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JoVE Journal Developmental Biology
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Developmental Biology

विकसित करने के लिए Microinjection लक्ष्य करने के लिए तकनीक Published: May 3, 2016 doi: 10.3791/53799
Automatic Translation
1, 1,2, 1,2,3,4
1Department of Pediatrics, Pediatric Research Center, University of Texas McGovern Medical School, 2Program in Genes & Development, University of Texas Graduate School of Biomedical Sciences, 3Program in Cell & Regulatory Biology, University of Texas Graduate School of Biomedical Sciences, 4Department of Genetics, University of Texas MD Anderson Cancer Center

Abstract

Xenopus laevis (मेंढक), pronephros के भ्रूण गुर्दे एक भी नेफ्रॉन के होते हैं, और गुर्दे की बीमारी के लिए एक मॉडल के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है। Xenopus भ्रूण बड़े हैं, बाहर से विकसित करने, और आसानी से microinjection या सर्जिकल प्रक्रियाओं के द्वारा चालाकी से किया जा सकता है। इसके अलावा, भाग्य नक्शे जल्दी Xenopus भ्रूण के लिए स्थापित किया गया है। व्यक्तिगत blastomere है कि अंततः एक अंग या ब्याज के ऊतकों को जन्म देगा में लक्षित microinjection चुनिंदा overexpress या इस प्रतिबंधित क्षेत्र के भीतर जीन अभिव्यक्ति नीचे दस्तक, विकासशील भ्रूण के बाकी हिस्सों में माध्यमिक प्रभाव को कम करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है। इस प्रोटोकॉल में, हम कैसे स्थापित Xenopus भाग्य नक्शे का उपयोग करने के लिए 4 और 8 सेल भ्रूण के विशिष्ट blastomere में विकसित Xenopus गुर्दा (pronephros), microinjection के माध्यम से लक्षित करने का वर्णन है। वंश ट्रेसर इंजेक्शन इंजेक्शन के विशिष्ट लक्ष्य-निर्धारण के सत्यापन की अनुमति देता है।भ्रूण 38 चरण के लिए विकसित किया है के बाद - 40, pronephric विकास कल्पना करने के लिए पूरे माउंट immunostaining प्रयोग किया जाता है, और pronephros को लक्षित कोशिकाओं द्वारा योगदान का आकलन किया जा सकता है। उसी तकनीक pronephros के अलावा अन्य प्रकार के ऊतकों को लक्षित करने के लिए अनुकूलित किया जा सकता है।

Introduction

Xenopus भ्रूण गुर्दे, pronephros, गुर्दे की बीमारी के विकास और अध्ययन के लिए एक अच्छा मॉडल है। भ्रूण, बाहर से विकसित आकार में बड़े होते हैं, बड़ी संख्या में उत्पादन किया जा सकता है, और आसानी microinjection या सर्जिकल प्रक्रियाओं के माध्यम से छेड़छाड़ कर रहे हैं। इसके अलावा, स्तनधारियों और उभयचर में गुर्दे की विकास शासी जीन संरक्षित कर रहे हैं। स्तनधारी गुर्दे तीन चरणों के माध्यम से प्रगति: pronephros, मेसोनेफ्रॉस, और metanephros 1, जबकि भ्रूण उभयचर एक pronephros है और वयस्क उभयचर एक metanephros है। इन गुर्दे रूपों की बुनियादी इकाई को छानने नेफ्रॉन है, और दोनों स्तनपायी और उभयचर nephrogenesis 2, 3 गुजरना करने के लिए एक ही cascades संकेत और प्रेरक घटनाओं की आवश्यकता होती है। Xenopus pronephros समीपस्थ, मध्यवर्ती बाहर का और नलिकाओं को जोड़ने से बना एक भी नेफ्रॉन होता है, और एक केशिकाजाल (स्तनधारी glomerulus के अनुरूप) 1, 4-6 (चित्रा 1 Xenopus pronephros में एकल, बड़े नेफ्रॉन वर्तमान में यह गुर्दे की बीमारी के विकास और प्रक्रियाओं में शामिल जीन के अध्ययन के लिए एक सरल मॉडल के रूप में उपयुक्त बनाता है।

सेल भाग्य नक्शे जल्दी Xenopus भ्रूण के लिए स्थापित किया गया है, और स्वतंत्र रूप से Xenbase 7-11 पर ऑनलाइन उपलब्ध हैं। यहाँ, हम विकसित Xenopus pronephros को लक्षित करने के वंश ट्रेसर के microinjection के लिए एक तकनीक का वर्णन है, हालांकि उसी तकनीक जैसे हृदय या आंखों के रूप में अन्य ऊतकों को लक्षित करने के लिए अनुकूलित किया जा सकता है। वंश ट्रेसर लेबल है कि एक प्रारंभिक blastomere में इंजेक्ट किया जा सकता है, विकास के दौरान कहा कि सेल की संतान के दृश्य की अनुमति (महत्वपूर्ण रंजक, fluorescently लेबल dextrans, histochemically detectable एंजाइमों, और mRNA फ्लोरोसेंट प्रोटीन एन्कोडिंग सहित) कर रहे हैं। इस प्रोटोकॉल सदस्य आरएफपी mRNA, एन्कोडिंग झिल्ली लक्षित लाल फ्लोरोसेंट प्रोटीन 12 एक वंश अनुरेखक के रूप में, का इस्तेमाल करता है। लक्षित microinjection तकनीकयहाँ वर्णित 4 और 8 सेल भ्रूण में अलग-अलग blastomeres के लिए niques morpholinos ब्याज की एक जीन overexpress करने के लिए जीन अभिव्यक्ति, या exogenous शाही सेना के साथ नीचे दस्तक करने के साथ इंजेक्शन के लिए उपयोग किया जा सकता है। उदर, वनस्पति blastomere में इंजेक्शन लगाने के द्वारा, मुख्य रूप से भ्रूण के pronephros लक्षित किया जाएगा, एक विकासात्मक नियंत्रण के रूप में contralateral pronephros जा रही है। एक अनुरेखक के सह इंजेक्शन की पुष्टि करता है कि सही blastomere इंजेक्ट किया गया था, और पता चलता है जो भ्रूण में ऊतकों इंजेक्शन blastomere से उठी, pronephros के लक्षित कर की पुष्टि करने। pronephros की Immunostaining कितनी अच्छी तरह pronephric नलिकाओं लक्षित किया गया है के दृश्य के लिए अनुमति देता है। Overexpression और पछाड़ना प्रभाव तो भ्रूण है, जो एक विकासात्मक नियंत्रण के रूप में कार्य करता है के contralateral पक्ष के खिलाफ रन बनाए जा सकते हैं, और pronephric सूचकांक 13 गणना करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है। सेल भाग्य नक्शे की उपलब्धता इस लक्षित microinjection तकनीक अन्य संगठनों के ऊतकों को लक्षित करने के लिए इस्तेमाल किया जा करने की अनुमति देता हैएर pronephros, और एक फ्लोरोसेंट ट्रेसर के सह इंजेक्शन से अनुमति देता है प्रत्येक ऊतक के लिए लक्षित microinjection विश्लेषण करने से पहले सत्यापित किया जाना है।

भ्रूण microinjection के दौरान विकास तापमान कसकर विनियमित किया जाना चाहिए, यह देखते हुए कि Xenopus विकास की यह दर 14 पर बहुत निर्भर है। 4 और 8 सेल इंजेक्शन के लिए - (16 डिग्री सेल्सियस 14) क्योंकि विकास के समय धीमा है भ्रूण कूलर तापमान में incubated किया जाना चाहिए। 22 डिग्री सेल्सियस, चरण 1 (1 सेल) से विकास के समय में मंच के लिए 3 (4 कोशिकाओं), लगभग 2 घंटे का होता है, जबकि 16 डिग्री सेल्सियस के विकास के समय में मंच के लिए 3 लगभग 4 घंटे है। यह 22 डिग्री सेल्सियस पर एक 8-सेल (स्टेज 4) भ्रूण के लिए एक 4 सेल भ्रूण से जाने के लिए लगभग 15 मिनट लगते हैं, लेकिन 16 डिग्री सेल्सियस पर लगभग 30 मिनट लगते हैं। इसी तरह, 22 डिग्री सेल्सियस पर, यह केवल 30 मिनट के एक 8 सेल भ्रूण के लिए एक 16-सेल भ्रूण (चरण 5) के लिए प्रगति के लिए ले जाता है। इस बार 16 डिग्री सेल्सियस पर 45 मिनट के लिए बढ़ जाती है।refore, यह भ्रूण 16 सेल चरण के लिए प्रगति से पहले 8 सेल मंच पर इंजेक्शन के लिए पर्याप्त समय सक्षम करने के लिए भ्रूण के विकास दर को धीमा करने के लिए उपयोगी है। इसके अतिरिक्त, विकास तापमान गति या भ्रूण के विकास को धीमा जब तक गुर्दे पूरी तरह से विकसित किया गया है करने के लिए संग्राहक जा सकता है।

मेढक चरण Xenopus भ्रूण की एपिडर्मिस विच्छेदन या ऊतक 15 के समाशोधन के बिना विकासशील pronephros की आसान इमेजिंग के लिए अनुमति अपेक्षाकृत पारदर्शी है। Xenopus भ्रूण के रिश्तेदार पारदर्शिता के कारण, जीवित कोशिका इमेजिंग भी संभव 16,17 है। पूरे माउंट pronephros कल्पना करने के लिए immunostaining स्थापित एंटीबॉडी कि समीपस्थ, मध्यवर्ती बाहर का और मंच के जोड़ने नलिकाओं 38 लेबल के साथ संभव है - 40 भ्रूण कि pronephric विकास के मूल्यांकन के लिए अनुमति देते हैं Xenopus भ्रूण 18-20 में लक्षित जीन अभिव्यक्ति के हेरफेर के बाद।

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Protocol

(: एचएससी-आंगनवाडी-13-135 प्रोटोकॉल #) निम्नलिखित प्रोटोकॉल प्रयोगशाला पशु चिकित्सा पशु कल्याण समिति, जो के रूप में संस्थागत देखभाल और उपयोग समिति में कार्य करता है के लिए ह्यूस्टन के केंद्र में टेक्सास स्वास्थ्य विज्ञान केंद्र के विश्वविद्यालय द्वारा अनुमोदित किया गया है।

1. पहचान और किडनी-लक्षित इंजेक्शन के लिए ब्लास्टोमेरेस का चयन

  1. भ्रूण पैदा करने के लिए पहले, Xenopus विकास 21 के सामान्य तालिका का उपयोग भ्रूण के शुरू में कोशिका विभाजन के उन्मुखीकरण को समझते हैं। वैकल्पिक रूप से, Xenbase 11 पर Xenopus के प्रारंभिक विकास के चरणों का उपयोग चित्र।
  2. जो blastomere microinjection के लिए लक्षित किया जाएगा का चयन करने के Xenbase 11 पर इंटरैक्टिव Xenopus सेल भाग्य नक्शे पर पहुँचें।
  3. निरीक्षण एकल कोशिका भ्रूण एक अंधेरे में pigmented पशु ध्रुव और एक वनस्पति पोल, जो सफेद और yolky है कि। ध्यान दें कि एक सुरक्षात्मक झिल्ली, के रूप में जाना जाता है पीतक ईnvelope, भ्रूण शामिल किया गया है।
  4. सूचना है कि पहली दरार आम तौर पर भ्रूण के बाएँ और दाएँ पक्ष के बीच होता है। इन कोशिकाओं को pronephric वंश के लिए समान रूप से योगदान करते हैं।
  5. ध्यान दें कि दूसरी दरार पृष्ठीय और भ्रूण के उदर हिस्सों में बिताते हैं, एक 4 सेल भ्रूण के लिए अग्रणी। पृष्ठीय कोशिकाओं छोटे होते हैं और उदर कोशिकाओं (2A चित्रा और चित्रा 3 ए) की तुलना में कम वर्णक है।
    1. बाएँ और दाएँ पक्ष पर है, जो पृष्ठीय से विकासशील गुर्दे के लिए अधिक योगदान (डी, छोटे, हल्के कोशिकाओं) blastomeres (2A चित्रा); उदर blastomeres (बड़े, अंधेरे कोशिकाओं वी) को पहचानें।
    2. अगर एक 4 सेल भ्रूण में इंजेक्शन लगाने, बायां गुर्दा (चित्रा 3 ए और धारा 3) को लक्षित करने के लिए बाईं उदर blastomere इंजेक्षन।
  6. तीसरे दरार पशु और वनस्पति पक्षों भागों में बांटती है, एक आठ सेल भ्रूण में जिसके परिणामस्वरूप। इस बिंदु पर, वहाँ चार पशु blastomeres [हैं छोड़ दिया और सही उदर(V1) और पृष्ठीय (डी 1)] और चार वनस्पति blastomeres [बाएँ और दाएँ उदर (V2) और पृष्ठीय (डी 2)] (चित्रा 2 बी और चित्रा 3 बी)।
    1. उदर, वनस्पति blastomeres (V2) का पता लगा। ये blastomeres इस स्तर (चित्रा 2 बी) पर किसी भी अन्य कोशिकाओं के विकास गुर्दे के लिए अधिक योगदान करते हैं। एक 8 सेल भ्रूण का बायां गुर्दा लक्षित करने के लिए छोड़ दिया है, V2 blastomere (चित्रा 3 बी और धारा 3) में इंजेक्षन।
  7. सूचना है कि चौथे और पांचवें चोली पशु और वनस्पति blastomeres दोटूक। दो संतान प्रत्येक blastomere से उत्पन्न कर रहे हैं, एक 16-सेल भ्रूण में जिसके परिणामस्वरूप। कोशिकाओं उनके पूर्ववर्ती के नाम पर रखा जाता है। उदाहरण के लिए, 8 सेल चरण से V2 blastomere 16 सेल चरण (चित्रा -2) पर v2.1 और V2.2 संतान को जन्म देता है। 16 सेल मंच पर V2.2 सेल कोशिकाओं के विकास के लिए योगदान दे गुर्दे के बहुमत प्रदान करता है।
  8. नोट छठे और सातवें चोली एक 32-सेल Embry में परिणामओ। फिर, दो संतान प्रत्येक blastomere, जो उनके पूर्ववर्ती निम्नलिखित नामित कर रहे हैं से उत्पन्न कर रहे हैं। उदाहरण के लिए, 16 सेल चरण से V2.2 blastomere 32 सेल मंच पर v2.2.1 और v2.2.2 को जन्म देता है। वहाँ 32 सेल चरण में जो कोशिकाओं के रूप में ए, बी, सी और डी (वनस्पति को जानवर से) चार पंक्तियों में पहचाने जाते हैं पर एक विकल्प के नामकरण प्रणाली है, और चार स्तंभों में 1, 2, 3, और 4 (के रूप में पृष्ठीय से उदर के लिए)। इस प्रकार, v2.2.2 blastomere, जो विकासशील pronephros के लिए सबसे अधिक योगदान देता है, इस विकल्प नामकरण प्रणाली (चित्रा 2 डी) के तहत सी 3 कहा जाता है।

2. भ्रूण की तैयारी

  1. (8.0 पीएच को 2% सिस्टीन, NaOH) Dejelly समाधान के 50 मिलीलीटर की तैयारी।
  2. मानक प्रोटोकॉल 14 के अनुसार एक भी नर मेंढक से दोनों वृषण अलग। 0.1 एम NaCl, 2 मिमी KCl, 1 मिमी MgSO 4, 2 मिमी, एक 60 मिमी पेट्री 10 मिलीलीटर वृषण भंडारण समाधान (1x मार्क संशोधित Ringers [एमएमआर के साथ भरा पकवान में वृषण रखेंCaCl 2, 5 मिमी HEPES पीएच 8, 0.1 मिमी EDTA] 12, 1% गोजातीय सीरम albumin, 50 माइक्रोग्राम / एमएल gentamycin)। 4 डिग्री सेल्सियस पर वृषण स्टोर।
    नोट: वृषण लगभग 7 के लिए भंडारित किया जा सकता है - 4 डिग्री सेल्सियस पर 10 दिन, लेकिन निषेचन दक्षता अब वृषण संग्रहित किया गया है कमी होगी।
  3. एक महिला मेंढक निचोड़ मानक प्रोटोकॉल 14 के अनुसार अंडे प्राप्त करने के लिए। एक 100 मिमी पेट्री डिश में अंडे ले लीजिए। किसी भी अतिरिक्त पानी डालो।
  4. एक वृषण की ¼ कट जबकि यह वृषण भंडारण समाधान में है संदंश और एक रेजर ब्लेड का उपयोग कर। अंडे युक्त पेट्री डिश के लिए वृषण का टुकड़ा स्थानांतरण। वृषण, कब तक वृषण संग्रहीत किया गया है के आकार के लिए खाते में करने के लिए इस्तेमाल वृषण हिस्से का आकार समायोजित करें, और कितने अंडे निषेचित किया जा रहे हैं। आम तौर पर एक हौसले से विच्छेदित वृषण का 1/3 के लिए ¼ का उपयोग अंडे में से एक क्लच की खाद डालना।
  5. संदंश और एक रेजर ब्लेड का उपयोग कर छोटे टुकड़ों में वृषण भाग कट। पर्याप्त 0.3x एमएमआर जोड़े+ 30 मिलीग्राम / मिलीलीटर पेट्री डिश के लिए gentamycin अंडे कवर करने के लिए। मिश्रण करने के लिए डिश में एमएमआर भंवर।
  6. लगभग 30 मिनट तक प्रतीक्षा करें निषेचन कमरे के तापमान पर जगह लेने के लिए। ध्यान दें कि पशु गोलार्द्ध (भ्रूण के pigmented पक्ष) प्रभावी निषेचन पर भ्रूण के शीर्ष पर बैठेंगे। फिर, एक हस्तांतरण पिपेट का उपयोग पेट्री डिश से एमएमआर को हटा दें। डिश के लिए पर्याप्त Dejelly समाधान जोड़ने के भ्रूण को कवर करने के लिए।
  7. अगले कुछ मिनटों के दौरान, धीरे पकवान रहकर ज़ुल्फ़। इस समय डिश के जोरदार झटकों के अक्ष दोष उत्पन्न कर सकते हैं।   भ्रूण पर जेली कोट भंग होगा, और भ्रूण घूमता दौरान डिश के केंद्र में एकत्र होंगे। एक बार भ्रूण बारीकी डिश के केंद्र में एक दूसरे को छू रहे हैं, एक हस्तांतरण विंदुक के साथ Dejelly समाधान निकालें। अब की तुलना में 5 मिनट के लिए Dejelly समाधान में भ्रूण मत छोड़ो, या भ्रूण क्षतिग्रस्त हो सकती है।
  8. 0.3x में 5 बार - dejellied भ्रूण 3 धोएमएमआर + 30 मिलीग्राम / ध्यान डालने का कार्य या एमएमआर बंद pipetting और नए एमएमआर के साथ पकवान भरने के द्वारा मिलीलीटर gentamycin। डिश से एमएमआर के सभी दूर मत करो, या भ्रूण क्षतिग्रस्त हो सकती है।
  9. एक हस्तांतरण पिपेट का उपयोग पेट्री डिश से किसी भी unfertilized अंडे या वृषण के टुकड़े निकालें।
  10. 14 और 22 डिग्री सेल्सियस के बीच भ्रूण सेते हैं।
    नोट: कम तापमान पर उगाया भ्रूण उच्च तापमान पर उगाया भ्रूण की तुलना में अधिक धीरे धीरे विकसित करना। विकास के चरणों की टाइमिंग Xenbase 22 पर पाया जा सकता है।
    1. उनके विकास के बाहर अंतरिक्ष के लिए, एक पेट्री डिश में एक निषेचन से भ्रूण की जगह आधा 14 डिग्री सेल्सियस पर रखा है, और एक पेट्री डिश में भ्रूण के दूसरे आधे 18 डिग्री सेल्सियस पर रखा। यह एक एकल निषेचन से 4 सेल या 8 सेल भ्रूण में इंजेक्शन के दो सेट के लिए अनुमति देता है।

3. इंजेक्शन समाधान और भ्रूण के microinjection की तैयारी

  1. 0.01 युक्त इंजेक्शन समाधान तैयारएनजी / nl झिल्ली ही सीमित लाल फ्लोरोसेंट प्रोटीन (सदस्य आरएफपी) mRNA 9 भ्रूण 4 सेल या 8 सेल चरण के लिए विकसित कर रहे हैं। इंजेक्षन करने के लिए तैयार है जब तक बर्फ पर इंजेक्शन समाधान स्टोर।
  2. "एक सुई खींचने में प्रतिस्थापन गिलास केशिका ट्यूब, सुई खींचने मामले में सबसे ऊपर के साथ गठबंधन प्रतिस्थापन ट्यूब के शीर्ष के साथ। 800 के लिए गर्मी # 2 मूल्य निर्धारित करें, और 650 प्रेस करने के लिए पुल मूल्य" एक 7 लोड खींच "बटन सुई खींचने के लिए। यह एक एकल 7 से 2 सुइयों पैदा करेगा" गिलास केशिका ट्यूब।
  3. Dumont संदंश की एक जोड़ी के साथ एक खींच सुई की नोक बंद कटाव।
    नोट: सुई खींच के बाद, टिप बंद सील कर दिया जाता है और खुले में कटौती की जानी चाहिए। व्यास सुई की नोक होगी सुई कि यह कट जाता है के बिंदु के करीब, छोटे। हालांकि टिप के व्यास microinjection यहां इस्तेमाल किया प्रणाली के साथ इंजेक्शन की मात्रा को प्रभावित नहीं करेगा, एक बड़ा व्यास के साथ एक टिप अधिक भ्रूण को नुकसान होने की संभावना है।
  4. एम पर्चीसुई के पीछे पर icropipette कोलिट। अगले, कोलिट पीछे सुई की पीठ पर बड़े छेद हे अंगूठी पर्ची।
  5. खनिज तेल एक 27 गेज चमड़े के नीचे सुई का प्रयोग, सावधान किया जा रहा सुई में हवा के बुलबुले पाने के लिए नहीं के साथ सुई भरें।
  6. microinjector के सवार पर सुई पर्ची, सफेद प्लास्टिक स्पेसर सवार पर स्थापित की बड़ी छेद में सुई बैठने। सवार microinjector के शरीर, सफेद स्पेसर, बड़े छेद हे अंगूठी, और कोलिट के द्वारा पीछा करने के लिए पास के एक छोटे हे अंगूठी होनी चाहिए। कोलिट कस द्वारा सुई सुरक्षित। सुई पर धीरे से खींच यकीन है कि यह ठीक से सुरक्षित बनाने के लिए किया जाता है।
  7. प्रेस और microinjector नियंत्रण बॉक्स पर "खाली" बटन पकड़ जब तक वहाँ दो beeps कर रहे हैं।
  8. पिपेट 3 Parafilm के एक टुकड़े पर इंजेक्शन समाधान के μl। Parafilm पर इंजेक्शन के समाधान के मनका में सुई की नोक डालें। प्रेस और पकड़ microi पर बटन "भरने"njector नियंत्रण बॉक्स सुई में इंजेक्शन समाधान आकर्षित करने के लिए।
  9. 0.3x एमएमआर + 30 मिलीग्राम / एमएल gentamycin में 5% Ficoll के साथ जाल 500 माइक्रोन पॉलिएस्टर के साथ लाइन में खड़ा एक 60 मिमी पेट्री डिश भरें। डिश में 30 4 सेल या 8 सेल भ्रूण - ध्यान 20 पिपेट।
  10. एक बाल पाश 14 का उपयोग करना, भ्रूण इतना है कि blastomere इंजेक्शन जा सुई का सामना करना पड़ रहा है हेरफेर। बायां गुर्दा लक्षित करने के लिए है, इसलिए कि 4 सेल भ्रूण या 8 सेल भ्रूण के लिए छोड़ दिया V2 blastomeres के बाईं उदर blastomeres सुई का सामना भ्रूण अप लाइन।
  11. डिश में प्रत्येक भ्रूण के चयनित blastomere में इंजेक्शन के समाधान के 10 nl इंजेक्षन।
    नोट: पेट्री डिश के तल पर जाल भ्रूण स्थिर और उन्हें रोलिंग, की अनुमति उन्हें स्थिरीकरण के लिए एक बाल पाश के उपयोग के बिना इंजेक्शन जा से रोकता है।
  12. स्थानांतरण एक संस्कृति थाली के कुओं कि 5% Ficoll साथ 0.3x एमएमआर + 30 मिलीग्राम / एमएल gentamycin में भर दिया गया है में इंजेक्शन भ्रूण। इंजेक्शन भ्रूण सेतेकम से कम एक घंटे के लिए 16 डिग्री सेल्सियस पर रों इंजेक्शन blastomeres चंगा करने के लिए अनुमति देने के लिए।
  13. एक नई संस्कृति थाली के कुओं कि 0.3x एमएमआर + 30 मिलीग्राम / एमएल gentamycin के साथ मंच 9 (gastrulation से पहले) से भर दिया गया है में चंगा भ्रूण स्थानांतरण।
  14. 14 में भ्रूण सेते - 22 डिग्री सेल्सियस तक भ्रूण चरण तक पहुंचने के 38 - 40 21।

4. फिक्सेशन और भ्रूण के Immunostaining

  1. MOPS / EGTA / मैग्नीशियम सल्फेट की 50 मिलीलीटर की तैयारी / संक्रामक बफर [MEMFA: 100 मिमी MOPS (7.4 पीएच), 2 मिमी EGTA, 1 मिमी MgSO 4, 3.7% (वी / वी) formaldehyde]।
  2. एक कांच की शीशी में 40 भ्रूण - 20 चरण 38 - एक हस्तांतरण पिपेट का प्रयोग, 10 डाल दिया। शीशी और पलटना शीशी के लिए 100% इथेनॉल में 10 μl 5% benzocaine जोड़े मिश्रण करने के लिए। भ्रूण anesthetize करने के लिए 10 मिनट तक प्रतीक्षा करें।
  3. शीशी एक गिलास पिपेट का उपयोग करने से एमएमआर निकालें। एक ही समय में कई शीशियों प्रसंस्करण हैं, शीशियों 24 अच्छी तरह से सेल संस्कृति की थाली में ईमानदार ठहराया जा सकता है।
  4. एक गिलास पाइप के साथटीटीई, MEMFA साथ शीशी में भर जाओ। एक तीन आयामी कमाल मंच पर शीशी कमरे के तापमान पर 1 घंटे के लिए रखें।
  5. शीशी एक गिलास पिपेट का उपयोग करने से MEMFA निकालें। 100% मेथनॉल के साथ शीशी भरें। एक तीन आयामी कमाल मंच पर शीशी कमरे के तापमान पर 10 मिनट के लिए रखें। इस धोने कदम एक बार और दोहराएँ, और -20 डिग्री सेल्सियस पर 100% मेथनॉल रात भर में भ्रूण की दुकान।
  6. तैयार 1x फॉस्फेट खारा बफर-गोजातीय सीरम albumin-ट्राइटन (पीबीटी): 1x पीबीएस, 2 मिलीग्राम / एमएल गोजातीय सीरम अंडे की सफ़ेदी, 0.1% ट्राइटन X-100।
  7. , माउस मोनोक्लोनल एंटीबॉडी 3G8 की एक 1:30 कमजोर पड़ने (मध्यवर्ती बाहर का और जोड़ने वाली नलिकाओं 20 की झिल्ली लेबल करने के लिए) माउस मोनोक्लोनल एंटीबॉडी के 5 कमजोर पड़ने 4A6 एक 1: के साथ 10% बकरी सीरम के साथ 1x पीबीटी: प्राथमिक एंटीबॉडी समाधान तैयार , और एक 1 (समीपस्थ नलिकाओं 20 के लेबल लुमेन के लिए): खरगोश पॉलीक्लोनल आरएफपी एंटीबॉडी के 250 कमजोर पड़ने (सदस्य आरएफपी दरियाफ्त लेबल करने के लिए)। 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर।
  8. seconda तैयारRY एंटीबॉडी समाधान: 10% बकरी सीरम के साथ 1x पीबीटी, 1: 500 एलेक्सा 488 बकरी विरोधी माउस आईजीजी (शेयर एकाग्रता 2 मिलीग्राम / एमएल, लेबल 4A6 और 3G8 करने के लिए), और 1: 500 एलेक्सा 555 बकरी विरोधी खरगोश आईजीजी (शेयर एकाग्रता 2 मिलीग्राम / एमएल, सदस्य आरएफपी दरियाफ्त लेबल करने के लिए)। 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर, पन्नी में कवर ट्यूब प्रकाश से बचाने के लिए।
  9. वैकल्पिक रूप से, धुंधला के बाद प्राथमिक और माध्यमिक एंटीबॉडी जमा है, और भविष्य प्रयोगों में पुन: उपयोग करने के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर बचाने के लिए। एंटीबॉडी पुन: उपयोग करने के लिए बचाया जा रहा है, तो 0.01% सोडियम azide जोड़ें।
  10. स्थापित प्रोटोकॉल का उपयोग भ्रूण 18 immunostain।

5. भ्रूण और लक्षित pronephric ऊतक के विश्लेषण के दृश्य

  1. (पूरे भ्रूण देखने के लिए) immunostained भ्रूण स्क्रीन को सत्यापित करें कि सही blastomere 1x पर एक फ्लोरोसेंट stereomicroscope के तहत दरियाफ्त की प्रतिदीप्ति को देखने के द्वारा इंजेक्ट किया गया था और 5X बढ़ाई (गुर्दे देखने के लिए)। हम साथ एक बहु अच्छी तरह से कांच की प्लेट में रखें भ्रूण1x पीबीटी टिप के साथ एक हस्तांतरण पिपेट का उपयोग के साथ भरा lls काट दिया। एक बाल पाश के साथ भ्रूण हेरफेर। केवल भ्रूण जो भ्रूण के बाईं ओर pronephros में सह इंजेक्शन दरियाफ्त मौजूद है का उपयोग करें (चित्रा -3 सी, एफ और चित्रा 4C, एफ) जीन overexpression या पछाड़ना के विश्लेषण के लिए।
  2. एक कांच की शीशी में भ्रूण रखने और मरे के स्पष्ट साथ शीशी भरने के द्वारा: वैकल्पिक रूप से, मूर्रे स्पष्ट में भ्रूण (1 भाग बेंजाइल अल्कोहल 2 भागों लोबान बेंजोएट) को साफ किया। एक गिलास अच्छी तरह से थाली का उपयोग भ्रूण कल्पना।
    नोट: मूर्रे साफ़ एक कार्बनिक विलायक है, और देखभाल के साथ संभाला जाना चाहिए। दस्ताने पहनें, और केवल मूर्रे स्पष्ट साथ कांच की शीशियों और pipettes का उपयोग करें।
  3. 3 सप्ताह - 4 डिग्री सेल्सियस 1x में 2 के लिए पीबीटी पर स्टोर भ्रूण। भ्रूण की लंबी अवधि के भंडारण के लिए, 10 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर 100% मेथनॉल में दो बार धोने से भ्रूण निर्जलीकरण। 100% मेथनॉल में -20 डिग्री सेल्सियस पर भ्रूण स्टोर।

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Representative Results

4 और 8 सेल सदस्य आरएफपी mRNA के साथ Xenopus भ्रूण के Microinjections pronephros को निशाना बनाने का विभिन्न स्तरों दिखा। 4 से पता चलता चरण सही सदस्य आरएफपी mRNA अभिव्यक्ति पैटर्न के साथ 40 भ्रूण चित्रा। भ्रूण बाईं उदर blastomere (चित्रा 4 ए) में इंजेक्ट किया, और सदस्य आरएफपी mRNA की उचित अभिव्यक्ति पैटर्न के लिए हल किया गया। समीपस्थ, मध्यवर्ती डिस्टल में सदस्य आरएफपी व्यक्त और गुर्दे की नलिकाओं को जोड़ने के अलावा, ठीक से इंजेक्शन भ्रूण सिर, ट्रंक, और पूंछ की एपिडर्मिस में प्रतिदीप्ति दिखाने के लिए उम्मीद कर रहे हैं। उन्होंने यह भी otocyst में प्रतिदीप्ति, सीमेंट ग्रंथि, proctodeum, और somites (चित्रा 4C) दिखाना चाहिए। 8 ठीक से इंजेक्शन भ्रूण के गुर्दे में सदस्य आरएफपी प्रतिदीप्ति का वितरण एक फ्लोरोसेंट stereomicroscope (चित्रा 4 बी) के साथ निर्धारित किया गया था। एपिडर्मिस में सदस्य आरएफपी अभिव्यक्ति के उच्च स्तर के साथ भ्रूण किअवरुद्ध गुर्दे क्षेत्रों का पता लगाने के रूप में "occluded" रन बनाए थे। सदस्य आरएफपी अभिव्यक्ति समीपस्थ में पता चला था, सभी भ्रूण की, मध्यवर्ती बाहर का और जोड़ने वाली नलिकाओं के रूप में occluded रन बनाए नहीं कर रहे थे कि। स्टिरियोस्कोप (चित्रा 4D-एफ) और confocal सूक्ष्मदर्शी (चित्रा 4 जी-आई) 3G8 और 4A6 साथ immunostained सदस्य आरएफपी और गुर्दे ऊतक के सह स्थानीयकरण सत्यापित करने के लिए इस्तेमाल किया गया। Confocal इमेजिंग समीपस्थ, गुर्दे के मध्यवर्ती, बाहर और जोड़ने नलिकाओं के साथ सदस्य आरएफपी के सह स्थानीयकरण सत्यापित, यह दर्शाता है कि बाईं उदर blastomere में सदस्य आरएफपी के microinjection सही ढंग से गुर्दे निशाना बनाता है।

8 सेल मंच पर सदस्य आरएफपी mRNA के साथ इंजेक्शन भ्रूण (चित्रा 5 ए), प्रतिदीप्ति प्रदर्शित ऊतकों की एक संकरा श्रृंखला को दिखाने का संकेत है कि 8-सेल इंजेक्शन गुर्दे के लिए माध्यमिक प्रभाव की संभावना को कम। 4 सेल चरण, embr पर इंजेक्शन भ्रूण की तरहyos समीपस्थ में 8 सेल स्टेज शो प्रतिदीप्ति पर इंजेक्शन, गुर्दे के मध्यवर्ती, बाहर और जोड़ने नलिकाओं, साथ ही somites और proctodeum (चित्रा 5C-एफ)। 4 सेल चरण में इंजेक्शन भ्रूण के विपरीत, सीमेंट ग्रंथि और otocyst सदस्य आरएफपी के साथ लेबल नहीं कर रहे हैं। 10 ठीक से निशाना बनाया भ्रूण में से एक भ्रूण समीपस्थ नलिकाओं के लगभग सभी सदस्य में आरएफपी से पता चला है, और 3 लगभग सभी गुर्दा (चित्रा 5 ब) के मध्यवर्ती और बाहर का नलिकाओं के सदस्य में आरएफपी दिखाया। 7 भ्रूण के जोड़ने वाली नलिकाओं को आंशिक रूप से सदस्य आरएफपी के साथ लेबल रहे थे। इसके अलावा, 8 सेल मंच पर इंजेक्शन भ्रूण के गुर्दे कल्पना करने के लिए आसान थे, और जैसा कि occluded केवल एक रन बनाए थे। सदस्य आरएफपी और गुर्दे (3G8 और 4A6) लेबल एंटीबॉडी के सह स्थानीयकरण एक stereomicroscope (चित्रा 5 डी-एफ) का उपयोग निर्धारित किया है, और एक confocal खुर्दबीन (चित्रा 5 जी-आई) का उपयोग कर सत्यापित किया गया था। समीपस्थ, मध्यवर्ती, बाहर और जोड़ने Tuगुर्दे की bules 8 सेल मंच पर इंजेक्शन भ्रूण में सदस्य आरएफपी, प्रदर्शन है कि लक्षित V2 blastomere के इंजेक्शन गुर्दे लेबल, जबकि 4 सेल पर बाईं उदर blastomere में इंजेक्शन भ्रूण की तुलना में कम ऊतकों में प्रतिदीप्ति प्रदर्शित करने के साथ लेबल थे मंच।

इस परख एक अनुरेखक संकेत मिलता है जो ऊतकों microinjection द्वारा निशाना बनाया गया के रूप में चिह्नित एक fluorescently का उपयोग mRNA बनाता है। यह विश्लेषण करने से पहले लगातार दरियाफ्त स्थानीयकरण के लिए भ्रूण स्क्रीन करने के लिए महत्वपूर्ण है, और किसी भी भ्रूण कि उम्मीद दरियाफ्त वितरण पैटर्न प्रदर्शित नहीं करने के लिए खारिज किया जाना चाहिए। चित्रा 6 एक मंच 40 भ्रूण है कि गलत तरीके से सदस्य आरएफपी mRNA के साथ निशाना बनाया गया था की एक उदाहरण दिखाता है 4 सेल चरण। सदस्य आरएफपी mRNA अभिव्यक्ति भ्रूण की बजाय बाईं ओर (चित्रा 6A) के दाईं ओर स्थित है। इसके अलावा, mRNA अभिव्यक्ति का सबसे अधिक है, कम ट्रंक और पूंछ की त्वचा में है साथsomites में थोड़ा अभिव्यक्ति। कोई mRNA अभिव्यक्ति समीपस्थ, मध्यवर्ती, बाहर और जोड़ने नलिकाओं (चित्रा 6B) में देखा जाता है, गुर्दे की अनुचित लक्ष्य-निर्धारण की पुष्टि। इसलिए, इस भ्रूण विश्लेषण के लिए इस्तेमाल नहीं किया जाना चाहिए।

आकृति 1
चित्रा 1:। Xenopus भ्रूण गुर्दे एक मंच 35 Xenopus भ्रूण के गुर्दे का आरेख, समीपस्थ, मध्यवर्ती, बाहर का दिखा रहा है, और नलिकाओं को जोड़ने। Raciti एट अल के आधार पर। (2008) 6। यहां यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए क्लिक करें।

चित्र 2
चित्रा 2: Xenopuएस भ्रूण भाग्य नक्शे। भाग्य नक्शे की पहचान करने और blastomeres कि विकासशील pronephros के लिए योगदान नामकरण। ए) एक 4 सेल भ्रूण की किस्मत नक्शा। बी) एक 8 सेल भ्रूण की किस्मत नक्शा। एक 16-सेल भ्रूण के सी) किस्मत नक्शा। एक 32-सेल भ्रूण के डी) भाग्य नक्शा। 32-सेल भ्रूण के blastomeres भी एक वैकल्पिक blastomere नामकरण प्रणाली का उपयोग लेबल रहे हैं। भाग्य नक्शे मूडी (1987) 8, 9 और मूडी और क्लाइन (1990) के आधार पर 7। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्र तीन
चित्रा 3:। Xenopus Pronephros लक्ष्य निर्धारण के लिए इंजेक्शन योजना लाल तीर से संकेत मिलता है इंजेक्षन करने के लिए सेल। ए) जानवर और एक 4 सेल भ्रूण के उदर विचारों बाईं उदर बी के इंजेक्शन दिखाछोड़ दिया pronephros लक्षित करने lastomere। लाल तीर छोड़ दिया उदर blastomere संकेत मिलता है। बी) पशु और एक 8 सेल छोड़ दिया V2 blastomere के इंजेक्शन दिखा भ्रूण के उदर विचारों बाईं pronephros निशाना बनाने के लिए। लाल तीर छोड़ दिया V2 blastomere संकेत मिलता है। एबी) 4x बढ़ाई पर एक त्रिविमदर्शी पर लिया भ्रूण की छवियाँ। Xenopus भाग्य पर आधारित इंजेक्शन मूडी (1987) 8, 9 और मूडी और क्लाइन (1990) द्वारा विकसित नक्शे 7। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्रा 4
चित्रा 4:। 4 सेल मंच पर लक्षित भ्रूण के उदाहरण immunostained चरण 40 Xenopus सदस्य आरएफपी mRNA एक अनुरेखक के रूप में उपयोग करते हुए 4 सेल मंच पर बाईं pronephros को लक्षित इंजेक्शन दिखा भ्रूण। सदस्य आरएफपी लेबलोंकोशिका झिल्ली लाल। ए) एक 4 सेल भ्रूण के बाईं उदर blastomere में सदस्य आरएफपी mRNA के योजनाबद्ध दिखा इंजेक्शन। ठीक से इंजेक्शन भ्रूण के गुर्दे में सदस्य आरएफपी प्रतिदीप्ति की बी) ऊतक स्थानीयकरण। सी) स्टेज 40 भ्रूण 4 सेल मंच पर बाईं उदर blastomere में सदस्य आरएफपी के साथ इंजेक्शन। सदस्य आरएफपी स्थानीयकरण, लाल रंग में दिखाया है, जबकि गुर्दे की हरी लेबल है। 1X बढ़ाई। डी) गुर्दा 3G8 के साथ दाग समीपस्थ नलिकाओं के लुमेन लेबल करने के लिए, और 4A6, मध्यवर्ती बाहर का और जोड़ने वाली नलिकाओं में कोशिकाओं की झिल्ली लेबल करने के लिए। 5X बढ़ाई। ई) दिखा सदस्य आरएफपी स्थानीयकरण गुर्दे में इस क्षेत्र की वृद्धि। 5X बढ़ाई। एफ) दिखा गुर्दे के साथ सदस्य आरएफपी दरियाफ्त की सह स्थानीयकरण मर्ज किए गए छवि। 5X बढ़ाई। सीएफ) एक त्रिविमदर्शी पर एक ओलिंप DP71 कैमरा के साथ लिया भ्रूण की छवियाँ। जी) 3G8 और 4A6 के साथ दाग एक दूसरे भ्रूण के गुर्दे के Confocal छवि। एच) गुर्दे में सदस्य आरएफपी का स्थानीयकरण और आसपास के ऊतकों। मैं) छवि थानेदार विलयसदस्य आरएफपी, 3G8, और गुर्दे में 4A6 के पंख सह स्थानीयकरण। सैनिक) 20X बढ़ाई अधिकतम प्रक्षेपण का उपयोग Confocal छवियों। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्रा 5
चित्रा 5:। 8 सेल मंच पर लक्षित भ्रूण के उदाहरण immunostained चरण 40 Xenopus सदस्य आरएफपी mRNA एक अनुरेखक के रूप में उपयोग करते हुए 8 सेल मंच पर बाईं pronephros को लक्षित इंजेक्शन दिखा भ्रूण। सदस्य आरएफपी कोशिका झिल्ली लाल लेबल। एक 8 सेल भ्रूण के छोड़ दिया V2 blastomere में सदस्य आरएफपी mRNA की ए) योजनाबद्ध दिखा इंजेक्शन। ठीक से इंजेक्शन भ्रूण के गुर्दे में सदस्य आरएफपी प्रतिदीप्ति की बी) ऊतक स्थानीयकरण। सी) स्टेज 40 भ्रूण 8 सेल मंच पर बाईं V2 blastomere में सदस्य आरएफपी के साथ इंजेक्शन। सदस्य आरएफपी स्थानीयकरण दिखाया गया हैलाल रंग में, गुर्दे की हरी लेबल है, जबकि। 1X बढ़ाई। डी) गुर्दा 3G8 के साथ दाग समीपस्थ नलिकाओं के लुमेन लेबल करने के लिए, और 4A6, मध्यवर्ती बाहर का और जोड़ने वाली नलिकाओं में कोशिकाओं की झिल्ली लेबल करने के लिए। 5X बढ़ाई। ई) दिखा सदस्य आरएफपी स्थानीयकरण गुर्दे में इस क्षेत्र की वृद्धि। 5X बढ़ाई। एफ) दिखा गुर्दे के साथ सदस्य आरएफपी दरियाफ्त की सह स्थानीयकरण मर्ज किए गए छवि। 5X बढ़ाई। सीएफ) एक त्रिविमदर्शी पर एक ओलिंप DP71 कैमरा के साथ लिया भ्रूण की छवियाँ। जी) 3G8 और 4A6 के साथ दाग एक दूसरे भ्रूण के गुर्दे के Confocal छवि। एच) गुर्दे में सदस्य आरएफपी का स्थानीयकरण और आसपास के ऊतकों। मैं) दिखा सदस्य आरएफपी, 3G8, और गुर्दे में 4A6 के सह स्थानीयकरण की छवि विलय कर दिया। सैनिक) 20X बढ़ाई अधिकतम प्रक्षेपण का उपयोग कर लिया Confocal छवियों। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।


चित्रा 6: भ्रूण का उदाहरण गलत ढंग से 4 सेल मंच पर लक्षित immunostained चरण 40 Xenopus भ्रूण सदस्य आरएफपी mRNA एक अनुरेखक के रूप में उपयोग करते हुए 4 सेल मंच पर बाईं pronephros की गलत लक्ष्यीकरण दिखा।। सदस्य आरएफपी कोशिका झिल्ली लाल लेबल। ए) स्टेज 40 गलत blastomere में सदस्य आरएफपी इंजेक्शन का संकेत के अनुचित वितरण दिखा भ्रूण। गलत blastomere में इंजेक्शन का संकेत गलत दरियाफ्त वितरण होने के अलावा, इस भ्रूण सही पक्ष पर इंजेक्ट किया गया था। 1X बढ़ाई। बी) गुर्दा (3G8, 4A6) लेबल एंटीबॉडी के साथ सदस्य आरएफपी के सह स्थानीयकरण की कमी दिखा गुर्दे का मर्ज किए गए छवि। 5X बढ़ाई। एबी) एक त्रिविमदर्शी पर लिया भ्रूण की छवियाँ। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

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Discussion

Xenopus भ्रूण के विकास की pronephros लक्ष्य निर्धारण की पहचान करने और सही blastomere इंजेक्शन लगाने पर निर्भर करता है। 8 सेल भ्रूण के V2 blastomere इंजेक्शन बाईं pronephros 18 निशाना बनाता है। यह एक आंतरिक नियंत्रण के रूप में contralateral सही pronephros छोड़ देता है। morpholino पछाड़ना या आरएनए overexpression गुर्दे विकास को बदलने के लिए प्रयोग किया जाता है, तो contralateral सही pronephros बाईं pronephros पर जीन पछाड़ना या overexpression के प्रभाव की तुलना करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है। इस मामले में, इस तरह के एक बेमेल नियंत्रण morpholino या प्रमुख नकारात्मक आरएनए निर्माण के रूप में उचित नियंत्रण जीन अभिव्यक्ति में परिवर्तन के परिणामों का विश्लेषण करने के लिए contralateral आंतरिक नियंत्रण करने के लिए इसके अलावा में इस्तेमाल किया जाना चाहिए। Xenopus भ्रूण के रिश्तेदार पारदर्शिता के कारण, गुर्दे दोष आसानी से कई तकनीकों का उपयोग मात्रा निर्धारित किया जा सकता है। उदाहरण के लिए, जीन पछाड़ना या overexpression बस भ्रूण के pronephric सूचकांक की गणना के द्वारा मात्रा निर्धारित किया जा सकता हैएंटीबॉडी 3G8 13 है, जो भ्रूण के इंजेक्शन और नियंत्रण पक्षों पर समीपस्थ नलिकाओं के विकास की तुलना के साथ immunostained। Pronephric विकास का अध्ययन करने के अलावा, इस तकनीक को आसानी से स्थापित भाग्य नक्शे 7-10 का उपयोग कर इंजेक्षन करने के लिए उचित blastomere का चयन करके अन्य ऊतकों को लक्षित करने के लिए अनुकूलित किया जा सकता है। अन्य प्रकार के ऊतकों को लक्षित करने के लिए इसके अलावा, इस प्रोटोकॉल भी विभिन्न चरणों में गुर्दे विकास का अध्ययन करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है। इस प्रोटोकॉल के स्तर पर देखा 40 भ्रूण एंटीबॉडी 3G8 और 4A6 के साथ दाग है, जो अलग-अलग गुर्दे ऊतक का पता लगाने। युवा भ्रूण अलग गुर्दे एंटीबॉडी के साथ immunostained किया जा सकता है, या सीटू संकरण 5, 6, 20 में के अधीन है। उदाहरण के लिए, एंटीबॉडी Lim1 विकासशील pronephros 21, 22 का पता लगा सकते। इसी तरह, lim1, pax8, और hnf1- β टेप हो सकता है मंच 12.5 22-24 में सीटू संकरण शुरू में साथ पाया सीटू संकरण मार्करों में अन्य बाद में बाद में विकास के चरणों में गुर्दे के विभिन्न क्षेत्रों का पता लगाने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है। उदाहरण के लिए, जांच केशिकाजाल में nphs1, clckb, slc5a1, और atp1a1 की अभिव्यक्ति का पता लगाने के लिए बनाया गया है, बाहर का और नलिकाओं, समीपस्थ नलिकाओं, और पूरे गुर्दे को जोड़ने, क्रमश: 25 में वर्णित किया गया है, 5, 26, 27। गुर्दे का आकलन विभिन्न एंटीबॉडी या सीटू विश्लेषण में उपयोग कर रहा है कि कैसे एक उपचार गुर्दे विकास बदल का एक बेहतर समझ के लिए अनुमति होगी कई चरणों के पार।

इस प्रोटोकॉल में से एक महत्वपूर्ण पहलू सही चयन और blastomere की पहचान इंजेक्ट किया जा रहा है। इस प्रोटोकॉल में, हम कैसे 8 सेल भ्रूण के बाईं V2 blastomere या 4 सेल भ्रूण के बाईं उदर blastomere इंजेक्शन द्वारा pronephros को निशाना बनाने का वर्णन है। गलत blastomere इंजेक्ट किया जाता है, तो pronephros सही ढंग से लक्षित नहीं किया जाएगा। इसलिए, यहजल्दी Xenopus भ्रूण के विकास और सेल दरार विमानों microinjection 28 से पहले से परिचित बनने के लिए महत्वपूर्ण है, 29। भ्रूण दरार हमेशा की स्थापना की विकास मंच के चार्ट का पालन नहीं करता है, तो यह केवल भ्रूण में जो जल्दी सेल चोली लग इंजेक्षन करने के लिए उपयोगी है "सामान्य" और उचित blastomere आसानी से पहचाना जा सकता है। यह भ्रूण है कि अनुचित तरीके से निशाना बनाया गया की संख्या में कमी होगी। इसके अलावा, इसके लिए भ्रूण की blastomeres पूरी तरह से इंजेक्शन के समय में विभाजित किया जा करने के लिए भी महत्वपूर्ण है। उदाहरण के लिए, यदि blastomeres V1 और एक 8 सेल भ्रूण के V2 के बीच दरार microinjection से पहले पूरा नहीं हुआ है, ट्रेसर V1 में भी V2 के रूप में फैल सकता है। यह microinjection का निशाना बना दक्षता में कमी होगी, और जिसके परिणामस्वरूप भ्रूण दरियाफ्त वितरण है कि और अधिक एक भ्रूण 8 सेल चरण 4 सेल चरण के बजाय पर इंजेक्शन के समान लग रहा है दिखा सकते हैं।

एकइस प्रोटोकॉल के अन्य महत्वपूर्ण हिस्सा सत्यापन कि pronephros ठीक से microinjection द्वारा निशाना बनाया गया है। यह pronephric विकास का विश्लेषण करने से पहले किया जाना चाहिए, क्योंकि भ्रूण कि pronephros ठीक से निशाना बनाया जिसके परिणामस्वरूप डाटासेट तिरछा कर सकते हैं नहीं पड़ा है। उचित लक्ष्य-निर्धारण करने के लिए, प्रत्येक इंजेक्शन भ्रूण में दरियाफ्त वितरण का विश्लेषण। इंजेक्शन (बाएं) भ्रूण के पक्ष फ्लोरोसेंट ट्रेसर के विशाल बहुमत प्रदर्शित करना चाहिए। भ्रूण के नियंत्रण (दाएं) की ओर प्रतिदीप्ति की एक पर्याप्त राशि से पता चलता है, तो इस भ्रूण खारिज किया जाना चाहिए। यदि ऐसा होता है, तो गलत blastomere इंजेक्ट किया गया था, या इंजेक्शन blastomere इंजेक्शन से पहले cleaved नहीं पूरा किया था। दूसरा, इंजेक्शन (बाएं) भ्रूण के पक्ष में प्रतिदीप्ति सही ढंग से pronephros लक्ष्य होगा। भ्रूण 8 सेल चरण, पृष्ठीय और उदर somites, पार्श्व प्लेट, पश्चांत्र, proctodeum, पर इंजेक्ट किया गया था, तो ट्रंक और ट्रंक में तंत्रिका शिखा की त्वचा फ्लू को दिखाने के लिए उम्मीद कर रहे हैंorescence pronephros 6, के अलावा 29। 8-सेल इंजेक्शन के लिए सूचीबद्ध ऊतकों, भ्रूण 4 सेल मंच पर इंजेक्शन त्वचा और somites में फ्लोरोसेंट दरियाफ्त की व्यापक वितरण के साथ ही निशाना बना होना चाहिए के अलावा सीमेंट ग्रंथि, otocyst, लेंस और घ्राण placode। भ्रूण उचित ऊतक लक्ष्यीकरण प्रदर्शित नहीं करता है, तो इसे खारिज किया जाना चाहिए विश्लेषण करने से पहले (चित्रा 5)।

इस प्रोटोकॉल में वर्णित लक्षित इंजेक्शन एक वांछित ऊतक में जीन की अभिव्यक्ति में हेर-फेर करने का एक साधन प्रदान करते हैं। इस तकनीक की एक सीमा है कि हालांकि इन इंजेक्शनों लक्षित कर रहे हैं, वे केवल विकासशील गुर्दे को प्रभावित नहीं करते है। 4 और 8 सेल इंजेक्शन इस तकनीक में वर्णित अधिक एकल कोशिका मंच है, जहां जीन अभिव्यक्ति पूरे भ्रूण में बदल दिया जाएगा पर किया इंजेक्शन से लक्षित कर रहे हैं, और इंजेक्शन दो सेल मंच, पर किया जहां से आधे से भ्रूण प्रदर्शित करता बदल जीन एक्सप्रेसआयन। वे, लेकिन नहीं, केवल एक ही लक्ष्य ऊतक है। हालांकि 4 सेल भ्रूण और 8 सेल भ्रूण के V2 blastomeres के उदर blastomeres में इंजेक्शन pronephros में जीन की अभिव्यक्ति में परिवर्तन, वे भी अन्य ऊतकों में जीन की अभिव्यक्ति में परिवर्तन। अन्य प्रभावित ऊतकों त्वचा, somites, आंत, और तंत्रिका शिखा शामिल हैं। इसलिए, यह समझने के लिए कि हालांकि 4 और 8 सेल इंजेक्शन एक या दो सेल इंजेक्शन से अधिक लक्षित कर रहे हैं, वे अभी भी कई ऊतकों में जीन की अभिव्यक्ति बदल जाएगा महत्वपूर्ण है। 4 और 8 सेल चरणों में भ्रूण इंजेक्शन लगाने के अलावा, इंजेक्शन भी 2-, 16-, और 32-सेल चरणों में किया जा सकता है। 2-सेल मंच पर इंजेक्शन भ्रूण बाद के चरणों में इंजेक्शन भ्रूण से प्रभावित ऊतकों की एक व्यापक श्रृंखला के लिए होगा। हालांकि अधिक तकनीकी रूप से चुनौतीपूर्ण, 16- और 32-सेल चरणों में इंजेक्शन भ्रूण 4 और 8 सेल चरणों में इंजेक्शन भ्रूण से प्रभावित ऊतकों का एक संकरा रेंज होगा।

सदस्य आरएफपी वंश ट्रेसआर microinjection के बाद उचित लक्ष्यीकरण सत्यापित करने के लिए इस प्रोटोकॉल में प्रयोग किया जाता है। सदस्य आरएफपी mRNA लेबल कोशिकाओं के बाद कोशिका झिल्ली इंजेक्शन शाही सेना से प्रोटीन अनुवाद किया है। इस प्रोटोकॉल (एक 10 nl इंजेक्शन में सदस्य आरएफपी mRNA की 0.1 एनजी) में इस्तेमाल सदस्य आरएफपी वंश दरियाफ्त की एकाग्रता के रूप में भ्रूण मौत के लिए खाते में करने की जरूरत है और वांछित दरियाफ्त प्रतिदीप्ति की तीव्रता संशोधित किया जाना चाहिए। ऐसे rhodamine-dextran, क्वांटम डॉट्स, या histochemically detectable β-galactosidase के रूप में इंजेक्शन वंश दरियाफ्त की राशि, एक अलग वंश अनुरेखक, संशोधित करने के लिए इसके अलावा, सदस्य आरएफपी के बजाय प्रयोग किया जा सकता है। वंश ट्रेसर कोशिकाओं के विभाजन के रूप में अधिक पतला हो जाते हैं, के रूप में विकसित भ्रूण कम करने के लिए प्रतिदीप्ति के स्तर पर हो सकता है। इस तकनीक का एक अतिरिक्त आवेदन वंश अनुरेखक के साथ एक exogenous शाही सेना या morpholino सह-इंजेक्षन करने के लिए overexpress या ब्याज की एक जीन की अभिव्यक्ति के नीचे दस्तक करने के लिए है। वंश दरियाफ्त pronephros का सही लक्ष्य-निर्धारण सत्यापित करने के लिए प्रयोग किया जाता है, लेकिन नहींइंगित करने के लिए जहां सह इंजेक्शन बहिर्जात शाही सेना या morpholino भ्रूण में localizes। Exogenous शाही सेना और morpholinos संभावित बेटी कोशिकाओं दरियाफ्त नहीं बल्कि बहिर्जात शाही सेना या morpholino वर्तमान 30 है, जिसके परिणामस्वरूप सह इंजेक्शन अनुरेखक के रूप में एक ही दर पर इंजेक्शन blastomere के माध्यम से फैल नहीं हो सकता है। वास्तव में, हमने देखा है कि दो अलग अलग आरएनए निर्माणों एक ही सेल में इंजेक्शन हमेशा सह स्थानीय बनाना (अप्रकाशित डेटा) नहीं है। इसलिए, एक सेल में दरियाफ्त की उपस्थिति जरूरी संकेत नहीं है कि सह इंजेक्शन बहिर्जात शाही सेना या morpholino हमेशा कि सेल में मौजूद है।

इस प्रोटोकॉल blastomeres कि Xenopus भ्रूण के विकास की pronephros को जन्म देने के लिए microinjection को निशाना बनाने के लिए एक प्रक्रिया का विवरण। जीन अभिव्यक्ति अक्सर morpholinos या exogenous आरएनए, जो दोनों के कारण जल्दी विकास विसंगतियों को रोका जा सकता का इंजेक्शन के माध्यम से Xenopus भ्रूण में हेरफेर किया जाता है, तो एक या में इंजेक्शनदो-सेल भ्रूण। एकल कोशिका चरण प्रदर्शनी पछाड़ना या विकासशील भ्रूण की कोशिकाओं के सभी में overexpression पर इंजेक्शन भ्रूण। अगर जीन उचित जल्दी विकास की प्रक्रिया के लिए आवश्यक है, भ्रूण एक pronephros का विकास नहीं हो सकता। ऐसे 8 सेल यहाँ विस्तृत इंजेक्शन, के रूप में बाद के चरणों, में प्रदर्शन इंजेक्शन भ्रूण कि gastrulation और अंतिम pronephric विकास 18 से गुजरना में परिणाम कर सकते हैं। इसलिए, यहाँ पर चर्चा लक्षित इंजेक्शन gastrulation कुछ जीनों की अभिव्यक्ति के परिवर्तन की वजह से दोष दूर कर सकते हैं, भ्रूण pronephric विकास के माध्यम से प्रगति करने के लिए अनुमति देता है। भविष्य में, इस प्रोटोकॉल भी वांछित blastomeres को CRISPR निर्माणों को लक्षित करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है।

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Acknowledgments

इस काम के टेक्सास McGovern मेडिकल स्कूल विश्वविद्यालय में बाल रोग विभाग की ओर से स्वास्थ्य NIDDK अनुदान (K01DK092320) और स्टार्टअप धन का एक राष्ट्रीय संस्थान द्वारा समर्थित किया गया।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Sodium chloride Fisher S271-3
Potassium chloride Fisher P217-500
Magnesium sulfate  Fisher M63-500
Calcium chloride Fisher C79-500
HEPES Fisher BP310-500
EDTA Fisher S311-500
Gentamycin solution, 50 mg/ml Amresco E737-20ML
L-Cysteine, 99%+ Acros Organics 52-90-4
Ficoll Fisher BP525-100
100 mm x 15 mm Petri dish Fisher FB0875712
Mini Fridge II Boekel 260009 Benchtop incubator for embryos.
Gap43-RFP plasmid For making tracer RNA. Ref: Davidson et al., 2006.
Rhodamine dextran, 10,000 M.W. Invitrogen D1817 Tracer.
Molecular biology grade, USP sterile purified water Corning 46-000-CI
7" Drummond replacement tubes Drummond 3-000-203-G/XL Microinjection needles.
Needle puller Sutter Instruments P-30
Fine forceps Dumont 11252-30 For breaking microinjection needle tip.
Nanoject II Drummond 3-000-204 Microinjector.
Mineral oil, heavy Fisher CAS 8042-47-5 Oil for needles.
27 G Monoject hypodermic needle Covidien 8881200508 For loading mineral oil into microinjection needle.
5 ml Luer-Lok syringe BD 309646 For loading mineral oil into microinjection needle.
60 mm x 15 mm Petri dish Fisher FB0875713A
800 micron Polyester mesh Small Parts CMY-0800-C
Transfer pipets Fisher 13-711-7M For transferring embryos. Cut off the tip so that the embryos are easily taken up by the pipette.
6-well cell culture plate Nest Biotechnology
MOPS Fisher BP308-500
EGTA Acros Organics 67-42-5
Formaldehyde Fisher BP531-500
15 mm x 45 mm Screw thread vial Fisher 03-339-25B For fixing, staining, and storing embryos.
24-well cell Culture plate Nest Biotechnology
Benzocaine Spectrum BE130
Ethanol Fisher BP2818-4
Methanol Fisher A412-4
Phosphate buffered saline (PBS) 1x powder Fisher BP661-50
Bovine serum albumen Fisher BP1600-100
Triton X-100 Fisher BP151-500
3D Mini rocker, model 135 Denville Scientific 57281
Goat serum, New Zealand origin Invitrogen 16210064
Sodium azide Fisher S227I-25
Monoclonal 3G8 antibody European Xenopus Resource Centre Primary antibody to label proximal tubules.
Monoclonal 4A6 antibody European Xenopus Resource Centre Primary antibody to label intermediate, distal and connecting tubules.
anti-RFP pAb, purified IgG/rabbit MBL PM005 Primary antibody to label Gap43-RFP tracer.
Alexa Fluor 488 goat anti-mouse IgG Life Technologies A11001 Secondary antibody to label kidney tubules.
Alexa Fluor 555 goat anti-rabbit IgG Life Technologies A21428 Secondary antibody to label Gap43-RFP tracer.
9 Cavity spot plate Corning 7220-85
Benzyl benzoate Fisher 105862500 Optional - for clearing embryos
Benzyl alcohol Fisher A396-500 Optional - for clearing embryos

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References

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विकास जीवविज्ञान अंक 111, गुर्दे pronephros लक्षित इंजेक्शन microinjection भाग्य नक्शा वंश अनुरेखक विकास जीव विज्ञान
विकसित करने के लिए Microinjection लक्ष्य करने के लिए तकनीक<em&gt; Xenopus</em&gt; किडनी
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DeLay, B. D., Krneta-Stankic, V.,… More

DeLay, B. D., Krneta-Stankic, V., Miller, R. K. Technique to Target Microinjection to the Developing Xenopus Kidney. J. Vis. Exp. (111), e53799, doi:10.3791/53799 (2016).

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