Abstract
제노 laevis의 (개구리)에 pronephros의 배아 신장은 하나의 네프론 구성 및 신장 질환에 대한 모델로서 사용될 수있다. 제노 배아 외부 개발 크고, 쉽게 미세 주입 또는 외과 수술에 의해 조작 될 수있다. 또한, 운명의지도는 초기 Xenopus의 배아 설립되었습니다. 결국 기관 또는 조직의 관심을 야기한다 개별 할구로 타겟 마이크로 인젝션 선택적 배아의 나머지의 차 효과를 감소 또는 과발현이 제한된 영역 내에서 유전자 발현을 녹아웃하기 위해 사용될 수있다. 이 프로토콜에서는, 우리는 4 - 8 세포 배아의 특정 할구에 미세 주입을 통해 개발 Xenopus의 신장합니다 (pronephros)를 대상으로 설립 Xenopus의 운명 맵을 활용하는 방법에 대해 설명합니다. 계보 추적자의 주입은 주입의 구체적인 타겟팅의 확인을 할 수 있습니다.배아 38 무대 개발 후 - 40 전체 마운트 면역 염색을 pronephric 개발 시각화 사용되고 pronephros 타겟팅 세포에 의한 기여가 평가 될 수있다. 동일한 기술은 pronephros 외에 다른 조직 유형을 표적으로하도록 할 수있다.
Introduction
Xenopus의 배아 신장의 pronephros은 신장 개발 및 질병 연구를위한 좋은 모델입니다. 배아 외부 개발 크기가 크며, 대량으로 제조 할 수 있고, 용이하게 미세 주사 또는 수술을 통해 조작된다. 또한, 포유류와 양서류의 신장 발달을 지배하는 유전자가 보존되어있다. 배아 양서류가 pronephros이 성인 양서류가 metanephros을하면서 pronephros, mesonephros 및 metanephros 1 : 포유류의 신장은 세 단계를 통해 진행. 이러한 신장 형태의 기본 필터링 유닛 네프론이며, 포유류 양서류 모두 nephrogenesis (2, 3)를 거쳐 동일한 시그널링 캐스케이드 및 유도 이벤트를 요구한다. 아프리카 발톱 개구리 pronephros는 근위, 중간의 선단과 세관의 접속 이루어지는 단일 네프론 포함 및 (포유 동물 사구체와 유사)는 사구 1, 4-6 (그림 1 Xenopus의의 pronephros에서 하나의 큰 네프론 존재는 신장 개발 및 질병 과정에 관여하는 유전자의 연구에 대한 간단한 모델로 적합합니다.
세포 운명의지도는 초기 Xenopus의 배아 설립, 자유롭게 Xenbase 7-11에서 온라인으로 사용할 수있다. 동일한 기술은 같은 심장이나 눈과 같은 다른 조직을 대상으로 적용 할 수 있지만, 여기, 우리는 개발 Xenopus의의 pronephros을 대상으로 계보 추적자의 미세 주입하는 기술에 대해 설명합니다. 리니지 추적자는 초기 할구에 주입 될 수 있으며, 개발하는 동안 그 셀의 자손의 시각화를 허용 (중요한 염료, 형광 표지 된 덱스 트란, histochemically 검출 효소와 mRNA를 형광 단백질을 코딩 포함) 라벨이다. 이 프로토콜은 MEM-RFP의 mRNA는, 인코딩 막은 계보 추적으로, 적색 형광 단백질 (12)를 대상으로 사용합니다. 대상 미세 주입 기술여기에 설명 된 4 - 8 세포 배아의 개별 할구에 대한 niques 관심의 유전자를 과발현하는 유전자 발현, 또는 외인성 RNA와 함께 아래로 노크 morpholinos와 함께 주입을 위해 이용 될 수있다. 복부, 식물 할구에 주입하여, 주로 배아의 pronephros이 발달 컨트롤로 반대편 pronephros를 떠나, 타겟이 될 것입니다. 추적자의 공동 주입 올바른 할구 주입 된 것을 확인하고, 태아에 어떤 조직이 쇼는 pronephros의 대상 확인, 주입 된 할구에서 일어났다. pronephros의 면역 염색은 pronephric 세관을 대상으로 한 얼마나 잘 시각화 할 수 있습니다. 과발현 녹다운 효과는 발달 제어 역할 배아의 반대쪽에 대해 획득 될 수 있고, 13 pronephric 인덱스를 계산하는데 사용될 수있다. 세포 운명 맵의 가용성이 타겟 마이크로 인젝션 기술 OTH 조직을 대상으로 사용될 수 있도록어 pronephros, 형광 추적자의 공동 주입보다는 각 조직의 표적 미세 주입 분석하기 전에 확인할 수 있도록합니다.
배아 미세 주입 동안 발육 온도 단단히 통제 Xenopus의 발생률이 14에 크게 의존한다는 주어져야한다. 개발 시간이 둔화되기 때문에 4- 및 8 셀의 주사에 대해 - (16 °의 C (14)) 배아는 낮은 온도에서 배양한다. 22 ° C, 1 단계 (1 셀)에서 개발 시간에서 16 ° C 개발 시간에서 3 약 4 시간입니다 무대 동안 3 (4 셀), 약 2 시간입니다 무대입니다. 그것은 22 ° C에서 8 셀 (단계 4) 배아에 4 셀 배아에서 이동 약 15 분 걸리지 만 16 ℃에서 약 30 분 정도 소요됩니다. 마찬가지로, 22 ° C에서, 만 16 세포 배아 (단계 5)으로 진행하는 8 세포 배아 30 분 정도 걸립니다. 이 시간은 16 ° C 45 분으로 증가한다. 그만큼refore, 배아 16 세포 단계로 진행하기 전에 8 세포 단계에서 주입을위한 충분한 시간을 사용하는 배아의 발전 속도를 느리게하는 것이 유용하다. 또한, 성장 온도는 속도를 높이거나 신장이 완전히 개발 될 때까지 배아 발달을 느리게 조절 될 수있다.
올챙이 단계 Xenopus의 배아의 표피 조직 (15)의 절개 또는 청산하지 않고 개발 pronephros 쉽게 영상을 허용, 상대적으로 투명하다. 인해 Xenopus의 배아의 상대적 투명성, 생균 촬상 16,17 또한 가능하다. 이후 Xenopus의 배아 18-20에서 유전자 발현의 조작을 대상으로 pronephric 개발 평가 수 (40) 배아 - pronephros을 시각화하는 면역 염색하면, 중간 원위 인접, 무대의 연결 세관 (38) 레이블을 설립 항체 가능한 항목의 마운트.
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Protocol
(: HSC-AWC-13-135 프로토콜 #) 다음 프로토콜은 기관 관리 및 사용위원회의 역할을 실험 동물 의학 동물 복지위원회, 휴스턴의 센터에서 텍사스 건강 과학 센터의 대학에 의해 승인되었습니다.
신장 타겟 주사에 대한 Blastomeres을 1. 식별 및 선택
- 배아를 생성하기 전에, 배아의 초기 세포 분열의 배향을 이해 Xenopus의 개발 (21)의 정상 표를 사용한다. 또한, Xenbase 11 Xenopus의 초기 발달 단계의 액세스도.
- 마이크로 인젝션 대상이 될 할구 선택 Xenbase (11)의 상호 작용 Xenopus의 세포 운명의지도에 액세스 할 수 있습니다.
- 단세포 배아가 어둡게 착색 된 동물 극과 흰색과 노른자위의 인 식물 극을 가지고 있음을 관찰한다. 참고 난황 전자로 알려진 보호막,nvelope, 배아를 다루고 있습니다.
- 제 절단은 전형적으로 배아의 왼쪽과 오른쪽 사이에서 발생하는 것을 알 수 있습니다. 이러한 세포는 pronephric 리니지 동등 기여한다.
- 두 번째 분열은 4 셀 배아로 이어지는, 지느러미 및 배아의 복부 절반을 분할합니다. 지느러미 세포는 작고 복부 세포 (그림 2A 그림 3A)보다 안료가있다.
- 왼쪽과 오른쪽에, 지느러미보다 개발 신장에 더 기여 (D, 작은, 빛 세포) 할구 (그림 2A), 복부 할구 (큰, 어두운 세포 V)를 확인합니다.
- 4 셀 배아에 주입하면, 왼쪽 신장 (그림 3A 및 제 3 항)을 대상으로 왼쪽 복부 할구를 주입.
- 세번째 절단는 8 세포 배아 발생, 동물 및 식물의 측면을 이등분. 이 시점에서, 네 동물 할구는 [가 왼쪽 복부 오른쪽(V1)과 지느러미 (D1)] 네 식물 할구 [왼쪽과 복부 오른쪽 (V2)와 지느러미 (D2) (도 2b 및도 3b).
- 복부, 식물 할구 (V2)를 찾습니다. 이 할구는 다른 셀이 단계 (그림 2B)에서 개발 신장에 더 많은 기여한다. 8 세포 배아의 왼쪽 신장을 목표로, 왼쪽 V2의 할구 (그림 3b 및 제 3 항)에 주입.
- 네 번째와 다섯 번째 분열은 동물과 식물 할구를 이등분 것을 알 수 있습니다. 두 자손 16 세포 배아 발생, 각 할구로부터 생성된다. 세포는 그들의 전임자의 이름을 따서 명명된다. 예를 들어, 8 세포 단계에서 V2의 할구는 16 세포 단계 (도 2c)에서 V2.1 및 V2.2 자손을 일으킨다. 16 세포 단계에서 V2.2 셀 현상 신장에 기여하는 세포의 대부분을 제공한다.
- 여섯 번째와 일곱 번째 분열 32 셀 엠브리 결과 참고영형. 다시 말하지만,이 자손들은 이전 다음 명명 된 각각의 할구에서 생성됩니다. 예를 들어, 16 세포 단계에서 V2.2의 할구 32 세포 단계에서 V2.2.1 및 V2.2.2을 일으킨다. 가 셀 (식물로 동물)에서 A, B, C, 및 D와 같은 네 개의 행에서 식별되는 32 세포 단계에서 대체 네이밍 시스템은, 4 열 1, 2, 3, 4 (AS 지느러미)에서 복부에. 따라서, 개발 pronephros에 가장 기여하는 V2.2.2의 할구는,이 대안 네이밍 시스템 (그림 2D)에서 C3라고합니다.
배아 2. 준비
- (8.0 pH로 2 % 시스테인, 수산화 나트륨) Dejelly 용액 50 ㎖를 준비합니다.
- 표준 프로토콜 (14)에 따른 단일 남성 개구리에서 두 고환을 분리합니다. 0.1 M의 NaCl, 2 밀리미터의 KCl, 1 mM의 황산, 2 mM의 10 ml의 고환 스토리지 솔루션 (1 배 마크의 수정 링거 [MMR 가득 60mm 페트리 접시에 고환을 배치CaCl2를 5 mM의 HEPES pH를 8, 0.1 mM의 EDTA] (12), 1 % 소 혈청 알부민, 50 μg의 / ㎖ 젠타 마이신). 4 ° C에서 고환을 저장합니다.
주 : 고환 약 7 일 동안 저장 될 수있다 - 39 ° C에서 10 일이지만 시비 효율 고환이 저장되어있는 이상 감소한다. - 표준 프로토콜 14에 따라 알을 얻기 위해 여성 개구리 짠다. 100mm의 페트리 접시에 계란을 수집합니다. 초과 물을 붓는다.
- 이 집게와 면도날을 사용하여 고환 스토리지 솔루션에있는 동안 고환의 ¼을 잘라. 알을 함유하는 페트리 접시에 정소의 단편을 전송. 정소는 저장된 얼마나 고환의 크기를 고려하여 사용하는 정소 부분의 크기를 조정하고, 얼마나 많은 계란 시비하여야한다. 일반적으로 계란 한 클러치를 비옥하게하기 위해 갓 해부 고환의 1/3에 ¼ 사용합니다.
- 집게와 면도날을 사용하여 작은 조각으로 고환 부분을 잘라. 충분히 0.3 배의 MMR 추가페트리 접시에 + 30 ㎎ / ㎖ 겐타 마이신은 계란을 포함합니다. 섞어 접시에 MMR 소용돌이 친다.
- 수정은 실온에서 일어날 때까지 약 30 분을 기다립니다. 동물 반구 (배아의 색소 측) 효과적인 수정시 배아의 꼭대기에 앉아 않습니다. 이어서, 전사 피펫을 사용하여 배양 접시에서 MMR 제거. 배아를 충당하기 위해 요리에 충분한 Dejelly 솔루션을 추가합니다.
- 다음 몇 분 동안 부드럽게 간헐적으로 접시를 소용돌이 친다. 이 때 접시의 격렬한 흔들림 축 결함의 원인이 될 수 있습니다. 배아의 젤리 코트 용해하고, 배아는 소용돌이 치는 동안 접시의 중앙에 모이는 것입니다. 배아가 밀접하게 접시의 중앙에 서로 닿지되면, 전송 피펫으로 Dejelly 솔루션을 제거합니다. 이상 5 분 동안 Dejelly 솔루션의 배아를 두지 마십시오, 또는 배아가 손상 될 수 있습니다.
- 0.3 배에서 5 배 - dejellied 배아 3을 씻으십시오조심스럽게 쏟아져 또는 MMR 오프 피펫과 새로운 MMR과 접시를 작성하여 MMR은 + 30 ㎎ / ㎖ 겐타 마이신. 접시에서 MMR을 모두 제거하지 마십시오, 또는 배아가 손상 될 수 있습니다.
- 전송 피펫을 사용하여 페트리 접시에서 모든 미 수정 계란 또는 고환의 조각을 제거합니다.
- 14, 22 °의 C 사이의 배아를 품어.
주 : 낮은 온도에서 성장 된 배아 높은 온도에서 성장 된 배아보다 느리게 개발한다. 발달 단계의 타이밍 Xenbase (22)에서 찾을 수 있습니다.- 자신의 개발 밖으로 공간, 페트리 접시에 한 수정에서 배아의 장소 반은 14 ° C로 유지하고, 페트리 접시에 배아의 나머지 절반은 18 ° C로 유지. 이는 단일 시비 4 셀, 8 셀 배아 내로 주사 두 집합을 허용한다.
사출 솔루션 및 태아의 미세 주입 3. 준비
- 0.01를 함유하는 주사액을 제조NG / NL 막 결합 적색 형광 단백질 (RFP-MEM)의 mRNA 9 배아 4 셀, 8 셀 스테이지 개발하고있다. 주입 할 준비가 될 때까지 얼음에 주입 솔루션을 저장합니다.
- ". 바늘 풀러 케이스의 상단에 정렬 교체 튜브의 상단에, 바늘 풀러로 교체 유리 모세관 튜브 (800)에 열 # 2 값을 설정하고 (650)을 눌러 당김 값은"7을로드 당겨 "버튼을 눌러 바늘을 당겨. 이는 단일 7에서 2 바늘을 만들 것"유리 모세관.
- 뒤몽의 포셉 한 쌍으로 뽑아 바늘의 끝을 싹둑.
참고 : 바늘을 당기는 후, 팁 차단을 밀봉 오픈 절단해야합니다. 바늘 끝이 될 직경이 작을 것이 절단 바늘의 지점에 가까워. 팁의 직경은 여기에 사용 된 마이크로 인젝션 시스템과 주입 부피에 영향을주지되지만, 더 큰 직경을 갖는 팁이 배아가 손상 할 가능성이있다. - m 개의 슬립바늘의이면 상 icropipette 콜레트. 다음에, 콜레트 뒤에 바늘의 후방에 큰 구멍 O 링 슬립.
- 미네랄 오일이 바늘에 공기 방울을 얻을 않도록주의하면서, 27 게이지 피하 주사 바늘을 이용하여 바늘을 입력합니다.
- 플런저에 설치되어있는 흰색 플라스틱 스페이서의 큰 구멍에 바늘을 좌석의 마이크로 인젝터의 플런저에 바늘을 슬립. 플런저 흰색 스페이서 큰 구멍 O 링과 콜릿 뒤에 마이크로 인젝터의 몸에 가까운 작은 O 링을 가져야한다. 콜레트를 조여 바늘을 고정합니다. 제대로 고정되어 있는지 확인하기 위해 바늘에 부드럽게 잡아 당깁니다.
- 이 비프 음이 될 때까지 눌러은 마이크로 인젝터 제어 상자의 "빈"버튼을 누르고 있습니다.
- 파라 필름의 조각 위에 주입 솔루션의 피펫 3 μL. 파라 필름에 주사 용액의 구슬로 바늘의 끝을 삽입합니다. 언론과는이 microi 버튼을 "작성"개최njector 컨트롤 박스는 바늘로 주사 솔루션을 그립니다.
- 0.3 배의 MMR + 30 mg을 / ㎖ 겐타 마이신 5 % 피콜 메쉬 500 미크론 폴리 에스테르 늘어서 60mm 페트리 접시를 입력합니다. 접시에 30 4 셀 또는 8 셀 배아 - 조심스럽게 20 피펫.
- 모발 루프 (14)를 사용하여, 바늘 할구를 향 분사 될 수 있도록 조작 배아. , 왼쪽 신장을 대상으로 4 셀 배아 또는 8 세포 배아의 왼쪽 V2의 할구의 왼쪽 복부 할구가 바늘을 마주 보도록 배아를 정렬합니다.
- 디쉬 각 배아 선택된 할구로 주사액 10 NL 주입한다.
주 : 배양 접시의 바닥에 메쉬는 배아를 안정화시키고 그들을 안정화 모발 루프를 사용하지 않고 삽입 될 수 있도록 구르는을 방지한다. - 전송 0.3 배의 MMR + 30 mg을 / ㎖ 겐타 마이신 5 % 피콜 충전 된 문화 판의 우물에 배아를 주입. 주입 된 배아를 품어적어도 한 시간 동안 16 ° C에서의이 주입 된 할구 치유 할 수 있도록합니다.
- 단계 9 (전 낭 배기로)으로 0.3 배의 MMR + 30 ㎎ / ㎖ 겐타 마이신 충전 된 새로운 문화 판의 우물에 치유 배아를 전송합니다.
- 40 21 - 배아 단계 38에 도달 할 때까지 22 °의 C - 14 배아를 품어.
4. 고정 및 태아의 면역 염색
- MOPS / EGTA / 황산 마그네슘 50 ㎖를 준비 / 포름 알데히드 버퍼 [MEMFA : 100 mM의 MOPS (PH 7.4), 2 mM의 EGTA, 1 mM의 황산, 3.7 % (v / v)의 포름 알데히드].
- 유리 병에 40 배아 - 20 단계 (38) - 전송 피펫을 사용하여, 10을 넣어. 혼합 유리 병 및 반전 바이알에 100 % 에탄올에 10 ㎕의 5 % 벤조 카인을 추가합니다. 배아를 마취 10 분을 기다립니다.
- 유리 피펫을 사용하여 유리 병에서 MMR을 제거합니다. 동시에 다수의 튜브를 처리하는 경우, 바이알을 24 웰 세포 배양 플레이트에 수직으로 유지 될 수있다.
- 유리 파이프TTE, MEMFA와 유리 병을 채 웁니다. 실온에서 1 시간 동안 입체 요동 플랫폼 바이알을 놓는다.
- 유리 피펫을 사용하여 유리 병에서 MEMFA를 제거합니다. 100 % 메탄올 병을 채 웁니다. 실온에서 10 분 동안 입체 요동 플랫폼 바이알을 놓는다. 이 세척 단계를 한 번 더 반복하고, -20 ° C에서 100 % 메탄올 하룻밤에 배아를 저장합니다.
- 준비 1X 인산 완충 생리 식염수 - 소 혈청 알부민 트리톤 (PBT) 1X PBS, 2 ㎎ / ㎖ 소 혈청 알부민, 0.1 % 트리톤 X-100.
- 1X PBT 1 10 %의 염소 혈청과 : 차 항체 솔루션을 준비 마우스 단일 클론의 5 희석 4A6 항체, 마우스 모노클로 날 항체 3G8의 1:30 희석합니다 (중간 말단과 연결 세관 (20)의 막을 레이블을) 그리고 1 (근위 세뇨관 (20)의 라벨 루멘에) : 토끼 폴리 클로 날 RFP 항체의 250 희석합니다 (MEM-RFP의 추적 라벨을합니다). 4 ℃에서 보관하십시오.
- seconda 준비공예 항체 용액 : 10 % 염소 혈청과 1X PBT, 1 : 500 알렉사 488 염소 항 - 마우스 IgG (재고 농도 2 ㎎ / ㎖, 라벨 4A6 및 3G8로), 1 : 500 알렉사 555 염소 항 - 토끼 IgG를 (주 농도 2 ㎎ / ㎖하며 MEM-RFP의 추적 라벨을). 저장 4 ° C에서, 호일에 튜브를 다루는 것은 빛으로부터 보호 할 수 있습니다.
- 또한, 염색 후 기본 및 보조 항체를 수집하고, 미래의 실험에서 재사용 4 ° C에 저장합니다. 항체는 재사용을 위해 저장되어야하는 경우, 0.01 %의 아 지드 화 나트륨을 추가한다.
- 설립 된 프로토콜 (18)을 사용하여 배아를 발현 사이.
태아 및 대상 Pronephric 조직의 분석 5. 시각화
- 올바른 할구는 1X에서 형광 실체 현미경 하에서 추적의 형광을 확인하여 주입되었는지 확인하기 위해 면역 염색 배아를 화면 (전체 배아를 볼 수)과 5 배 확대 (신장를 볼 수 있습니다). 우리와 멀티 웰 유리 접시에 장소 배아1X PBT는 끝이 전송 피펫을 사용하여 가득 재편이 차단. 헤어 루프 배아를 조작 할 수 있습니다. 배아의 왼쪽에있는 pronephros의 공동 주입 추적 존재가있는 경우에만 배아를 사용합니다 (그림 3C, F 및 그림 4C, F) 유전자 과발현 또는 최저 분석.
- 유리 병에 배아를 놓고 머레이의 취소와 함께 유리 병을 작성하여 : 또는 머레이의 지우기의 배아 (1 부 벤질 알코올이 부분 벤질 벤조 에이트)을 취소합니다. 유리 웰 플레이트를 사용하여 배아를 시각화합니다.
참고 : 머레이의 삭제는 유기 용매 및 취급시주의해야한다. 장갑을 착용하고 만 머레이의 투명 유리 튜브 및 피펫을 사용합니다. - 삼주 - 2 4 ° C 1 배에서 PBT에서 보관 배아. 배아의 장기 저장을 위해 10 분 동안 실온에서 100 % 메탄올을 두 번 세척하여 배아 탈수. 100 % 메탄올에서 -20 ° C에서 배아를 저장합니다.
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Representative Results
MEM-RFP의 mRNA와 4- 및 8 셀 Xenopus의 배아의 Microinjections는 pronephros을 대상으로 서로 다른 수준을 보여줍니다.도 4 단계 올바른 MEM-RFP mRNA 발현 패턴 (40) 배아 그림. 배아는 왼쪽 복부 할구 (그림 4A)에 주입하고, MEM-RFP의 mRNA의 적절한 발현 패턴 분류 하였다. 중간 근위 말단에서 MEM-RFP를 발현하고, 신장 세관의 접속뿐만 아니라, 적절하게 주입 배아 머리, 몸통 및 꼬리 표피에서 형광을 표시 할 것으로 기대된다. 그들은 또한 otocyst에 형광, 시멘트 선, proctodeum 및 somites (그림 4C)를 표시해야합니다. 8 적절히 주입 배아 신장 MEM-RFP 형광의 분포 형광 실체 현미경 (도 4b)로 측정 하였다. 표피 MEM-RFP 발현 수준이 높은 것을 배아신장 영역의 검출 "흡장"로 얻었 차단 하였다. 폐색으로 MEM-RFP 발현이 근위부에서 발견 된 모든 배아의 중간 말단과 연결 세관은 득점하지 않은 그. 입체경 (그림 4D-F) 및 공 초점 현미경 (그림 4G-I)는 3G8 및 4A6과 면역 염색 MEM-RFP 및 신장 조직의 공동 현지화를 확인하는 데 사용되었다. 공 촛점 영상은 왼쪽 복부 할구로 MEM-RFP의 미세 주입이 제대로 신장을 목표로 나타내는, 근위, 신장의 중간, 말단과 연결 세관에 MEM-RFP의 공동 현지화을 확인했습니다.
8 세포 단계에서 MEM-RFP mRNA를 주입 배아 (도 5a)를 8 셀 주사 신장에 차 효과의 가능성을 줄일 수 있음을 나타내는 형광 표시 조직의 좁은 범위를 도시한다. 4- 세포 단계에서 EMBR 주입 배아 추천YOS는 기단에 8 셀 스테이지 쇼 형광 주입 중간 신장 원위 세관과 연결뿐만 아니라 somites 및 proctodeum (도 5C-F). 4 세포 단계에서 주입 된 배아는 달리, 시멘트 선 및 otocyst은 MEM-RFP으로 표시되지 않습니다. 10 제대로 대상으로 배아 중 하나의 배아는 근위 세뇨관의 거의 모두 MEM-RFP를 보였으며, 3 거의 모든 신장 (그림 5B)의 중간과 원위 세뇨관의에서 MEM-RFP를 보였다. 7 배아의 연결 세관은 부분적으로 MEM-RFP으로 표시 하였다. 또한, 8 세포 단계에서 주입 배아 신장 시각화 쉬웠다 및 폐색으로 하나만 획득 하였다. MEM-RFP 및 신장 (3G8 및 4A6)를 라벨링 항체의 공동 지역화 실체 (도 5D-F)를 사용하여 측정하고, 공 초점 레이저 주사 현미경 (도 5G-I)를 사용하여 확인 하였다. 근위부, 중간, 말단과 연결 부엉신장의 bules은 4 셀의 왼쪽 복부 할구 주입 배아보다 적은 조직에서 형광을 표시하면서 V2의 할구의 주입은 신장에 레이블을 대상으로 8 세포 단계에서 주입 된 배아에서 MEM-RFP, 시연으로 표시 하였다 단계.
이 분석은 형광의 사용은 마이크로 인젝션의 대상이 된 조직을 표시하는 추적으로 mRNA를 태그한다. 분석하기 전에 일관된 추적 현지화를위한 배아를 선별하는 것이 중요하고, 예상 추적 분포 패턴을 표시 할 수있는 배아는 폐기해야합니다. 6 잘못에 MEM-RFP의 mRNA와 대상이 된 단계 40 배아의 예를 보여줍니다 4- 세포 단계. MEM-RFP의 mRNA 발현은 태아 대신 좌측 (도 6a)의 우측에 위치한다. 또한, mRNA 발현의 대부분과, 상기 하부 몸체와 꼬리의 피부에somites에서 작은 식입니다. 어떤 mRNA 발현은 신장의 부적절한 타겟팅을 확인, 근위부, 중간, 말단과 연결 세관 (그림 6B)에서 볼 수 없습니다. 따라서,이 배아 분석을 위해 사용되지 않아야한다.
그림 1 :. 무대 35 Xenopus의 배아의 신장 Xenopus의 배아 신장도, 근위, 중간, 말초을 표시하고 세관을 연결. Raciti 등을 기준으로합니다. (2008) 6. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2 : Xenopu의 배아 운명지도. 운명의지도를 식별하고 개발 pronephros에 기여하는 할구의 이름을 지정. 4 셀 배아의) 운명의지도. B) 8 세포 배아의 운명지도. 16 세포 배아의 C) 운명의지도. 32 세포 배아 D) 운명의지도. 32 세포 배아 할구는 대체 할구 명명 시스템을 사용하여 라벨링된다. 무디 (1987) 8, 9, 무디스와 클라인 (1990)에 따라 운명지도 7. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3 :. Xenopus의 Pronephros 타겟팅을위한 사출 방식은 빨간색 화살표는 세포가 주입을 나타냅니다. A) 동물 및 4 셀 배아 복부 뷰 왼쪽 복부 (b)의 주입을 도시왼쪽 pronephros을 대상으로 lastomere. 빨간색 화살표는 왼쪽 복부 할구를 나타냅니다. B) 동물과 왼쪽 V2의 할구의 주입을 나타내는 8 세포 배아의 복부보기는 왼쪽 pronephros을 대상으로합니다. 빨간색 화살표는 왼쪽 V2의 할구를 나타냅니다. AB) 4 배 배율에서 입체경에 찍은 배아의 이미지. Xenopus의 운명에 따라 주사 무디 (1987) 8, 9, 무디스와 클라인 (1990)에 의해 개발 된 맵을 7. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 4 :. 4 셀 단계 대상으로 태아의 예 면역 염색 단계 추적자로 MEM-RFP의 mRNA를 사용하여 4 셀 단계에서 왼쪽 pronephros을 대상으로 주사를 보여주는 40 Xenopus의 배아. MEM-RFP 라벨세포막 빨간색. A) 4 셀 배아의 왼쪽 복부 할구로 MEM-RFP의 mRNA의 도식을 보여주는 주입입니다. 제대로 주입 된 배아의 신장에서 MEM-RFP 형광 B) 조직의 현지화. C) 단계는 40 배 4- 세포 단계에서 좌 복부에 할구 MEM-RFP 주입. 신장이 녹색으로 표시되는 동안 MEM-RFP 현지화는 빨간색으로 표시됩니다. 1X 확대. D) 신장 근위 세뇨관의 내강에 레이블을 3G8로 염색하고, 4A6는, 중간 말단과 연결 세관 세포의 세포막을 라벨. 5 배 확대. MEM-RFP 현지화를 보여주는 신장을 통해 지역의 E) 확대. 5 배 확대. F)는 신장과 MEM-RFP 트레이서의 공동 현지화를 보여주는 이미지를 병합. 5 배 확대. CF) 입체경에 올림푸스 DP71 카메라로 촬영 한 배아의 이미지. G) 3G8 및 4A6로 염색 두 번째 태아의 신장의 공 촛점 이미지. H) 신장에서 MEM-RFP의 현지화 및 주변 조직. 나는) 이미지 소를 합병신장에서 MEM-RFP, 3G8 및 4A6의 날개 공동 현지화. GI) 20 배 배율에서 최대 투사를 사용하여 공 촛점 이미지. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 5. 8 세포 단계 대상으로 태아의 예 면역 염색 단계 추적자로 MEM-RFP의 mRNA를 사용하여 8 셀 단계에서 왼쪽 pronephros을 대상으로 주사를 보여주는 40 Xenopus의 배아. MEM-RFP는 적혈구의 세포막을 라벨. 8 세포 배아의 왼쪽 V2의 할구로 MEM-RFP의 mRNA의 A) 도식 보여주는 주입입니다. 제대로 주입 된 배아의 신장에서 MEM-RFP 형광 B) 조직의 현지화. C) 40 배아는 8 세포 단계에서 왼쪽 V2의 할구에서 MEM-RFP 주입 단계. MEM-RFP 현지화가 표시됩니다적색, 녹색, 신장이 표시되어있다. 1X 확대. D) 신장 근위 세뇨관의 내강에 레이블을 3G8로 염색하고, 4A6는, 중간 말단과 연결 세관 세포의 세포막을 라벨. 5 배 확대. MEM-RFP 현지화를 보여주는 신장을 통해 지역의 E) 확대. 5 배 확대. F)는 신장과 MEM-RFP 트레이서의 공동 현지화를 보여주는 이미지를 병합. 5 배 확대. CF) 입체경에 올림푸스 DP71 카메라로 촬영 한 배아의 이미지. G) 3G8 및 4A6로 염색 두 번째 태아의 신장의 공 촛점 이미지. H) 신장에서 MEM-RFP의 현지화 및 주변 조직. 나는) 신장에서 MEM-RFP, 3G8 및 4A6의 공동 현지화를 보여주는 이미지를 병합. GI) 20 배 배율에서 최대 투사를 사용하여 촬영 공 촛점 이미지. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 6 : 배아의 예는 잘못 4 셀 단계에서 대상으로 면역 염색 무대 40 Xenopus의 배아는 추적자로 MEM-RFP의 mRNA를 사용하여 4 셀 단계에서 왼쪽 pronephros의 잘못된 타겟팅을 보여주는.. MEM-RFP는 적혈구의 세포막을 라벨. A) 단계 잘못된 할구에 주입 나타내는 MEM-RFP의 부적절한 분포를 나타내는 40 배. 잘못된 할구 내로 주입 나타내는 잘못된 트레이서 분포이있을뿐만 아니라 배아 우측에 주입 하였다. 1X 확대. 신장 (3G8, 4A6)를 라벨 항체와 MEM-RFP의 공동 현지화의 부족을 보여주는 신장의 B) 병합 된 이미지입니다. 5 배 확대. AB) 입체경에 찍은 배아의 이미지. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
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Discussion
Xenopus의 배아를 개발하는 pronephros을 타겟팅 확인하고 올바른 할구 주입에 의존합니다. 8 셀 배아의 V2의 할구의 주입 왼쪽 pronephros (18)을 목표로하고있다. 이 내부 통제와 반대편 오른쪽 pronephros을 떠난다. 모르가 녹다운 또는 RNA 과발현이 신장 개발을 변경하는 데 사용되는 경우, 반대측 pronephros 오른쪽 왼쪽 pronephros에 유전자 녹다운 또는 과발현의 효과를 비교하기 위해 사용될 수있다. 이 경우, 이러한 불일치 제어 모르 지배적 네거티브 RNA 구조체와 같은 적절한 제어 유전자 발현의 변화의 결과를 분석하는 반대쪽 내부 제어에 부가하여 사용해야한다. 인해 Xenopus의 배아의 상대적 투명성, 신장 결함 쉽게 여러 기술을 이용하여 정량화 할 수있다. 예를 들어, 유전자 녹다운 또는 과발현은 단순히 배아 pronephric 인덱스를 산출함으로써 정량 할 수있다배아의 분사 제어 측면에서 근위 세뇨관의 개발을 비교 항체 3G8 (13)로 면역 염색. pronephric 개발 연구뿐만 아니라,이 기술을 쉽게 7-10 매핑 확립 운명을 사용하여 주입하는 적절한 할구를 선택하여 다른 조직을 표적으로하도록 할 수있다. 다른 조직 유형을 대상으로하는 것 외에도,이 프로토콜은 다른 단계에서 신장 현상을 연구하는데 사용될 수있다. 이 프로토콜은 단계에서 차별화 된 신장 조직을 검출 항체 3G8 및 4A6로 염색 (40) 배아를 보였다. 이세 배아 상이한 신장 항체로 면역 염색 또는 계내 혼성화 (5, 6), (20)에서 실시 될 수있다. 예를 들어, 항체 LIM1이 현상 pronephros (21), (22)을 검출 할 수있다. 마찬가지로, LIM1가 pax8 및 hnf1- β 사체 일 수 단계 12.5 22-24에서 현장 하이브리드의 시작에서 검출 계내 혼성화 마커에 나중에 다른 나중에 개발 단계에서 신장의 서로 다른 영역을 검출 할 수있다. 예를 들어, 프로브가 사구에 nphs1, clckb, slc5a1 및 atp1a1의 발현을 검출하기위한, 말초 및 세뇨관 근위 세뇨관, 전체 신장을 연결하는 각각 27 (26), 5, 25에 설명되어있다. 신장 평가 치료는 신장 전개를 변경하는 방법의 더 나은 이해를 허용하는 다른 항체 계내 분석을 사용하여 여러 단계에 걸쳐.
이 프로토콜의 하나의 중요한 측면 주입 할 수있는 올바른 선택과 할구의 식별이다. 이 프로토콜에서는, 우리는 8 셀 배아의 왼쪽 V2의 할구 또는 4 셀 배아의 왼쪽 복부 할구를 주입하여 pronephros을 대상으로하는 방법에 대해 설명합니다. 잘못된 할구를 주입하면 pronephros 올바르게 타겟팅되지 않는다. 따라서, 그것을이 초기 세포 분열이보고있는 만 주입 배아에 도움이 될 수 있도록 초기 Xenopus의 배아의 개발과 세포 분열면 이전에 미세 주입 (28)에 익숙해지는 것이 중요하다 29. 배아 분열은 항상 기존의 발달 단계 차트를 따르지 않는 "정상"적절한 할구를 용이하게 식별 될 수있다. 이것은 부적절하게 타겟팅 된 배아의 수를 감소한다. 배아의 할구 완전히 주입시 분할 될 수 있도록 또한, 중요하다. 할구 V1 및 8 셀 배아 V2 간의 분열이 마이크로 인젝션 전에 완료되지 않은 경우, 예를 들어, 탐침은 V2뿐만 아니라 V1로 퍼져있다. 이 마이크로 인젝션의 타겟팅 효율을 감소시킬 것이며, 그 결과는 4 배아 세포 단계보다는 8 세포 단계에서 주입 된 배아의 더 비슷 트레이서 분포를 표시 할 수있다.
이 프로토콜의 다른 중요한 부분은 pronephros가 제대로 미세 주사의 대상이되었다 확인합니다. 배아가 제대로 생성 된 데이터 집합을 왜곡 할 수있다 대상으로 pronephros 없었어요 그 때문은 pronephric 개발을 분석하기 전에 수행해야합니다. 적절한 타겟팅을 확인하려면, 각 주입 배아의 추적 분포를 분석 할 수 있습니다. 배아의 주입 (왼쪽) 측 형광 추적자의 대다수를 표시해야합니다. 배아의 제어 (오른쪽) 측이 형광의 상당한 양을 표시하는 경우,이 배아는 폐기해야합니다. 이 경우, 잘못된 할구 하나는 주입 또는 주사 할구 주입 전에 절단을 완료하지 않았다. 둘째, 배아의 주입 (왼쪽) 측에 형광 올바르게 pronephros을 대상으로해야합니다. 배아는 8 세포 단계, 지느러미 및 복부 somites, 측판, hindgut, proctodeum, 주입 된 경우 트렁크에 트렁크 및 신경 능선의 피부는 독감을 보여줄 것으로 예상된다orescence pronephros (6)에 더하여 (29). 넓은 피부 somites 내의 형광 탐침의 분포뿐만 아니라 타겟팅 있어야 4- 세포 단계에서 주입 된 8 세포 주입 나와 조직 배아 이외에 시멘트 선, otocyst, 렌즈와 후각 placode. 배아 적절한 조직 타겟팅을 표시하지 않는 경우에는 분석에 앞서 (도 5)을 파기한다.
이 프로토콜에 설명 된 타겟 주사 원하는 조직에서 유전자 발현을 조작하는 수단을 제공한다. 이 기술의 한계는 이들 주사 타겟팅되었지만, 그들은 단지 현상 신장에 영향을주지 않는다는 것이다. 이 기술에 기재된 4- 및 8 셀 주사보다 유전자 발현 전 배아에서 변경 될 단일 세포 단계에서 수행 주사보다 타겟 주사제 두 세포 단계에서 수행되는 경우의 절반 배아 표시 변경 유전자 표현이온. 그러나 이들은 단지 하나의 조직을 대상으로하지 않는다. 4 배아 8 배아의 V2의 할구의 복부에 주사 할구는 pronephros에서 유전자 발현을 변경하지만, 또한, 다른 조직에서의 유전자 발현 변화. 기타 영향을받는 조직은 피부, somites, 장, 신경 문장을 포함한다. 따라서, 4- 8 세포 주사 1 또는 2 셀 주사보다 타겟되지만, 그들은 여전히 여러 조직에서의 유전자 발현을 변화된다는 것을 이해하는 것이 중요하다. 4- 8 세포 배아 단계에서 주입 외에도 주사제도 2, 16, 및 32 세포 단계에서 수행 될 수있다. 2- 세포 단계에서 주입 배아 이후 단계에서 주입 된 배아 조직의 영향보다 더 넓은 범위를 가질 것이다. 기술적으로 어려운 있지만, 16, 32 세포 단계에서 주입 된 배아 4- 8 세포 단계에서 주입 된 배아 조직의 영향보다 좁은 범위를 가질 것이다.
MEM-RFP 계보 추적R은 마이크로 인젝션 한 후 적절한 표적을 확인하기 위해 프로토콜이 사용된다. MEM-RFP의 mRNA는 세포 후 세포막이 주입 된 RNA에서 단백질을 번역 한 레이블. 배아의 죽음을 설명하는 데 필요한 및 추적 형광의 강도를 원하는대로이 프로토콜 (10 NL 주사에 MEM-RFP의 mRNA의 0.1 NG)에 사용 MEM-RFP의 계보 추적의 농도는 수정해야합니다. 예컨대 로다 덱스 트란, 양자점 또는 histochemically 검출 β 갈 락토시다 제 등의 주입 계통 트레이서의 양은 다른 혈통 트레이서, 수정 이외에도 대신 MEM-RFP 사용될 수있다. 리니지 추적자는 배아 발달로 감소하는 형광의 레벨을 일으키는 세포 분열로 더 희석된다. 이 기술의 또 다른 응용 프로그램이 과발현 또는 관심의 유전자의 발현을 허물고 계보 추적과 외래 RNA 또는 모르 폴리 노를 공동으로 주입하는 것입니다. 계보 트레이서는 pronephros의 정확한 표적을 확인하기 위해 사용되지 않지만,공동 주입 외래 RNA 또는 모르 폴리 노의 배아에서 지역화 위치를 나타냅니다. 외래 RNA 및 morpholinos 잠재적 트레이서 아니라 외래 RNA 30 모르 본가 딸세포 결과, 공동 주입 트레이서와 동일한 속도로 주입 할구를 통해 확산 할 수 없습니다. 사실, 우리는 하나의 세포에 주입 두 개의 서로 다른 RNA 구조가 항상하지 않는 공동 지역화 (게시되지 않은 데이터)를 관찰했다. 따라서, 셀의 추적의 존재가 반드시 공동 주입 외래 RNA 또는 모르 폴리 노 항상 해당 셀에 있는지 나타내는 것은 아닙니다.
이 프로토콜은 제노 배아를 개발 pronephros을 야기 할구를 마이크로 인젝션을 타겟팅하는 방법에 대해 설명. 단면 또는 주입하면 유전자 발현은 종종 원인 초기 발달 이상을 방지 할 수 있습니다 둘 morpholinos 또는 외인성 RNA의 주입을 통해 Xenopus의 배아의 조작이 세포 배아. 현상 태아의 모든 셀에서의 단일 세포 단계 전시 녹다운 또는 과발현 주입 배아. 유전자 적절한 초기 개발 과정에 필요한 경우, 배아는 pronephros을 개발할 수 없다. 이러한 여기에 설명 된 8 셀 주사 등의 나중 단계에서 수행 주사는 낭 배기 및 최종 pronephric 개발 (18)을 거쳐 배아가 발생할 수 있습니다. 따라서, 여기서 설명하는 대상 주사 배아 pronephric 개발을 통해 진행할 수 있도록, 일부 유전자 발현의 변화에 의해 야기되는 낭배 결함을 극복 할 수있다. 앞으로,이 프로토콜은 원하는 할구에 CRISPR 구조물을 대상으로 사용될 수있다.
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Acknowledgments
이 작품은 텍사스 맥거번 의과 대학 소아과에서 건강 NIDDK 부여 (K01DK092320) 및 시작 기금의 국립 연구소에 의해 지원되었다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Sodium chloride | Fisher | S271-3 | |
| Potassium chloride | Fisher | P217-500 | |
| Magnesium sulfate | Fisher | M63-500 | |
| Calcium chloride | Fisher | C79-500 | |
| HEPES | Fisher | BP310-500 | |
| EDTA | Fisher | S311-500 | |
| Gentamycin solution, 50 mg/ml | Amresco | E737-20ML | |
| L-Cysteine, 99%+ | Acros Organics | 52-90-4 | |
| Ficoll | Fisher | BP525-100 | |
| 100 mm x 15 mm Petri dish | Fisher | FB0875712 | |
| Mini Fridge II | Boekel | 260009 | Benchtop incubator for embryos. |
| Gap43-RFP plasmid | For making tracer RNA. Ref: Davidson et al., 2006. | ||
| Rhodamine dextran, 10,000 M.W. | Invitrogen | D1817 | Tracer. |
| Molecular biology grade, USP sterile purified water | Corning | 46-000-CI | |
| 7" Drummond replacement tubes | Drummond | 3-000-203-G/XL | Microinjection needles. |
| Needle puller | Sutter Instruments | P-30 | |
| Fine forceps | Dumont | 11252-30 | For breaking microinjection needle tip. |
| Nanoject II | Drummond | 3-000-204 | Microinjector. |
| Mineral oil, heavy | Fisher | CAS 8042-47-5 | Oil for needles. |
| 27 G Monoject hypodermic needle | Covidien | 8881200508 | For loading mineral oil into microinjection needle. |
| 5 ml Luer-Lok syringe | BD | 309646 | For loading mineral oil into microinjection needle. |
| 60 mm x 15 mm Petri dish | Fisher | FB0875713A | |
| 800 micron Polyester mesh | Small Parts | CMY-0800-C | |
| Transfer pipets | Fisher | 13-711-7M | For transferring embryos. Cut off the tip so that the embryos are easily taken up by the pipette. |
| 6-well cell culture plate | Nest Biotechnology | ||
| MOPS | Fisher | BP308-500 | |
| EGTA | Acros Organics | 67-42-5 | |
| Formaldehyde | Fisher | BP531-500 | |
| 15 mm x 45 mm Screw thread vial | Fisher | 03-339-25B | For fixing, staining, and storing embryos. |
| 24-well cell Culture plate | Nest Biotechnology | ||
| Benzocaine | Spectrum | BE130 | |
| Ethanol | Fisher | BP2818-4 | |
| Methanol | Fisher | A412-4 | |
| Phosphate buffered saline (PBS) 1x powder | Fisher | BP661-50 | |
| Bovine serum albumen | Fisher | BP1600-100 | |
| Triton X-100 | Fisher | BP151-500 | |
| 3D Mini rocker, model 135 | Denville Scientific | 57281 | |
| Goat serum, New Zealand origin | Invitrogen | 16210064 | |
| Sodium azide | Fisher | S227I-25 | |
| Monoclonal 3G8 antibody | European Xenopus Resource Centre | Primary antibody to label proximal tubules. | |
| Monoclonal 4A6 antibody | European Xenopus Resource Centre | Primary antibody to label intermediate, distal and connecting tubules. | |
| anti-RFP pAb, purified IgG/rabbit | MBL | PM005 | Primary antibody to label Gap43-RFP tracer. |
| Alexa Fluor 488 goat anti-mouse IgG | Life Technologies | A11001 | Secondary antibody to label kidney tubules. |
| Alexa Fluor 555 goat anti-rabbit IgG | Life Technologies | A21428 | Secondary antibody to label Gap43-RFP tracer. |
| 9 Cavity spot plate | Corning | 7220-85 | |
| Benzyl benzoate | Fisher | 105862500 | Optional - for clearing embryos |
| Benzyl alcohol | Fisher | A396-500 | Optional - for clearing embryos |
References
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