Abstract
इन विट्रो में प्राथमिक hippocampal न्यूरॉन्स संवर्धन न्यूरोनल विकास के कई पहलुओं की यंत्रवत पूछताछ की सुविधा। अलग भ्रूण hippocampal न्यूरॉन्स अक्सर सीरम मुक्त शर्तों के तहत उच्च घनत्व में कांच coverslips पर सफलतापूर्वक विकसित कर सकते हैं, लेकिन आम तौर पर कम घनत्व संस्कृतियों से पौष्टिकता संबंधी कारकों में से एक की आपूर्ति की आवश्यकता है उन्हें एक glia फीडर परत, जो तैयारी के समय लेने वाली हो सकता है के साथ सह संवर्धन और श्रमसाध्य। इसके अलावा, glia की उपस्थिति परिणाम और न्यूरॉन विशिष्ट तंत्र पर रोकना अध्ययन की व्याख्या उलझाना सकता है। इधर, एक सरल विधि अल्ट्रा कम घनत्व (~ 2,000 न्यूरॉन्स / 2 सेमी), लंबी अवधि (> 3 महीने) प्राथमिक हिप्पोकैम्पस न्यूरॉन संस्कृति है कि सीरम मुक्त शर्तों के तहत और glia सेल समर्थन के बिना के लिए प्रस्तुत किया है। कम घनत्व न्यूरॉन्स पाली डी lysine लेपित coverslips पर हो, और उच्च घनत्व 24 अच्छी तरह से थाली में उगाया न्यूरॉन्स पर फ़्लिप हैं। इसके बजाय betwee एक जगह बनाने के लिए पैराफिन डॉट्स का उपयोग करने काn दो न्यूरोनल परतों, प्रयोगकर्ताओं बस अच्छी तरह से प्लास्टिक के नीचे है, जिस पर उच्च घनत्व न्यूरॉन्स रहते एक microspace कम घनत्व न्यूरॉन विकास के लिए अनुकूल बनाने के लिए खोदना कर सकते हैं। सह संस्कृति को आसानी से कम घनत्व न्यूरॉन्स की महत्वपूर्ण नुकसान के बिना> 3 महीने के लिए बनाए रखा जा सकता है, इस प्रकार इन न्यूरॉन्स की रूपात्मक और शारीरिक अध्ययन की सुविधा। इस सफल संस्कृति हालत उदाहरण देकर स्पष्ट करने के लिए, डेटा लंबे समय तक संस्कृति के बाद कम घनत्व कोशिकाओं में विपुल synapse गठन को दिखाने के लिए प्रदान की जाती हैं। इस प्रणाली सह संस्कृति भी विरल व्यक्ति पाली डी lysine substrates और इस प्रकार autaptic कनेक्शन के गठन के द्वीपों में उगाया न्यूरॉन्स के अस्तित्व की सुविधा।
Introduction
इन विट्रो की शर्तों के तहत hippocampal न्यूरॉन्स बढ़ते अवलोकन और इन न्यूरॉन्स कि अन्यथा विवो में संभव नहीं हैं की प्रयोगात्मक हेरफेर सक्षम बनाता है। इस प्रयोगात्मक दृष्टिकोण व्यापक रूप से विकास, polarity, neurite विनिर्देश, तस्करी और प्रोटीन की subcellular स्थानीयकरण, synapse गठन और कार्यात्मक परिपक्वता 1 के neuronal तंत्र प्रकट करने के लिए प्रयोग किया जाता है। इन विट्रो में संवर्धित hippocampal न्यूरॉन्स, जब देर से भ्रूण चरणों से काटा, अपेक्षाकृत शुद्ध पिरामिड आकृति विज्ञान के 2 (> 90%) ग्लूटामेटरगिक कोशिकाओं रहे हैं। क्योंकि न्यूरॉन्स इन विट्रो परिस्थितियों में एक 2-डी सतह में बड़े हो रहे थे, इस विधि इस तरह के लाइव इमेजिंग या immunocytochemistry (आईसीसी) के रूप में आसान अवलोकन की अनुमति देता है एक ही फोकल हवाई जहाज़ से 3 को धुंधला हो जाना; या ऐसी दवा उपचार और transfections 3-6 के रूप में जोड़तोड़। जब उच्च घनत्व में वृद्धि हुई, न्यूरॉन्स उच्च सह अस्तित्व की उच्च दर की वजह से हो जाते हैंविकास मीडिया से, और भी neurite संपर्क-निर्भर तंत्र 7 की वजह से पाचन समर्थन के अलावा में secreted वृद्धि कारकों की ncentrations। हालांकि, कम घनत्व hippocampal न्यूरॉन्स रूपात्मक अध्ययन, जहां एक व्यक्ति न्यूरॉन अपनी संपूर्णता में imaged किया जा सकता है या आईसीसी के विश्लेषण के लिए दाग के लिए वांछित हैं। कम घनत्व न्यूरॉन्स पैराक्राइन समर्थन की कमी के कारण संस्कृति में बनाए रखने के लिए मेहनत कर रहे हैं और इस प्रकार अक्सर एक glial (आमतौर पर cortical astrocyte) फीडर परत है, जो न्यूरॉन संस्कृति 2 से पहले तैयार हो गया है पौष्टिकता से समर्थन की आवश्यकता है। जब सह-सुसंस्कृत एक glial सेल फीडर परत के साथ, कम घनत्व न्यूरॉन्स coverslips पर बड़े हो रहे हैं, और फिर glia परत के शीर्ष पर फ़्लिप किया है, ताकि कम घनत्व न्यूरॉन्स और glia एक दूसरे का सामना कर रहे हैं। Glia और न्यूरॉन्स के बीच एक छोटा सा सीमित स्थान coverslips के कोनों पर पैराफिन मोम डॉट्स रखने, इसलिए एक 'सैंडविच' लेआउट 2,8,9 बनाने के द्वारा बनाई गई है। कम घनत्व न्यूरॉन्स डब्ल्यू विकसित होगाglia और coverslip, जो न्यूरॉन्स और glia द्वारा स्रावित केंद्रित कारकों के साथ एक अनुमोदक microenvironment बनाता बीच सीमित स्थान Ithin। यह दृष्टिकोण कम घनत्व, पूरी तरह से विकसित न्यूरॉन्स कि यथोचित अलग स्थान है, इसलिए आईसीसी की सुविधा लेबलिंग या लाइव इमेजिंग अध्ययन अर्जित करता है।
न्यूरॉन glia सह संस्कृति का एक स्पष्ट दोष यह है, एक तरफ समय लेने वाली और श्रमसाध्य जा रहा है, कि यह न्यूरॉन विशिष्ट, या सेल स्वायत्त तंत्र के अध्ययन से बचाता है। हालांकि इस प्रणाली में अब तक कम से कम जटिल है विवो तंत्रिका ऊतक, स्रावित, नहीं, अभी तक पूरी तरह से परिभाषित कारकों के माध्यम से न्यूरॉन विकास पर प्रभाव glia प्रयोगों 10 उलझाना कर सकते हैं। इसलिए, प्रयोगों कि न्यूरॉन विशिष्ट तंत्र की जांच, परिभाषित संस्कृति की स्थिति को दूर सीरम और glial समर्थन परत जरूरी हैं की आवश्यकता होती है। पिछले एक अध्ययन न्यूरॉन्स की कम मात्रा (~ 9000 कोशिकाओं / 2 सेमी) एक वें का उपयोग कर संवर्धन में सफल रहा हैREE आयामी हाइड्रोजेल मैट्रिक्स 11। चूंकि एक अपेक्षाकृत शुद्ध न्यूरोनल जनसंख्या glial समर्थन के बिना सीरम मुक्त शर्तों के तहत उच्च घनत्व में संवर्धित किया जा सकता है, हम परिकल्पना है कि hippocampal न्यूरॉन्स की अल्ट्रा कम घनत्व से सीरम मुक्त परिभाषित संस्कृति के माध्यम में उगाया जा सकता है उन्हें उच्च घनत्व न्यूरॉन्स के साथ सह संवर्धन में एक तरीका है कि पारंपरिक अपनाया न्यूरॉन glia सह संस्कृति के अनुरूप है। दरअसल, एक 'सैंडविच' विन्यास में उच्च घनत्व हिप्पोकैम्पस न्यूरॉन संस्कृतियों हाल ही में अंत: स्रावी magnocellular न्यूरॉन्स 12 विशेष की एक छोटी संख्या का समर्थन करने के लिए इस्तेमाल किया गया है।
इसलिए, उच्च घनत्व न्यूरॉन्स के साथ सह संस्कृति कम घनत्व न्यूरॉन्स पौष्टिकता संबंधी कारकों समर्थन है कि लंबे समय तक जीवित रहने के लिए सक्षम करने के लिए पर्याप्त है प्राप्त करने की अनुमति हो सकती है। संवर्धन अल्ट्रा कम घनत्व न्यूरॉन्स की इस प्रोटोकॉल इस प्रकार तैयार की है और मान्य किया गया था। प्रोटोकॉल, एक ही प्रयोग के भीतर लागू किया जा सकता उच्च घनत्व तैयार करके (~ 250,000 कोशिकाओं / एमएल) जिलेsociated hippocampal न्यूरॉन्स पहले, और फिर एक घनत्व ~ 10,000 न्यूरॉन्स उपज के लिए एक कमजोर पड़ने बनाने / एमएल (~ 3,000 न्यूरॉन्स / coverslip, या ~ 2,000 न्यूरॉन्स / 2 सेमी) है, जो बहुत कम की तुलना में सबसे कम घनत्व संस्कृतियों की सूचना दी है 2,3,9 , 11,13। इस संस्कृति हालत शिथिल 'अल्ट्रा कम घनत्व' संस्कृति के रूप में करने के लिए भेजा और 'कम-घनत्व' अंतर-changeably के साथ प्रयोग किया जाता है। उच्च घनत्व न्यूरॉन्स पाली डी lysine लेपित 24 अच्छी तरह से प्लेटों पर चढ़ाया जाता है; जबकि कम घनत्व न्यूरॉन्स पाली डी lysine लेपित 12 मिमी कांच coverslips पर वरीयता प्राप्त कर रहे हैं एक और 24 अच्छी तरह से थाली के अंदर रखा जाता है। कम घनत्व न्यूरॉन्स पालन करने के साथ coverslips 2 घंटा बाद में उच्च घनत्व न्यूरॉन्स के शीर्ष पर फ़्लिप हैं न्यूरॉन्स के बाद उतरा और coverslips से जुड़े होते हैं। इसके अलावा, बजाय उच्च घनत्व न्यूरॉन परत के ऊपर coverslips तरक्की के लिए पैराफिन मोम डॉट्स का उपयोग कर के, एक 18 जी सिरिंज सुई दो समानांतर धारियों के साथ 24 अच्छी तरह से प्लेट के नीचे खोदना करने के लिए इस्तेमाल किया गया था। जिसके परिणामस्वरूप displAced, आसपास के प्लास्टिक गिलास coverslips के लिए एक ऊंचा समर्थन प्रदान करते हैं। इस अंतरिक्ष लगातार 150-200 माइक्रोन, जो पर्याप्त ऑक्सीजन और संस्कृति के माध्यम से आदान-प्रदान की अनुमति देता है, जबकि केंद्रित पौष्टिकता संबंधी कारकों के साथ एक microenvironment उपलब्ध कराने पर मापा जाता है। इस शर्त के तहत, कम घनत्व न्यूरॉन्स बड़े पैमाने पर हो जाना, और संस्कृति में तीन महीने से परे जीवित रह सकते हैं। इन न्यूरॉन्स संस्कृति में तीन सप्ताह के बाद GFP प्लाज्मिड के साथ ट्रांसफ़ेक्ट कर रहे हैं, डेन्ड्राइट दरियादिली से वृक्ष के समान कांटा के साथ जड़ी हैं। सिद्धांत का एक सबूत के रूप में, डेटा है कि इस प्रणाली सह संस्कृति पाली-D-लाइसिन 'सूक्ष्म द्वीप' है, जहां न्यूरॉन्स autaptic कनेक्शन है कि सेल की जांच की सुविधा हो सकती फार्म पर वरीयता प्राप्त hippocampal न्यूरॉन्स की अल्ट्रा कम घनत्व संस्कृतियों का समर्थन दिखाने के लिए प्रस्तुत कर रहे हैं -autonomous, नेटवर्क स्वतंत्र तंत्र।
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Protocol
सभी प्रयोगात्मक चूहों को शामिल प्रक्रियाओं एरिजोना विश्वविद्यालय की संस्थागत पशु की देखभाल और उपयोग समिति ने मंजूरी दे दी है, और एनआईएच दिशा निर्देशों के लिए पुष्टि कर रहे थे।
1. ऊतक हिप्पोकैम्पस न्यूरॉन संस्कृति के लिए स्रोत
- हिप्पोकैम्पस न्यूरॉन संस्कृति के लिए जन्म के पूर्व माउस पिल्ले उत्पन्न करने के लिए, समय गर्भवती चूहों (C57BL6 / जम्मू) उस घर में 17 पैदा कर रहे हैं का उपयोग करें। योनि प्लग का पता लगाने के साथ दिन E0.5 के रूप में नामित किया गया है। संस्कृति के लिए फसल समय की योजना बनाई E16.5-E17.5 है।
नोट: इस प्रोटोकॉल दो उच्च घनत्व न्यूरॉन्स कम घनत्व न्यूरॉन्स के साथ सह संवर्धन के दो 24 अच्छी तरह प्लेटें की संस्कृतियों का वर्णन (48 coverslips कुल)। अधिक प्लेटें, सामग्री और अभिकर्मकों के लिए तदनुसार बढ़ाया जा सकता है।
2. 24 अच्छी तरह प्लेटें उच्च घनत्व न्यूरॉन संस्कृतियों के लिए तैयारी
नोट: भ्रूण की योजना बनाई फसल से पहले निम्नलिखित कदम (2-3) दिन प्रदर्शन।
- दो 24 अच्छी तरह से ले आओसेल संस्कृति हुड में प्लेटें, व्यक्तिगत पैकेजिंग खुला।
- एक 1 मिलीलीटर की प्लास्टिक एकल उपयोग सिरिंज के लिए एक 18 जी सिरिंज सुई कनेक्ट।
- सिरिंज पकड़ो, और ~ 1 मिमी अच्छी तरह से नीचे के केंद्र के लिए छोड़ दिया पर सुई की नोक के उद्देश्य। अच्छी तरह से (~ 1 मिमी लंबे) के नीचे खोदना करने के लिए मध्यम बल (~ 250 ग्राम) को लागू करें। एक नाली का गठन किया जाएगा और प्लास्टिक सामग्री फ्लैट नीचे अच्छी तरह से सतह से ऊपर एक ऊंचा समर्थन बनेगी विस्थापित। एक समान तरीके से नीचे के केंद्र के अधिकार के लिए एक और ~ 1 मिमी लंबी ~ 1 मिमी पर समानांतर नाली खोदना।
- दो 24 अच्छी तरह प्लेटों के सभी कुओं के लिए इस चरण को दोहराएँ। दो 24 अच्छी तरह से उच्च घनत्व संस्कृति के लिए इस्तेमाल प्लेटों अब पाली डी lysine (नीचे कदम 3.8 देखें) के साथ कोटिंग के लिए तैयार हैं।
3. Coverslips कम घनत्व न्यूरॉन संस्कृतियों के लिए तैयारी
- 12 मिमी व्यास # 1 गोल कांच का प्रयोग करें।
- एक 100 मिमी व्यास बाँझ प्लास्टिक पेट्री डिश के अंदर 50 coverslips प्लेस, और coverslips डूब20 मिलीलीटर 70% इथेनॉल समाधान में। मध्यम (70 आरपीएम) एक घंटे के लिए गति रोटेशन के साथ एक घूर्णन मंच पर इस पेट्री डिश रखें। 70% इथेनॉल निकालें और फिर 70% इथेनॉल के एक ताजा बैच के साथ बदलें। बारी बारी से और एक घंटे के लिए धो लें।
- 70% इथेनॉल सफाई समाधान त्यागें। बाँझ पानी (0.2 माइक्रोन फिल्टर यूनिट के माध्यम से फ़िल्टर्ड) जोड़ें। हाथ से पेट्री डिश घूर्णन द्वारा कड़ाई से coverslips कुल्ला। तीन बार, हर बार नए सिरे से बाँझ पानी के साथ की जगह कुल्ला।
- लामिना का प्रवाह के साथ एक बाँझ सेल संस्कृति हुड के अंदर coverslips के साथ पेट्री डिश रखें। वैक्यूम लाइन के माध्यम से rinsing पानी Aspirate, और फ़िल्टर बाँझ पानी coverslips विसर्जित करने के लिए 10 मिलीलीटर जोड़ें। coverslips बाँझ होना चाहिए और सतह पाली डी lysine कोटिंग के लिए पर्याप्त स्वच्छ होना चाहिए।
- उनकी अलग-अलग पैकिंग से दो 24 अच्छी तरह प्लेटें ओपन, और उन्हें हुड में जगह है।
- हुड में निर्वात लाइन चालू करें। शून्य रेखा के लिए एक 200 μl विंदुक टिप कनेक्ट करें, और एक Scis का उपयोगसोर एक बड़ा खोलने बनाने के लिए टिप कटौती करने के लिए।
- पेट्री डिश, एक समय में एक से coverslips उठा, और पूरी तरह से coverslip सुखाने के लिए वैक्यूम लाइन का उपयोग करने के लिए एक ठीक-टिप # 5 चिमटी से नोचना का प्रयोग करें। फिर 24 अच्छी तरह से थाली के कुओं में से प्रत्येक में एक coverslip जगह। 50 से साफ coverslips दो 24 अच्छी तरह से प्लेटों के कुओं में से प्रत्येक को भरने के लिए पर्याप्त होना चाहिए।
- borate बफर (पीएच 8.5) के साथ काम कर समाधान (0.1 मिलीग्राम / एमएल) में पाली डी lysine शेयर समाधान (1 मिलीग्राम / एमएल) पतला। (Etched नीचे के साथ दो उच्च घनत्व प्लेटों सहित) चार 24 अच्छी तरह से प्लेटों के लिए, कुल काम समाधान के 30 मिलीलीटर की तैयारी।
- कांच coverslips के साथ प्रत्येक अच्छी तरह से करने के लिए 300 μl 0.1 मिलीग्राम / एमएल पाली डी lysine काम समाधान जोड़ें। यकीन coverslips पूरी तरह से समाधान में डूब रहे हैं। यदि नहीं, तो अच्छी तरह से नीचे के खिलाफ coverslips नीचे प्रेस करने के लिए # 5 चिमटी से नोचना टिप का उपयोग करें, और टिप का उपयोग पाली डी lysine समाधान coverslips के सभी सतह को कवर करने के लिए गाइड। दिखने में सु बनाने के लिए सभी coverslips का निरीक्षणकोई हवा पुन प्लेट और coverslips के बीच फंस गया था।
- जोड़े 300 μl 0.1 मिलीग्राम / एमएल पाली डी lysine नक्काशी नीचे के साथ उच्च घनत्व संस्कृति की थाली के प्रत्येक अच्छी तरह से काम समाधान। हाथ से बारी बारी से समाधान प्रसार करने के लिए अच्छी तरह से पूरे नीचे कवर करने के लिए।
- संस्कृति इनक्यूबेटर पाली डी lysine के साथ सभी चार प्लेटों लौटें, और सेते हे / एन।
संस्कृति के लिए 4. कपड़े धोने और पूर्व कंडीशनिंग प्लेट्स
नोट: निम्न चरणों (4-9) ऊतक फसल के दिन किया जाता है।
- बाद coverslips और 24 अच्छी तरह प्लेटें हे / एन के ऊष्मायन / कोटिंग, सभी चार प्लेटों संस्कृति हुड में (दाता coverslips, etched प्लास्टिक के नीचे के साथ दो स्वीकर्ता उच्च घनत्व प्लेटों के साथ दो) लाने के लिए। पाली डी lysine समाधान निकालने के लिए वैक्यूम लाइन का प्रयोग करें।
- इसके तत्काल बाद पाली डी lysine समाधान को हटाने के बाद, जोड़ने ~ 1 मिलीलीटर बाँझ पानी अच्छी तरह से प्रत्येक एक प्लास्टिक हस्तांतरण पिपेट का उपयोग करने के लिए। बाद सभी कुओं भर रहे हैंपानी के साथ, 10 मिनट के लिए खड़े हो जाओ। वैक्यूम से पानी निकालें, तो साथ (या कांच coverslips के बिना) अच्छी तरह से नीचे कवर करने के लिए प्रत्येक कुएं में 300 μl धो माध्यम जोड़ें। पाली डी lysine कोटिंग बाहर सूखी मत देना।
- सेल इनक्यूबेटर के लिए सभी चार प्लेटों लौटें। प्लेटों एक बार छितरी hippocampal न्यूरॉन्स तैयार कर रहे हैं का उपयोग करने के लिए तैयार हैं।
Enzymatic पाचन के लिए 5. पूरा मध्यम संस्कृति की तैयारी, और trypsin समाधान
- सामग्री (सामग्री देखें) के मिश्रण से 60 मिलीलीटर की पूरी संस्कृति के माध्यम से तैयार। एक 50 मिलीलीटर 0.2 माइक्रोन ताकना आकार सिरिंज फिल्टर के साथ जुड़ा हुआ सिरिंज का प्रयोग करें, दो 50 मिलीलीटर शंक्वाकार ट्यूब में पूर्ण संस्कृति के माध्यम से फिल्टर। प्रत्येक ट्यूब 30 मिलीलीटर संस्कृति के माध्यम से पूरा होता है।
- एक अलग 50 मिलीलीटर शंक्वाकार ट्यूब में जोड़ने ~ 30 मिलीलीटर धो मध्यम (सामग्री देखें) और 37 डिग्री सेल्सियस के लिए यह गर्म है। इस enzymatic पाचन के बाद ऊतक धोने के लिए इस्तेमाल किया जाएगा।
- एंजाइम पाचन के माध्यम से तैयार। एक 15 मीटर मेंएल शंक्वाकार ट्यूब, जोड़ने 4.5 मिलीलीटर धो मध्यम और 0.5 मिलीलीटर 2.5% trypsin समाधान, और 50 μl 100X DNase मैं
- पूर्ण संस्कृति के माध्यम से, धो मध्यम प्लेस, और एक 37 डिग्री सेल्सियस पानी के स्नान में पाचन मध्यम एंजाइम।
6. सर्जिकल उपकरणों की तैयारी
- एक नसबंदी थैली में सभी सर्जिकल उपकरण जीवाणुरहित: दो छोटे कैंची, संदंश की एक जोड़ी और दो # 5 चिमटी।
7. E16.5-E17.5 माउस भ्रूण, और हिप्पोकैम्पस के विच्छेदन से दिमाग का हटाया
- तैयार दो 10 सेमी पेट्री ठंडा, बाँझ हांक संतुलित नमक समाधान (HBSS) के साथ भरा बर्तन।
- (का एक मात्रा ~ 0.5 मिलीलीटर में 100 मिलीग्राम / किग्रा) सोडियम phenobarbital की intraperitoneal इंजेक्शन के साथ माउस बांध euthanize। इंजेक्शन के बाद, एक बार बांध पैर की अंगुली चुटकी के जवाब खो देता है, गर्भाशय ग्रीवा अव्यवस्था के साथ बलिदान।
- 70% इथेनॉल के साथ बांध के पेट क्षेत्र स्प्रे, और बेनकाब करने के लिए पेट के midline के साथ एक 2 सेमी लंबा चीरा बनानेगर्भाशय।
- भ्रूण निकालें और ठंड विदारक HBSS बफर के साथ एक 10 सेमी व्यास पेट्री डिश में अलग-अलग लोगों के लिए जगह है।
- गर्दन एक संदंश का उपयोग करके भ्रूण पकड़ो, और मस्तिष्क के ऊतकों भर में सेरिबैलम के स्तर पर और अनुभाग नीचे midline में पहली कट सही बनाने के लिए एक छोटी सी कैंची का उपयोग करें। भ्रूण सिर काटना नहीं है।
- भ्रूण के मस्तिष्क के व्याख्यान चबूतरे वाला भाग के माध्यम से सभी तरह, दुम क्षेत्र से छोटी कैंची है कि खुले में कटौती के दाईं ओर टिप डालें (पार midline नहीं है), और खोपड़ी के आधार के स्तर पर बाईं ओर एक काट कर।
- सही पक्ष पर एक कटौती करने के लिए बाईं ओर कैंची टिप फिर से डालें। व्याख्यान चबूतरे अंत में काटा हुआ खोपड़ी की हड्डी और त्वचा के ऊतकों की एक संकीर्ण बैंड को छोड़ दें, तो यह है कि पूरे दिमाग आसान निकासी के लिए अलग से फ़्लिप किया जा सकता है।
- HBSS समाधान में भ्रूण के मस्तिष्क बाहर निकालना कैंची की नोक का प्रयोग करें। एक विदारक माइक्रोस्कोप के तहत मस्तिष्क का निरीक्षण किया। मस्तिष्क कोई सकल कट ओ के साथ बरकरार होना चाहिएएफएफ क्षेत्रों के।
- सभी भ्रूण दिमाग को इकट्ठा करने के लिए इन चरणों को दोहराएँ।
- 20 मिलीलीटर ठंड HBSS बफर युक्त एक नया पेट्री डिश में सभी बरकरार दिमाग लीजिए। एक विच्छेदन खुर्दबीन के नीचे पेट्री डिश रखें।
- उदर की ओर से मस्तिष्क देखें। दुम अंत में संदंश के साथ मस्तिष्क नीचे पकड़े, तिरछे एक तेज # 5 चिमटी से नोचना डालने बीच व्याख्यान चबूतरे बिंदु और दुम लौकिक क्षेत्र के बीच एक कट बनाने के लिए। अन्य गोलार्द्ध के लिए इस दोहराएँ। ब्रेन स्टेम ऊतकों के बाकी हिस्सों से बरकरार हिप्पोकैम्पस के साथ काटने, अलग दो गोलार्द्धों के बाद।
- दिमाग से प्रत्येक के लिए इस दोहराएँ।
- सभी विच्छेदित गोलार्द्धों पूल, और # 5 चिमटी के दो जोड़े का उपयोग कर तानिका हटा दें।
- एक घुमावदार संरचना है कि टेम्पोरल लोब के अंदर जोड़ रहा है के रूप में विकसित हिप्पोकैम्पस को पहचानें। चिमटी के दो जोड़े वैकल्पिक cortical ऊतकों से सटे हिप्पोकैम्पस अलग करने के लिए। लीजिए और सभी hippocam पूलगड़बड़ी ऊतक (चित्रा 1 देखें)।
8. enzymatic पाचन, एकल न्यूरॉन्स में अलग-अलग
- एक प्लास्टिक हस्तांतरण पिपेट का उपयोग करना, 0.25% trypsin + एक 15 मिलीलीटर शंक्वाकार ट्यूब में 1X DNase मैं के साथ 5 मिलीलीटर धो मध्यम युक्त enzymatic पाचन समाधान में सभी विच्छेदित hippocampi हस्तांतरण।
- ट्यूब एक पानी के स्नान के अंदर जगह और 25 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर सेते रुक-रुक कर हल्की हर 5 मिनट में एक बार ट्यूब के साथ inverting।
- 25 मिनट के बाद, ध्यान से एंजाइम समाधान आकांक्षा से एक हाथ पकड़ा प्लास्टिक पिपेट का उपयोग कर हटा दें। 10 मिलीलीटर गर्म धो मध्यम जोड़ें और धीरे धीरे धीरे inverting ट्यूब 5 बार से ऊतक धो लें। धो माध्यम से निकालें, और एक अतिरिक्त धोने के लिए फिर से 10 मिलीलीटर धो माध्यम जोड़ें।
- धो माध्यम से निकालें, और फिर ताजा गर्म धो माध्यम के 3 मिलीलीटर जोड़ें। हाथ से ट्यूब हिला कड़ाई के लिए 15 बार के ऊतकों से पच न्यूरॉन्स को बेदखल करने के लिए। मध्यम एक बार कोशिकाओं को एक परेशान हो जाना चाहिएधो माध्यम में ऊतक से अलग हो रहे हैं। जबकि ट्यूब में शेष ऊतक छोड़ने एक नया 15 मिलीलीटर शंक्वाकार ट्यूब में सेल निलंबन लीजिए।
- ऊतक के लिए एक और 2 मिलीलीटर धो मध्यम जोड़ें, और धीरे ~ 15 बार के लिए एक प्लास्टिक पिपेट के माध्यम से triturating द्वारा शेष ऊतक अलग। 5 मिनट के लिए बैठते हैं। नया 15 मिलीलीटर शंक्वाकार ट्यूब एकत्र होता है कि 'हिला-बंद' कोशिकाओं में सेल निलंबन पूल।
- एक hemocytometer साथ न्यूरॉन्स के घनत्व की गणना करें। आमतौर पर, microliter प्रति 3,000-5,000 कोशिकाओं विच्छेदित भ्रूण की संख्या के आधार पर प्राप्त किया जा सकता है। 2.5 10 x 7 न्यूरॉन्स की एक औसत संख्या का अनुमान है कि अगर छह भ्रूण संभालने विच्छेदित कर रहे हैं।
- जब 30 मिलीलीटर की मात्रा पूरी संस्कृति माध्यम से जोड़ा 250,000 न्यूरॉन्स / एमएल के एक घनत्व उपज के लिए इस सेल निलंबन की जरूरत की गणना। दो शंक्वाकार 30 मिलीलीटर युक्त पूर्ण संस्कृति के माध्यम से उच्च घनत्व न्यूरॉन चढ़ाना मध्यम उपज के लिए ट्यूबों में से एक को यह मात्रा में जोड़ें। <li> एक और 30 मिलीलीटर के लिए इस उच्च घनत्व न्यूरॉन समाधान के स्थानांतरण 1.2 एमएल पूरा संस्कृति के माध्यम ~ 10,000 न्यूरॉन्स / एमएल की एकाग्रता उपज के लिए। कम घनत्व coverslips वंश को यह कमजोर पड़ने का प्रयोग करें।
9. न्यूरॉन्स और लंबी अवधि के सह-संस्कृति का चढ़ाना
- सेल संस्कृति हुड में उच्च घनत्व न्यूरॉन्स के लिए नक्काशी पैंदा के साथ दो 24 अच्छी तरह प्लेटें ले आओ। वैक्यूम द्वारा 300 μl पूर्व शर्त के माध्यम से निकालें। 250,000 न्यूरॉन्स / एमएल पर थाली 0.6 मिलीलीटर उच्च घनत्व सेल निलंबन।
- संस्कृति हुड में coverslips के साथ अन्य दो 24 अच्छी तरह प्लेटें ले आओ, और वैक्यूम द्वारा 300 μl पूर्व शर्त मध्यम निकालें। प्लेट 0.6 मिलीलीटर दो 24 अच्छी तरह प्लेटें अंदर coverslips पर 10,000 न्यूरॉन्स / मिलीलीटर में कम घनत्व सेल निलंबन।
- इनक्यूबेटर सभी चार 24 अच्छी तरह प्लेटें लौटें। 2 घंटे के लिए बैठते हैं।
- उच्च घनत्व संस्कृति के न्यूरॉन्स पालन करने के साथ कम घनत्व coverslips पलटें। सुनिश्चित करें कि न्यूरॉन्स एक दूसरे का सामना कर रहे हैं (यानी, एन बनाओगिलास coverslip के द्वारा अलग ओटी)। तब इनक्यूबेटर सह संस्कृति के साथ दो प्लेटें लौटें।
10 सह संस्कृति कायम रखना
- 300 μl ताजा फ़ीड मध्यम (देखें सामग्री) इन विट्रो (DIV) में दिन में जोड़ने 5. वहाँ मूल पूर्ण संस्कृति के माध्यम से 50% को दूर करने के लिए कोई ज़रूरत नहीं है, के रूप में कई अन्य अध्ययनों द्वारा सूचना दी है द्वारा फीड सह संस्कृतियों। खिला मध्यम भी 15 माइक्रोन के साइटोसिन arabinoside (आरा-सी, 5 सुक्ष्ममापी के अंतिम एकाग्रता उपज के लिए) glia प्रदूषण और प्रसार की संभावना को कम करने के लिए होता है।
- इस प्रारंभिक खिलाने के बाद, हर हफ्ते अच्छी तरह से करने के लिए आरा-सी के बिना 300 μl ताजा फ़ीड के माध्यम जोड़ें। संस्कृति और अधिक से अधिक एक महीने के लिए रखा जाना चाहिए, हर हफ्ते ताजा फ़ीड माध्यम के साथ मध्यम के आधे की जगह एक माह के समय बिंदु से आगे (DIV33 में पहली मध्यम आधा प्रतिस्थापन के साथ)। आकृति विज्ञान, दोनों उच्च घनत्व और कम घनत्व न्यूरॉन्स को तीन महीने (सबसे लंबे समय के अनुभव से मनाया करने के लिए स्वस्थ लग रहेimenters)।
11. एक प्रायोगिक हेरफेर-कम घनत्व न्यूरॉन अभिकर्मक का चित्रण
नोट: जब कम घनत्व न्यूरॉन्स में अभिकर्मक वांछित है, एक सरल कैल्शियम फास्फेट प्रोटोकॉल को अपनाया जा सकता है। हमने पाया है कि कम घनत्व संस्कृतियों DIV12 पहले कैल्शियम फास्फेट प्रोटोकॉल के साथ बेहतर अभिकर्मक दक्षता है, लेकिन वे DIV21 या पुराने पर बहुत कम दक्षता, जो समय के दौरान वृक्ष के समान कांटा प्रमुख हैं साथ ट्रांसफ़ेक्ट किया जा सकता है। सुसंस्कृत कम घनत्व न्यूरॉन के अभिकर्मक की व्यवहार्यता का एक pEGFP-सी 3 प्लाज्मिड के साथ न्यूरॉन्स transfecting से यह साफ है (देखें नीचे)।
- DIV21 में सह संस्कृति के प्रत्येक अच्छी तरह से वातानुकूलित माध्यम से 600 μl हटाने, और एक नया 24 अच्छी तरह से थाली को हस्तांतरण। फिर इसे वापस मूल मात्रा में लाने के लिए सह संस्कृति के लिए 600 μl ताजा फ़ीड के माध्यम जोड़ें।
- वातानुकूलित माध्यम से 600 μl के साथ नए 24 अच्छी तरह से थाली में coverslips स्थानांतरण। सुनिश्चित करेंकम घनत्व न्यूरॉन्स ऊपर की ओर का सामना करना पड़ रहे हैं। उच्च घनत्व प्लेटें और coverslips इनक्यूबेटर में पीठ के साथ नई प्लेटों रखें।
- दो 1.5 मिलीलीटर बाँझ ट्यूबों तैयार। एक ट्यूब में जोड़ने के लिए, 600 μl 2X HEPES बफर खारा (एचबीएस) समाधान। 12 माइक्रोग्राम pEGFP-सी 3 डीएनए की मात्रा प्लाज्मिड एकाग्रता के आधार पर गणना। अन्य ट्यूब में जोड़ने के 74 μl CaCl 2 (2 एम स्टॉक) और पानी की मात्रा है कि प्लाज्मिड जोड़ने के बाद 600 μl कर देगा। pipetting द्वारा अच्छी तरह से मिलाएं और फिर प्लास्मिड डीएनए जोड़ें। धीरे-धीरे अच्छी तरह मिला लें। दोनों ट्यूबों आरटी पर 5 मिनट के लिए बैठते हैं।
- 2X HBS ट्यूब हाथ से पकड़े हुए और मध्यम एक मिक्सर पर समाधान के आंदोलन, वहीं 600 μl 2X HBS ट्यूब के लिए ड्रॉप द्वारा 600 डीएनए 2 CaCl समाधान बूंद μl के सभी जोड़ सकते हैं। यह महत्वपूर्ण है कि वेग का गठन 'ठीक रेत' कणिकाओं की स्थिति में है। बहुत मजबूत और भी तेजी से मिश्रण नहीं वांछनीय है, क्योंकि यह अधिक संभावना है कि बड़े 'बर्फ flake'-तरह अवक्षेप का उत्पादन होगा, जो हैज नाटकीय रूप से कम अभिकर्मक हमारी टिप्पणियों के आधार पर दक्षता है।
- वेग 30 मिनट के लिए आरटी पर अंधेरे में फार्म के लिए जारी है।
- प्रत्येक अच्छी तरह से है कि coverslips पर कम घनत्व न्यूरॉन शामिल करने के लिए 100 μl वेग जोड़ें, ड्रॉप और समान रूप से ड्रॉप। प्लेट इनक्यूबेटर पर लौटने, और 2 घंटे के लिए सेते हैं। 2 CaCl की सबसे संभालने इस ~ 17.6 मिमी सीए 2 + की एकाग्रता, जो लंबे समय तक ऊष्मायन के बाद न्यूरॉन्स को विषाक्त हो सकता है में परिणाम नि: शुल्क फार्म में है।
- ~ 50 मिलीलीटर धो माध्यम के साथ एक 50 एमएल शंक्वाकार ट्यूब तैयार 37 डिग्री सेल्सियस तक यह गर्म है।
- 2 घंटे के अंत में, डीएनए कैल्शियम फॉस्फेट के साथ कम घनत्व न्यूरॉन लाने हुड में precipitates। एक तेज # 5 चिमटी से नोचना के साथ प्रत्येक व्यक्ति coverslip उठाओ, और यह 50 मिलीलीटर धो माध्यम में तीन बार डुबकी इसे संक्षेप में धोने के लिए। फिर, अपने मूल सह संस्कृति प्लेटों में उच्च घनत्व न्यूरॉन्स के लिए इसे वापस कम घनत्व न्यूरॉन्स नीचे की ओर का सामना करना पड़ के साथ।
- संस्कृति जारी रखें जब तकcoverslips पर कम घनत्व संस्कृति न्यूरॉन्स की पढ़ाई के लिए काटा जाता है।
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Representative Results
यहां वर्णित प्रोटोकॉल एक फीडर परत के रूप में सेवारत glia कोशिकाओं की जरूरत के बिना सफल अल्ट्रा कम घनत्व, शुद्ध ग्लूटामेटरगिक न्यूरॉन्स की लंबी अवधि संस्कृति सक्षम बनाता है। प्रोटोकॉल चित्रा 1, जो (पाली डी lysine पर लेपित 24 कुओं) (पाली डी lysine लेपित गिलास coverslips पर) उच्च घनत्व की तैयारी और कम घनत्व न्यूरॉन्स शामिल है में अलग से diagramed है, और बाद में सह संस्कृति कर सकते हैं कि तीन महीने तक बनाए रखा जाना।
आंकड़े 2A और 2 बी चढ़ाना के बाद 5 दिनों में उच्च घनत्व और कम घनत्व न्यूरॉन्स के चित्र हैं। कम घनत्व संस्कृति लगभग 30 गुना घनत्व में कम है। के रूप में Kaech और बैंकर (2006) द्वारा उल्लिखित दोनों न्यूरॉन्स ठेठ विकास के चरणों से गुजरना। 14 दिन में, दोनों उच्च घनत्व और कम घनत्व न्यूरॉन्स, विस्तृत वृक्ष के समान संरचनाओं दिखाने के रूप में डीआईसी छवियों (आंकड़े -2 से पता चला है,डी, ध्यान दें के रूप में खोदना के स्थान के आधार पर दिखाया गया है) दोनों पैनलों, विभिन्न फोकल विमानों के साथ ही क्षेत्र से हैं। और कुल वृक्ष के समान लंबाई (टी 16 = 1.41, पी> 0.05, इन न्यूरॉन्स डेन्ड्राइट, डेन्ड्राइट (वृक्ष के समान टिप संख्या से मापा टी 13 = 1.27, पी> 0.05) की संख्या में कोई महत्वपूर्ण मतभेद प्रकट करने के लिए MAP2 एंटीबॉडी के साथ दाग रहे हैं जब ) उच्च घनत्व और कम घनत्व न्यूरॉन्स के बीच न्यूरॉन प्रति (चित्रा 2 ई, एफ) पाए जाते हैं।
Immunocytochemistry लेबलिंग कार्यात्मक ग्लूटामेटरगिक synapses प्रकट करने के लिए प्रयोग किया जाता है। हम डबल धुंधला का उपयोग NMDA रिसेप्टर सबयूनिट NR1 और AMPA रिसेप्टर सबयूनिट GluR1 (चित्रा 3 ए), और कार्यात्मक synapses (पीले रंग में सह स्थानीय puncta) आसानी से पहचाना जा सकता है लेबल करने के लिए और ImageJ का उपयोग मात्रा। कम घनत्व न्यूरॉन्स भी वृक्ष के समान प्रोटीन मार्कर MAP2 के खिलाफ एंटीबॉडी के साथ चिह्नित कर रहे हैंaxonal प्रोटीन मार्कर पी-ताऊ के साथ संयोजन में। इस दोहरे लेबलिंग dendrites और एक्सोन (चित्रा 3 बी) के स्पष्ट अंतर की अनुमति देता है। कम घनत्व संस्कृतियों भी सफलतापूर्वक, कैल्शियम फास्फेट तरीकों का उपयोग कर डीएनए plasmids के साथ ट्रांसफ़ेक्ट किया जा सकता है, हालांकि अभिकर्मक दर आम तौर पर बाद के चरणों (<0.2% न्यूरॉन्स जब DIV21 पर ट्रांसफ़ेक्ट) पर बहुत कम है। चित्रा -3 सी दिखाता है कि EGFP अभिकर्मक न्यूरोनल आकृति विज्ञान प्रकट कर सकते हैं, और ठीक वृक्ष के समान रीढ़ संरचनाओं दिखाई प्रस्तुत करना। अन्त में, अवधारणा के एक सबूत के रूप में, अल्ट्रा कम घनत्व न्यूरॉन्स की स्थिति है कि autapse गठन (चित्रा 3 डी) को बढ़ावा देने के तहत विकसित किया जा सकता है। ये अल्ट्रा कम घनत्व autaptic पाली डी lysine लेपित 'सूक्ष्म' द्वीप पर हो न्यूरॉन्स इस सह-संस्कृति प्रोटोकॉल के साथ 2 महीने परे करने के लिए उच्च घनत्व फीडर न्यूरॉन द्वारा निरंतर किया जा सकता है।
<strong> चित्रा 1. उच्च घनत्व और कम घनत्व सह संस्कृति प्रोटोकॉल के योजनाबद्ध चित्रण। (ए) E16.5-E17.5 माउस भ्रूण दिमाग एकत्र कर रहे हैं, hippocampi बाहर विच्छेदित और trypsin के साथ पचा रहे हैं। (बी) पचा hippocampi धो रहे हैं, एकल न्यूरॉन्स में विभाजित है, और (250,000 कोशिकाओं / एमएल) 24 अच्छी तरह से प्लेटों पर उच्च घनत्व पर चढ़ाया; इस बीच में, कम घनत्व (10,000 कोशिकाओं / एमएल) न्यूरॉन्स coverslips पर चढ़ाया जाता है। उच्च घनत्व संस्कृति के लिए कुओं एक 18 जी सिरिंज सुई के साथ etched हैं coverslips के लिए एक ऊंचा समर्थन प्रदान करने के लिए। (सी) के सह-संस्कृति का चित्रण। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
चित्रा 2. दोनों उच्च घनत्व और कम घनत्व न्यूरॉन्स सह हैसह संस्कृति में mparable रूपात्मक विकास। (ए, बी) के दोनों उच्च घनत्व और कम घनत्व की परत चढ़ाना घनत्व दिखा Photomicrographs। (सी, डी) डीआईसी दोनों उच्च (सी) में व्यापक neurite वृद्धि और कम घनत्व (डी) न्यूरॉन्स दिखा छवियों। coverslip पर कम घनत्व न्यूरॉन्स सही उच्च घनत्व न्यूरॉन्स के ऊपर आराम कर रहे हैं। प्लास्टिक उठाया समर्थन के स्थान पर ध्यान दें। वृक्ष के समान प्रोटीन की MAP2 (ई) Immunocytochemistry लेबलिंग। (एफ) वृक्ष के समान मात्रा की कुल लंबाई और न्यूरॉन प्रति वृक्ष के समान संख्या के टिप (मतलब ± SEM)। कोई महत्वपूर्ण अंतर (एनएस) उच्च घनत्व और कम घनत्व सह-संस्कृति में विकसित न्यूरॉन्स के बीच देखा गया था। (बी, डी), 100 माइक्रोन। में स्केल बार यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
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चित्रा 3. सह-संस्कृति में विकसित कम घनत्व न्यूरॉन्स की प्रायोगिक जोड़तोड़। (ए) कम घनत्व संस्कृति में Immunocytochemistry लेबलिंग कार्यात्मक अन्तर्ग्रथन GluR1 (हरा) और NR1 (लाल) के सह-लेबलिंग द्वारा परिभाषित की पहचान के लिए अनुमति देता है। (बी) न्यूरोनल वृक्ष के समान प्रोटीन MAP2 (मैजंटा) के सह-लेबलिंग और axonal प्रोटीन पी ताउ (हरा)। (सी) एक कम घनत्व हिप्पोकैम्पस न्यूरॉन pEGFP-सी 3 प्लाज्मिड के साथ ट्रांसफ़ेक्ट, विपुल वृक्ष के समान कांटा दिखा। (डी) एक कम घनत्व न्यूरॉन पाली डी lysine 'सूक्ष्म द्वीप' पर तैयार किया है, और उच्च घनत्व न्यूरॉन्स के शीर्ष पर हो। एक रिकॉर्डिंग पैच इलेक्ट्रोड न्यूरॉन की आकृति विज्ञान प्रकट करने के लिए एलेक्सा-555 hydrazide साथ न्यूरॉन भरता है। ईसवी में स्केल बार, 20 माइक्रोन।7fig3large.jpg "लक्ष्य =" _blank "> यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
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Discussion
हम सीरम मुक्त शर्तों के तहत अल्ट्रा कम घनत्व हिप्पोकैम्पस ग्लूटामेटरगिक न्यूरॉन्स की लंबी अवधि संस्कृति के लिए एक विस्तृत प्रोटोकॉल उपस्थित थे। पर ~ 2000 न्यूरॉन्स / 2 सेमी, घनत्व के साथ या glia समर्थन मौजूदा साहित्य 2,3,11,13,14 द्वारा सूचना के बिना 'सबसे कम घनत्व' संस्कृति की तैयारी की तुलना में कम से कम दो गुना कम है। अल्ट्रा कम घनत्व होने के अलावा, इस प्रोटोकॉल उपन्यास और दो और मायनों में महत्वपूर्ण है। सबसे पहले, कोई glia फीडर परत की जरूरत है के रूप में कम घनत्व न्यूरॉन्स उच्च घनत्व न्यूरॉन्स कि करीब शारीरिक निकटता के भीतर हैं पौष्टिकता से कारक समर्थन प्राप्त है, भले ही कोई synaptic कनेक्शन या अलग घनत्व पर सभ्य न्यूरॉन्स के बीच सीधे संपर्क कर रहे हैं। इस प्रोटोकॉल glia monolayer की योजना बनाई संस्कृति प्रयोगों से आगे की तैयारी के लिए की आवश्यकता समाप्त, और दोनों उच्च घनत्व और कम घनत्व संस्कृतियों को एक साथ विकसित करने के लिए अनुमति देता है। glia monolayer की तैयारी समय लेने वाली और एल हो सकता हैaborious, और सबसे साहित्य नवजात चूहे पिल्ला cortices 2 का उपयोग करता है। इसलिए, प्रयोगशालाओं कि केवल चूहों के साथ काम करने के लिए, यह महत्वपूर्ण अतिरिक्त प्रयासों की आवश्यकता है। इससे भी महत्वपूर्ण बात, प्रयोगों जहां न्यूरोनल विशिष्ट तंत्र में जांच कर रहे हैं, सह संस्कृति में glia की उपस्थिति अवांछनीय, हो सकता है क्योंकि यह न्यूरॉन्स, glia या दो प्रकार की कोशिकाओं 10 के बीच बातचीत के लिए विशेष रूप ascribing मनाया प्रभाव से बचाता है। इसके अलावा, glia संस्कृति के लिए, सीरम पूरक अनिवार्य 2,15 है, और इस glia न्यूरॉन सह संस्कृति को दूषित और अतिरिक्त कारकों पेश हो सकता है। हमारे प्रोटोकॉल की एक महत्वपूर्ण विशेषता सह संस्कृति परिभाषित मध्यम शर्तों के तहत है। हम कड़ाई से सीरम पूरक के बिना पूर्ण संस्कृति के माध्यम का उपयोग करें, और पाते हैं कि यदि संस्कृति के माध्यम से आदान-प्रदान अनुसूची का कड़ाई से पालन किया जाता है, सह संस्कृति तीन महीने से परे निरंतर किया जा सकता है, जो प्रयोगों के बहुमत को संतुष्ट करना चाहिए। क्योंकि वहाँ लगभग कोईglia उपस्थिति, इस तकनीक की एक सीमा है कि सावधानी जब कि प्रयोग glia न्यूरॉन सह संस्कृतियों साहित्य के परिणामों के साथ तुलना प्रयोग किया जाना चाहिए है।
इस प्रोटोकॉल का एक अन्य पहलू यह है कि उपन्यास हम एक सरल विधि का उपयोग 24 अच्छी तरह से थाली के तल पर हो उच्च घनत्व न्यूरॉन्स के बीच एक प्रभावी सूक्ष्म अंतरिक्ष, और कम घनत्व न्यूरॉन ठीक ऊपर बैठे कांच coverslips का पालन बनाने के लिए है। पिछले अध्ययनों लेपित coverslips के लिए आवेदन किया आयल डॉट्स का उपयोग करता ~ glia फीडर परत 2,8,9 ऊपर 500 माइक्रोन पर coverslips बढ़ाने के लिए। पैराफिन डॉट्स की तैयारी सही आकार और सही तापमान है, जो प्रयासों और अभ्यास का एक उचित राशि की मांग की आवश्यकता है। इसकी तुलना में, एक 18 जी सुई के साथ अच्छी तरह से नीचे प्लास्टिक पर एक साधारण नक़्क़ाशी न्यूरॉन्स की दो परतों के बीच coverslips के लिए समर्थन के साथ ही अच्छा जुदाई प्रदान करता है। हम डिजिटल मीटर जेड के साथ एक पैच दबाना रिकॉर्डिंग रिग का इस्तेमाल किया है लिन निर्धारित करने के लिएउच्च घनत्व पर और फिर कम घनत्व परतें एक 60X पानी विसर्जन उद्देश्य का उपयोग पर ध्यान केंद्रित करके न्यूरॉन्स की दो परत के बीच कान अंतरिक्ष, और पाया कि अंतरिक्ष में आम तौर पर 150-200 माइक्रोन (179.4 +/- 25.3 माइक्रोन, एन = 5 )। यह संकरा अंतरिक्ष (मोम डॉट्स द्वारा उत्पन्न उस के साथ तुलना में) एक तेजी से वृद्धि, और neurotrophic कारकों के उच्च एकाग्रता के लिए अनुवाद करने के लिए है, इसलिए विकसित करने के लिए कम घनत्व न्यूरॉन के लिए पर्याप्त सहायता प्रदान करने की संभावना है। हालांकि इस संकरा अंतरिक्ष संस्कृति के माध्यम से विदेशी मुद्रा की दर के बारे में और क्या छोटे अंतरिक्ष में ऑक्सीजन और पोषक तत्वों से समर्थन प्राप्त करने में बाधा उत्पन्न न्यूरॉन्स सवाल उठा सकता है, हमारे परिणाम बताते हैं कि इस संभावना के लिए एक चिंता का विषय नहीं है। इसके विपरीत, हमने पाया कि coverslips के तहत उच्च घनत्व न्यूरॉन्स भी बेहतर (उच्च जीवित रहने की दर, अधिक व्यापक वृक्ष के समान पेड़ और NR1 धुंधला द्वारा अधिक synaptic puncta, नहीं दिखाया डेटा) हो जाना ही तैयारी से, लेकिन बिना उच्च घनत्व न्यूरॉन्स के साथ तुलना में overlaying coverslips। इसलिए, इस सरल प्रोटोकॉल न केवल तेजी से, सरल, लेकिन यह भी दोनों उच्च घनत्व और कम घनत्व न्यूरॉन्स को बनाए रखने में बहुत प्रभावी है।
इन विट्रो में hippocampal न्यूरॉन्स संवर्धन पाली-D-लाइसिन और / या laminin / कोलेजन 5,16 के रूप में विकास को बढ़ावा देने substrates, कोटिंग की आवश्यकता है। हालांकि सावधानीपूर्वक चयन और कांच coverslips की तैयारी प्रभावी न्यूरोनल अस्तित्व के लिए महत्वपूर्ण हैं, हमने पाया है कि कांच कवर हम चयनित साथ, 70% इथेनॉल के साथ एक पूरी तरह से सफाई के लिए पर्याप्त है, इस प्रकार के कठोर उपचार की जरूरत को नकार दिया है (जैसे, एसिड में उबलते) coverslips की। बाद coverslips इथेनॉल में साफ किया और वैक्यूम से सूख रहे हैं, कांच मूल कोटिंग के कारण हाइड्रोफोबिक हो रहा है। हालांकि, 0.1 मिलीग्राम के सफल कोटिंग / borate बफर में मिलीलीटर पाली डी lysine इतनी है कि जब coverslips धोने के पानी, पानी की एक समान परत से उठाया जाता है कि समान रूप से, कांच की सतह हाइड्रोफिलिक प्रस्तुत करना चाहिएपूरे कांच की सतह भर में फैल मनाया जा सकता है। हमने पाया है कि यह महत्वपूर्ण है। अन्यथा न्यूरॉन्स सबसे अधिक संभावना अपर्याप्त कोटिंग के कारण चढ़ाना के बाद मर जाएगा। हालांकि केवल कम घनत्व hippocampal न्यूरॉन्स इस प्रोटोकॉल में परीक्षण कर रहे हैं, यह उम्मीद है कि अन्य neuronal प्रकार (जैसे, cortical न्यूरॉन्स, अनुमस्तिष्क दाना न्यूरॉन्स, या विशेष तंत्रिका आबादी) को भी एक उच्च घनत्व न्यूरॉन फीडर की उपस्थिति में कम घनत्व पर निरंतर किया जा सकता परत। अंत में, जब इस सरल प्रोटोकॉल का पालन किया जाता है, एक स्वस्थ अल्ट्रा कम घनत्व न्यूरॉन्स फसल के लिए उम्मीद कर सकते हैं। ऐसे immunocytochemistry लेबलिंग, लाइव इमेजिंग, रूपात्मक अध्ययन और इलेक्ट्रोफिजियोलॉजी रिकॉर्डिंग के रूप में व्यापक आवेदन पत्र सभी मानक प्रक्रियाओं का पालन 16,17 इन न्यूरॉन्स पर आयोजित किया जा सकता है।
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Neurobasal medium | Life Technologies | 21103-049 | Protect from light |
| B27 supplement | Life Technologies | 17504-044 | aliquot, store in 0.6ml size |
| GlutaMAX-I | Life Technologies | 35050-061 | dilute 100X |
| antibiotic-antimycotic (AA) | Life Technologies | 15240-096 | dilute 100X |
| Complete Culture medium | Neurobasal medium with 1X B27, 1X AA, 1X GlutaMAX-I | ||
| Wash medium | same as 'Neurobasal medium' | ||
| Feed medium | Neurobasal with 1X B27 supplement | ||
| DNAse I | Sigma-Aldrich | D5025 | prepare 100X stock at 0.6mg/ml |
| poly-D-lysine | Sigma-Aldrich | P6407 | M.W. 70000-150000 |
| borate buffer | Sigma-Aldrich | B6768 (boric acid); 71997(borax) | 1.24g boric acid & 1.9g borax in 400ml H2O, pH to 8.5 use HCl |
| 12-mm round glass coverslips | Glasswarenfabrik Karl Hecht GmbH | 1001/12 | No. 1 glass, purchase from Carolina Biological Supply |
| proFection transfection kit | Promega | E1200 | see protocol for details |
| 2X HEPES buffered saline (HBS) | Promega | E1200 | see protocol for details |
| Syringe filter | Pall Corporation | 4192 | 0.2um pore size |
| Endofree plasmid prep kit | Qiagen | 12362 | for preparation of transfection grade plasmid DNA |
| anti-MAP2 antibody | Millipore | MAB3418 | mouse antibody, clone AP20 |
| anti-p-Tau antibody | Millipore | AB10417 | rabbit polyclonal antibody |
| anti-NR1 antibody | Millipore | MAB1586 | mouse antibody, clone R1JHL |
| anti-GluR1 antibody | Millipore | AB1504 | rabbit polyclonal antibody |
| Hank's balanced salt solution | ThermoFisher | 14025092 | 500ml size |
References
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