Abstract
アフリカツメガエル （カエル）の胚腎臓は、前腎は、単一ネフロンから構成されており、腎疾患のモデルとして使用することができる。 アフリカツメガエル胚は、外部開発、大型であり、かつ容易に微量注入または外科的処置によって操作することができます。また、運命のマップは初期のアフリカツメガエル胚のために確立されています。最終的に関心のある器官または組織に上昇を与える個々の割球への標的型マイクロインジェクションは、選択的胚の残りの二次的影響を減少させること、この制限領域内の遺伝子発現を過剰発現またはノックダウンするために使用することができます。このプロトコルでは、我々は4と8細胞胚の特定の割球へのマイクロインジェクションを介して、開発アフリカツメガエルの腎臓（前腎）を、標的とするために設立されたアフリカツメガエルの運命マップを利用する方法について説明します。系統トレーサーの注入は、注入の特異的標的の検証を可能にします。胚は38ステージに開発した後 - 40を、ホールマウント免疫染色は前腎の開発を可視化するために使用され、前腎への標的細胞による寄与を評価することができます。同技術は、前腎に加えて他の組織タイプを標的とするように適合させることができます。
Introduction
アフリカツメガエル胚腎臓、前腎は、腎臓の開発と疾患を研究するための優れたモデルです。胚は、外部開発サイズが大きく、大量に製造することができ、かつ容易に微量注入または外科的処置を介して操作されます。また、哺乳類や両生類における腎臓発生を支配する遺伝子が保存されています。胚両生類は前腎を持っており、大人の両生類は後腎を持っていながら、前腎、中腎、および後腎1：哺乳類の腎臓は三つの段階を経て進行します。これらの腎臓形の基本フィルタリング部はネフロンで、両方の哺乳類や両生類は腎形成2、3を受けるために、同じシグナル伝達カスケードおよび誘導のイベントを必要としている。 アフリカツメガエルの前腎は、近位の単ネフロン、中間遠位端との接続細管が含まれ、 （哺乳動物の糸球体に類似）とグロムス1、4-6（ 図1 アフリカツメガエルの前腎に存在する単一の大きなネフロンは腎臓の開発と疾患過程に関与する遺伝子の研究のための単純なモデルとして、それが適しています。
細胞運命マップは初期のアフリカツメガエル胚のために設立され、Xenbase 7-11オンラインで自由にご利用いただけますされています。同技術は、心臓や目などの他の組織を標的とするように適合させることができるが、ここでは、発展途上アフリカツメガエル前腎を対象とする系統のトレーサーのマイクロインジェクションのための技術が記載されています。リネージュトレーサーは、開発中にその細胞の子孫の可視化を可能にする、初期の割球に注入することができる（生体染色色素を含む、蛍光標識されたデキストラン、組織化学的に検出可能な酵素、およびmRNAは、蛍光タンパク質をコードする）ラベルです。このプロトコルは、系統のトレーサーとして膜対象と赤色蛍光タンパク質12をコードする、MEM-RFPのmRNAを利用しています。対象となるマイクロインジェクション技術ここで説明した4および8細胞胚における個々の割球のためのniquesは、目的の遺伝子を過剰発現するように遺伝子発現、または外因性RNAとをノックダウンするモルフォリノの注射のために利用することができます。腹側、植物割球に注入することにより、主に胚の前腎が発育コントロールとして、対前腎を残して、標的にされるであろう。トレーサーの同時注射は正しい割球を注入し、胚における組織ショーは前腎のターゲティングを検証し、注入された割球から生じたかどうかを確認します。前腎の免疫染色は、前腎細管が標的にされているどれだけの可視化を可能にします。過剰発現およびノックダウン効果は、その後発達対照として胚の反対側に対してスコア付けすることができ、前腎指標13を計算するために使用することができます。細胞運命マップの利用可能性は、この標的マイクロインジェクション技術はOTH組織を標的化するために使用されることを可能にしますえー前腎、および蛍光トレーサーの同時注射よりも、各組織を標的とするマイクロインジェクション分析する前に確認することができます。
胚のマイクロインジェクションの間に、発達の温度はアフリカツメガエルの開発の速度が14に大きく依存することを考えると、厳密に調節されるべきです。開発時間が遅くなるため、4および8細胞注射のために - （16°C 14）胚は低い温度でインキュベートされるべきです。 16で3ステージする°Cの開発時間は約4時間である22℃で、3（4細胞）ステージの段階1（1セル）から現像時間は、約2時間です。これは、22℃で8細胞（ステージ4）胚に4細胞期胚から行くのに約15分かかりますが、16℃で約30分かかります。同様に、22℃で、それだけで16細胞期胚（ステージ5）に進むに8細胞期胚のために30分かかります。この時間は、16℃で45分間に増加されます。ザrefore、胚、16細胞期に進行する前に8細胞期での注射のために十分な時間を可能にするために胚の発達の速度を遅くするのに有用です。腎臓が完全に発達するまでさらに、成長温度、速度または遅い胚発生を調節することができます。
オタマジャクシ期アフリカツメガエル胚の表皮は、郭清または組織15のクリアせずに開発する前腎の容易なイメージングを可能にする、比較的透明です。 アフリカツメガエル胚の相対的な透明度に、ライブセルイメージングはまた、16,17実現可能です。前腎 を可視化するために免疫染色ホールマウント近位にラベルを確立する抗体、ステージの中間、遠位端と接続する細管38で可能です- アフリカツメガエル胚18-20における遺伝子発現の標的操作の後に前腎開発の評価を可能にする40の胚。
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Protocol
以下のプロトコルは、施設ケアと使用委員会（：HSC-AWC-13から135のプロトコル番号）として機能し、実験動物医学動物福祉委員会、のためのヒューストンのセンターでテキサス大学健康科学センターによって承認されています。
腎臓を標的とする注射用の1割球の同定および選択を
- 胚を生成する前に、胚における初期の細胞分裂の方向性を理解するために、アフリカツメガエルの開発21の正常な表を使用しています。 Xenbase 11上のアフリカツメガエルの初期の発達段階の代わりに、アクセス図。
- マイクロインジェクションの対象とされる割球を選択するXenbase 11上のインタラクティブアフリカツメガエル細胞運命のマップにアクセスします。
- 単一細胞胚は暗く着色された動物極と白と卵黄のようなある植物極を、持っていることを確認します。なお、卵黄eとして知られている保護膜、nvelope、胚をカバーしています。
- 最初の切断は、典型的には、胚の左側と右側との間で発生していることに注意してください。これらの細胞は、前腎系統に均等に寄与する。
- 第二の切断は4細胞期胚につながる、胚の背側と腹側の半分を分割することに注意してください。背側細胞が小さく、腹側細胞（ 図2Aおよび図3A）未満の顔料を持っています。
- 左右に、背側よりも発展途上の腎臓に多くを貢献（D;小型、軽量細胞）割球（ 図2A）、腹側割球（大、ダーク細胞V）を特定します。
- 4細胞期胚に注入する場合は、左腎臓（ 図3Aおよび第3節）を標的とするために、左腹側割球を注入します。
- 第三の開裂は、8細胞胚を生じ、動物および植物の側面を二等分します。この時点で、4動物割球[左右の腹があります（V1）と背側（D1）]と4植物腹左右の割球[（V2）と背側（D2）]（ 図2Bおよび図3B）。
- 腹、植物割球（V2）を見つけます。これらの割球は、この段階で、他の細胞（ 図2B）を開発し、腎臓に多くを貢献しています。 8細胞期胚の左腎臓を標的とするために、左V2の割球（ 図3B及び第3項）に注入。
- 第四及び第五の切断は、動物や植物割球を二分することに注意してください。二つの子孫は16細胞期胚を生じ、各割球から生成されます。細胞は、その前身にちなんで命名されています。例えば、8細胞期からV2の割球は、16細胞期（ 図2C）でV2.1とV2.2の子孫を生じさせます。 16細胞期でのV2.2セルは、発展途上の腎臓に貢献する細胞の大部分を提供します。
- （注）第六及び第七の切断は、32セルエンブリーになりますO。ここでも、2子孫は、その前身で、次の名前が付けられ、各割球から生成されています。例えば、16細胞期からV2.2の割球は、32細胞期でのV2.2.1およびV2.2.2を生じさせます。そこ細胞は（植物に動物から）A、B、C、およびDの4行で識別される32細胞期での代替的な命名システムであり、4列に1、2、3、及び4（AS背側から腹側へ）。このように、開発前腎に最も貢献V2.2.2の割球は、この代替ネーミングシステム（ 図2D）の下でC3と呼ばれています。
胚の作製
- Dejelly液（pH 8.0から2パーセントシステイン、NaOHを）の50ミリリットルを準備します。
- 標準的なプロトコル14に従って、単一の男性のカエルからの両方の精巣を分離します。 0.1MのNaCl、2 mMの塩化カリウム、1mMのMgSO 4を、2 mMの、10ミリリットル精巣ストレージソリューション（1×マークの改変リンガー[MMRで満たされた60ミリメートルペトリ皿に精巣を配置CaCl 2、5mMのHEPES pH8の、0.1mMのEDTA] 12、1％ウシ血清アルブミン、50μg/ mlのゲンタマイシン）。 4°Cで睾丸を保管してください。
注： - 4℃で10日間が、受精率が長く精巣が格納されている減少する精巣は約7のために保存することができます。 - 標準的なプロトコル14に従って卵を得るために、女性のカエルを絞ります。 100ミリメートルペトリ皿に卵を収集します。余分な水分をオフに注ぎます。
- それは鉗子やカミソリの刃を使用して、精巣ストレージソリューションでありながら、精巣の1/4をカット。卵を含むペトリ皿に精巣の一部を転送します。精巣が格納されているどのくらいの精巣の大きさを考慮するために使用される精巣部分のサイズを調整し、どのように多くの卵を受精されるべきです。一般的に卵の一方のクラッチを肥やすためにたて解剖精巣の1/3に¼を使用しています。
- 鉗子やカミソリの刃を使用して小片に精巣部分をカットします。十分な0.3XのMMRを追加します。卵をカバーするペトリ皿に+を30mg / mlのゲンタマイシン。ミックスする皿にMMRを旋回。
- 受精は室温で行われるようにするために約30分を待ちます。動物半球（胚の着色された側）が有効受精時に胚の上に座ることに注意してください。そして、トランスファーピペットを用いて、ペトリ皿からMMRを削除します。胚をカバーするために皿に十分なDejellyソリューションを追加します。
- 次の数分間にわたって、静かに断続的に料理を旋回。この時点で皿の激しく振盪は、軸の欠陥を引き起こす可能性があります。 胚上のゼリーコートが溶解し、そして胚が渦巻く中に皿の中央に集まるだろう。胚が密接に皿の中央で互いに接触されると、転送ピペットでDejellyソリューションを削除します。より長い5分間Dejellyソリューションで胚を放置しないでください、または胚が破損する恐れがあります。
- 0.3Xで5回 - dejellied胚3を洗います慎重に注ぐまたはMMRオフピペッティングし、新しいMMRと皿を充填することによってMMRは、+ 30 mg / mlでのゲンタマイシン。皿からMMRのすべてを削除しないでください、または胚が破損する恐れがあります。
- トランスファーピペットを用いて、ペトリ皿から任意の未受精卵や精巣の部分を削除します。
- 14と22℃の間の胚を培養します。
注：より低い温度で成長した胚は、より高い温度で成長した胚よりもゆっくりと開発しています。発達段階のタイミングはXenbase 22で見つけることができます。- その開発外空間に、ペトリ皿内の単一の受精から胚の場所の半分を14℃に維持し、ペトリ皿中の胚の他の半分を18℃に維持しました。これは、単一の受精から4細胞もしくは8細胞胚に注射二組のを可能にします。
注射液および胚のマイクロインジェクションの調製
- 0.01を含む注射液を調製NG / NL膜結合型赤色蛍光タンパク質（MEM-RFP）のmRNA 9胚は4セルまたは8細胞期に開発されています。注射する準備が整うまで氷上で注射液を保管してください。
- プル」800への熱＃2の値を設定します。針プラーケースの上部に揃え交換チューブの上部で、ニードルプラーに交換用ガラス毛細管、および650プレスへのプル値「7のロード「針を引っ張るためのボタン。これは、単一の7から2針を作成する「ガラス毛細管。
- デュモンのピンセットで引っ張っ針の先端をチョキンと切ります。
注意：針を引っ張った後、先端が閉じ封入されていると切り開かなければなりません。それが切断された針のポイントに近い、より小さな直径針の先端になります。先端の直径は、ここで使用されるマイクロインジェクションシステムとの注入量には影響しませんが、大径の先端は、胚を損傷する可能性が高いです。 - メートルスリップ針の背面上にicropipetteコレット。次に、コレットの背後にある針の背面に大きな穴Oリングをスリップ。
- 針で気泡を取得しないように注意しながら、27ゲージの皮下注射針を使用して、鉱物油と針を埋めます。
- プランジャーにインストールされている白いプラスチック製スペーサーの大きな穴に針を座席、マイクロインジェクターのプランジャーの上に針をスリップ。プランジャは白いスペーサー、大きな穴Oリング、およびコレットに続くマイクロインジェクターの身体に最も近い小さなOリングを、持っている必要があります。コレットを締めて、針を固定します。それが適切に確保されていることを確認するために、針をゆっくりと引き出します。
- 2ビープ音がなくなるまで長押しすると、マイクロインジェクターコントロールボックスの「空」のボタンを押し続けます。
- パラフィルムの一部の上に注射液のピペット3μlの。パラフィルム上の注射液のビードに針の先端を挿入します。長押しすると、microiのボタンを「埋める」開催しますnjectorコントロールボックスは、針への注射液を描画します。
- 500ミクロンのポリエステルミリグラム/ mlのゲンタマイシン30 + 0.3XのMMRで5％フィコールとメッシュの裏地付き60ミリメートルペトリ皿を埋めます。皿に30 4細胞もしくは8細胞期胚 - 慎重に20をピペット。
- 髪のループ14を使用して、割球が注入されるように胚を操作すると、針に直面しています。 4細胞胚または8細胞期胚の左側V2の割球の左腹側割球は、針を向くように、左腎臓を標的とするために、胚をラインアップ。
- 皿中の各胚の選択割球に注射液の10 NLを注入します。
注：ペトリ皿の底部にメッシュが胚を安定化し、それらを安定化するためのヘアループを使用せずに注入できるように、圧延するのを防止します。 - 転送は、0.3XのMMR +を30mg / mlのゲンタマイシン、5％フィコールで満たされている培養プレートのウェルに胚を注入しました。注入された胚をインキュベート癒すために注入された割球を可能にするために、少なくとも1時間16℃で秒。
- ステージ9（前原腸形成する）ことにより、0.3XのMMR + 30 mg / mlでのゲンタマイシンで満たされた新しい培養プレートのウェルに癒さ胚を移します。
- 40 21 -胚がステージ38に到達するまで22°C - 14で胚をインキュベートします。
4.固定および胚の免疫染色
- MOPS / EGTA /硫酸マグネシウムを50mlを調製/ホルムアルデヒド緩衝液[MEMFA：100mMのMOPS（pH7.4）中、2mMのEGTA、1mMの硫酸マグネシウム、3.7％（v / v）のホルムアルデヒド]。
- ガラスバイアル中で40胚 - 20段38 - トランスファーピペットを使用して、10を置きます。混合するためにバイアルと反転バイアルに100％エタノールに10μlの5％のベンゾカインを追加します。胚を麻酔するために10分を待ちます。
- ガラスピペットを用いて、バイアルからMMRを削除します。同時に複数のバイアルを処理する場合は、バイアルを24ウェル細胞培養プレート中で直立に保持することができます。
- ガラス管とMEMFAでバイアルを埋めます。室温で1時間、3次元ロッキングプラットフォーム上でバイアルを置きます。
- ガラスピペットを用いて、バイアルからMEMFAを削除します。 100％のメタノールでバイアルを記入してください。室温で10分間、三次元揺動プラットフォーム上でバイアルを置き。この洗浄ステップをもう一度繰り返し、-20℃で100％のメタノールで一晩胚を格納します。
- 調製1×リン酸緩衝生理食塩水、ウシ血清アルブミン、トリトン（PBT）：1×PBS、2ミリグラム/ mlのウシ血清アルブミン、0.1％トリトンX-100。
- 1と10％ヤギ血清と1×PBT：マウスモノクローナル4A6抗体の5希釈（、中間遠位及び連結細管20の膜を標識する）、マウスモノクローナル抗体3G8の午前1時30希釈の一次抗体溶液を準備します（近位尿細管20のラベルの内腔へ）、および1：ウサギポリクローナルRFP抗体の250希釈（MEM-RFPトレーサーを標識します）。 4℃で保存。
- secondaを準備RY抗体溶液：10％ヤギ血清で1×PBT、1：500のAlexa 488ヤギ抗マウスIgG（ストック濃度を2mg / mlで標識4A6及び3G8）は、1：500のAlexa 555ヤギ抗ウサギIgG（ストック濃度2 mg / mlで、MEM-RFPトレーサーを標識します）。光から保護するためにホイルでチューブをカバーし、4℃で保管してください。
- また、染色後の一次および二次抗体を収集し、今後の実験に再利用するために4℃で保存します。抗体は、再利用のために保存される場合、0.01％アジ化ナトリウムを加えます。
- 確立されたプロトコル18を使用して胚を免疫染色。
ターゲット前腎組織の胚および分析5.可視化
- 正しい割球は、1Xでの蛍光実体顕微鏡下でトレーサーの蛍光を見ることにより、注入されたことを確認するために免疫染色した胚を選別（胚全体を表示する）と5X倍率（腎臓を表示します）。我々にマルチウェルガラスプレートに胚を置きますカットオフチップで転送ピペットを用いて1×PBTで満たさLLS。髪のループを持つ胚を操作します。遺伝子の過剰発現やノックダウン分析のための胚の左側に前腎に同時注入トレーサーの存在を持つ胚（ 図3C、Fおよび図4C、F）のみを使用してください。
- ガラスバイアルに胚を配置し、マレーのクリアでバイアルを充填することによって：代わりに、マレーのクリア（1部のベンジルアルコール2部の安息香酸ベンジル）で胚をオフにします。ガラスウェルプレートを使用して胚を視覚化します。
注：マレーのクリアは、有機溶媒であり、取り扱いに注意する必要があります。手袋を着用し、唯一のマレーのクリアでガラスバイアルとピペットを使用しています。 - 3週間 - 2のための1X PBTで4℃で保存胚。胚の長期保存のために、室温で10分間、100％メタノールで2回洗浄することにより、胚を脱水します。 100％メタノール中で-20℃で胚を保管してください。
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Representative Results
MEM-RFP mRNAと4と8細胞アフリカツメガエル胚のマイクロインジェクションは、前腎への標的の異なるレベルを示す。図4に示すステージ正しいMEM-RFPのmRNAの発現パターンを有する40胚を図 。胚は、左の腹側割球（ 図4A）に注入し、MEM-RFPのmRNAの適切な発現パターンのために選別しました。近位にMEM-RFPを発現していることに加えて、中間遠位および腎臓の尿細管を接続し、適切に注入された胚は、頭部、胴体、尾の表皮に蛍光を示すことが期待されています。彼らはまた、耳胞での蛍光、セメント腺、肛門道、および体節（ 図4C）を示すべきです。 8適切に注入された胚の腎臓におけるMEM-RFP蛍光の分布は、蛍光実体顕微鏡（ 図4B）を用いて測定しました。表皮中のMEM-RFP発現レベルが高い胚います腎臓領域の検出は「閉塞」として記録したブロックされました。 MEM-RFP発現は、中間遠位および閉塞したとして採点されなかったすべての胚の細管を接続し、近位で検出されました。ステレオスコープ（ 図4D-F）、共焦点顕微鏡（ 図4G-I）は、3G8および4A6で免疫MEM-RFPおよび腎組織の共局在を確認するために使用されました。共焦点イメージングは、左の腹側割球にMEM-RFPのマイクロインジェクションが正しく腎臓を標的とすることを示す、近位、腎臓の中間、遠位端と接続する細管でMEM-RFPの共局在を検証しました。
8細胞期でMEM-RFP mRNAを注入した胚（ 図5A）は、8細胞注射は腎臓への二次的効果の可能性を低減することを示す、蛍光を表示する組織のより狭い範囲を示しています。 4細胞期に注入した胚と同様に、EMBRヨーヨーは、中間遠位お よび腎臓の尿細管を接続する近位で8細胞期ショーの蛍光、ならびに体節と肛門道（ 図5C-F）で注入しました。 4細胞期に注入した胚とは異なり、セメント腺と耳胞は、MEM-RFPで標識されていません。 10適切に目標と胚のうち、1胚は、ほぼすべての近位尿細管の中にMEM-RFPを示し、図3は、ほぼすべての腎臓（ 図5B）の中間および遠位尿細管の中にMEM-RFPを示しました。 7胚の接続細管の一部はMEM-RFPで標識しました。また、8細胞期に注入した胚の腎臓が可視化が容易であり、そして一つだけを閉塞したとして点数化しました。腎臓を標識MEM-RFPおよび抗体の共局在（3G8および4A6）実体顕微鏡（ 図5D-F）を使用して決定され、共焦点顕微鏡（ 図5G-I）を用いて確認しました。近位、中間、遠位端と接続TU腎臓のbulesは8細胞期に注入した胚でMEM-RFPで標識した4セルで左腹側割球に注入された胚よりも少ない組織で蛍光を表示しながら、V2の割球の注入を目標と実証は、腎臓にラベルを付けますステージ。
このアッセイは、マイクロインジェクションによって標的とされた組織を示すために、トレーサーとして、蛍光タグ付けされたmRNAを使用しています。分析前に一貫性トレーサーの局在化のための胚を選別することが重要である、と予想されるトレーサーの分布パターンを表示しないように任意の胚を破棄しなければならない。6が誤っでMEM-RFPのmRNAの標的とされたステージ40胚の例を示します4細胞期。 MEM-RFPのmRNA発現は、胚の代わりに左側（ 図6A）の右側に配置されています。また、mRNA発現のほとんどはで、下部胴体尾の皮膚であります体節に少し表情。いいえmRNA発現は、腎臓の不適切なターゲティングを確認し、近位、中間、遠位端と接続細管（ 図6B）に見られません。したがって、この胚は、分析のために使用すべきではありません。
図1：ステージ35 アフリカツメガエル胚の腎臓のアフリカツメガエル 胚性腎臓ダイアグラム、近位、中間、先端を示す、と細管を接続します。 Raciti らに基づきます。 （2008年）6。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
図2：Xenopusの胚運命マップ。フェイトマップが開発前腎に貢献割球を特定し、命名。 4細胞期胚のA）運命マップ。 B）8細胞期胚の運命マップ。 16細胞期胚のC）運命マップ。 32細胞期胚のD）運命マップ。 32細胞期胚の割球は、代替割球のネーミングシステムを用いて標識されます。ムーディ（1987）8、9とムーディとクライン（1990）に基づいて、運命のマップ7。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
図 3： アフリカツメガエル 前腎を ターゲットとするための注入スキームは、赤矢印は細胞が注入することを示しています。 A）動物および4細胞期胚の腹側のビューは、左腹側Bの注入を示します左の前腎をターゲットにするlastomere。赤い矢印は左腹側割球を示しています。 B）動物と左前腎を標的とするために、左のV2割球の注入を示す8細胞期胚の腹側の景色。赤い矢印は左V2の割球を示しています。 AB）4Xの倍率でステレオスコープで撮影した胚の画像。ムーディ（1987）8、9によって開発されたアフリカツメガエルの運命マップに基づいて、注射剤とムーディとクライン（1990）7。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
図4：4 細胞期を対象胚の例として免疫染色段階トレーサーとしてMEM-RFPのmRNAを用いて、4細胞期で左前腎への標的注入を示す40 アフリカツメガエル胚。 MEM-RFPラベル赤血球膜。 A）4細胞期胚の左腹側割球にMEM-RFPのmRNAの略図で注入。適切に注入された胚の腎臓におけるMEM-RFP蛍光のB）組織局在。 C）はステージ40胚は4細胞期で左腹側割球内MEM-RFPを注射しました。腎臓が緑色のラベル付けされている間MEM-RFPの局在化は、赤色で示されています。 1X倍率。 D）腎臓近位尿細管の内腔にラベルを付けるために3G8で染色し、4A6は、中間遠位及び連結細管内の細胞の膜を標識します。 5X倍率。 MEM-RFPの局在を示す腎臓超える地域のE）拡大。 5X倍率。 F）腎臓とMEM-RFPトレーサーの共局在を示す画像を吸収合併。 5X倍率。ステレオスコープにオリンパスDP71カメラで撮影した胚のCF）画像。 G）3G8および4A6で染色された第二の胚の腎臓の共焦点画像。 H）腎臓におけるMEM-RFPの局在と周囲の組織。 I）マージされた画像笙腎臓におけるMEM-RFP、3G8、および4A6の翼共局在。 GI）20X倍率で最大投影を使用して共焦点画像は、この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
図5：8 細胞期を対象胚の例として免疫染色段階トレーサーとしてMEM-RFPのmRNAを用いて、8細胞期で左前腎への標的注入を示す40 アフリカツメガエル胚。 MEM-RFPは細胞膜は赤ラベル。 8細胞期胚の左側V2の割球へのMEM-RFPのmRNAのA）を示す概略図注射。適切に注入された胚の腎臓におけるMEM-RFP蛍光のB）組織局在。 C）40胚が8細胞期で左V2の割球にMEM-RFPを注射したステージ。 MEM-RFP局在化が示されています赤で、腎臓が緑色のラベル付けされています。 1X倍率。 D）腎臓近位尿細管の内腔にラベルを付けるために3G8で染色し、4A6は、中間遠位及び連結細管内の細胞の膜を標識します。 5X倍率。 MEM-RFPの局在を示す腎臓超える地域のE）拡大。 5X倍率。 F）腎臓とMEM-RFPトレーサーの共局在を示す画像を吸収合併。 5X倍率。ステレオスコープにオリンパスDP71カメラで撮影した胚のCF）画像。 G）3G8および4A6で染色された第二の胚の腎臓の共焦点画像。 H）腎臓におけるMEM-RFPの局在と周囲の組織。 I）腎臓にMEM-RFP、3G8、および4A6の共局在を示す画像を吸収合併。 GI）20X倍率で最大投影を使用して撮影した共焦点画像。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
図6：胚の例が誤っ4細胞期を対象とした免疫染色ステージ40アフリカツメガエル胚は、トレーサーとしてMEM-RFPのmRNAを用いて、4細胞期で左前腎の不正なターゲティングを示します。 MEM-RFPは細胞膜は赤ラベル。誤った割球への注入を示すMEM-RFPの不適切な分布を示すA）ステージ40胚。誤った割球への注入を示す誤ったトレーサ分布を有することに加えて、この胚は右側に注射しました。 1X倍率。 B）腎臓（3G8、4A6）を標識する抗体とMEM-RFPの共局在の欠如を示す、腎臓の画像を吸収合併。 5X倍率。ステレオスコープで撮影した胚のAB）イメージ。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
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Discussion
アフリカツメガエル胚の開発の前腎を標的とすることは識別し、正しい割球を注入することに依存しています。 8細胞胚のV2の割球の注入は、左の前腎18を対象としています。これは、内部コントロールとして、反対側の右側前腎を残します。モルホリノは、ノックダウンまたはRNAの過剰発現は、腎臓の発達を変更するために使用されている場合、反対側の右側前腎は、左側前腎の遺伝子ノックダウンまたは過剰発現の効果を比較するために使用することができます。この場合には、そのようなミスマッチ対照モルホリノまたはドミナントネガティブRNA構築などの適切なコントロールは、遺伝子発現の変化の結果を分析するために反対側の内部統制に加えて使用する必要があります。 アフリカツメガエル胚の相対的な透明性、腎臓欠陥が簡単に複数の技術を使用して定量することができます。例えば、遺伝子ノックダウンまたは過剰発現は、単に、胚の前腎指数を計算することによって定量することができます胚の注入と制御側に近位尿細管の開発を比較する抗体3G8 13、で免疫染色。前腎 発達を研究することに加えて、この技術は、容易に確立された運命マップを7-10を使用して注入するための適切な割球を選択することによって他の組織を標的とするように適合させることができます。他の組織タイプを標的とすることに加えて、このプロトコルは、異なる段階で腎臓発達を研究するために使用することができます。このプロトコルは段階で分化した腎組織を検出する抗体3G8および4A6で染色した40胚を、見ました。若い胚は異なる腎臓抗体で免疫染色し、またはin situハイブリダイゼーション5、6、20 でにかけることができます。例えば、抗体LIM1は開発前腎21、22を検出することができる。同様に、LIM1、pax8、およびhnf1-β転写物がすることができます段階12.5 22-24で始まるin situハイブリダイゼーションと検出in situハイブリダイゼーションマーカーの後、他のは、後の発達段階で腎臓の異なる領域を検出するために使用され得ます。例えば、それぞれ、グロムス、遠位連結細管、近位尿細管、全体腎臓でNPHS1の発現、clckb、slc5a1、及びatp1a1を検出するように設計されたプローブは、25、5、26、27に記載されている。腎臓の評価異なる抗体を使用して複数の段階にわたって、又はin situ分析は、治療は、腎臓の開発を変更する方法のよりよい理解を可能にします。
このプロトコルの1つの重要な側面は、注入されるための正しい選択と割球の同定です。このプロトコルでは、我々は8細胞期胚または4細胞胚の左腹側割球の左V2の割球を注入することにより、前腎をターゲットにする方法について説明します。誤った割球が注入されている場合は、前腎は正確に標的されません。したがって、マイクロインジェクション前28、29への早期アフリカツメガエル胚の開発と細胞劈開面に精通することが重要です。それは初期のセル切断が見ているだけ注入した胚に便利ですので、胚の切断は常に、確立された発達段階チャートに従っていません「正常」と適切な割球を容易に識別することができます。これは、不適切に標的にされた胚の数が減少します。また、胚の割球は、注射時に完全に分割するためにも重要です。 8細胞期胚の割球V1とV2との間の切断はマイクロインジェクションの前に完了していない場合たとえば、トレーサーはV1と同様にV2に拡散する可能性があります。これは、マイクロインジェクションの標的化効率を低下させるであろう、そして得られた胚、4細胞期ではなく、8細胞期胚に注入するとより似トレーサー分布を表示することができます。
アンこのプロトコルの他の重要な部分は、前腎が適切にマイクロインジェクションにより標的とされたことの検証です。前腎が正常にターゲットに持っていなかった胚は、得られたデータセットをゆがめる可能性があるので、これは、前に前腎発展を分析するに行わなければなりません。適切なターゲティングを確認するには、各注入された胚におけるトレーサーの分布を分析します。胚の注入（左）側は、蛍光トレーサーの大半を表示する必要があります。胚のコントロール（右）側は蛍光のかなりの量を示している場合、この胚を破棄しなければなりません。この問題が発生した場合、誤った割球を注入した、または注入された割球は、注射の前に切断された完了していなかったのどちらか。第二に、胚の注入（左）側の蛍光が正しく前腎をターゲットにする必要があります。胚を背側と腹側体節、側板、後腸、肛門道、8細胞期で注入した場合は、トランク内のトランクと神経堤の皮膚は、インフルエンザを示すことが期待されています前腎6、29に加えてorescence。8細胞注入のために列挙した組織に加えて、4細胞期に注入された胚が広く、皮膚や体節における蛍光トレーサーの分布と同様の標的を持つべきですセメント腺、耳胞、レンズと嗅板。胚は、適切な組織ターゲッティングが表示されない場合は、分析の前（ 図5）に破棄されるべきです。
このプロトコルに記載標的注入は、所望の組織における遺伝子発現を操作する手段を提供します。この技術の限界は、これらの注射が対象とされているが、彼らは唯一の開発、腎臓に影響を与えないということです。この技術で説明4及び8細胞注射半分の遺伝子発現は、全胚で変更され、注射剤は、2細胞期で行わ単細胞段階で行わ注射、より標的化されます胚が表示され変更された遺伝子急行イオン。彼らは、しかし、唯一の組織を標的としません。 4細胞胚、8細胞胚のV2の割球の腹側割球内注射は、前腎における遺伝子発現を変化させるが、それらはまた、他の組織における遺伝子発現を変化させます。他の影響を受けた組織は、皮膚、体節、腸、および神経堤が含まれます。したがって、4と8細胞注射が1つまたは2つの細胞の注射よりもよりターゲットを絞っているが、彼らはまだ複数の組織における遺伝子発現を変化させることを理解することが重要です。 4および8細胞段階で胚を注入することに加えて、注射はまた、2-、16-、及び32細胞段階で行うことができます。 2細胞期に注入した胚は、後期に注入された胚よりも、影響を受けた組織のより広い範囲を持っています。より技術的に困難なものの、16および32細胞段階で注入した胚は、4と8細胞期に注入した胚よりも、影響を受けた組織の狭い範囲を持つことになります。
MEM-RFP系譜トレースrはマイクロインジェクション後に、適切なターゲティングを確認するために、このプロトコルで使用されています。 MEM-RFPのmRNAは、細胞が注入されたRNAからタンパク質を翻訳した後、細胞膜を標識します。胚の死とトレーサー蛍光の所望の強度を考慮するために、必要に応じて、このプロトコル（10 nlの注入でMEM-RFPのmRNAの0.1 ngの）で使用されるMEM-RFP系統トレーサーの濃度を変更する必要があります。注入された系統のトレーサーの量を変更することに加えて、そのようなローダミン - デキストラン、量子ドット、または組織化学的に検出可能なβガラクトシダーゼなどの異なる系統のトレーサーは、代わりに、MEM-RFPを用いてもよいです。リネージュトレーサーは、胚が発達するにつれて減少する蛍光のレベルを引き起こし、細胞が分裂として、より希薄になります。この技術の追加のアプリケーションは、過剰発現または目的の遺伝子の発現をノックダウンするために系統トレーサーと外因性RNAまたはモルホリノを同時注入することです。系統のトレーサーは前腎の正しいターゲティングを検証するために使用されるのではなく、同時注入外因性RNAまたはモルホリノが胚に局在する場所を示します。外因性RNAおよびモルフォリノは、潜在的トレーサーではなく、外因性RNAまたはモルホリノ現在30を持って娘細胞で、その結果、同時注入トレーサーと同じ速度で注入された割球を介して拡散しないことがあります。実際に、我々は、単一のセルに注入二つの異なるRNA構築物は、必ずしも共局在（未発表データ）を行うことを観察しました。そのため、細胞内のトレーサの存在は、必ずしも同時注入外因性RNAまたはモルホリノは常にその細胞内に存在することを示すものではありません。
このプロトコルは、 アフリカツメガエル胚の開発の前腎を生じさせる割球へのマイクロインジェクションを標的化するための手順を詳しく説明します。遺伝子発現は、多くの場合、一次元に注入した場合、または原因の早期発生異常を防ぐことができますどちらも、モルフォリノまたは外因性RNAの注入によりアフリカツメガエル胚で操作されます2細胞胚。胚の細胞の全てに単一細胞期展示ノックダウンまたは過剰発現に注入された胚。遺伝子は、適切な初期発生過程のために必要であるならば、胚は前腎を発症しないことがあります。そのようなここでは詳述8細胞注射など後期に行わ注射は、原腸形成および最終的な前腎開発18を受ける胚をもたらすことができます。したがって、ここで議論対象と注射は、胚は前腎の開発を経て進行することができ、いくつかの遺伝子の発現の変化によって引き起こされる原腸形成の欠陥を克服することができます。今後は、このプロトコルはまた、所望の割球へのCRISPR構築物を標的化するために使用されてもよいです。
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Acknowledgments
この作品は、テキサス大学のマクガバン医学部小児科から健康NIDDK助成金（K01DK092320）とスタートアップ資金の国立研究所によってサポートされていました。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Sodium chloride | Fisher | S271-3 | |
| Potassium chloride | Fisher | P217-500 | |
| Magnesium sulfate | Fisher | M63-500 | |
| Calcium chloride | Fisher | C79-500 | |
| HEPES | Fisher | BP310-500 | |
| EDTA | Fisher | S311-500 | |
| Gentamycin solution, 50 mg/ml | Amresco | E737-20ML | |
| L-Cysteine, 99%+ | Acros Organics | 52-90-4 | |
| Ficoll | Fisher | BP525-100 | |
| 100 mm x 15 mm Petri dish | Fisher | FB0875712 | |
| Mini Fridge II | Boekel | 260009 | Benchtop incubator for embryos. |
| Gap43-RFP plasmid | For making tracer RNA. Ref: Davidson et al., 2006. | ||
| Rhodamine dextran, 10,000 M.W. | Invitrogen | D1817 | Tracer. |
| Molecular biology grade, USP sterile purified water | Corning | 46-000-CI | |
| 7" Drummond replacement tubes | Drummond | 3-000-203-G/XL | Microinjection needles. |
| Needle puller | Sutter Instruments | P-30 | |
| Fine forceps | Dumont | 11252-30 | For breaking microinjection needle tip. |
| Nanoject II | Drummond | 3-000-204 | Microinjector. |
| Mineral oil, heavy | Fisher | CAS 8042-47-5 | Oil for needles. |
| 27 G Monoject hypodermic needle | Covidien | 8881200508 | For loading mineral oil into microinjection needle. |
| 5 ml Luer-Lok syringe | BD | 309646 | For loading mineral oil into microinjection needle. |
| 60 mm x 15 mm Petri dish | Fisher | FB0875713A | |
| 800 micron Polyester mesh | Small Parts | CMY-0800-C | |
| Transfer pipets | Fisher | 13-711-7M | For transferring embryos. Cut off the tip so that the embryos are easily taken up by the pipette. |
| 6-well cell culture plate | Nest Biotechnology | ||
| MOPS | Fisher | BP308-500 | |
| EGTA | Acros Organics | 67-42-5 | |
| Formaldehyde | Fisher | BP531-500 | |
| 15 mm x 45 mm Screw thread vial | Fisher | 03-339-25B | For fixing, staining, and storing embryos. |
| 24-well cell Culture plate | Nest Biotechnology | ||
| Benzocaine | Spectrum | BE130 | |
| Ethanol | Fisher | BP2818-4 | |
| Methanol | Fisher | A412-4 | |
| Phosphate buffered saline (PBS) 1x powder | Fisher | BP661-50 | |
| Bovine serum albumen | Fisher | BP1600-100 | |
| Triton X-100 | Fisher | BP151-500 | |
| 3D Mini rocker, model 135 | Denville Scientific | 57281 | |
| Goat serum, New Zealand origin | Invitrogen | 16210064 | |
| Sodium azide | Fisher | S227I-25 | |
| Monoclonal 3G8 antibody | European Xenopus Resource Centre | Primary antibody to label proximal tubules. | |
| Monoclonal 4A6 antibody | European Xenopus Resource Centre | Primary antibody to label intermediate, distal and connecting tubules. | |
| anti-RFP pAb, purified IgG/rabbit | MBL | PM005 | Primary antibody to label Gap43-RFP tracer. |
| Alexa Fluor 488 goat anti-mouse IgG | Life Technologies | A11001 | Secondary antibody to label kidney tubules. |
| Alexa Fluor 555 goat anti-rabbit IgG | Life Technologies | A21428 | Secondary antibody to label Gap43-RFP tracer. |
| 9 Cavity spot plate | Corning | 7220-85 | |
| Benzyl benzoate | Fisher | 105862500 | Optional - for clearing embryos |
| Benzyl alcohol | Fisher | A396-500 | Optional - for clearing embryos |
References
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