Abstract
체외에서 차 해마 신경 세포를 배양하는 것은 신경 발달의 여러 측면의 기계적인 심문을 용이하게한다. 해리 배아 해마 신경 세포는 종종 혈청이없는 조건 하에서 고밀도로 커버 글라스에 성공적으로 성장할 수 있지만, 저밀도 문화는 일반적으로 영양 요소의 공급이 필요 시간이 소요될 수 있습니다 제조는 아교 세포 영양 세포층, 그들을 공동 배양 힘드는. 또한, 신경교의 존재는 신경 특정 메커니즘에 결과 및 해석을 배제 연구를 혼동 할 수있다. 여기서, 단순화 된 방법은 무 혈청 조건에서 아교 세포의 지원없이 매우 낮은 밀도 (~ 2,000 뉴런 / cm 2), 장기 (> 3 개월) 주 해마 신경 세포 배양에 표시됩니다. 저밀도 뉴런 폴리 D 라이신 코팅 된 커버 슬립 상에 성장하고, 24 웰 플레이트에서 성장 고밀도 뉴런에 대칭된다. 대신 betwee 공간을 만들기 위해 파라핀 도트를 사용N 개의 뉴런 층은, 실험자는 단순히 저밀도 신경 세포의 성장에 도움이되는 미소 공간을 만들기 위해, 고밀도 뉴런 상주하는 웰의 플라스틱 하부를 식각 할 수있다. 공동 배양을 용이하게, 따라서 이러한 뉴런의 형태 학적 및 생리 학적 연구를 촉진 저밀도 뉴런의 상당한 손실없이> 3개월 유지할 수있다. 이 성공적으로 배양 조건을 설명하기 위해 데이터를 장기간 배양 후 저밀도 세포에서 넘치 시냅스 형성을 보여주기 위해 제공됩니다. 본 공 배양 시스템은, 폴리 D 라이신 기재 따라서 autaptic 연결 형성 제도 성장 희소 개별 뉴런의 생존을 촉진한다.
Introduction
시험관 조건에서 해마 신경 세포 성장하는 것은 관찰과 생체 내에서, 그렇지 않으면 가능하지 않습니다 이러한 뉴런의 실험 조작을 할 수 있습니다. 이 실험 방법은 널리 성장, 극성 신경 돌기 사양, 인신 매매와 단백질의 세포 내 현지화, 시냅스 형성과 기능 성숙 하나의 신경 메커니즘을 나타 내기 위해 사용된다. 늦은 배아 단계에서 수확 때 이러한 체외 배양 된 해마 신경 세포는 피라미드 형태 2의 (> 90 %) 글루타메이트 세포 비교적 순수한 있습니다. 신경 세포는 생체 외 조건에서 2-D 표면에서 성장 되었기 때문에,이 방법은 하나의 초점면 (3)을 통해 라이브 영상 염색 또는 면역 세포 화학 (ICC)와 같은 쉽게 관찰을 허용한다; 이러한 약물 치료 및 형질 3-6이나 조작. 고밀도로 성장하면 신경 세포 때문에 더 높은 공동의 생존의 높은 비율을 갖는 경향이성장 배지에서, 또한 돌기 때문에 접촉 의존적기구 (7)의 영양 지원 외에 분비 된 성장 인자의 ncentrations. 그러나, 저밀도 해마 뉴런 개별 뉴런은 그 전체에 이미징 또는 ICC 분석 물들 수 학적 연구를하는 것이 바람직하다. 저밀도 뉴런 인해 분비 지원의 부족 문화에서 유지하기 어려운 때문에 종종 이전의 신경 세포 배양 2 준비하는 아교 (일반적으로 대뇌 피질의 성상 세포) 피더 층에서 영양 지원이 필요합니다. 신경교 세포 공급기 층과 공동 - 배양 할 때, 저밀도 뉴런 커버 슬립 상에 성장되고, 저밀도의 뉴런 및 아교 세포가 서로를 향하도록 한 후 아교 층 위에 대칭. 아교 세포와 신경 세포 사이의 작은 밀폐 된 공간 따라서 '샌드위치'레이아웃 2,8,9을 생성 된 커버의 모서리에 파라핀 왁스 점을 배치하여 만들어집니다. 저밀도 뉴런 w 성장할아교 세포와 신경 세포와 아교 세포에 의해 분비 농축 인자 허용 미세 환경을 만드는 커버 슬립 사이의 좁은 공간을 ithin. 이 방식은 저밀도 합리적 이격 완전히 개발 뉴런 따라서 용이 ICC 라벨 또는 라이브 영상 검사를 산출한다.
따로 시간과 힘든되는 신경 세포 - glia 공동 문화의 명백한 단점은,이 신경 세포 특이 적 또는 세포 자율 메커니즘의 연구를 방지한다는 것입니다. 이 시스템은 훨씬 덜 복잡한보다하지만 생체 신경 조직, 실험 (10)를 혼동 할 수 분비하지 아직 완벽하게 정의 된 요소를 통해 신경 세포의 개발에 아교 세포에 미치는 영향. 따라서, 신경 세포의 특정 메커니즘 조사 혈청 신경교 지지층이 필요 제거 정의 배양 조건을 필요로 실험한다. 이전의 연구는 일을 사용하여 신경 세포의 낮은 농도 (~ 9,000 세포 / cm 2)의 배양에 성공REE 차원 하이드로 겔 매트릭스 (11). 비교적 순수한 신경 인구 폐해를 지원하지 않는 무 혈청 조건에서 고밀도로 배양 할 수 있기 때문에, 우리는 해마 신경 세포의 매우 낮은 밀도로 혈청 규정 배지에서 성장 될 수 있다는 가설에 고밀도 신경 세포로 공동 배양 통상적으로 채택 된 신경 세포 - glia 공동 문화 유사 방법. 실제로, "샌드위치"구성의 고밀도 해마 신경 세포 배양은 최근 전문 magnocellular 신경 내분비 (12)의 소수를 지원하기 위해 사용되었다.
따라서, 고밀도 신경 세포와 공동 배양 저밀도 신경 세포가 장기 생존을 가능하게하기에 충분한 영양 요소 지원을받을 수있다. 배양 초 저밀도 신경이 프로토콜은 이렇게 공식화하고 검증 하였다. 프로토콜 고밀도 준비함으로써, 하나의 단일 실험 내에서 구현 될 수있다 (~ 250,000 세포 / ㎖) DISsociated 해마 뉴런 제 다음 밀도 ~ 10,000 뉴런을 얻었다 희석액을 만들고 / ㎖ (~ 3000 뉴런 / 커버 슬립 또는 ~ 2000 뉴런 / cm 2) 대부분 저밀도 배양보고보다 훨씬 낮은, 2,3,9 , 11,13. 이 배양 조건은 느슨하게 '매우 낮은 밀도'문화로하고, '저밀도'간 가변적으로 사용된다. 고밀도 뉴런 폴리 D 라이신 코팅 된 24- 웰 플레이트 상에 플레이 팅된다; 저밀도 뉴런 폴리 D 라이신 코팅 된 12-mm 유리 커버 슬립 위에 접종하면서 다른 24 웰 플레이트 내부에 배치되어있다. 뉴런 내려와 된 커버에 부착 된 후 저밀도 신경을 부착 된 커버와 함께 2 시간 이상 고밀도 뉴런의 상부에 뒤집혀있다. 또한, 대신에 고밀도 뉴런 층 위에 커버 슬립을 상승 파라핀 왁스 도트를 사용하는 18 G 주사기 바늘은 두 개의 평행 한 줄무늬로 24 웰 플레이트의 바닥을 에칭 하였다. 그 결과 DISPL했었죠는, 인접 플라스틱 커버 글라스에 대한 높은 지원을 제공합니다. 이 공간은 지속적으로 농축 된 영양 인자와 미세 환경을 제공하면서 충분한 산소와 배지를 교환 할 수 150-200 μm의에서 측정된다. 이 상태에서, 저밀도 신경 세포는 광범위하게 성장하고, 문화 삼개월 이상 살아남을 수 있습니다. 이 신경 세포는 문화에 삼주 후 GFP 플라스미드로 형질 때, 수상 돌기는 무릎을 꿇고 서라도 돌기 쪽이 박혀있다. 원리의 증거로, 데이터는이 공동 문화 시스템은 신경 세포의 조사를 용이하게 할 수있다 autaptic 연결을 형성 폴리 - D - 라이신 '마이크로 섬'에 시드 해마 신경 세포의 매우 낮은 밀도 문화를 지원하는 것을 보여주기 위해 제시 GPS 자율, 네트워크에 독립적 인 메커니즘.
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Protocol
마우스와 관련된 모든 실험 절차는 아리조나 대학의 기관 동물 관리 및 사용위원회의 승인을, 그리고 NIH 가이드 라인을 따른다되었다.
해마 신경 세포 문화 1. 조직 소스
- 해마 신경 세포 배양 태아 마우스 새끼를 생성하려면 집 (17)에서 사육되는 시간 임신 마우스 (C57BL6 / J)를 사용합니다. 질 플러그 감지와 날 E0.5로 지정됩니다. 문화에 대한 계획 수확 시간은 E16.5-E17.5이다.
주 :이 프로토콜은 저밀도 뉴런와 공동 배양 개의 고밀도 뉴런의 24 개의 웰 플레이트의 배양 설명 (커버 슬립 (48) 전체). 더 플레이트, 재료 및 시약에 대한 대응 확장 할 수 있습니다.
고밀도 신경 문화 2. 24 웰 플레이트 준비
참고 : 배아의 계획 수확하기 전에 다음 단계 (2 ~ 3에게) 일을 수행합니다.
- 두 개의 24도를 가져와세포 배양 후드로 플레이트는 개별 포장을 연다.
- 1 ml의 플라스틱 일회용 주사기로 18 G 주사기 바늘을 연결합니다.
- 주사기를 잡고 웰의 바닥의 중앙 왼쪽 ~ 1mm의 바늘 끝을 목표로한다. 잘 (~ 1mm 길이)의 바닥을 에칭 적당한 힘 (~ 250g)을 적용합니다. 홈이 형성되고, 플라스틱 재료가 웰 평평한 바닥 표면 위에 높은지지를 형성하게 변위한다. 유사한 방법으로 아래의 중앙 우측 ~ 1mm 또 다른 ~ 1mm 길이의 평행 홈을 에칭.
- 두 개의 24 웰 플레이트의 모든 웰에 대해이 단계를 반복합니다. 고밀도의 배양에 사용되는 24 개의 웰 플레이트 해주기 폴리 D 라이신 (아래의 단계 3.8 참조) 코팅을위한 준비이다.
저밀도 신경 문화 3. Coverslips는 준비
- 12 mm 직경 1 라운드 유리를 사용합니다.
- 100 mm 직경 멸균 플라스틱 페트리 접시 안에 50 커버 슬립을 놓고 커버 슬립 잠수함20 ml의 70 % 에탄올 용액. 시간 중간 (70 회전) 속도 회전 회전 플랫폼이 배양 접시를 놓습니다. 70 % 에탄올을 분리 한 다음 70 % 에탄올의 신선한 배치로 대체합니다. 회전 및 다른 시간 동안 세척한다.
- 70 % 에탄올 세척 용액을 폐기하십시오. (0.2 μm의 필터 장치를 통해 여과) 멸균 물을 추가합니다. 손으로 배양 접시의 회전에 의해 엄격하게 커버 슬립을 씻어. 세 번, 신선한 멸균 물을 교체 할 때마다 씻어.
- 층류와 무균 세포 배양 후드 안쪽 된 커버와 페트리 접시를 놓습니다. 진공 라인을 통해 헹굼 물을 흡인하고, 커버 슬립을 몰입하기 위해 멸균 물을 여과 10ml를 추가합니다. 커버 슬립은 멸균되어야하고, 표면 폴리 D 라이신 코팅 충분히 깨끗해야한다.
- 개별 포장에서 열기이 24 웰 플레이트, 그리고 후드에 배치합니다.
- 후드의 진공 라인을 켭니다. 진공 라인에 200 μL 피펫 팁을 연결하고 SCIS를 사용SOR은 더 큰 구멍을 만드십시오 끝을 잘라.
- 페트리 접시, 한 번에 하나 된 커버를 선택, 완전히 커버 슬립을 건조 진공 라인을 사용하는 미세 팁 # 5 집게를 사용합니다. 그런 다음 24 웰 플레이트의 각 웰에 하나 coverslip에 배치합니다. 세정 된 커버 (50)는 두 개의 24- 웰 플레이트의 각 웰을 채우기에 충분해야한다.
- 보레이트 완충액 (pH 8.5)로 작업 용액 (0.1 ㎎ / ㎖)에 폴리 D 라이신 스톡 용액 (1 ㎎ / ㎖)에 희석. (에칭 바닥 두 고밀도 판 포함) 네 24 웰 플레이트 전체 작동 용액의 30 ㎖를 준비한다.
- 커버 글라스와 각 웰에 300 ㎕의 0.1 ㎎ / ㎖ 폴리 D 라이신 작업 솔루션을 추가합니다. 커버 슬립이 완전히 용액에 침지되어 있는지 확인합니다. 그렇지 않은 경우, 웰의 바닥에 대해 커버 슬립을 아래로 눌러 # 5 집게 팁을 사용하여 된 커버의 모든면을 커버하는 폴리 D 라이신 용액을 안내하는 팁을 사용한다. 시각 스와을 만들기 위해 모든 커버 슬립을 검사어떤 공기 재 판과 커버 슬립 사이에 갇혀 있었다.
- 추가 300 μL, 0.1 밀리그램 / 에칭 바닥 고밀도 배양 플레이트의 각 웰에 mL의 폴리 D 라이신 작업 용액. 웰의 전체 바닥을 덮는 확산 용액을 손으로 돌린다.
- 문화 인큐베이터에 폴리 D 라이신 모든 네 개의 접시를 반환하고, / N을 O를 품어.
문화 4. 세탁 사전 조절 플레이트
참고 : 다음 단계 (4-9)를 조직 수확의 날에 실시된다.
- 커버 슬립 24 웰 플레이트 O / N의 배양 / 코팅 한 후, 네 판 문화 후드에 (기증자 된 커버, 에칭 플라스틱 바닥이 수용체 고밀도 판 두)를 가져온다. 폴리 D 라이신 용액을 제거하기 위해 진공 라인을 사용한다.
- 즉시 각 웰 플라스틱 이전 피펫을 사용하여 1 ~ ㎖의 멸균 수를 추가하고, 폴리 D 라이신 용액의 제거를 수행. 모든 웰을 충전 한 후물에 10 분간 방치 할 수 있습니다. 다음 (또는 커버 글라스없이) 잘 바닥을 충당하기 위해 각 웰에 300 ㎕의 세척 매체를 추가, 진공 물을 제거합니다. 폴리 D 라이신 코팅이 건조하게하지 마십시오.
- 세포 배양기에 네 개의 접시를 돌려줍니다. 플레이트는 분산 된 해마의 신경 세포가 준비되면 사용할 준비가 된 것입니다.
효소 소화 5. 전체 문화 매체의 제조 및 트립신 솔루션
- 성분 (자료 참조)를 혼합하여 60 ml의에게 완전한 문화 매체를 준비합니다. 두 개의 50 ㎖ 원뿔형 튜브에 전체 배양액을 필터링 0.2 ㎛의 세공 크기의 주사기 필터로 연결된 50 ㎖ 주사기를 사용한다. 각 튜브는 30 ml의 전체 문화 매체를 포함한다.
- 별도의 50 ML 원뿔 관에서 ~ 30 ml의 세척 매체 (자료 참조)를 37 ° C로 예열 추가 할 수 있습니다. 이것은 효소 분해 후 조직을 세척하기 위해 사용될 것이다.
- 효소 소화 매체를 준비합니다. 15m에서L 개의 원뿔형 튜브, 4.5 mL의 세척 배지 0.5 ml의 2.5 % 트립신 용액 50 μL 100X DNase의 추가의 I.
- 전체 문화 매체, 워시 매체를 놓고 37 ° C의 물을 욕조에 소화 매체 효소.
수술 도구 6. 준비
- 살균 주머니에있는 모든 수술 도구를 소독 : 두 개의 작은 가위, 집게 한 쌍의 두 # 5 핀셋을.
해마의 E16.5-E17.5 마우스 배아 및 해부에서 두뇌의 7 제거
- 준비 개의 10 cm 페트리 빙냉 멸균 행크의 균형 잡힌 염 용액 (HBSS)으로 채워진 음식.
- (체적 ~ 0.5 ㎖ 중의 100 ㎎ / ㎏) 나트륨 페노바르비탈의 복강 내 주사하여 마우스를 안락사 댐. 댐 발가락 핀치에 응답을 잃게되면 주입 한 후, 자궁 경부 탈구로 희생.
- 70 % 에탄올로 댐의 복부 영역을 스프레이하고, 노광하는 복부 정중선을 따라 길이 2 cm 절개를자궁.
- 배아를 제거하고 차가운 해부 HBSS 버퍼와 10 cm 직경 페트리 접시에 각각의 사람을 배치합니다.
- 집게를 사용하여 목에 의한 배아를 잡고 뇌 조직에서 소뇌 수준 및 섹션 아래의 중간 선에서 첫 번째 컷 권리를 만들기 위해 작은 가위를 사용합니다. 배아 목을 벨하지 마십시오.
- 모든 방법 배아 뇌의 주동이의 부분을 통해, 오픈 절단 꼬리 지역에서 작은 가위의 오른쪽 끝을 삽입 (크로스 중간 선 안) 및 두개골베이스의 수준에서 왼쪽에 상처를합니다.
- 오른쪽에 컷을 다시 왼쪽 시저 팁을 삽입합니다. 전체 뇌가 쉽게 추출 옆으로 반전 될 수 있도록, 주동이의 끝에서 포경 두개골 뼈와 피부 조직의 좁은 밴드를 남겨주세요.
- HBSS 용액에 배아 뇌를 특종하기 위해 가위의 끝 부분을 사용합니다. 해부 현미경으로 뇌를 검사합니다. 뇌는 더 심한 컷 - 오에 그대로 있어야한다FF 지역.
- 모든 배아의 뇌를 수집하려면 다음 단계를 반복합니다.
- 20 ml의 차가운 HBSS 버퍼를 포함하는 새로운 배양 접시에있는 모든 그대로 뇌를 수집합니다. 해부 현미경 페트리 접시를 놓습니다.
- 복부 측면에서 뇌를 볼 수 있습니다. 꼬리 끝에 집게로 머리를 누른 상태에서 중간 주동이 점과 꼬리 - 시간 영역 사이 상처를 만들기 위해 대각선으로 날카로운 # 5 집게를 삽입합니다. 다른 반구에 대해이 작업을 반복합니다. 뇌간 조직의 나머지 부분에서 그대로 해마로, 별도의 두 반구를 절단 한 후.
- 뇌의 각각에 대해이 단계를 반복합니다.
- 모든 해부 반구를 수영장, # 5 핀셋 두 쌍을 사용하여 수막을 제거합니다.
- 측두엽 안쪽에 접혀 곡선 구조와 개발 해마를 확인합니다. 대뇌 피질 조직에서 인접 해마를 분리 핀셋 두 쌍 번갈아. 수집하고 모든 hippocam 수영장PI 조직 (도 1 참조).
단일 뉴런에 별도 8. 효소 소화,
- 플라스틱 전송 피펫을 사용하여 15 ML 원뿔 튜브에 0.25 % 트립신 + 1X의 DNase I 5 ml의 세척 매체를 포함하는 효소 소화 용액에 모든 해부 해마를 전송합니다.
- 수조의 내부 튜브를 넣고 5 분마다 한번 튜브 간헐적 부드러운 반전으로 25 분 동안 37 ℃에서 배양한다.
- 25 분 후, 조심스럽게 흡인 휴대용 플라스틱 피펫을 사용하여 효소 용액을 제거한다. 10 ml의 따뜻한 워시 매체를 추가하고 부드럽게 천천히 튜브 5 번 반전 조직을 씻는다. 워시 매체를 제거하고 추가 세척 다시 10 ml의 세척 매체를 추가 할 수 있습니다.
- 워시 매체를 제거하고 다시 신선한 따뜻한 세척 매체의 3 ㎖를 추가합니다. 조직에서 소화 신경을 제거하기 위해 손으로 엄격하게 15 번 튜브를 흔들어. 매체는 셀 번 혼탁이되어야세척 매체에 조직에서 분리 다시. 튜브의 나머지 조직을 남기면서 새로운 15ml의 원뿔형 튜브에 세포 현탁액을 수집한다.
- 조직에 또 다른 2 ml의 세척 매체를 추가하고 부드럽게 ~ 15 회 플라스틱 피펫을 통해 분쇄하여하여 나머지 조직을 분리합니다. 5 분 동안 앉아 보자. '흔들 오프'세포를 수집 포함 새로운 15 ML 원뿔 튜브에 세포 현탁액을 풀.
- 혈구와 신경 세포의 밀도를 계산합니다. 통상적으로, 마이크로 리터 당 3,000-5,000 해부 배아 세포의 수에 따라 얻을 수있다. 여섯 배아를 가정하는 것은 해부 경우 2.5 × 10 (7) 신경 세포의 평균 수는 추정된다.
- 30ml의 완전 배양 배지에 첨가 될 때 250,000 뉴런 / ml의 밀도를 산출이 세포 현탁액 필요한 부피를 계산한다. 고밀도 신경 도금 매체 수득 30 ㎖를 전체 배양액을 함유하는 두 개의 원뿔형 튜브 중 하나에이 볼륨. <리> 또 다른 30 ㎖이 고밀도 신경 용액 1.2 mL를 전송 완료 배양액 ~ 10,000 뉴런 / ㎖의 농도를 얻었다. 저밀도 된 커버 씨앗이 희석을 사용합니다.
신경 세포와 장기 공동 문화 9. 도금
- 세포 배양 후드로 고밀도 뉴런 에칭 바지와 24 개의 웰 플레이트를 준비한다. 진공 청소기를 이용하여 300 ㎕의 전제 조건 매체를 제거합니다. 250,000 신경 세포 / ㎖에서 0.6 ml의 고밀도 세포 현탁액 플레이트.
- 문화 후드로 된 커버와 다른 두 24 웰 플레이트를 가지고, 진공하여 300 ㎕의 전제 조건 매체를 제거합니다. 24 개의 웰 플레이트 내부 커버 슬립 10,000 뉴런 / ㎖ 접시에 0.6 ml의 저밀도 세포 현탁액.
- 인큐베이터에 네 개의 24 웰 플레이트를 돌려줍니다. 2 시간 동안 앉아 보자.
- 고밀도 배양 신경 세포 부착과 저밀도 플립 커버 슬립. 뉴런 (즉, n은 서로 마주하고 있는지 확인) 유리 커버 슬립으로 구분 OT. 그런 다음 인큐베이터에 공동 문화 두 접시를 돌려줍니다.
10. 공동 문화 후원회
- 많은 다른 연구에 의해보고 된 원래의 전체 문화 매체의 50 %를 제거 할 필요가 없다 (5) 시험 관내 (DIV)의 날에 (자료 참조) 300 μL에게 신선한 피드 매체를 추가하여 공동 문화를 피드. 공급 매체는 15 μM 사이토 신 아라 비노 시드 (아-C, 5 μM의 최종 농도를 수득) 신경교 오염 확산 가능성을 최소화하기를 포함한다.
- 초기 공급에 따라, 매주 웰에 아라-C없이 300 ㎕의 신선한 피드 매체를 추가 할 수 있습니다. 배양 한 달 이상 보관한다 (DIV33에서 제 1 매질 절반으로 교체)는 하나 개월 시점 이상 매주 신선한 피드 배지로 배지의 절반을 교체한다. 형태 학적, 고밀도 및 저밀도 뉴런 모두 최대 3 개월 (EXPER에 의해 관찰 된 가장 긴 시간으로 건강한 봐imenters).
실험 조작 낮은 밀도 신경 세포의 형질 11. 그림
주 : 저밀도 뉴런 형질 원하는 경우, 간단한 인산 칼슘 프로토콜을 채용 할 수있다. 우리는 저밀도 배양 DIV12 전에 인산 칼슘 형질 감염 프로토콜 나은 효율을 발견했지만, 그것들은이 기간 동안 돌기 쪽이 두드러진다 DIV21 이상 훨씬 낮은 효율로 형질 감염 될 수있다. 배양 된 저밀도 신경 세포의 형질 전환의 가능성이 및 pEGFP-C3 플라스미드와 신경 세포를 형질 감염에 의해 설명된다 (아래 참조).
- DIV21에서 공동 배양의 각 웰에서 배지를 조절 600 μL를 제거하고 새로운 24- 웰 플레이트로 옮긴다. 그런 다음 다시 원래 볼륨으로 가져옵니다 공동 문화 600 μL 신선한 피드 매체를 추가 할 수 있습니다.
- 매체 조절 600 μL와 새로운 24 웰 플레이트에 커버 슬립을 전송합니다. 확인저밀도 신경 세포가 위쪽으로 직면하고있다. 고밀도 판 다시 인큐베이터에서 커버 슬립과 함께 새로운 판을 놓습니다.
- 이 1.5 ml의를 멸균 튜브를 준비합니다. 하나의 튜브에 600 ㎕의 2 배 HEPES은 염분 (HBS) 솔루션을 버퍼에 추가합니다. 플라스미드 농도에 기초하여 12 μg의 DNA 및 pEGFP-C3의 체적을 계산한다. 다른 관에서 74 μL 염화칼슘 (2) (2 M 주)와 플라스미드를 추가 한 후 600 μl를 만들 것입니다 물의 부피를 추가합니다. 피펫으로 잘 혼합 한 후 플라스미드 DNA를 추가합니다. 천천히 잘 섞는다. 두 튜브는 실온에서 5 분 동안 앉아 보자.
- 2X HBS 튜브를 손-잡고 적당히 믹서에 솔루션을 교반하면서, 600 μL 2X HBS 튜브에 드롭하여 DNA-CaCl2를 솔루션 드롭 μL (600)을 모두 추가 할 수 있습니다. 이 침전물은 '고운 모래'과립 형상 인 것이 중요하다. 좀 더 가능성이 큰 '눈 flake' 같은 침전물을 생성하기 때문에 너무 강하고 너무 빨리 믹싱, whic 바람직하지 않다시간은 우리의 관찰에 따라 크게 낮은 형질 전환 효율을 가지고있다.
- 침전물을 실온에서 30 분 동안 어두운 데에서 형성 계속하자.
- 커버 슬립에 저밀도 신경 세포를 포함하는 각 웰에 100 ㎕의 침전물을 추가, 균등 드롭에 의해 놓습니다. 인큐베이터 판을 반환하고, 2 시간 동안 품어. 염화칼슘이 대부분의 가정이 장기간 배양 다음 뉴런에 독성 일 수있다 ~ 17.6 mM의 칼슘 이온의 농도 결과, 유리 형태이다.
- ~ 50 ㎖ 세척 매체와 50 ML 원뿔 튜브를 준비 37 ° C로 예열.
- 2 시간의 끝에서, 후드 내로 DNA 침전 칼슘 포스페이트 저밀도 뉴런을 가져온다. 날카로운 # 5 집게와 각 커버 슬립을 선택하고, 간단히 씻어 50 ㎖ 세척 매체에 세 번 찍어. 이어서 저밀도 뉴런 아래쪽을 향 원래 공동 배양 플레이트에서 고밀도 뉴런에 반환.
- 까지 문화를 계속커버 슬립에 저밀도 배양 신경 연구를 위해 수확한다.
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Representative Results
여기에 설명 된 프로토콜은 급전 층으로서 신경교 세포 없이도 성공적인 초 저밀도 순수한 글루타메이트 성 신경 세포의 장기간 배양 할 수있다. 프로토콜은 수 단품 (폴리 D 라이신 코팅 된 커버 글라스에) (24 웰 코팅 폴리 D 라이신)에 고밀도의 제조 저밀도 뉴런을 포함한다도 1에 도식화하고 후속 공동 문화 3 개월까지 유지 될 수있다.
도 2a 및도 2b는 도금 후 5 일에 고밀도 및 저밀도 뉴런의 도면이다. 저밀도 문화는 밀도의 약 30 배 이하이다. Kaech와 뱅커 (2006)에 의해 설명 된대로 두 신경 세포는 전형적인 발달 단계를 겪는다. DIC 이미지 (도 2C에 의해 계시 14 일째에, 고밀도 및 저밀도 뉴런 모두 정교한 수지상 구조를 보여D는) 식각의 위치로 도시 된 바와 같이 두 패널은, 서로 다른 초점 비행기와 같은 분야에서 양해. 총 수지상 길이 (t (16) = 1.41, p> 0.05, 이러한 신경 세포는 수상 돌기, 수상 돌기 (수상 돌기 끝 번호에 의해 측정 t (13) = 1.27, p> 0.05)의 수에 유의 한 차이를 나타 내기 위해 MAP2 항체로 염색하는 경우 ) 고밀도 및 저밀도 신경 세포 사이의 신경 세포 당 (그림 2E, F) 발견된다.
면역 세포의 표지는 기능 글루타메이트 시냅스를 나타 내기 위해 사용된다. 우리는 NMDA 수용체의 서브 유닛 NR1 및 AMPA 수용체의 서브 유닛하는 GluR1 (그림 3A)를 쉽게 식별 할 수 있습니다 기능 시냅스 (노란색 공동 현지화 puncta의)를 레이블을 두 번 염색을 사용 ImageJ에를 사용하여 정량화. 저밀도 뉴런은 또한 돌기 단백질 MAP2 마커에 대한 항체로 표지되고축삭 단백질 마커 P-타우와 함께. 이 이중 라벨은 수지상 및 축삭 (그림 3B)의 명확한 구별을 할 수 있습니다. 형질 전환 속도가 전형적 (DIV21에서 형질 <0.2 % 뉴런) 후반부 매우 낮지 만 저밀도 배양 성공적 인산 칼슘 법을 사용하여 DNA 플라스미드로 형질 감염 될 수있다.도 3c는 EGFP 형질 신경 세포 형태를 공개하고 수 도시 미세 돌기 척추의 구조를 볼 수 렌더링합니다. 마지막으로, 개념의 증거로, 매우 낮은 밀도의 뉴런은 autapse 형성 (그림 3D)를 촉진 조건 하에서 성장시킬 수있다. 폴리 D 라이신 코팅 된 "마이크로 섬"에 성장이 매우 낮은 밀도 autaptic 뉴런이 공 배양 프로토콜 2 개월 이내에 고밀도 공급기 신경에 의해 유지 될 수있다.
<강한> 그림 1. 도식 고밀도 및 저밀도 공동 문화 프로토콜의 그림입니다. (A) E16.5-E17.5 마우스 배아의 뇌는 수집 해마 밖으로 해부 및 트립신으로 분해된다. (B)는 단일 소화 해마 뉴런으로 분리, 세정 한 후, 24 웰 플레이트에 (250,000 세포 / ㎖)를 고밀도로 도금; 한편, 저밀도 (10,000 세포 / ㎖) 뉴런 된 커버에 도금되어있다. 고밀도 배양 웰은 커버 슬립을위한 높은지지를 제공하기 위해 18 G 주사기 바늘로 에칭된다. 공동 문화의 (C) 그림. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
도 2 모두 고밀도 및 저밀도 뉴런 공동했다공동 배양 mparable 형태 개발. (A, B), 고밀도 및 저밀도 층 모두 도금 밀도를 나타내는 현미경 사진. 광범위한 높은 (C) 모두에서 신경 돌기의 성장과 낮은 밀도 (D) 뉴런을 보여주는 (C, D) DIC 이미지. 커버 슬립에 저밀도 뉴런 오른쪽 고밀도 뉴런 위에 쉬고있다. 제기 플라스틱 지원의 위치를 확인합니다. 수지상 단백질 MAP2의 (E) 면역 세포 화학 라벨. (F) 정량 총 수지상 길이와 신경 세포 당 수지상 팁 수의 (± SEM을 의미). 유의 한 차이 (NS)는 높은 밀도와 공동 문화에서 자란 저밀도 신경 세포 사이에 보이지 않았다. (B, D), 100 μm의. 규모 표시 줄 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
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그림 공동 문화에서 자란 저밀도 신경 3. 실험 조작. 저밀도 문화 (A) 면역 세포 화학 라벨링하는 GluR1 (녹색) 및 NR1 (적색)의 공동 라벨에 의해 정의 된 기능 시냅스의 식별을 할 수 있습니다. (B) 신경 세포의 수지상 단백질 MAP2 (마젠타)의 공동 라벨링 및 축삭 단백질 P-타우 (녹색). 넘치 돌기 쪽을 보여주는 (C) 및 pEGFP-C3 플라스미드로 형질 저밀도 해마 신경 세포. (D) 폴리 D 라이신 '마이크로 섬'에서 제조 된 저밀도 뉴런 및 고밀도 뉴런 위에 성장. 기록 패치 전극은 신경 세포의 형태를 나타 내기 위해 알렉사-555 하이 드라 자이드와 신경 세포를 채 웁니다. AD의 스케일 바, 20 μm의.7fig3large.jpg "대상 ="_ 빈 ">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
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Discussion
우리는 무 혈청 조건에서 매우 낮은 밀도 해마 글루타메이트 신경 세포의 장기 문화에 대한 자세한 프로토콜을 제시한다. 뉴런 ~ 2,000 / cm 2, 밀도 또는 기존 문헌에서보고 2,3,11,13,14 신경교 지원없이 대부분 '저밀도'배양 제제보다 적어도 두 배 더 낮다에서. 초 저밀도 할뿐만 아니라,이 프로토콜은 소설과 두 개 더 가지 방법으로 중요하다. 저밀도 뉴런 가까운 물리적 근접도 내에 고밀도 뉴런 영양 인자 지원을받는 첫째, 더 신경교 세포층 더 시냅스 연결하거나 상이한 밀도에서 배양 한 신경 세포 간의 직접적인 접촉이 없더라도 필요하지 않다. 이 프로토콜은 미리 계획된 배양 실험 아교 세포 단층을 준비하기위한 필요성을 제거하고, 고밀도 및 저밀도의 배양이 동시에 증가 할 수있다. 아교 세포 단층의 제조 시간과 L 일 수있다aborious, 대부분의 문헌은 신생아 쥐 강아지 피질 (2)를 사용합니다. 따라서, 단지 마우스로 작업 실험실, 이것은 상당한 추가 노력이 필요합니다. 이 뉴런, 아교 세포 또는 이들 세포 유형 (10) 사이의 상호 작용에 특히 관찰 돌리는 효과를 방지하기 때문에 더욱 중요한 신경 특정 메커니즘을 조사 하였다 실험에서 공동 배양 아교 세포의 존재는 바람직하지 않을 수있다. 또한 신경교 배양 혈청 보충 필수 2,15이며,이 신경교 - 뉴런 공 배양을 오염 추가 교란 요소를 도입 할 수있다. 우리의 프로토콜의 하나의 중요한 특징은 공동 배양 한정 배지 조건 때문이다. 우리는 엄격 혈청 보충제없이 완전한 배양 배지를 사용하고, 실험의 대부분을 충족해야하는 배양 배지 교환 스케줄 무시한 경우, 공 배양 석 달 이상으로 유지 될 수 있다는 발견. 아니 사실상 있기 때문에아교 세포의 존재는이 기술의 한 가지 제한은 아교 세포 - 신경 세포의 공동 문화를 사용하는 문학의 결과와 비교할 때주의가 행사해야한다는 것입니다.
이 프로토콜의 또 다른 신규 한 특징은, 우리는 24- 웰 플레이트의 바닥 위에 성장 고밀도 뉴런 간의 효과적인 미세 공간 및 오른쪽 위에 앉아 커버 글라스에 부착 저밀도 뉴런을 생성하는 간단한 방법을 사용한다는 것이다. 이전 연구는 아교 세포 영양 세포층 2,8,9 위 500 μm의 ~에 커버 슬립을 높이기 위해 코팅 된 커버에 적용 파라핀 점을 사용합니다. 파라핀 점의 준비 노력과 실천의 합리적인 금액을 요구하고 적당한 크기와 적당한 온도가 필요합니다. 비교, 18 G 바늘 잘 하단 플라스틱에 대한 간단한 에칭 뉴런의 두 층 사이의 커버 슬립에 대한 지원뿐만 아니라 좋은 분리를 제공합니다. 우리는 LIN를 결정하는 디지털 Z 측정기 패치 클램프 기록 장비를 사용한이어 높은 밀도 후 60X 수침 목적을 이용한 저밀도 층에 집중하여 뉴런의 두 층 사이의 공간 및 공간은 일반적으로 150 ~ 200 μm의 (179.4 +/- 25.3 μm의 N = 5 인 것으로 ). (왁스 도트 생성과 비교)이 좁은 공간에 따라서 성장 된 저밀도의 신경 세포에 대한 충분한지지를 제공하고, 빠르게 증가하고, 신경 영양 인자의 더 높은 농도로 변환 할 가능성이있다. 이 좁은 공간이 배지 교환의 속도에 대한과 작은 공간이 산소와 영양 지원을 얻는에서 뉴런을 방해하는지 의문을 제기 할 수 있지만, 우리의 결과는이 가능성이 우려 아니라는 것을 보여줍니다. 반면에, 우리는 커버 슬립 하의 고밀도 뉴런 같은 제조에서뿐만없이 고밀도 뉴런과 비교하여 더 나은 (더 높은 생존율, 더 정교한 수지상 트리 NR1 염색으로 더 시냅스 puncta에 도시되지 않은 데이터)를 성장할 것으로 오버레이 COVerslips. 따라서, 이러한 간단한 프로토콜뿐만 아니라 신속하고 간단하게 할뿐만 아니라 고밀도 및 저밀도 뉴런 모두 유지에 매우 효과적이다.
체외에서 해마 신경 세포를 배양하는 폴리 D 라이신 및 / 또는 라미닌 / 콜라겐 5,16와 같은 성장 촉진 기판의 코팅이 필요합니다. 세심한 선택 및 커버 글라스의 제조 효과적인 신경 세포의 생존에 중요하지만, 우리는 우리가 선택한 커버 유리, 70 % 에탄올로 철저하게 세척 따라서 가혹한 처리의 필요성을 부정 충분하다는 것을 발견 하였다 (예, 산에 끓는) 커버 슬립의. 커버 슬립을 에탄올로 세정하고, 진공 건조 후, 유리 인해 원래 소수성 코팅 보인다. 그러나, 0.1 mg을 성공적으로 코팅 / 커버 슬립이 세정 물을 균일 한 층으로부터 촬상 될 때 그 균등하게되도록, 유리 표면을 친수성한다 보레이트 완충액 ml의 폴리 D 라이신전체 유리 표면에 걸쳐 확산하는 것이 관찰 될 수있다. 우리는 이것이 매우 중요하다는 것을 발견했다. 그렇지 않으면 신경이 가장 가능성이 충분 코팅으로 인해 도금 후 죽을 것이다. 단 저밀도 해마 뉴런이 프로토콜 시험이지만, 다른 신경 세포 유형 (예, 피질 뉴런 소뇌 과립 뉴런 또는 특수 신경 집단)도 고밀도 신경 공급기의 존재 하에서 저밀도에서 유지 될 수있을 것으로 기대된다 층. 이 간단한 프로토콜을 준수하는 경우 마지막으로, 하나는 건강한 초 저밀도 신경을 수확 할 것으로 예상 할 수 있습니다. 이러한 면역 세포 라벨링, 라이브 영상, 형태 학적 연구와 전기 생리학 녹음 등의 광범위한 응용 프로그램은 모든 표준 절차 (16, 17) 다음이 신경 세포에 수행 될 수있다.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Neurobasal medium | Life Technologies | 21103-049 | Protect from light |
| B27 supplement | Life Technologies | 17504-044 | aliquot, store in 0.6ml size |
| GlutaMAX-I | Life Technologies | 35050-061 | dilute 100X |
| antibiotic-antimycotic (AA) | Life Technologies | 15240-096 | dilute 100X |
| Complete Culture medium | Neurobasal medium with 1X B27, 1X AA, 1X GlutaMAX-I | ||
| Wash medium | same as 'Neurobasal medium' | ||
| Feed medium | Neurobasal with 1X B27 supplement | ||
| DNAse I | Sigma-Aldrich | D5025 | prepare 100X stock at 0.6mg/ml |
| poly-D-lysine | Sigma-Aldrich | P6407 | M.W. 70000-150000 |
| borate buffer | Sigma-Aldrich | B6768 (boric acid); 71997(borax) | 1.24g boric acid & 1.9g borax in 400ml H2O, pH to 8.5 use HCl |
| 12-mm round glass coverslips | Glasswarenfabrik Karl Hecht GmbH | 1001/12 | No. 1 glass, purchase from Carolina Biological Supply |
| proFection transfection kit | Promega | E1200 | see protocol for details |
| 2X HEPES buffered saline (HBS) | Promega | E1200 | see protocol for details |
| Syringe filter | Pall Corporation | 4192 | 0.2um pore size |
| Endofree plasmid prep kit | Qiagen | 12362 | for preparation of transfection grade plasmid DNA |
| anti-MAP2 antibody | Millipore | MAB3418 | mouse antibody, clone AP20 |
| anti-p-Tau antibody | Millipore | AB10417 | rabbit polyclonal antibody |
| anti-NR1 antibody | Millipore | MAB1586 | mouse antibody, clone R1JHL |
| anti-GluR1 antibody | Millipore | AB1504 | rabbit polyclonal antibody |
| Hank's balanced salt solution | ThermoFisher | 14025092 | 500ml size |
References
- Banker, G. Cultureing Nerve Cells. , 2nd edition, 339-370 (1998).
- Kaech, S., Banker, G.
- Petersen, J. D., Kaech, S., Banker, G. Selective microtubule-based transport of dendritic membrane proteins arises in concert with axon specification. J Neurosci. 34, 4135-4147 (2014).
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