Abstract
Культивирование первичных гиппокампа нейронов в пробирке облегчает механистической опрос многих аспектов развития нейронов. Разъединенные эмбриональные нейроны гиппокампа часто могут успешно расти на покровные стекла при высокой плотности при бессывороточной условиях, но культуры низкой плотности обычно требуют поставки трофических факторов путем совместного культивирования их с фидерной глии слоем, получение которого может занять много времени и трудоемкий. Кроме того, наличие глии может запутать интерпретацию результатов и исключает исследований по механизмам нейроноподобных специфичны. Здесь упрощенный метод представлен для ультра-низкой плотности (~ 2000 нейронов / см 2), долгосрочный (> 3 месяца) первичной гиппокампа нейрон культуры , который находится под бессывороточной условиях и без поддержки глии клеток. Нейроны низкой плотности выращены на поли-D-лизином покровные с покрытием, и переворачивается на нейроны с высокой плотностью, выращенных в 24-луночный планшет. Вместо того чтобы использовать парафиновые точки, чтобы создать пространство betweeп два нейрональных слоев, экспериментаторы могут просто травить пластический дно колодца, на котором нейроны высокой плотности проживают, чтобы создать Микрокосмом, способствующую росту нейронов низкой плотности. Сокультуры можно легко поддерживать в течение> 3-х месяцев без значительной потери нейронов низкой плотности, тем самым облегчая морфологические и физиологические исследования этих нейронов. Чтобы проиллюстрировать это успешное состояние культуры, данные предоставляются, чтобы показать образование обильное синапсов в клетках с низкой плотностью после длительной культуры. Эта система сокультуры также способствует выживанию редких отдельных нейронов, выращенных на островах поли-D-лизином субстратов и, таким образом, образованию autaptic соединений.
Introduction
Рост гиппокампа нейронов в условиях , в пробирке позволяет вести наблюдение и экспериментальные манипуляции этих нейронов, которые в противном случае не представляется возможным в естественных условиях. Этот экспериментальный подход широко используется для выявления нейронные механизмы роста, полярности, спецификации аксонов, торговлей и внутриклеточной локализации белков, формирование синапсов и функционального созревания 1. Эти в пробирке культивированный нейронов гиппокампа, когда собирали из поздних эмбриональных стадий, относительно чистый (> 90%) глутаматергические клетки пирамидальной морфологии 2. Поскольку нейроны выращивали в поверхности 2-D в условиях , в пробирке, этот метод позволяет легко наблюдать, например, живого изображения или иммуноцитохимию (ICC) окрашиванием через единый фокальной плоскости 3; или манипуляции, такие как медикаментозное лечение и трансфекциях 3-6. При выращивании при высокой плотности, нейроны, как правило, имеют высокие показатели выживаемости из-за более высокого сотрудничестваncentrations секретируемых факторов роста в дополнение к алиментарной поддержки со стороны средств массовой информации роста, а также из - за аксонов контакт-зависимые механизмы 7. Тем не менее, низкая плотность нейронов гиппокампа являются желательными для морфологических исследований, где отдельный нейрон может быть отображенных в полном объеме или окрашенными для анализа ICC. Нейроны низкой плотности трудно поддерживать в культуре из - за отсутствия поддержки паракринной и , таким образом , часто требуют трофической поддержки со стороны глиальных ( как правило , коркового астроцитов) фидерного слоя, который должен быть подготовлен до нейрон культуры 2. При культивировании совместно с глиальной фидерного слоя клеток, нейронов низкой плотности выращивают на покровных стеклах, а затем переворачивается на вершине глии слоя таким образом, что нейроны низкой плотности и глии обращены друг к другу. Небольшое ограниченное пространство между глии и нейронов создается путем размещения парафиновые точки на углах покровные, создавая тем самым «сэндвича» макет 2,8,9. Нейроны низкая плотность будет расти шithin ограниченного пространства между глии и покровного, что создает разрешительный микросреду с концентрированными факторами, выделяемыми нейронов и глии. Такой подход позволяет получить низкую плотность, полностью развитые нейроны, которые отстоят друг от друга достаточно, поэтому маркировку, облегчающую ICC или исследования живого изображения.
Очевидным недостатком нейрон-глиальных сокультивирования, помимо того, что отнимает много времени и трудоемким, является то, что он предотвращает исследование нейрон-специфический, или клеточно-автономными, механизмы. Хотя эта система является гораздо менее сложной , чем в естественных условиях нервной ткани, воздействие глии на развитие нейрон через секретируемых, пока еще не полностью определенных факторов могут посрамить эксперименты 10. Таким образом, в экспериментах, которые требуют изучения конкретных механизмов нейрон, определенные условия культивирования, которые удаляют сыворотку и глиальных слой подложки необходимы. Предыдущее исследование удалось культивировании низкие концентрации нейронов (~ 9000 клеток / см 2) , используя юРЗЭ мерная матрица гидрогеля 11. Так как относительно чистый нейрональной популяции можно культивировать при высокой плотности при бессывороточной условиях без глии, мы предполагаем, что сверхнизкой плотности нейронов гиппокампа можно выращивать в не содержащей сыворотки определяется культуральной среды путем совместного культивирования их с нейронами с высокой плотностью, в путь, который является аналогом традиционно принятой нейрон-глии сокультивирования. Действительно, высокая плотность гиппокампа нейрон культур в конфигурации «сэндвича» были недавно использованы для поддержки небольшого количества специализированных КРУПНОКЛЕТОЧНЫХ эндокринных нейронов 12.
Таким образом, совместное культивирование с нейронами высокой плотности может позволить нейроны с низкой плотностью, чтобы получить коэффициенты трофической поддержки, которая достаточна для того, чтобы на долгосрочное выживание. Этот протокол нейронов культивирования сверхнизкой плотности, таким образом, сформулирована и утверждена. Протокол может быть реализован в одном эксперименте, подготовив высокой плотности (~ 250000 клеток / мл) ЦСИsociated нейроны гиппокампа, а затем сделать разбавление , чтобы получить плотность ~ 10000 нейронов / мл (~ 3000 нейронов / покровное, или ~ 2000 нейронов / см 2), что значительно ниже , чем у большинства сообщалось культур низкой плотности 2,3,9 , 11,13. Это состояние культуры свободно упоминается как культура "ультра-низкой плотности" и используется с "низкой плотности" интер-непостоянно. Нейроны высокой плотности высевают на поли-D-лизин покрытием 24-луночных планшетах; в то время как нейроны с низкой плотностью высевают на поли-D-лизин покрытием покровные стекла 12 мм, которые размещены внутри другой 24-луночный планшет. Покровные с соблюдением нейронами низкой плотности перевернуты на вершине нейронов высокой плотности 2 ч спустя после того, как нейроны происходят и прикреплены к покровные. Кроме того, вместо того чтобы использовать парафиновые точки, чтобы поднять покровные над нейрон слоя высокой плотности, шприц иглой 18 G использовали травление в нижней части 24-луночные планшеты с двумя параллельными полосами. Полученный DisplACED, примыкающие пластмассы обеспечивают повышенную поддержку покровные стекла. Это пространство последовательно измеряется при 150-200 мкм, что позволяет достаточно кислорода и культуральной среды, обеспечивая при этом обмен микросреду с концентрированными трофических факторов. При выполнении этого условия, нейроны низкая плотность растут интенсивно, и может выжить после трех месяцев в культуре. Когда эти нейроны трансфицировали плазмидой GFP через три недели в культуре, дендриты обильно усеяна дендритных шипиков. В качестве доказательства принципа, приведены данные, чтобы показать, что эта система совместно культуры поддерживает сверхнизкие культур плотности нейронов гиппокампа, посеянных на поли-D-лизином 'микро-островков », где нейроны образуют autaptic соединения, которые могут облегчить исследование клетки -autonomous, сетевые независимые механизмы.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Все экспериментальные процедуры, связанные с мышами были одобрены Institutional Animal Care и использование комитета Университета штата Аризона по, и соответствовали рекомендациям NIH.
1. Ткань Источник для гиппокампа Нейрон культуры
- Для создания предродовые щенят мыши для гиппокампа нейрон культуры, использовать временные беременных мышей (C57BL6 / J), которые разводятся в доме 17. На следующий день с вагинальным обнаружения пробки обозначается как E0.5. Планируемое время сбора урожая для культуры E16.5-E17.5.
Примечание: Этот протокол описывает культуры двух 24-луночных двух нейронов с высокой плотностью сокультивирования с нейронами низкой плотности (всего 48 покровные). Для большего количества пластин, материалов и реагентов можно масштабировать соответственно.
2. 24-луночные планшеты для подготовки с высокой плотностью Neuron культур
Примечание: Выполните следующие шаги (2-3) за день до планируемого урожая эмбрионов.
- Принесите два 24-луночногоПланшеты в капот культуре клеток, открыть индивидуальную упаковку.
- Подключение 18 G иглу шприца в 1 мл пластиковом одноразовом шприце.
- Держа шприц, и направлены кончик иглы на ~ 1 мм слева к центру нижней части скважины. Применить умеренное усилие (~ 250 г) травление в нижней части скважины (~ 1 мм). Канавка будет сформирован и пластические материалы, перемещенными сформирует повышенную поддержку над плоской нижней поверхности скважины. Травление другой ~ 1 мм длиной Плашечные при ~ 1 мм вправо от центра дна в аналогичным образом.
- Повторите этот шаг для всех ям двух 24-луночных планшетах. Две 24-луночные планшеты, используемые для высокой культуры плотности теперь готовы к покрытию с поли-D-лизином (этап 3.8 ниже).
3. Покровные Подготовка к низкой плотности культур Нейрон
- Используйте 12-мм Диаметр # 1 круглый стакан.
- Поместите 50 покровные внутри диаметром 100 мм стерильной пластиковой чашке Петри, и погрузите покровныхв 20 мл 70% -ного раствора этанола. Поместите эту чашку Петри на вращающейся платформе с умеренным (70 оборотов в минуту) скорости вращения в течение часа. Удалить 70% этанола, а затем заменить свежей порции 70% этанола. Поворот и мыть в течение еще одного часа.
- Откажитесь 70% моющий раствор этанола. Добавить стерильную воду (фильтрованную через блок фильтра 0,2 мкм). Промыть покровные строго, поворачивая чашку Петри вручную. Промыть три раза, каждый раз заменяя свежей стерильной водой.
- Поместите чашку Петри с покровные внутри стерильной капот культуре клеток с ламинарным потоком. Аспирируйте промывочную воду через вакуумную линию, и добавьте 10 мл фильтрованного стерильную воду, чтобы погрузить покровные. Покровные должны быть стерильными и поверхность должна быть достаточно чистым для поли-D-лизин покрытием.
- Открыто два 24-луночные планшеты от их индивидуальной упаковки, и поместите их в капюшоне.
- Включите вакуумной линии в капюшоне. Подключите 200 мкл кончиком пипетки к вакуумной линии, и использовать SCISсор, чтобы сократить кончик, чтобы создать большее открытие.
- Используйте тонкую Совет № 5 пинцет, чтобы забрать покровные из чашек Петри, по одному за раз, и использовать вакуумную линию, чтобы полностью высохнуть покровное. Затем поместите один покровное в каждую из лунок 24-луночного планшета. В 50 Очищенные покровные должно быть достаточно, чтобы заполнить каждую из лунок, двух 24-луночных планшетах.
- Развести поли-D-лизином маточного раствора (1 мг / мл) в рабочий раствор (0,1 мг / мл) с боратного буфера (рН 8,5). За четыре 24-луночных планшетах (в том числе две пластины с высокой плотностью с гравированного дном), подготовить 30 мл полного рабочего раствора.
- Добавьте 300 мкл 0,1 мг / мл поли-D-лизина работы в каждую лунку с покровные стекла. Убедитесь, что покровные полностью погружены в раствор. Если нет, то используйте # 5 пинцет наконечник придавить покровные на дно колодца, и использовать наконечник для руководства поли-D-лизин решение, чтобы покрыть всю поверхность покровные. Осмотреть все покровные сделать суповторно не воздух был пойман в ловушку между пластиной и покровные.
- Добавить 300 мкл 0,1 мг / мл поли-D-лизина работы в каждую лунку планшета для культуры высокой плотности с гравированного дном. Поворот вручную, чтобы распространить решение, чтобы покрыть всю нижнюю часть скважины.
- Верните все четыре пластины с поли-D-лизина в культуре инкубатора и инкубировать O / N.
4. Стиральные и предобуславливание Пластины для культуры
Примечание: Следующие шаги (4-9) проводят в день сбора урожая ткани.
- После инкубации / покрытия покровные и 24-луночных планшетах O / N, довести все четыре пластины (два с покровные доноров, два акцепторных пластин высокой плотности с гравированным пластиковым дном) в капот культуре. Используйте вакуумную линию, чтобы удалить поли-D-лизина раствор.
- Сразу после удаления поли-D-лизина, добавить ~ 1 мл стерильной воды в каждую лунку с помощью пластиковой пипетки передачи. После того как все скважины заполненыс водой, дайте постоять в течение 10 мин. Удалите воду с помощью вакуума, затем добавьте 300 мкл промывочного среды в каждую лунку, чтобы покрыть дно колодца (с или без покровных стеклах). Не позволяйте поли-D-лизин покрытие высыхает.
- Верните все четыре пластины ячейки инкубатора. Пластины готовы к использованию, как только дисперсные нейроны гиппокампа получают.
5. Получение полной культуральной среде, и раствор трипсина для ферментативного переваривания
- Приготовьте 60 мл полной культуральной среде путем смешивания ингредиентов (см Материалы). Используйте 50 мл шприц, соединенный с размером шприцевой фильтр 0,2 мкм порами, фильтр Полного культуральную среду в двух 50 мл конические пробирки. Каждая трубка содержит 30 мл полной среды культуры.
- В отдельном 50 мл коническую трубку, добавляют ~ 30 мл Wash среды (см Материалы) и подогреть до 37 ° C. Это будет использоваться для промывки ткани после ферментативного расщепления.
- Подготовить фермент переваривания среду. В 15 мл коническую трубку, добавьте 4,5 мл промывочного среды и 0,5 мл 2,5% -ного раствора трипсина и 50 мкл 100X ДНКазы I.
- Место полной среды культуры, вымойте среды и ферментативного расщепления среды в водяной бане при 37 ° C.
6. Подготовка хирургических инструментов
- Стерилизовать все хирургические инструменты в сумке стерилизации: две маленькие ножницы, пару щипцов и два # 5 пинцетом.
7. Удаление Мозги из E16.5-E17.5 эмбрионов мыши, и Препарирование гиппокампа
- Приготовьте два 10-см чашках Петри, заполненных охлажденным льдом, сбалансированный солевой раствор стерильного Хэнкса (HBSS).
- Эвтаназии плотину мыши с внутрибрюшинного введения фенобарбитала натрия (100 мг / кг в объеме ~ 0,5 мл). После инъекции, как только плотина теряет ответ на носок щепотку, пожертвуйте с цервикальной дислокацией.
- Спрей живота плотины с 70% этанола, и сделать 2-см длиной разрез по средней линии живота, чтобы выставитьматка.
- Удалить эмбрионов и поместить отдельные из них в 10 см диаметром чашку Петри с холодным рассекает HBSS буфера.
- Держите эмбриона на шее с помощью щипцов, и использовать небольшой ножницы, чтобы сделать первый разрез прямо в средней линии ниже уровня мозжечка и секции по всей ткани мозга. Не обезглавить эмбриона.
- Вставьте правую боковую кончик маленького ножничные из хвостового области, разрезают, весь путь через ростральной части эмбрионального мозга (не пересекают срединной линии), и сделать разрез на левой стороне на уровне основания черепа.
- Вставьте левую боковую кончик ножниц снова, чтобы сделать разрез на правой стороне. Оставьте узкую полосу неподрезанные кости черепа и кожной ткани на ростральной конце, так что весь мозг может быть перевернута в сторону для легкого извлечения.
- Используйте кончик ножниц, чтобы выкопать эмбрионального мозга в раствор HBSS. Осмотрите мозг под рассекает микроскопом. Мозг должен быть цельным, без грубой резки-оФФ регионы.
- Повторите эти шаги, чтобы собрать все мозги эмбриона.
- Соберите все неповрежденные мозги в новом чашку Петри, содержащую 20 мл холодного буфера HBSS. Поместите чашку Петри под рассечение микроскопом.
- Просмотреть мозг от брюшной стороны. Удерживая мозг с щипцами на хвостовом конце, вставьте острый # 5 пинцет по диагонали, чтобы сделать разрез между средней точкой ростральной и каудальной-височной области. Повторите эту процедуру для другого полушария. После резки, разделения двух полушарий с исправным гиппокампа от остальной части ствола мозга ткани.
- Повторите эту процедуру для каждого из мозга.
- Бассейн все расчлененный полушарий, и удалить мозговые оболочки, используя две пары # 5 пинцетом.
- Определение развивающегося гиппокампа в виде изогнутой структуры, которая сложена внутри височной доли. Чередуйте две пары пинцетов, чтобы отделить гиппокамп от прилегающих тканей коры головного мозга. Собрать и объединить все hippocamпи ткани (рисунок 1).
8. ферментативного переваривания, разделиться на отдельных нейронов
- С помощью пластмассовой пипетки передачи, передать все расчлененный гиппокампе в ферментативным расщеплением раствора, содержащего 5 мл моющего среды с 0,25% трипсина + 1X ДНКазы I в 15 мл коническую пробирку.
- Поместите пробирку в водяную баню и инкубируют при температуре 37 ° С в течение 25 мин, с прерывистой нежным инвертирующим трубки один раз в каждые 5 мин.
- Через 25 мин, осторожно удалите раствор фермента с помощью ручной пластиковой пипетки с помощью аспирации. Добавить теплую среду Wash до 10 мл и осторожно промывать ткани, медленно переворачивая пробирку 5 раз. Удалите среду Wash, и добавьте 10 мл промывочного среду снова для дополнительной стирки.
- Удалите среду Wash, и добавить 3 мл свежей теплой среды промывочного снова. Встряхните трубку вручную строго по 15 раз, чтобы выбить переваренных нейроны из ткани. Среда должна стать мутным когда-клеткамвновь отделяется от ткани, в среду стирке. Собирают суспензию клеток в новой 15 мл конической трубки, оставляя оставшиеся ткани в трубке.
- Добавить еще 2 мл промывочного среды к ткани, и осторожно отделить оставшиеся ткани растиранием через пластиковую пипетку в течение ~ 15 раз. Пусть сидят в течение 5 мин. Бассейн суспензии клеток в новый 15 мл коническую трубку, которая содержит собранные клетки "встряхивание".
- Подсчитайте плотность нейронов с помощью гемоцитометра. Как правило, 3000-5000 клеток на микролитр могут быть получены в зависимости от количества эмбрионов расчленены. Среднее число 2,5 х 10 7 нейронов оцениваются при предположении шесть эмбрионов расчленены.
- Рассчитать объем, необходимый этой клеточной суспензии с получением плотности 250000 нейронов / мл при добавлении к 30 мл полной среды культуры. Добавьте этот объем в один из двух конических пробирок, содержащих 30 мл полной культуральной среде с получением высокой плотности нейрон гальванического среды. <литий> Передача 1,2 мл этого раствора в нейрон высокой плотности к еще 30 мл Полная среда культуры, чтобы получить концентрацию ~ 10000 нейронов / мл. Используйте это разведение семян покровные низкой плотности.
9. Покрытие из нейронах и длительного сотрудничества культуры
- Принесите два 24-луночные планшеты с выгравированными днищ для нейронов высокой плотности в капот культуре клеток. Удалите 300 мкл предварительного условия среды с помощью вакуума. Тарелка 0,6 мл суспензии клеток с высокой плотностью на 250000 нейронов / мл.
- Принесите два других 24-луночные планшеты с покровные в капот культуре, и удалить 300 мкл предварительного условия среды с помощью вакуума. Пластинчатые 0,6 мл Клеточные суспензии с низкой плотностью при 10000 нейронов / мл на покровные внутри двух 24-луночных планшетах.
- Возвращение все четыре 24-луночных планшетах в термостате. Пусть сидят в течение 2 часов.
- Флип покровные низкой плотности с соблюдением нейронов к высокой культуре плотности. Убедитесь в том , что нейроны обращены друг к другу (т.е., пOt отделены друг от друга покровным стеклом). Затем вернитесь две пластины с сокультивирования в инкубатор.
10. Совместное культивирование Устойчивое развитие
- Поток совместное культивирование путем добавления 300 мкл свежей загрузке среды (см Материалы) в день в пробирке (Div) 5. Там нет необходимости удалять 50% исходной полной питательной среде культуры, как сообщает многих других исследованиях. Подающий среда также содержит 15 мкМ цитозинарабинозидом (Ara-C, с получением конечной концентрации 5 мкМ), чтобы минимизировать вероятность загрязнения глии и пролиферации.
- После этого начального кормления, добавьте 300 мкл свежей среды без подачи Ara-C к колодцу каждую неделю. Если культура будет храниться в течение более одного месяца, заменить половину среды со свежей средой подачи каждую неделю за один месяц временной точки (с первой средней половинной замены на DIV33). Морфологически, как высокая плотность и нейроны низкой плотности выглядят здоровыми до трех месяцев (дольше, наблюдаемого EXPERimenters).
11. Иллюстрация экспериментальной Манипуляция низкой плотности Neuron Трансфекция
Примечание: При трансфекции в нейронах низкой плотности желательно, простой протокол фосфат кальция может быть принят. Мы обнаружили, что культуры низкой плотности имеют более высокую эффективность трансфекции протоколом фосфата кальция до DIV12, но они могут быть трансфицированы с гораздо более низкой эффективностью при DIV21 или старше, в течение которых дендритные шипы видным. Целесообразность трансфекцией культивированных нейроне низкой плотности иллюстрируется трансфекцию нейронов с плазмидой pEGFP-С3 (смотри ниже).
- В DIV21, удалить 600 мкл-кондиционированной среды из каждой лунки со-культуры, и перенести его на новый 24-луночного планшета. Затем добавьте 600 мкл свежей поток среды в совместной культуре, чтобы вернуть его к первоначальному объему.
- Передача покровные в новый 24-луночный планшет с 600 мкл кондиционированной средой,. Убедитесь, чтонейроны низкой плотности обращены вверх. Место пластин высокой плотности и новые пластины с покровные обратно в инкубатор.
- Приготовьте два 1,5 мл в стерильные пробирки. В одной пробирке, добавьте 600 мкл 2X HEPES буферный солевой раствор (HBS). Рассчитать объем 12 мкг pEGFP-С3 ДНК, основанный на концентрации плазмиды. В другой трубке, добавляют 74 мкл CaCl 2 (2 М маточного) и объем воды , который после добавления плазмиды будет сделать 600 мкл. Хорошо перемешать с помощью пипетки, а затем добавить ДНК плазмиды. Медленно хорошо перемешать. Пусть обе трубки сидят в течение 5 мин при комнатной температуре.
- В то время как рука держит трубку 2X HBS и умеренно перемешивая раствор на смеситель, добавьте все 600 мкл капли раствора ДНК-CaCl 2 по каплям к 600 мкл 2X HBS трубки. Очень важно, что осадок в виде гранул «мелкий песок». Смешивание слишком сильно и слишком быстро не желательно, так как он будет более вероятно, производят большие "снежные flake' подобные осадки, whicч имеет значительно более низкую эффективность трансфекции, основываясь на наших наблюдениях.
- Пусть осадок продолжают формироваться в темноте при комнатной температуре в течение 30 мин.
- Добавить осадок 100 мкл в каждую лунку, которая содержит нейрон низкой плотности на покровные, по капле и равномерно. Возвращение пластины в инкубатор, и инкубировать в течение 2 часов. Предполагая , что большая часть CaCl 2 находится в свободной форме, это приводит к концентрации ~ 17.6 мМ Са 2+, которые могут быть токсичными для нейронов после длительной инкубации.
- Приготовьте 50 мл коническую трубку с ~ 50 мл промывочного среды, подогреть до 37 ° C.
- В конце 2 часов, довести нейрон с низкой плотностью с фосфатом ДНК-кальция выпадает в осадок в капот. Возьмите каждый отдельный покровное с резким # 5 пинцетом, и окуните его три раза в среде промывочного 50 мл, чтобы вымыть его на короткое время. Затем вернуть его к нейронам высокой плотности в оригинальной совместно культуральные планшеты с нейронами низкой плотности лицевой стороной вниз.
- Продолжайте до тех пор культурунейроны культуры низкой плотности на покровные собирают для исследований.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Протокол, описанный здесь, обеспечивает успешную сверхнизкой плотности, долгосрочную культуру чистых глутаматэргических нейронов без необходимости глиальных клеток, выступающей в качестве фидерного слоя. Протокол схематически на рисунке 1, который включает получение высокой плотности (поли-D-лизина с покрытием 24 лунок) и нейронов низкой плотности (поли-D-лизином с покрытием покровные стекла) отдельно, и последующее совместное культивирование , что может сохраняться до трех месяцев.
Фигуры 2А и 2В представляют собой иллюстрации нейронов с высокой плотностью и низкой плотностью через 5 дней после посева. Низкая культура плотность приблизительно в 30 раз меньше плотности. Оба нейроны претерпевают типичные стадии развития, как это изложено Kaech и Banker (2006). На 14 -й день, как высокая плотность и нейроны низкой плотности показывают сложные дендритные структуры, как показали DIC изображений (рисунки 2C,D, обратите внимание , обе панели из того же поля с различными фокальных плоскостях, как показано по месту нахождения травление). Когда эти нейроны окрашивали map2 антитела для выявления дендриты, никаких существенных различий в количестве дендритов (т 13 = 1,27, р> 0,05; измеряется дендритных числом TIP) и общая дендритных длины (т 16 = 1,41, р> 0,05 ) в нейроне между высокой плотностью и низкой плотности нейронов обнаруживаются (рис 2E, F).
маркировка Иммуноцитохимическая используется для выявления функциональных глутаматергические синапсы. Мы используем двойное окрашивание для обозначения NMDA - рецептора субъединицы NR1 и рецептор субъединицу АМРА GluR1 (рис 3А), а также функциональные синапсы (колокализуются Puncta желтым цветом) можно легко идентифицировать и количественно , используя ImageJ. Нейроны низкой плотности, также маркируют с антителом против дендритных маркерного белка МАР2,в сочетании с аксонов маркерного белка р-тау. Эта двойная маркировка позволяет четкое разграничение дендритов и аксонов (рис 3б). Культуры низкой плотности также может быть успешно трансфицированы ДНК плазмид с использованием методов фосфата кальция, хотя скорость трансфекции , как правило , очень низка на более поздних стадиях (<0,2% нейронов при трансфицированных на DIV21). Рисунок 3C показывает , что EGFP трансфекция может выявить нейронную морфологию и оказывают тонкие дендритные позвоночника структуры видны. И, наконец, как доказательство концепции, нейроны сверхнизкой плотности можно выращивать в условиях , которые способствуют образованию autapse (рис 3D). Эти сверхнизкой плотности autaptic нейроны, выращенные на поли-D-лизин покрытием "микро-островков» может быть устойчивым фидером нейроне высокой плотности к за 2-х месяцев с этим протоколом сокультуры.
<сильный> Рисунок 1. Схематическое изображение высокой плотности и низкой плотности протокола сокультуры. (А) E16.5-E17.5 мышиных эмбриональных мозг собирают, гиппокамп отсекают и переваривают с помощью трипсина. (Б) дайджестом Гиппокамп моют, разделяют на отдельных нейронов, и высевают при высокой плотности (250000 клеток / мл) на 24 - луночные планшеты; в то же время, с низкой плотностью (10000 клеток / мл) нейронов высевают на покровных стеклах. Лунки для высокой культуры плотности вытравливают с иглой шприца 18 G, чтобы обеспечить повышенную поддержку покровные. (C) Иллюстрация совместной культуры. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Рисунок 2. Оба высокой плотности и низкой плотности нейронов имеют совместноеmparable морфологическое развитие в совместной культуре. (А, В) микрофотографии , показывающие плотность окожушивания как высокой плотностью и низкой плотностью слоя. (C, D) DIC изображения , показывающие рост аксонов обширный в обоих высокой (С) и низкой плотности (D) нейронов. Нейроны низкой плотности на покровное отдыхают прямо над нейронами высокой плотности. Обратите внимание на расположение повышенной пластической поддержки. (E) Иммуноцитохимическая маркировка дендритных белка MAP2. (F) Количественная (среднее ± СКО) от общей длины дендритов и дендритных номер наконечника в нейроне. Никаких существенных различий (нс) не было замечено между высокой плотностью и низкой плотности нейронов , выращенных в совместной культуре. Шкала бар (B, D), 100 мкм. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
ВОК: Keep-together.within-страницу = "1"> 
Рисунок 3. Экспериментальные манипуляции нейронов низкой плотности , выращенных в совместной культуре. (А) Иммуноцитохимическая маркировка в условиях низкой плотности культуры позволяет определить функциональную синапса , определенной путем совместного маркировки GluR1 (зеленый) и NR1 (красный). (B) Co-маркировка нейронная дендритных белка map2 (пурпурного) и аксонов белок р-тау (зеленый). (C) с низкой плотностью гиппокампа нейрон , трансфицированные pEGFP-С3 плазмиды, показывая обильное дендритных шипиков. (D) Нейрон низкой плотности подготовленный на поли-D-лизином "микро-острова", и выращивают на вершине нейронов высокой плотности. Пластырь записи электрода заполняет нейрон с Alexa-555 гидразида, чтобы выявить морфологию нейрона. Шкала бар в AD, 20 мкм.7fig3large.jpg "целевых =" _blank "> Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Мы представляем подробный протокол для долгосрочной культуры ультра-низкой плотности нейронов гиппокампа глутаматэргических под бессывороточной условиях. В ~ 2000 нейронов / см 2, плотность по меньшей мере , в два раза ниже , чем у большинства препаратов "низкой плотности" культуры с или без поддержки глии об этом сообщил существующей литературе 2,3,11,13,14. В дополнение к ультра-низкой плотности, этот протокол является новым и значимым еще в двух направлениях. Во-первых, ни один фидер глии слой не требуется, как нейроны низкая плотность получения трофической поддержки фактора от нейронов высокой плотности, которые находятся в непосредственной физической близости, даже если нет синаптические связи или прямой контакт между нейронами культивировали при различной плотности. Этот протокол исключает необходимость подготовки глии монослой впереди запланированных экспериментов культуры, и позволяет как высокая плотность и культуры низкой плотности одновременно растут. Приготовление глии монослоя может отнимать много времени и лaborious, и большинство литература использует неонатальный крысят 2 кору. Поэтому, для лабораторий, которые работают только с мышами, это требует значительных дополнительных усилий. Что еще более важно, в экспериментах , в которых исследуются нейронные специфические механизмы, наличие глии в совместной культуре может быть нежелательным, так как он предотвращает приписывании наблюдали эффекты специально для нейронов, глии или взаимодействие между этими двумя типами клеток 10. Кроме того, для глии культуры, сыворотка добавка является обязательным 2,15, и это может загрязнять глии-нейрон совместно культуры и ввести дополнительные искажающие факторы. Одной из важных особенностей нашего протокола является то, что совместно культура при определенных условиях среды. Мы строго использовать полную среду культуры без сыворотки дополнения, и обнаружили, что если культура график среда обмена строго соблюдаются, совместное культивирование может продолжаться более трех месяцев, что должно удовлетворить большинство экспериментов. Потому что практически не существуетналичие глии, одно ограничение этого метода является то, что следует проявлять осторожность при сравнении с результатами литературы, которые используют глии-нейрон сопутствующих культур.
Другим новым аспектом данного протокола является то, что мы используем простой метод, чтобы создать эффективную микро-пространство между нейронами с высокой плотностью, выращенных на нижней части 24-луночного планшета, и нейронным низкой плотности, приклеенный к покровные стекла сидит выше. Предыдущие исследования используются парафиновые точки , применяемые к покровные с покрытием , чтобы поднять покровные при ~ 500 мкм над фидерного слоя глии 2,8,9. Приготовление парафиновых точек требует правильного размера и нужной температуры, что требует разумное количество усилий и практики. Для сравнения, простое травление на забое скважины пластмассы с 18 G иглой обеспечивает поддержку покровные, а также хорошее разделение между двумя слоями нейронов. Мы использовали буровую установку патч записи клещи с цифровым Z метр для определения линУхо пространство между двух слоев нейронов, сосредоточившись на высокой плотности, а затем на слоях низкой плотности с использованием объектива погружения в воду 60X, и обнаружил, что пространство, как правило, 150-200 мкм (179,4 +/- 25,3 мкм, п = 5 ). Это узкое пространство (по сравнению с порождена восковыми точками), скорее всего, чтобы перевести к более быстрому росту и более высокой концентрации нейротрофических факторов, тем самым обеспечивая достаточную поддержку нейроне низкой плотности, чтобы расти. Хотя это узкое пространство может поднимать вопросы о скорости культуры обмена среды и является ли меньшее пространство препятствует нейроны от получения кислорода и продуктов питания, наши результаты показывают, что это, вероятно, не является проблемой. Напротив, мы обнаружили, что нейроны высокой плотности под покровные также растут лучше (выше выживаемость, более сложные дендритных дерева и более синаптическую Puncta путем NR1 окрашивания, данные не показаны) по сравнению с нейронами с высокой плотностью из того же препарата, но без покрывающей сОУerslips. Таким образом, этот простой протокол не только быстро, просто, но и очень эффективным в поддержании как высокой плотности и низкой плотности нейронов.
Культивирование гиппокампа нейроны в пробирке требует покрытия стимуляторами роста субстратов, таких как поли-D-лизина и / или ламинин / коллагена 5,16. Хотя тщательный отбор и подготовка покровные стекла имеют решающее значение для эффективного выживаемости нейронов, мы обнаружили , что с покровным стеклом , который мы выбрали, тщательной очистки с 70% -ным этанолом , достаточно, таким образом , исключая необходимость в более резкой обработки (например, кипячение в кислотах) из покровные. После того, как покровные очищены в этаноле и сушат под вакуумом, стекло, кажется, гидрофобными за счет первоначального покрытия. Тем не менее, успешное покрытие 0,1 мг / мл поли-D-лизина в боратного буфера должны оказывать стекло поверхность гидрофильной, так что, когда покровные подбирают из промывной воды, однородный слой воды, который является равномернораспространяется по всей поверхности стекла можно наблюдать. Мы обнаружили, что это критически важно. В противном случае нейроны, скорее всего, умрет после того, как покрытие из-за недостаточного покрытия. Хотя только с низкой плотностью нейроны гиппокампа испытываются в данном протоколе, предполагается , что другие типы нейронов (например, корковые нейроны, нейронов мозжечка гранула, или специализированные нейронные популяции) также может быть устойчивым при низкой плотности в присутствии фидера нейрон высокой плотности слой. И наконец, когда этот простой протокол следует, можно ожидать, чтобы собрать здоровые нейроны ультра-низкой плотности. Широкие приложения , такие как иммуноцитохимию маркировки, живого изображения, морфологических исследований и регистрации электрофизиологии могут быть проведены на этих нейронах следующих стандартных процедур 16,17.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Neurobasal medium | Life Technologies | 21103-049 | Protect from light |
| B27 supplement | Life Technologies | 17504-044 | aliquot, store in 0.6ml size |
| GlutaMAX-I | Life Technologies | 35050-061 | dilute 100X |
| antibiotic-antimycotic (AA) | Life Technologies | 15240-096 | dilute 100X |
| Complete Culture medium | Neurobasal medium with 1X B27, 1X AA, 1X GlutaMAX-I | ||
| Wash medium | same as 'Neurobasal medium' | ||
| Feed medium | Neurobasal with 1X B27 supplement | ||
| DNAse I | Sigma-Aldrich | D5025 | prepare 100X stock at 0.6mg/ml |
| poly-D-lysine | Sigma-Aldrich | P6407 | M.W. 70000-150000 |
| borate buffer | Sigma-Aldrich | B6768 (boric acid); 71997(borax) | 1.24g boric acid & 1.9g borax in 400ml H2O, pH to 8.5 use HCl |
| 12-mm round glass coverslips | Glasswarenfabrik Karl Hecht GmbH | 1001/12 | No. 1 glass, purchase from Carolina Biological Supply |
| proFection transfection kit | Promega | E1200 | see protocol for details |
| 2X HEPES buffered saline (HBS) | Promega | E1200 | see protocol for details |
| Syringe filter | Pall Corporation | 4192 | 0.2um pore size |
| Endofree plasmid prep kit | Qiagen | 12362 | for preparation of transfection grade plasmid DNA |
| anti-MAP2 antibody | Millipore | MAB3418 | mouse antibody, clone AP20 |
| anti-p-Tau antibody | Millipore | AB10417 | rabbit polyclonal antibody |
| anti-NR1 antibody | Millipore | MAB1586 | mouse antibody, clone R1JHL |
| anti-GluR1 antibody | Millipore | AB1504 | rabbit polyclonal antibody |
| Hank's balanced salt solution | ThermoFisher | 14025092 | 500ml size |
References
- Banker, G. Cultureing Nerve Cells. , 2nd edition, 339-370 (1998).
- Kaech, S., Banker, G. Culturing hippocampal neurons. Nat Protoc. 1, 2406-2415 (2006).
- Petersen, J. D., Kaech, S., Banker, G. Selective microtubule-based transport of dendritic membrane proteins arises in concert with axon specification. J Neurosci. 34, 4135-4147 (2014).
- Seibenhener, M. L., Wooten, M. W. Isolation and culture of hippocampal neurons from prenatal mice. J Vis Exp. , (2012).
- Shi, Y., Ethell, I. M. Integrins control dendritic spine plasticity in hippocampal neurons through NMDA receptor and Ca2+/calmodulin-dependent protein kinase II-mediated actin reorganization. J Neurosci. 26, 1813-1822 (2006).
- Viesselmann, C., Ballweg, J., Lumbard, D., Dent, E. W. Nucleofection and primary culture of embryonic mouse hippocampal and cortical neurons. J Vis Exp. , (2011).
- Biffi, E., Regalia, G., Menegon, A., Ferrigno, G., Pedrocchi, A. The influence of neuronal density and maturation on network activity of hippocampal cell cultures: a methodological study. PLoS One. 8, e83899 (2013).
- Crump, F. T., Dillman, K. S., Craig, A. M. cAMP-dependent protein kinase mediates activity-regulated synaptic targeting of NMDA receptors. J Neurosci. 21, 5079-5088 (2001).
- Leal, G., Afonso, P. M., Duarte, C. B. Neuronal activity induces synaptic delivery of hnRNP A2/B1 by a BDNF-dependent mechanism in cultured hippocampal neurons. PLoS One. 9, e108175 (2014).
- Clarke, L. E., Barres, B. A. Emerging roles of astrocytes in neural circuit development. Nat Rev Neurosci. 14, 311-321 (2013).
- Kaneko, A., Sankai, Y. Long-term culture of rat hippocampal neurons at low density in serum-free medium: combination of the sandwich culture technique with the three-dimensional nanofibrous hydrogel PuraMatrix. PLoS One. 9, e102703 (2014).
- Millet, L. J., Bora, A., Sweedler, J. V., Gillette, M. U. Direct cellular peptidomics of supraoptic magnocellular and hippocampal neurons in low-density co-cultures. ACS Chem Neurosci. 1, 36-48 (2010).
- Salama-Cohen, P., Arevalo, M. A., Meier, J., Grantyn, R., Rodriguez-Tebar, A. NGF controls dendrite development in hippocampal neurons by binding to p75NTR and modulating the cellular targets of Notch. Mol Biol Cell. 16, 339-347 (2005).
- Xu, S. Y., Wu, Y. M., Ji, Z., Gao, X. Y., Pan, S. Y. A modified technique for culturing primary fetal rat cortical neurons. J Biomed Biotechnol. 2012, 803930 (2012).
- McCarthy, K. D., de Vellis, J. Preparation of separate astroglial and oligodendroglial cell cultures from rat cerebral tissue. J Cell Biol. 85, 890-902 (1980).
- Qiu, S., Weeber, E. J. Reelin signaling facilitates maturation of CA1 glutamatergic synapses. J Neurophysiol. 97, 2312-2321 (2007).
- Qiu, S., Lu, Z., Levitt, P. MET receptor tyrosine kinase controls dendritic complexity, spine morphogenesis, and glutamatergic synapse maturation in the hippocampus. J Neurosci. 34, 16166-16179 (2014).
