Abstract
Den embryoniske nyre fra Xenopus laevis (frosk), den pronephros, består av et enkelt nevronet, og kan brukes som en modell for nyresykdom. Xenopus embryoer er store, utvikle eksternt, og kan lett manipuleres ved mikroinjeksjon eller kirurgiske prosedyrer. I tillegg er det etablert skjebne kart for tidlig Xenopus embryo. Målrettet mikroinjeksjon inn i de enkelte blastomere som til slutt vil gi opphav til et organ eller vev av interesse kan bli brukt for selektivt å overuttrykke eller slå ned genekspresjon innenfor dette begrensede område, reduseres sekundære effekter på resten av utvikling av embryo. I denne protokollen beskriver vi hvordan du kan utnytte etablerte Xenopus skjebne kart å målrette utvikle Xenopus nyre (de pronephros), gjennom mikroinjeksjon inn i spesifikke blastomere av 4- og 8-cellers embryoer. Injeksjon av avstamning tracere tillater verifisering av den spesifikke målrettingen av injeksjonen.Etter embryo har utviklet for å iscenesette 38-40, hel-mount farging brukes til å visualisere pronephric utvikling, og bidraget av målrettede celler til pronephros kan vurderes. Den samme teknikken kan tilpasses for å målrette andre typer vev i tillegg til pronephros.
Introduction
Xenopus embryoniske nyre, de pronephros, er en god modell for å studere nyre utvikling og sykdom. Embryoene utvikle eksternt, er store i størrelse, kan fremstilles i stort antall, og kan lett manipuleres via mikroinjeksjon eller kirurgiske prosedyrer. I tillegg er de gener som regulerer nyre utvikling hos pattedyr og amfibier bevart. Pattedyr nyrene går gjennom tre stadier: de pronephros, mesonephros og metanephros 1, mens embryonale amfibier har en pronephros og voksne amfibier har en metanephros. Den grunnleggende filtrering enhet av disse nyre formene er nevronet, og både pattedyr og amfibier krever de samme signalkaskader og induktive arrangementer for å gjennomgå nephrogenesis to, tre. Xenopus pronephros inneholder et enkelt nephron sammensatt av proksimale, middels, distal og kobler tubuli, og en glomus (analog til pattedyr glomerulus) 1, 4-6 (Figur 1 Xenopus pronephros gjør den egnet som en enkel modell for studiet av gener som er involvert i nyre utviklings- og sykdomsprosesser.
Cell skjebne kart er etablert for tidlig Xenopus embryo, og er fritt tilgjengelig online på Xenbase 7-11. Her beskriver vi en teknikk for mikroinjeksjon av avstamning tracere å målrette utviklings Xenopus pronephros, selv om den samme teknikken kan tilpasses målrette andre vev som hjerte eller øynene. Linjesporstoff etiketter (inkludert vitale farvestoffer, fluorescerende merkede dekstraner, histochemically detekterbare enzymer, og mRNA som koder for fluorescerende proteiner) som kan injiseres inn i en tidlig blastomere, som tillater visualisering av avkommet av cellen i løpet av utviklingen. Denne protokollen benytter MEM-RFP mRNA, som koder for membran målrettet rød fluorescerende protein 12, som en avstamning tracer. Den målrettede mikroinjeksjon techteknikker for individuelle blastomeres i 4- og 8-cellers embryo som er beskrevet her kan benyttes for injeksjon med morpholinos å slå ned genekspresjon, eller med eksogen RNA til overuttrykker et gen av interesse. Ved å injisere inn i ventral, vegetal blastomere, først og fremst pronephros av embryoet vil være målrettet, forlater kontralaterale pronephros som en utviklingsmessig kontroll. Samtidig injeksjon av en tracer bekrefter at riktig blastomere ble injisert, og viser hvilke vev i fosteret oppsto fra den injiserte blastomere, verifisere målretting av pronephros. Farging av pronephros tillater visualisering av hvor godt pronephric tubuli har vært målrettet. Overekspresjon og knockdown effekter kan deretter scoret mot motsatt side av embryoet, som fungerer som en utviklingsmessig kontroll, og kan brukes til å beregne pronephric indeksen 13. Tilgjengeligheten av celle skjebne kartene tillater dette målrettet mikroinjeksjonsteknikk som kan brukes til å målrette vev klienEr enn pronephros, og co-injeksjon av et fluorescerende sporstoff gjør at målrettet mikroinjeksjon til hver vev som skal verifiseres før analyse.
Under embryo mikroinjeksjon, bør utviklings temperatur reguleres strengt, gitt at frekvensen av Xenopus utviklingen er svært avhengig av det 14. Embryoet skal inkuberes ved kjøligere temperaturer (14-16 ° C) for 4- og 8-cellers injeksjoner fordi utviklingstiden er bremset ned. Ved 22 ° C, utviklingstiden fra trinn 1 (en celle) for å iscenesette 3 (4 celler) er ca 2 timer, mens ved 16 ° C utviklingstiden til scenen tre er ca 4 timer. Det tar ca 15 minutter å gå fra en 4-cellers embryo til en 8-cellers (stadium 4) embryo ved 22 ° C, men tar ca 30 minutter ved 16 ° C. Tilsvarende ved 22 ° C, det tar bare 30 minutter for en 8-cellers embryo for å utvikle seg til en 16-cellers embryo (trinn 5). Denne tiden økte til 45 minutter ved 16 ° C. Derefore, er det nyttig å bremse utviklingen til embryoene for å muliggjøre tilstrekkelig tid for injeksjon ved 8-cellestadiet før embryoene videre til 16-cellestadiet. I tillegg kan veksttemperaturer moduleres å fremskynde eller forsinke embryoutvikling til nyrene har fullt utviklet.
Epidermis av rumpetroll-trinns Xenopus embryo er relativt gjennomsiktig, noe som åpner for enkel bildebehandling av utviklings pronephros uten disseksjon eller clearing av vevet 15. På grunn av den relative åpenhet av Xenopus embryo, er levende celle bildebehandling også mulig 16,17. Hel-mount farging å visualisere de pronephros er mulig med etablerte antistoffer som merker den proksimale, middels, distal og kobler tubuli av scene 38 - 40 embryoer som gir mulighet for vurdering av pronephric utvikling etter målrettet manipulering av genuttrykk i Xenopus embryo 18-20.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Følgende protokoll er godkjent av University of Texas Health Science Center i Houston Center for Forsøksdyr Medicine Animal Welfare Committee, som fungerer som Institutional Care og bruk Committee (protokoll #: HSC-AWC-13-135).
1. Identifikasjon og utvelgelse av blastomeres for nyre-målrettet injeksjoner
- Før generere embryoer, bruker Normal Table of Xenopus Development 21 for å forstå retningen av de tidlige celledelinger i embryo. Alternativt tilgang diagrammer av de tidlige utviklingsstadier av Xenopus på Xenbase 11.
- Få tilgang til de interaktive Xenopus celle skjebne kart på Xenbase 11 for å velge hvilke blastomere vil være målrettet for mikroinjeksjon.
- Observer at enkelt celle embryo har en mørk pigmentert dyr stang og en vegetal pol, som er hvit og yolky. Legg merke til at et beskyttende membran, kjent som vitelline envelope, dekker embryo.
- Legg merke til at den første spaltningen oppstår vanligvis mellom venstre og høyre side av embryoet. Disse cellene bidrar like mye til pronephric avstamning.
- Legg merke til at den andre spaltingen skiller den dorsale og ventrale halvdelene av embryo, noe som fører til et 4-celle embryo. De dorsale cellene er mindre og har mindre pigment enn de ventrale celler (figur 2A og figur 3a).
- Identifiser ventrale blastomeres (V, de store, mørke celler) på venstre og høyre side, som bidrar mer til å utvikle nyre enn rygg (D; små, lette celler) blastomeres (figur 2A).
- Hvis injisering i en 4-cellers embryo, injiserer venstre ventral blastomere å målrette venstre nyre (figur 3A og § 3).
- Den tredje cleavage halverer dyr og vegetal sider, noe som resulterer i en åtte-cellers embryo. På dette punktet, er det fire dyr blastomeres [venstre og høyre ventral(V1) og rygg (D1)] og fire vege blastomeres [venstre og høyre ventrale (V2) og rygg (D2)] (figur 2B og figur 3B).
- Finn de ventrale, vegetal blastomeres (V2). Disse blastomeres bidrar mer til det fremkallende nyre eventuelle andre celler på dette stadium (figur 2B). For å målrette venstre nyre av en 8-cellers embryo, injisere i venstre V2 blastomere (figur 3B og § 3).
- Legg merke til at den fjerde og femte splittelser halvere dyr og vegetal blastomeres. To avkom genereres fra hver blastomere, noe som resulterer i et 16-celle embryo. Cellene er oppkalt etter sin forgjenger. For eksempel, V2 blastomere fra den 8-cellestadiet gir opphav til V2.1 og V2.2 avkom på 16-cellestadiet (figur 2C). Den V2.2 celle på 16-cellestadiet gir de fleste av cellene som bidrar til utviklingen av nyren.
- Merk sjette og syvende splittelser resultere i en 32-celle Embryo. Igjen er to avkom generert fra hver blastomere, som er oppkalt etter sin forgjenger. For eksempel, den V2.2 blastomere fra den 16-cellestadiet gir opphav til v2.2.1 og V2.2.2 ved 32-cellestadiet. Det er et alternativt navn system ved 32-celle trinn hvor cellene er identifisert i fire rader som A, B, C og D (fra dyr til vegetabilsk), og i fire kolonner som 1, 2, 3, og 4 ( fra dorsal til ventral). Dermed V2.2.2 blastomere, som bidrar mest til utviklings pronephros, heter C3 etter dette alternativet navnesystem (figur 2D).
2. Utarbeidelse av embryoer
- Forbered 50 ml Dejelly Solution (2% cystein, NaOH til pH 8,0).
- Isoler begge testikler fra en enkelt mann frosk i henhold til standard protokoller 14. Plasser testiklene i en 60 mm petriskål fylt med 10 ml Testes lagringsløsning (1x Marc modifiserte Ringers [MMR 0,1 M NaCl, 2 mM KCl, 1 mM MgSO4, 2 mMCaCl2, 5 mM HEPES pH 8, 0,1 mM EDTA] 12, 1% bovint serumalbumin, 50 ug / ml gentamycin). Oppbevar testiklene ved 4 ° C.
Merk: Testikler kan lagres i ca 7-10 dager ved 4 ° C, men befruktning effektivitet vil avta jo lenger testiklene har blitt lagret. - Klem en kvinnelig frosk for å få egg i henhold til standard protokoller 14. Samle eggene i en 100 mm petriskål. Hell av overflødig vann.
- Klipp av ¼ av en testikkel mens den er i Testes lagringsløsning ved hjelp av pinsett og et barberblad. Overfør stykke testis til petriskål inneholdende egg. Juster størrelsen på testiklene delen som brukes til kontoen for størrelsen på testiklene, hvor lenge testiklene er lagret, og hvor mange egg som skal befruktes. Vanligvis bruker ¼ til 1/3 av en fersk dissekert testikkel til å befrukte en clutch av egg.
- Skjær testis del i små biter ved hjelp av pinsett og et barberblad. Legg nok 0.3x MMR+ 30 mg / ml gentamycin til petriskål for å dekke eggene. Virvle MMR i fatet for å blande.
- Vent i ca. 30 min for befruktning finner sted ved værelsestemperatur. Legg merke til at dyret halvkule (pigmentert side av embryoet) vil sitte på toppen av embryoet på effektiv gjødsling. Deretter fjerner MMR fra petriskålen ved hjelp av en overføring pipette. Legg nok Dejelly Solution til retten for å dekke embryoene.
- I løpet av de neste minuttene, forsiktig virvel fatet midlertidig. Kraftig risting av fatet på dette tidspunktet kan forårsake aksefeil. Gelé pels på embryoene vil oppløse og embryoene skal samles i midten av fatet i løpet av virvlende. Når embryoene er tett inntil hverandre i sentrum av fatet, fjern Dejelly Solution med en overføring pipette. Ikke la embryoene i Dejelly løsning i mer enn 5 minutter, eller embryoene kan bli skadet.
- Vask dejellied embryoene 3 - 5 ganger i 0.3xMMR + 30 mg / ml gentamycin ved forsiktig å helle eller pipettering av MMR og fylle tallerken med ny MMR. Ikke fjern alt av MMR fra fatet, eller embryoene kan bli skadet.
- Fjern eventuelle ubefruktede egg eller biter av testikkel fra petriskålen ved hjelp av en overføring pipette.
- Inkuber embryoer mellom 14 og 22 ° C.
Merk: Embryoer dyrket ved lavere temperaturer utvikle mer langsomt enn embryoer dyrket ved høyere temperaturer. Tidspunkt for utviklingsstadier kan bli funnet på Xenbase 22.- Til verdensrommet ut deres utvikling, sted halvparten av embryoene fra en enkelt befruktning i en petriskål ble holdt ved 14 ° C, og den andre halvparten av embryoene i en petriskål ble holdt ved 18 ° C. Dette gjør det mulig for to sett av injeksjoner i 4-celle- eller celle-8-embryoer fra en enkelt befruktning.
3. Forberedelse av injeksjonsløsninger og mikroinjeksjon av embryoer
- Tilbered injeksjonsoppløsningen inneholder 0,01ng / nl membranbundet rød fluorescerende protein (MEM-RFP) mRNA 9 mens embryoene utvikler til 4-celle- eller 8-cellestadiet. Oppbevar injeksjonsoppløsningen på is inntil klar til å injisere.
- Legg i en 7 "erstatning glass kapillarrør inn en nål avtrekker, med toppen av erstatningsrøret på linje med toppen av nålen avtrekker saken. Sett varmen # 2 verdi til 800, og trekke verdien til 650. Trykk på" pull "-knappen for å trekke nålen. Dette vil skape 2 pinner fra en enkelt 7" glass kapillarrør.
- Klipp av tuppen på en trakk nål med et par Dumont tang.
Merk: Etter trekke nålen, spissen er forseglet stengt og må skjæres åpen. Jo nærmere nålspissen at det er kuttet, jo mindre diameter nålespissen vil bli. Selv om diameter av spissen ikke vil påvirke injeksjonsvolum med mikroinjeksjon system som brukes her, er mer sannsynlig å skade fosteret en spiss med en større diameter. - Slip micropipette krage på baksiden av nålen. Deretter settes det store hullet O-ringen på baksiden av nålen bak kraven.
- Fyll kanylen med mineralolje ved hjelp av en 27 gauge kanyle, være forsiktig med å få luftbobler i nålen.
- Stikk nålen på stempelet på microinjector, sitte nålen inn i den store hullet i hvit plast spacer montert på stempelet. Stempelet bør ha en liten O-ring nærmest kroppen av microinjector, etterfulgt av hvite avstands, stort hull O-ring, og spennhylsen. Fest kanylen ved å stramme spenn. Trekk forsiktig på nålen for å være sikker på at det er riktig sikret.
- Trykk og hold "tom" -knappen på microinjector styreboksen til det er to pip.
- Pipetter 3 ul av injeksjonsløsningen på et stykke av Parafilm. Sette inn spissen av nålen inn i vulsten injeksjonsoppløsning på den Parafilm. Trykk og hold "fylle" -knappen på microinjector kontrollboksen for å trekke injeksjonsoppløsningen i nålen.
- Fyll en 60 mm petriskål foret med 500 mikron polyester mesh med 5% Ficoll i 0.3x MMR + 30 mg / ml gentamycin. Nøye pipette 20 - 30 4-cellers eller 8-cellers embryo i fatet.
- Ved hjelp av et hår sløyfe 14, manipulere embryoene slik at blastomere som skal injiseres er vendt mot nålen. For å målrette venstre nyre, stille opp embryoene slik at venstre ventral blastomeres av 4-cellers embryo eller venstre V2 blastomeres av 8-cellers embryo møte nålen.
- Injiser 10 nl injeksjonsløsning i den valgte blastomere av hvert embryo i fatet.
Merk: mesh på bunnen av petriskålen stabiliserer embryoer og hindrer dem fra å rulle, slik at de kan injiseres uten bruk av et hår sløyfe for stabilisering. - Transfer injisert embryo i brønner på en kultur plate som har blitt fylt med 5% Ficoll i 0.3x MMR + 30 mg / ml gentamycin. Inkuber injisert embryos ved 16 ° C i minst en time for å tillate at de injiserte blastomeres å helbrede.
- Overfør helbredet embryoer i brønner på en ny kultur plate som er fylt med 0.3x MMR + 30 mg / ml gentamycin av scenen 9 (før gastrulation).
- Inkuber embryoer ved 14-22 ° C før embryoene nå scenen 38-40 21.
4. Fiksering og Farging av embryoer
- Fremstille 50 ml MOPS / EGTA / Magnesiumsulfat / formaldehyd-buffer [MEMFA: 100 mM MOPS (pH 7,4), 2 mM EGTA, 1 mM MgSO4, 3,7% (v / v) formaldehyd].
- Ved hjelp av en overføring pipette, sette 10-20 scene 38 - 40 embryoer i et hetteglass. Tilsett 10 mL 5% benzokain i 100% etanol til flasken og invertere flasken for å blande. Vent 10 min til bedøve embryoene.
- Fjern MMR fra hetteglasset ved hjelp av et glass pipette. Ved behandling av flere flasker samtidig, kan ampullene holdes opprett i en 24-brønners cellekulturplate.
- Med et glass pipeTTE, fyll glasset med MEMFA. Plasser flasken på en tredimensjonal vippeplattform i 1 time ved romtemperatur.
- Fjern MEMFA fra hetteglasset ved hjelp av et glass pipette. Fyll glasset med 100% metanol. Plasser flasken på en tredimensjonal vippeplattform i 10 minutter ved romtemperatur. Gjenta dette vasketrinn én gang, og lagre embryoer i 100% metanol over natten ved -20 ° C.
- Forbered 1x Fosfatbufret saltløsning-Bovine Serum Albumin-Triton (PBT): 1 x PBS, 2 mg / ml bovint serumalbumin, 0,1% Triton X-100.
- Fremstille den primære antistoffløsning: 1x PBT med 10% geiteserum med en 1: 5-fortynning av muse-monoklonalt antistoff 4A6 (for å merke membraner av de mellomliggende, distale tubuli og forbindelses 20), en 1:30 fortynning av muse-monoklonalt antistoff 3G8 (til etikett lumen av de proksimale tubuli 20), og en 1: 250 fortynning av kanin-polyklonale RFP-antistoff (for å merke den MEM-RFP tracer). Oppbevar ved 4 ° C.
- Klargjør secondary antistoffløsning: 1x PBT med 10% geiteserum, 1: 500 Alexa 488 geit-anti-mus IgG (lager-konsentrasjon 2 mg / ml, for å merke 4A6 og 3G8), og 1: 500 Alexa 555 geit-anti-kanin-IgG (stock konsentrasjon 2 mg / ml, for å merke den MEM-RFP tracer). Oppbevar ved 4 ° C, som dekker røret i folie for å beskytte mot lys.
- Alternativt, samle de primære og sekundære antistoffer etter farging, og lagre ved 4 ° C for gjenbruk i fremtidige eksperimenter. Dersom antistoff skal lagres for gjenbruk, tilsett 0,01% natriumazid.
- Immunfarging av embryoene gjennom etablerte protokoller 18.
5. Visualisering av embryoer og analyse av målrettet Pronephric Tissue
- Screen De immun embryo for å kontrollere at den riktige blastomere ble injisert ved å se på fluorescens av sporstoffet under en fluorescerende stereo på 1X (for å se hele embryo) og 5X (for å se nyre) forstørrelse. Plasser embryoene i en multi-brønn glassplate med den vills fylt med 1x PBT ved hjelp av en overføring pipette med spissen avskåret. Manipulere embryoene med et hår sløyfe. Bruk bare embryoer som har ko-injisert tracer til stede i pronephros på venstre side av embryoet (figur 3C, F og figur 4C, F) for genet overekspresjon eller knockdown analyse.
- Alternativt fjerne embryoene i Murrays Clear (2 deler benzylbenzoat: en del benzylalkohol) ved å plassere embryoene i hetteglass og fylle flasken med Murray Clear. Visual embryoene som bruker et glass godt plate.
Merk: Murrays Clear er et organisk løsemiddel, og bør behandles med forsiktighet. Bruk hansker, og bare bruke hetteglass og pipetter med Murray Clear. - Oppbevar embryoer ved 4 ° C i 1x PBT for 2 - 3 uker. For langtidslagring av embryo, tørke embryoene ved å vaske to ganger i 100% metanol ved romtemperatur i 10 min. Oppbevar embryoene ved -20 ° C i 100% metanol.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Microinjections av 4- og 8-cellers Xenopus embryoer med MEM-RFP mRNA viser ulike nivåer av målretting i pronephros. Figur 4 viser scene 40 embryoer med riktige MEM-RFP mRNA uttrykk mønstre. Embryoer ble injisert i den venstre ventrale blastomere (figur 4A), og sortert for den riktige uttrykk mønster av MEM-RFP mRNA. I tillegg til å uttrykke MEM-RFP i den proksimale, mellomliggende, distal og forbinder tubuli i nyrene, er riktig injiserte embryoer ventet å vise fluorescens i epidermis hos hode, kropp og hale. De bør også vise fluorescens i otocyst, sement kjertel, proctodeum, og somites (Figur 4C). Fordelingen av MEM-RFP fluorescens i nyrene til 8 ordentlig injiserte embryoer ble bestemt med et fluorescerende stereomikroskop (figur 4B). Embryoer med høye nivåer av MEM-RFP uttrykk i overhuden somblokkert påvisning av nyre regioner ble scoret som "okkludert". MEM-RFP uttrykk ble oppdaget i proksimale, middels, fjerne og kobler tubuli av alle befruktede egg som ikke ble scoret som okkludert. Stereoskop (figur 4D-F) og confocal mikroskoper (figur 4G-I) ble brukt til å bekrefte samlokalisering av MEM-RFP og nyrevevet immunostained med 3G8 og 4A6. Konfokalt avbildnings bekreftet ko-lokalisering av MEM-RFP med den proksimale, middels, distale og forbinder tubuli i nyrene, noe som indikerer at mikroinjeksjon av MEM-RFP inn i venstre ventral blastomere er rettet mot nyre på riktig måte.
Embryoer injisert med MEM-RFP mRNA ved 8-cellestadiet (figur 5A) viser et smalere område av vev som viser fluorescens, noe som indikerer at 8-celle injeksjoner redusere muligheten for sekundære effekter på nyrene. Som embryoer injisert ved 4-cellers stadiet, embryos injiseres ved 8-cellestadiet viser fluorescens i den proksimale, middels, distale og forbinder tubuli i nyrene, så vel som de somites og proctodeum (Figur 5C-F). Til forskjell fra embryoer injisert i 4-cellestadiet, blir sementkjertel og otocyst ikke er merket med MEM-RFP. Ut av 10 riktig rettet embryo, en embryo viste MEM-RFP i nesten alle av de proksimale tubuli, og 3 viste MEM-RFP i nesten alle av de mellomliggende og distale tubuli i nyrene (figur 5B). Forbindelses tubuli av 7 embryoer ble delvis merket med MEM-RFP. I tillegg, nyrene embryoer injisert ved 8-celle-stadiet var lettere å visualisere, og bare én ble scoret som okkludert. Samlokalisering av MEM-RFP og antistoffer merking nyrene (3G8 og 4A6) ble bestemt ved hjelp av en stereomikroskop (Figur 5D-F), og bekreftet ved hjelp av en konfokal mikroskop (figur 5G-I). Den proksimale, middels, distal og koble tubules av nyre ble merket med MEM-RFP i embryoer injisert ved 8-cellers stadiet, viser at målrettet injeksjon av V2 blastomere etiketter nyrene mens du viser fluorescens i færre vev enn embryoer injisert i venstre ventral blastomere på 4-cellers scene.
Denne analysen gjør bruk av en fluorescerende merket mRNA som en tracer for å indikere hvilken vev ble rettet ved mikroinjeksjon. Det er viktig å skjerme embryoer for konsekvent tracer lokalisering før analyse, og eventuelle embryoer som å ikke vise den forventede tracer fordelingsmønster skal kastes. Figur 6 viser et eksempel på en scene 40 embryo som ble feilaktig målrettet med MEM-RFP mRNA på 4-cellestadiet. MEM-RFP mRNA-ekspresjon er plassert på høyre side av embryoet i stedet for på venstre side (figur 6A). I tillegg er de fleste av mRNA-ekspresjon er i huden av den nedre stammen og hale, medlite uttrykk i somites. Ingen mRNA uttrykk er sett i proksimale, middels, distal og kobler tubuli (Figur 6b), som bekrefter urettmessig målretting av nyre. Derfor bør denne embryo ikke brukes til analyse.
Figur 1:. Xenopus Embryonic Nyre Diagram i nyrene av en scene 35 Xenopus embryo, som viser den proksimale, middels, distal, og koble tubuli. Basert på Raciti et al. (2008) 6. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2: Xenopus Embryonale Fate Maps. Fate kart identifisere og navngi de blastomeres som bidrar til utviklings pronephros. A) Fate kart over en 4-cellers embryo. B) Fate kart over en 8-cellers embryo. C) Fate kart over et 16-celle embryo. D) Fate kart over en 32-celle embryo. Blastomeres av 32-cellers embryo er også merket med et alternativt blastomere navnesystemet. Fate kart basert på Moody (1987) 8, 9 og Moody og Kline (1990) 7. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3:. Injection Skjema for målretting Xenopus Pronephros Røde piler indikerer celle å injisere. A) Animal og ventral utsikt over en 4-cellers embryo som viser injeksjon av venstre ventral blastomere å målrette venstre pronephros. Røde piler indikerer venstre ventral blastomere. B) Animal og ventral utsikt over en 8-cellers embryo som viser injeksjon av venstre V2 blastomere å målrette venstre pronephros. Røde piler indikerer venstre V2 blastomere. AB) Bilder av embryoer som er tatt på et stereoskop på 4X forstørrelse. Injeksjoner basert på Xenopus skjebnen maps utviklet av Moody (1987) 8, 9 og Moody og Kline (1990) 7. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 4:. Eksempler på Embryoet rettet mot 4-cellers Stage immunostained scenen 40 Xenopus embryo som viser målrettet injeksjon til venstre pronephros på 4-cellers stadium ved hjelp av MEM-RFP mRNA som en tracer. MEM-RFP etikettercellemembraner rød. A) Skjematisk viser injeksjon av MEM-RFP mRNA inn i den venstre ventrale blastomere av et 4-celle embryo. B) Tissue lokalisering av MEM-RFP fluorescens i nyrene av riktig injisert embryoer. C) Trinn 40 embryo injisert med MEM-RFP i venstre ventrale blastomere ved 4-cellestadiet. MEM-RFP lokalisering er vist i rødt, mens nyrene er merket grønt. 1X forstørrelse. D) Nyre farvet med 3G8 å merke lumen av de proksimale tubuli, og 4A6 å merke membraner i cellene i de mellomliggende, distale og forbindelses tubuli. 5X forstørrelse. E) Utvidelse av regionen over nyre viser MEM-RFP lokalisering. 5X forstørrelse. F) Sammenslåtte bilde som viser ko-lokalisering av den MEM-RFP tracer med nyrene. 5X forstørrelse. CF) Bilder av embryoer som er tatt med et Olympus DP71 kameraet på et stereoskop. G) Confocal bilde i nyrene av en andre embryo farget med 3G8 og 4A6. H) Lokalisering av MEM-RFP i nyre og omkringliggende vev. I) sammenslåtte bildet shovinge ko-lokalisering av MEM-RFP, 3G8, og 4A6 i nyrene. GI) Confocal bilder med maksimal projeksjon på 20X forstørrelse. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 5:. Eksempler på Embryos målrettet ved 8-celle Trinn immunostained trinnet 40 Xenopus embryoer som viser rettet injeksjon til venstre pronephros ved 8-cellestadiet ved hjelp av MEM-RFP mRNA som en tracer. MEM-RFP etiketter cellemembranene rødt. A) Skjematisk viser injeksjon av MEM-RFP mRNA inn i den venstre V2 blastomere av en 8-celle embryo. B) Tissue lokalisering av MEM-RFP fluorescens i nyrene av riktig injisert embryoer. C) Trinn 40 embryo injisert med MEM-RFP i venstre V2 blastomere ved 8-cellestadiet. MEM-RFP lokalisering er visti rødt, mens nyrene er merket grønt. 1X forstørrelse. D) Nyre farvet med 3G8 å merke lumen av de proksimale tubuli, og 4A6 å merke membraner i cellene i de mellomliggende, distale og forbindelses tubuli. 5X forstørrelse. E) Utvidelse av regionen over nyre viser MEM-RFP lokalisering. 5X forstørrelse. F) Sammenslåtte bilde som viser ko-lokalisering av den MEM-RFP tracer med nyrene. 5X forstørrelse. CF) Bilder av embryoer som er tatt med et Olympus DP71 kameraet på et stereoskop. G) Confocal bilde i nyrene av en andre embryo farget med 3G8 og 4A6. H) Lokalisering av MEM-RFP i nyre og omkringliggende vev. I) sammenslåtte bildet viser samlokalisering av MEM-RFP, 3G8, og 4A6 i nyrene. GI) confocal bilder tatt med maksimal projeksjon på 20X forstørrelse. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 6: Eksempel på embryo feilaktig rettet mot 4-cellers stadiet immunostained scenen 40 Xenopus embryo som viser feil målretting av venstre pronephros på 4-cellers stadium ved hjelp av MEM-RFP mRNA som en tracer.. MEM-RFP etiketter cellemembranene rødt. A) Stage 40 embryo som viser feil fordeling av MEM-RFP indikasjon på injeksjon i feil blastomere. I tillegg til å ha korrekt sporstoff fordeling indikerer injeksjon i uriktig blastomere, ble dette embryo injisert på høyre side. 1X forstørrelse. B) Sammenslåtte bilde av nyre viser en manglende samlokalisering av MEM-RFP med antistoffer merking nyrene (3G8, 4A6). 5X forstørrelse. AB) Bilder av embryo tatt på et stereoskop. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Rettet mot pronephros for å utvikle Xenopus embryo er avhengig av å identifisere og injisere riktig blastomere. Injeksjon av V2 blastomere av 8-cellers embryo rettet mot venstre pronephros 18. Dette etterlater kontralaterale riktige pronephros som en intern kontroll. Hvis morfolino knockdown eller RNA overekspresjon brukes til å endre nyre utvikling, kan kontralaterale riktige pronephros brukes til å sammenligne effekten av genet knockdown eller overekspresjon til venstre pronephros. I dette tilfellet bør egnede kontroller som en umake kontroll morfolino- eller dominant negativ RNA-konstruksjon bli brukt i tillegg til den kontralaterale intern kontroll for å analysere resultatene av endringer i genekspresjon. På grunn av den relative åpenhet i Xenopus embryo kan nyrefeil være lett kvantifiseres ved hjelp av flere teknikker. For eksempel kan genet knockdown eller overekspresjon ganske enkelt kvantifiseres ved å beregne pronephric indeks av embryoerimmunfarget med antistoff 3G8 13, som sammenligner utviklingen av de proksimale tubuli på de injiserte og kontroll sider av embryo. I tillegg til å studere pronephric utvikling, kan denne teknikken enkelt tilpasses målrette andre vev ved å velge riktig blastomere å injisere hjelp etablert skjebne kartene 7-10. I tillegg til å målrette andre vevstyper, kan denne protokollen også brukes til å studere nyre utvikling på forskjellige stadier. Denne protokollen sett på scenen 40 embryoer farget med antistoff 3G8 og 4A6, som oppdager differensiert nyrevevet. Yngre embryoene kan bli immunfarget med forskjellige nyre antistoffer, eller utsatt for in situ hybridisering 5, 6, 20. For eksempel kan antistoffet LIM1 detektere utviklings pronephros 21, 22. Likeledes LIM1 kan pax8 og hnf1- p-transkripter bli oppdaget med in situ hybridisering starter på scenen 12,5 22-24 in situ hybridisering markører kan anvendes for å detektere forskjellige regioner i nyrene på senere utviklingsstadier. For eksempel, prober utformet for å påvise ekspresjon av nphs1, clckb, slc5a1, og atp1a1 i glomus, distale og forbinder rør, proksimale tubuli, og hele nyren, henholdsvis, er blitt beskrevet 25, 5, 26, 27. Vurdering av nyre over flere etapper med forskjellige antistoffer eller in situ analyse vil gi rom for en bedre forståelse av hvordan en behandling endrer nyre utvikling.
Et kritisk aspekt ved denne protokollen er det riktige valg og identifikasjon av blastomere som skal injiseres. I denne protokollen beskriver vi hvordan å målrette pronephros ved å injisere venstre V2 blastomere av 8-cellers embryo eller venstre ventral blastomere av 4-cellers embryoer. Hvis feil blastomere injiseres, de pronephros vil ikke være riktig målrettet. Derfor er deter avgjørende for å bli kjent med utviklingen og celle cleavage plan av tidlige Xenopus embryo før mikroinjeksjon 28, ikke 29. Embryo cleavage ikke alltid følger de etablerte utviklingsstadiet diagrammer, så det er nyttig å bare injisere embryoer som de tidlige celle cleavages ser "normal" og riktig blastomere lett kan identifiseres. Dette vil redusere antall embryoer som har blitt urettmessig målrettet. I tillegg er det også viktig for blastomeres av embryoet å være fullstendig delt ved injeksjonstidspunktet. For eksempel, hvis spaltingen mellom blastomeres V1 og V2 av en 8-celle embryo er ikke fullstendig før mikroinjeksjon, kan sporstoffet spres inn i V1 og V2. Dette vil redusere den målsøkende effektiviteten av mikroinjeksjon, og det resulterende embryo kan vise tracer fordeling som ser mer lik den til et embryo injisert i 4-cellestadiet i stedet for 8-cellestadiet.
enannen viktig del av denne protokollen er bekreftelse på at pronephros ble riktig målrettet ved mikroinjeksjon. Dette må gjøres før analysere pronephric utvikling, fordi embryoer som ikke har hatt de pronephros skikkelig målrettet kan forskyve den resulterende datasettet. For å verifisere riktig målgruppe, analysere sporfordeling i hvert injisert embryo. Den injiserte (venstre) side av embryoet skal vise det store flertallet av fluorescerende tracer. Hvis styre (høyre) side av embryoet viser en vesentlig mengde av fluorescens, da dette embryo skal kastes. Hvis dette skjer, var enten feil blastomere injisert, eller injiseres blastomere hadde ikke fullført spaltet før injeksjon. For det andre må fluorescens på den injiserte (venstre) side av embryoet riktig målrette pronephros. Dersom embryo ble injisert ved 8-cellestadiet, dorsal og ventrale somites, lateral plate, hindgut, proctodeum, hud av stammen og neural crest i bagasjerommet er forventet å vise influensaorescence i tillegg til de pronephros 6, 29. I tillegg til de vev som er oppført for de 8-celleinjeksjon, embryoer injisert i 4-cellen stadiet bør ha bredere fordeling av det fluoriserende sporstoff i huden og somites samt målretting av sement kjertel, otocyst, linse og lukte placode. Dersom embryoet ikke står i riktig vev målretting, bør den kastes før analysen (figur 5).
De målrettede injeksjoner som beskrevet i denne protokollen tilveiebringe et middel for å manipulere genekspresjon i et ønsket vev. En begrensning ved denne teknikken er at selv om disse injeksjonene er målrettet, har de ikke bare påvirker det fremkallende nyre. De 4- og 8-cellers injeksjoner beskrevet i denne teknikken er mer målrettet enn injeksjoner gjort på encellede stadium, hvor genekspresjon vil bli endret i hele embryo, og injeksjoner gjort på to-cellers stadiet, hvor halvparten av embryo skjermer endret genet ekspression. De har imidlertid ikke rettet mot bare en vev. Selv om injeksjoner i ventral blastomeres av 4-celle embryoer og V2 blastomeres av 8-cellers embryo endre genuttrykk i pronephros, de også endre genuttrykk i andre vev. Andre berørte vev omfatter hud, somites, gut, og neural crest. Derfor er det viktig å forstå at selv om 4- og 8-celle injeksjoner er mer målrettet enn ett- eller to-celle-injeksjon, vil de fortsatt endre genekspresjon i flere vev. I tillegg til å injisere embryoer ved 4- og 8-celle stadium, kan injeksjoner også utføres ved 2-, 16-, og 32-celle etapper. Embryoer injisert ved to-trinns celle vil ha et bredere spekter av vev som påvirkes enn embryoer injisert på senere stadier. Selv om mer teknisk krevende, vil embryoer injisert på 16- og 32-cellers stadier har et smalere spekter av vev berørt enn embryoer injisert på 4- og 8-cellers stadier.
Den MEM-RFP avstamning sporr er brukt i denne protokollen for å verifisere riktig målretting etter mikroinjeksjon. MEM-RFP mRNA etiketter cellemembraner Etter at cellene har oversatt proteinet fra injisert RNA. Konsentrasjonen av MEM-RFP avstamning tracer brukes i denne protokoll (0,1 ng av MEM-RFP mRNA i en 10 nl injeksjon) bør bli endret etter behov for å ta hensyn til død embryo og ønsket intensitet av tracer fluorescens. I tillegg til å modifisere mengden av linjen tracer injiseres, en annen avstamning sporstoff, slik som rhodamin-dekstran, kvanteprikker, eller den histochemically påvisbare β-galaktosidase, kan brukes i stedet for MEM-RFP. Linjesporstoff blir mer fortynnet, ettersom cellene seg, forårsaker nivåene av fluorescens reduseres når fosteret utvikler seg. En ekstra anvendelsen av denne teknikken er å co-injisere et eksogent RNA eller morfolino med avstamning tracer å overuttrykker eller slå ned uttrykket av et gen av interesse. Slekten tracer brukes til å verifisere korrekt målretting av pronephros, men ikkefor å indikere hvor co-injisert eksogene RNA eller morfolino lokaliserer i embryoet. Eksogene RNA og morpholinos kan ikke spres gjennom injisert blastomere i samme takt som co-injisert tracer, potensielt resulterer i datterceller som har tracer, men ikke den eksogene RNA eller morfolino stede 30. Faktisk har vi observert at to ulike RNA konstruksjoner injiseres i en enkelt celle ikke alltid co-Localize (upubliserte data). Derfor er nærværet av sporstoffet i en celle indikerer ikke nødvendigvis at ko-injisert eksogent RNA eller morfolino alltid er til stede i cellen.
Denne protokollen detaljer en prosedyre for målretting mikroinjeksjon til blastomeres som gir opphav til de pronephros for å utvikle Xenopus embryoer. Genekspresjon ofte manipuleres i Xenopus embryoer ved injeksjon av morpholinos eller eksogent RNA, som begge kan hindre forårsaker tidlige utviklingsavvik hvis injiseres i en- ellerto-celle embryoer. Embryoer injisert på celle stadiet utstillingsknockdown eller overekspresjon i alle cellene i utvikling av embryo. Dersom genet er nødvendig for riktig tidlige utviklingsmessige prosesser, kan embryoet ikke utvikle en pronephros. Injeksjoner utføres på senere stadier, slik som 8-cellers injeksjoner detaljert her, kan resultere i embryoer som gjennomgår gastrulation og eventuell pronephric utvikling 18. Derfor kan målrettede injeksjoner diskutert her vinne gastrulation mangler som skyldes endring av uttrykket av noen gener, slik at embryoet til fremdrift gjennom pronephric utvikling. I fremtiden kan denne protokollen også brukes til å målrette CRISPR konstruksjoner til ønsket blastomeres.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Dette arbeidet ble støttet av et National Institutes of Health NIDDK stipend (K01DK092320) og oppstart finansiering fra Institutt for Pediatrics ved University of Texas McGovern Medical School.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Sodium chloride | Fisher | S271-3 | |
| Potassium chloride | Fisher | P217-500 | |
| Magnesium sulfate | Fisher | M63-500 | |
| Calcium chloride | Fisher | C79-500 | |
| HEPES | Fisher | BP310-500 | |
| EDTA | Fisher | S311-500 | |
| Gentamycin solution, 50 mg/ml | Amresco | E737-20ML | |
| L-Cysteine, 99%+ | Acros Organics | 52-90-4 | |
| Ficoll | Fisher | BP525-100 | |
| 100 mm x 15 mm Petri dish | Fisher | FB0875712 | |
| Mini Fridge II | Boekel | 260009 | Benchtop incubator for embryos. |
| Gap43-RFP plasmid | For making tracer RNA. Ref: Davidson et al., 2006. | ||
| Rhodamine dextran, 10,000 M.W. | Invitrogen | D1817 | Tracer. |
| Molecular biology grade, USP sterile purified water | Corning | 46-000-CI | |
| 7" Drummond replacement tubes | Drummond | 3-000-203-G/XL | Microinjection needles. |
| Needle puller | Sutter Instruments | P-30 | |
| Fine forceps | Dumont | 11252-30 | For breaking microinjection needle tip. |
| Nanoject II | Drummond | 3-000-204 | Microinjector. |
| Mineral oil, heavy | Fisher | CAS 8042-47-5 | Oil for needles. |
| 27 G Monoject hypodermic needle | Covidien | 8881200508 | For loading mineral oil into microinjection needle. |
| 5 ml Luer-Lok syringe | BD | 309646 | For loading mineral oil into microinjection needle. |
| 60 mm x 15 mm Petri dish | Fisher | FB0875713A | |
| 800 micron Polyester mesh | Small Parts | CMY-0800-C | |
| Transfer pipets | Fisher | 13-711-7M | For transferring embryos. Cut off the tip so that the embryos are easily taken up by the pipette. |
| 6-well cell culture plate | Nest Biotechnology | ||
| MOPS | Fisher | BP308-500 | |
| EGTA | Acros Organics | 67-42-5 | |
| Formaldehyde | Fisher | BP531-500 | |
| 15 mm x 45 mm Screw thread vial | Fisher | 03-339-25B | For fixing, staining, and storing embryos. |
| 24-well cell Culture plate | Nest Biotechnology | ||
| Benzocaine | Spectrum | BE130 | |
| Ethanol | Fisher | BP2818-4 | |
| Methanol | Fisher | A412-4 | |
| Phosphate buffered saline (PBS) 1x powder | Fisher | BP661-50 | |
| Bovine serum albumen | Fisher | BP1600-100 | |
| Triton X-100 | Fisher | BP151-500 | |
| 3D Mini rocker, model 135 | Denville Scientific | 57281 | |
| Goat serum, New Zealand origin | Invitrogen | 16210064 | |
| Sodium azide | Fisher | S227I-25 | |
| Monoclonal 3G8 antibody | European Xenopus Resource Centre | Primary antibody to label proximal tubules. | |
| Monoclonal 4A6 antibody | European Xenopus Resource Centre | Primary antibody to label intermediate, distal and connecting tubules. | |
| anti-RFP pAb, purified IgG/rabbit | MBL | PM005 | Primary antibody to label Gap43-RFP tracer. |
| Alexa Fluor 488 goat anti-mouse IgG | Life Technologies | A11001 | Secondary antibody to label kidney tubules. |
| Alexa Fluor 555 goat anti-rabbit IgG | Life Technologies | A21428 | Secondary antibody to label Gap43-RFP tracer. |
| 9 Cavity spot plate | Corning | 7220-85 | |
| Benzyl benzoate | Fisher | 105862500 | Optional - for clearing embryos |
| Benzyl alcohol | Fisher | A396-500 | Optional - for clearing embryos |
References
- Vize, P. D., Seufert, D. W., Carroll, T. J., Wallingford, J. B. Model systems for the study of kidney development: Use of the pronephros in the analysis of organ induction and patterning. Dev. Biol. 188 (2), 189-204 (1997).
- Brandli, A. W. Towards a molecular anatomy of the Xenopus pronephric kidney. Int. J. Dev. Biol. 43 (5), 381-395 (1999).
- Hensey, C., Dolan, V., Brady, H. R. The Xenopus pronephros as a model system for the study of kidney development and pathophysiology. Nephrol. Dial. Transplant. 17, (Suppl 9) 73-74 (2002).
- Carroll, T., Vize, P. D. Synergism between Pax-8 and lim-1 in embryonic kidney development. Dev. Biol. 214 (1), 46-59 (1999).
- Zhou, X., Vize, P. D. Proximo-distal specialization of epithelial transport processes within the Xenopus pronephric tubules. Dev. Biol. 271 (2), 322-338 (2004).
- Raciti, D., et al. Organization of the pronephric kidney revealed by large-scale gene expression mapping. Genome Biol. 9 (5), 84 (2008).
- Moody, S. A., Kline, M. J. Segregation of fate during cleavage of frog (Xenopus laevis) blastomeres. Anat. Embryol. Berl. 182 (4), 347-362 (1990).
- Moody, S. A. Fates of the blastomeres of the 16-cell stage of Xenopus embryo. Dev. Biol. 119 (2), 560-578 (1987).
- Moody, S. A. Fates of the blastomeres of the 32-cell stage of Xenopus embryo. Dev. Biol. 122 (2), 300-319 (1987).
- Bauer, D. V., Huang, S., Moody, S. A. The cleavage stage origin of Spemann's Organizer: Analysis of the movements of blastomere clones before and during gastrulation in Xenopus. Dev. 120 (5), 1179-1189 (1994).
- Karpinka, J. B., et al. Xenbase, the Xenopus model organism database; new virtualized system, data types and genomes. Nucleic Acids Res. 43, 756-763 (2015).
- Davidson, L. A., Marsden, M., Keller, R., Desimone, D. W. Integrin alpha5beta1 and fibronectin regulate polarized cell protrusions required for Xenopus convergence and extension. Curr. Biol. 16 (9), 833-844 (2006).
- Wallingford, J. B., Carroll, T. J., Vize, P. D. Precocious expression of the Wilms' tumor gene xWT1 inhibits embryonic kidney development in Xenopus laevis. Dev. Biol. 202, 103-112 (1998).
- Sive, H. L., Grainger, R. M., Harland, R. M. Early Development of Xenopus laevis. A Laboratory Manual. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. Cold Spring Harbor, NY. (2000).
- Miller, R. K., Lee, M., McCrea, P. D. The Xenopus pronephros: A kidney model making leaps toward understanding tubule development. Xenopus Development. Kloc, M., Kubiak, J. Z. , Wiley. 215-238 (2014).
- Lienkamp, S. S., et al. Vertebrate kidney tubules elongate using a planar cell polarity-dependent rosette-based mechanism of convergent extension. Nat. Genet. 44 (12), 1382-1387 (2012).
- Lyons, J. P., et al. Requirement of Wnt/β-catenin signaling in pronephric kidney development. Mech. Dev. 126 (3-4), 142-159 (2009).
- Miller, R. K., et al. Pronephric tubulogenesis requires Daam1-mediated planar cell polarity signaling. J. Am. Soc. Nephrol. 22, 1654-1667 (2011).
- Vize, P. D., Jones, E. A., Pfister, R.
- Miller, R. K., Lee, M., McCrea, P. D. Chapter 12: The Xenopus Pronephros: A Kidney Model Making Leaps toward Understanding Tubule Development. Xenopus Development. Kloc, M., Kubiak, J. Z. , Wiley and Sons. Oxford. (2014).
- Taira, M., Otani, H., Jamrich, M., Dawid, I. B. Expression of the LIM class homeobox gene Xlim-1 in pronephros and CNS cell lineages of Xenopus embryos is affected by retinoic acid and exogastrulation. Development. 120, 1525-1536 (1994).
- Weber, H., et al. Regulation and function of the tissue-specific transcription factor HNF1 alpha (LFB1) during Xenopus development. Int. Dev. Biol. 40 (1), 297-304 (1996).
- Carroll, T. J., Vize, P. D. Synergism between Pax-8 and lim-1 in embryonic kidney development. Dev. Biol. 214 (1), 46-59 (1999).
- Etkin, L. D., Pearman, B., Ansah-Yiadom, R. Replication of injected DNA templates in Xenopus embryos. Exp. Cell Res. 169 (2), 468-477 (1987).
- Vize, P. D. The chloride conductance channel ClC-K is a specific marker for the Xenopus pronephric distal tubule and duct. Gene Expr. Patterns. 3 (3), 347-350 (2003).
- Uochi, T. S., Takahashi, S., Ninomiya, H., Fukui, A., Asashima, M. The Na+, K+-ATPase alpha subunit requires gastrulation in the Xenopus embryo. Dev. Growth Differ. 39 (5), 571-580 (1997).
- Nieuwkoop, P. D., Faber, J. Normal table of Xenopus laevis (Daudin): A systematical & chronological survey of the development from the fertilized egg till the end of metamorphosis. , Garland Publishing, Inc. NY. (1994).
- Ubbels, G. A., Hara, K., Koster, C. H., Kirschner, M. W. Evidence for a functional role of the cytoskeleton in determination of the dorsoventral axis in Xenopus laevis eggs. J. Embryol. Exp. Morphol. 77, 15-37 (1983).
- Huang, S., Johnson, K. E., Wang, H. Z. Blastomeres show differential fate changes in 8-cell Xenopus laevis embryos that are rotated 90 degrees before the first cleavage. Dev. Growth Differ. 40 (2), 189-198 (1998).
- Colman, A., Drummond, D. The stability and movement of mRNA in Xenopus oocytes and embryos. J. Embryol. Exp. Morph. 97, 197-209 (1986).
