407 | M.W. 70000-150000 |
| borate buffer | Sigma-Aldrich | B6768 (boric acid); 71997(borax) | 1.24g boric acid & 1.9g borax in 400ml H2O, pH to 8.5 use HCl |
| 12-mm round glass coverslips | Glasswarenfabrik Karl Hecht GmbH | 1001/12 | No. 1 glass, purchase from Carolina Biological Supply |
| proFection transfection kit | Promega | E1200 | see protocol for details |
| 2X HEPES buffered saline (HBS) | Promega | E1200 | see protocol for details |
| Syringe filter | Pall Corporation | 4192 | 0.2um pore size |
| Endofree plasmid prep kit | Qiagen | 12362 | for preparation of transfection grade plasmid DNA |
| anti-MAP2 antibody | Millipore | MAB3418 | mouse antibody, clone AP20 |
| anti-p-Tau antibody | Millipore | AB10417 | rabbit polyclonal antibody |
| anti-NR1 antibody | Millipore | MAB1586 | mouse antibody, clone R1JHL |
| anti-GluR1 antibody | Millipore | AB1504 | rabbit polyclonal antibody |
| Hank's balanced salt solution | ThermoFisher | 14025092 | 500ml size |
References
- Banker, G. Cultureing Nerve Cells. , 2nd edition, 339-370 (1998).
- Kaech, S., Banker, G.
- Petersen, J. D., Kaech, S., Banker, G. Selective microtubule-based transport of dendritic membrane proteins arises in concert with axon specification. J Neurosci. 34, 4135-4147 (2014).
- Seibenhener, M. L., Wooten, M. W. Isolation and culture of hippocampal neurons from prenatal mice. J Vis Exp. , (2012).
- Shi, Y., Ethell, I. M. Integrins control dendritic spine plasticity in hippocampal neurons through NMDA receptor and Ca2+/calmodulin-dependent protein kinase II-mediated actin reorganization. J Neurosci. 26, 1813-1822 (2006).
- Viesselmann, C., Ballweg, J., Lumbard, D., Dent, E. W. Nucleofection and primary culture of embryonic mouse hippocampal and cortical neurons. J Vis Exp. , (2011).
- Biffi, E., Regalia, G., Menegon, A., Ferrigno, G., Pedrocchi, A. The influence of neuronal density and maturation on network activity of hippocampal cell cultures: a methodological study. PLoS One. 8, e83899 (2013).
- Crump, F. T., Dillman, K. S., Craig, A. M. cAMP-dependent protein kinase mediates activity-regulated synaptic targeting of NMDA receptors. J Neurosci. 21, 5079-5088 (2001).
- Leal, G., Afonso, P. M., Duarte, C. B. Neuronal activity induces synaptic delivery of hnRNP A2/B1 by a BDNF-dependent mechanism in cultured hippocampal neurons. PLoS One. 9, e108175 (2014).
- Clarke, L. E., Barres, B. A. Emerging roles of astrocytes in neural circuit development. Nat Rev Neurosci. 14, 311-321 (2013).
- Kaneko, A., Sankai, Y. Long-term culture of rat hippocampal neurons at low density in serum-free medium: combination of the sandwich culture technique with the three-dimensional nanofibrous hydrogel PuraMatrix. PLoS One. 9, e102703 (2014).
- Millet, L. J., Bora, A., Sweedler, J. V., Gillette, M. U. Direct cellular peptidomics of supraoptic magnocellular and hippocampal neurons in low-density co-cultures. ACS Chem Neurosci. 1, 36-48 (2010).
- Salama-Cohen, P., Arevalo, M. A., Meier, J., Grantyn, R., Rodriguez-Tebar, A. NGF controls dendrite development in hippocampal neurons by binding to p75NTR and modulating the cellular targets of Notch. Mol Biol Cell. 16, 339-347 (2005).
- Xu, S. Y., Wu, Y. M., Ji, Z., Gao, X. Y., Pan, S. Y. A modified technique for culturing primary fetal rat cortical neurons. J Biomed Biotechnol. 2012, 803930 (2012).
- McCarthy, K. D., de Vellis, J. Preparation of separate astroglial and oligodendroglial cell cultures from rat cerebral tissue. J Cell Biol. 85, 890-902 (1980).
- Qiu, S., Weeber, E. J. Reelin signaling facilitates maturation of CA1 glutamatergic synapses. J Neurophysiol. 97, 2312-2321 (2007).
- Qiu, S., Lu, Z., Levitt, P. MET receptor tyrosine kinase controls dendritic complexity, spine morphogenesis, and glutamatergic synapse maturation in the hippocampus. J Neurosci. 34, 16166-16179 (2014).
