Abstract
Den embryoniske nyre fra Xenopus laevis (frog), de pronephros, består af et enkelt nephron, og kan anvendes som en model for nyresygdom. Xenopus embryoner er store, udvikle eksternt, og kan nemt manipuleres ved mikroinjektion eller kirurgiske procedurer. Desuden er der etableret skæbne kort for tidlige Xenopus embryoner. Målrettet mikroinjektion i den enkelte blastomer, som til sidst vil give anledning til et organ eller væv af interesse, kan anvendes til selektivt overudtrykke eller vælte genekspression under denne begrænset område, faldende sekundære virkninger i resten af det udviklende foster. I denne protokol, beskriver vi, hvordan man udnytter etablerede Xenopus skæbne kort til at målrette udviklingen af Xenopus nyre (de pronephros), gennem mikroinjektion i specifikke blastomer af 4- og 8-celle embryoer. Injektion af slægt sporstoffer tillader kontrol af specifik målretning af injektionen.Efter embryoner har udviklet til at iscenesætte 38-40, hel-mount immunfarvning bruges til at visualisere pronephric udvikling, og kan vurderes bidraget med målrettede celler til pronephros. Den samme teknik kan tilpasses til at målrette andre vævstyper i tillæg til de pronephros.
Introduction
Xenopus embryoniske nyre, de pronephros, er en god model til undersøgelse af nyre udvikling og sygdom. Embryonerne udvikler eksternt, er store i størrelse, kan produceres i store antal, og er let manipuleres gennem mikroinjektion eller kirurgiske procedurer. Desuden er generne for nyre udvikling i pattedyr og padder bevares. Pattedyr nyrer fremskridt gennem tre faser: de pronephros, mesonephros og metanephros 1, mens embryonale padder har en pronephros og voksne padder har en metanephros. Den grundlæggende filtrering enhed af disse nyre former er nephron, og begge pattedyr og padder kræver de samme signalering kaskader og induktive begivenheder til at gennemgå nephrogenesis 2, 3. De Xenopus pronephros indeholder en enkelt nephron består af proksimale, mellemliggende, distal og tilslutning tubuli, og en glomus (analog med den mammale glomerulus) 1, 4-6 (figur 1 Xenopus pronephros gør den velegnet som en simpel model til undersøgelse af gener involveret i nyre udvikling og sygdomsprocesser.
Cell skæbne maps er blevet etableret for tidlige Xenopus embryoner, og er frit tilgængelige online på Xenbase 7-11. Her beskriver vi en teknik til mikroinjektion af afstamning sporstoffer at målrette udviklingslandene Xenopus pronephros, selvom den samme teknik kan tilpasses til at målrette andre væv, såsom hjerte eller øjne. Lineage sporstoffer er etiketter (herunder vitale farvestoffer, fluorescensmærkede dextraner, histokemisk detekterbare enzymer og mRNA, der koder fluorescerende proteiner), der kan injiceres i en tidlig blastomer, tillader visualisering af afkommet af denne celle under udvikling. Denne protokol udnytter MEM-RFP-mRNA, der koder for membran målrettet rødt fluorescerende protein 12 som en slægt sporstof. Den målrettede mikroinjektion technikker for individuelle blastomerer i 4- og 8-celle embryoer her beskrevne kan anvendes til injektion med morpholinos at vælte genekspression, eller med eksogent RNA at overudtrykke et gen af interesse. Ved indsprøjtning i den ventrale, vegetabilsk blastomer, primært pronephros af embryo vil blive målrettet, forlader kontralaterale pronephros som en udviklingsmæssig kontrol. Co-injektion af et sporstof kontrollerer, at den korrekte blastomer blev injiceret, og viser, hvilke væv i fosteret opstod fra den injicerede blastomer, verificere målretning af de pronephros. Immunfarvning af de pronephros tillader visualisering af, hvor godt de pronephric tubuli er målrettet. Overekspression og Knockdown effekter kan derefter scorede mod den kontralaterale side af embryo, der tjener som en udviklingsmæssig kontrol, og kan bruges til at beregne den pronephric indeks 13. Tilgængeligheden af celle skæbne maps tillader det målrettede mikroinjektion, der skal anvendes til at målrette væv OTHis end pronephros og co-injektion af et fluorescerende sporstof tillader målrettet mikroinjektion til hver væv, der skal verificeres inden analyse.
Under embryo mikroinjektion, bør udviklingsmæssige temperatur reguleres stramt, da antallet af Xenopus udvikling er meget afhængig af det 14. Embryoner skal inkuberes ved køligere temperaturer (14-16 ° C) i 4 og 8-celle injektioner, fordi udviklingstiden bremses. Ved 22 ° C, udviklingstid fra trin 1 (1 celle) til fase 3 (4-celler) er ca. 2 timer, mens ved 16 ° C udviklingstid til fase 3 er ca. 4 timer. Det tager ca. 15 minutter at gå fra en 4-celle embryon til en 8-celle (trin 4) embryo ved 22 ° C, men tager cirka 30 minutter ved 16 ° C. Tilsvarende ved 22 ° C, det tager kun 30 minutter for en 8-celle foster at gå videre til en 16-celle embryo (fase 5). Denne gang er forøget til 45 minutter ved 16 ° C. DetDerfor indgår, er det nyttigt at bremse udviklingen hastigheden af embryonerne at muliggøre tilstrækkelig tid til injektioner på 8 celler fase før embryonerne videre til det 16-celle stadiet. Derudover kan temperaturen vækst moduleres til at fremskynde eller forsinke fosterudviklingen, indtil nyrerne har fuldt udviklet.
Epidermis af haletudse-trins Xenopus embryoer er forholdsvis gennemsigtig, giver mulighed for nem billeddannelse af udviklingslandene pronephros uden dissektion eller clearing af vævet 15. På grund af den relative gennemsigtighed Xenopus embryoer, levende celler er også muligt 16,17. Whole-mount immunfarvning at visualisere pronephros er muligt med etablerede antistoffer, som mærker den proksimale, mellemliggende, distal og forbinder tubuli af fase 38 - 40 embryoner, der giver mulighed for vurdering af pronephric udvikling efter målrettet manipulation af genekspression i Xenopus embryoer 18-20.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Følgende protokol er godkendt af University of Texas Health Science Center på Houstons Center for Laboratory Animal Medicine Trivsel udvalg, der tjener som Institutional Care og brug Udvalg (protokol #: HSC-AWC-13-135).
1. Identifikation og udvælgelse af blastomererne for Nyre målrettet Injektioner
- Forud for at generere embryoner, bruge Normal Table of Xenopus Development 21 at forstå orienteringen af de tidlige celledelinger i embryoet. Alternativt adgang diagrammer over de tidlige udviklingsstadier af Xenopus på Xenbase 11.
- Få adgang til de interaktive Xenopus celle skæbne kort på Xenbase 11 for at vælge hvilken blastomer vil blive målrettet til mikroinjektion.
- Bemærk at den enkelt celle embryon har en mørkt pigmenteret dyr stang og en vegetabilske stang, som er hvid og yolky. Bemærk, at en beskyttende membran, kendt som vitelline envelope, dækker fosteret.
- Bemærk, at den første spaltning forekommer typisk mellem venstre og højre side af fosteret. Disse celler bidrager lige meget til pronephric afstamning.
- Bemærk, at den anden spaltning opdeler den dorsale og ventrale halvdele af embryonet, hvilket fører til en 4-celle embryon. Den dorsale celler er mindre og har mindre pigment end de ventrale celler (figur 2A og figur 3A).
- Identificer de ventrale blastomeres (V; de store, mørke celler) på venstre og højre side, som bidrager mere til udviklingslandene nyre end dorsale (D; små, lette celler) blastomerer (figur 2A).
- Hvis indsprøjtning i en 4-celle embryon, injicere venstre ventrale blastomer at målrette venstre nyre (figur 3A og afsnit 3).
- Den tredje spaltning halverer siderne animalske og vegetabilske, hvilket resulterer i en otte-celle embryon. På dette tidspunkt er der fire dyr blastomerer [venstre og højre ventrale(V1) og dorsal (D1)] og fire vegetabilske blastomerer [venstre og højre ventrale (V2) og dorsal (D2)] (figur 2B og figur 3B).
- Find de ventrale, vegetabilske blastomerer (V2). Disse blastomererne bidrage mere til udviklingen af nyrerne andre celler i denne fase (figur 2B). For at målrette den venstre nyre af en 8-celle embryon, tilføre den venstre V2 blastomer (figur 3B og afsnit 3).
- Bemærk, at fjerde og femte spaltninger gennemskære blastomererne Animalsk og vegetabilsk. To afkom genereres fra hver blastomer, hvilket resulterer i en 16-celle embryon. Cellerne er opkaldt efter deres forgænger. For eksempel V2 blastomer fra 8 celler fase giver anledning til V2.1 og V2.2 afkom ved 16-celle-stadium (figur 2C). Den V2.2 celle ved 16-celle stadiet tilvejebringer hovedparten af cellerne, der bidrager til udviklingen af nyren.
- Bemærk det sjette og syvende spaltninger resulterer i en 32-celle Embryo. Igen er to afkom genereres fra hver blastomer, som er navngivet efter deres forgænger. For eksempel V2.2 blastomer fra 16-celle stadium giver anledning til V2.2.1 og V2.2.2 ved 32-celle stadiet. Der er et alternativ navngivningssystem ved 32-celle stadium, hvor celler identificeres i fire rækker som A, B, C og D (fra dyr til vegetabilsk), og i fire kolonner som 1, 2, 3, og 4 ( fra dorsal til ventral). Således V2.2.2 blastomer, som bidrager mest til udviklingslandene pronephros, kaldes C3 under denne alternative navnesystem (figur 2D).
2. Fremstilling af embryoer
- Forbered 50 ml Dejelly Solution (2% cystein, NaOH til pH 8,0).
- Isoler begge testikler fra en enkelt mandlige frog overensstemmelse med standardprotokoller 14. Placer testiklerne i en 60 mm petriskål fyldes med 10 ml Testes Storage Solution (1x Marc Modified Ringers [MMR; 0,1 M NaCl, 2 mM KCI, 1 mM MgSO4, 2 mMCaCl2, 5 mM HEPES pH 8, 0,1 mM EDTA] 12, 1% bovint serumalbumin, 50 ug / ml gentamycin). Opbevar testiklerne ved 4 ° C.
Bemærk: Testikler kan opbevares i ca. 7 - 10 dage ved 4 ° C, men gødskningseffektiviteten vil mindske længere testiklerne er blevet gemt. - Klem en kvindelig frog at opnå æg i overensstemmelse med standard protokoller 14. Indsamle æg i en 100 mm petriskål. Hæld overskydende vand.
- Afskære ¼ testis, mens den er i Testes Storage Solution ved hjælp af pincet og et barberblad. Overfør stykke testis til petriskålen indeholder æg. Justere størrelsen af testiklerne del, der bruges til grund for størrelsen af testiklerne, hvor længe testiklerne er blevet lagret, og hvor mange æg skal befrugtes. Generelt bruger ¼ til 1/3 af en frisk dissekeret testikel at befrugte en kobling af æg.
- Skær testis del i små stykker ved anvendelse af pincetter og et barberblad. Tilføj nok 0.3x MMR+ 30 mg / ml gentamycin til petriskålen for at dække æggene. Swirl MMR i skålen for at blande.
- Vent ca 30 min til befrugtning kan finde sted ved stuetemperatur. Bemærk, at dyret halvkugle (den pigmenterede side af embryo) vil sidde på toppen af embryoet på effektiv befrugtning. Fjern derefter MFR fra petriskålen ved anvendelse af en overførsel pipette. Tilføj nok Dejelly Løsning på fadet at dække embryoner.
- I løbet af de næste par minutter, forsigtigt hvirvel fadet med mellemrum. Kraftig omrystning af skålen på dette tidspunkt kan forårsage akse defekter. Den gelé frakke på fostrene vil opløse, og embryoner vil samles i midten af fadet under hvirvlende. Når embryonerne nøje røre hinanden i midten af skålen, fjerne Dejelly Solution med en overførsel pipette. Efterlad ikke embryoner i Dejelly løsning i mere end 5 minutter, eller embryonerne kan blive beskadiget.
- Vask dejellied embryoner 3 - 5 gange i 0.3xMMR + 30 mg / ml gentamycin ved forsigtigt at hælde eller pipettering fra MFR og fylde skålen med nye MMR. Fjern ikke alle MFR fra fadet, eller embryonerne kan blive beskadiget.
- Fjern eventuelle ubefrugtede æg eller stykker af testis fra petriskålen ved anvendelse af en overførsel pipette.
- Inkuber embryoner mellem 14 og 22 ° C.
Bemærk: Embryoner dyrket ved lavere temperaturer udvikles langsommere end embryoner dyrket ved højere temperaturer. Timing af udviklingsstadier kan findes på Xenbase 22.- Til rummet ud deres udvikling, sted halvdelen af embryonerne fra en enkelt befrugtning i en petriskål holdt ved 14 ° C, og den anden halvdel af embryonerne i en petriskål holdt ved 18 ° C. Dette giver mulighed for to sæt af injektioner i 4-celle- eller 8-celle embryoer fra en enkelt befrugtning.
3. Udarbejdelse af Injection Solutions og Mikroinjektion af embryoner
- Forbered injektionsopløsningen indeholdende 0,01ng / nl membranbundet rødt fluorescerende protein (MEM-RFP) mRNA 9, mens de befrugtede æg udvikler til 4-celle eller 8-celle stadiet. injektionsopløsningen på is Opbevar indtil den er klar til at injicere.
- Læg en 7 "udskiftning glas kapillarrør i en nål aftrækker, med toppen af udskiftning midtpunkt rettet ind efter toppen af nålen aftrækker tilfældet. Sæt varmen # 2 værdi til 800, og pull værdi til 650. Tryk på" pull "for at trække nålen. Dette vil skabe 2 nåle fra en enkelt 7" glas kapillarrør.
- Afskæringstud spidsen af en forstrakt nål med et par Dumont pincet.
Bemærk: Efter at trække nålen er spidsen forseglet lukket og skal skæres åben. Jo tættere på spidsen af nålen, at den skæres, jo mindre diameter nålespidsen vil være. Selvom diameteren af spidsen ikke vil påvirke injektionsvolumen med mikroinjektion systemet bruges her, en spids med en større diameter er mere tilbøjelige til at beskadige embryoet. - Slip den micropipette spændetang på bagsiden af nålen. Dernæst sættes de stort hul O-ring på bagsiden af nålen bag spændetangen.
- Fyld nålen med mineralolie ved hjælp af en 27 gauge kanyle, pas på ikke at få luftbobler i nål.
- Sæt nålen ind på stemplet i mikroinjektor, siddepladser nålen ind i den store hul af den hvide plastik spacer installeret på stemplet. Stemplet bør have en lille O-ring nærmest kroppen af mikroinjektor, efterfulgt af hvide spacer, stort hul O-ring, og spændetang. Fastgør nålen ved at stramme patronen. Træk forsigtigt på nålen for at sikre, at det sidder ordentligt fast.
- Tryk og hold "tomme" -knappen på mikroinjektor kontrolboks til der er to bip.
- Pipetter 3 pi af injektionsopløsning på et stykke Parafilm. Sæt spidsen af nålen i perlen injektionsopløsning på Parafilm. Tryk og hold "fylde" knappen på microinjector kontrolboks at trække injektionsopløsningen ind i nålen.
- Fyld en 60 mm petriskål foret med 500 micron polyester mesh med 5% Ficoll i 0.3x MMR + 30 mg / ml gentamycin. pipettere forsigtigt 20 - 30 4-celle eller 8-celle embryoer i fadet.
- Ved hjælp af en hår sløjfe 14, manipulere embryoner således at blastomer skal injiceres vender nålen. For at målrette den venstre nyre, linje op embryoner, så den venstre ventrale blastomeres af 4-celle embryoer eller venstre V2 blastomeres af 8-celle embryoer står nålen.
- Injicer 10 nl af injektion løsning i det valgte blastomer af hver embryo i skålen.
Bemærk: Masken i bunden af petriskålen stabiliserer embryoner og forhindrer dem i at rulle, så de kan injiceres uden anvendelse af et hår løkke til stabilisering. - Overførsel injicerede embryoner i brønde i en kultur, plade, der er blevet fyldt med 5% Ficoll i 0.3x MMR + 30 mg / ml gentamycin. Inkubér den injicerede embryons ved 16 ° C i mindst en time, så de injicerede blastomeres at helbrede.
- Overfør helede embryoner i brønde i en ny kultur plade, der er blevet fyldt med 0.3x MMR + 30 mg / ml gentamycin ved trin 9 (før gastrulation).
- Inkubér embryoer ved 14 - 22 ° C, indtil embryonerne nå trin 38 - 40 21.
4. Fastgørelse og immunfarvning af embryoer
- Forbered 50 ml MOPS / EGTA / Magnesiumsulfat / Formaldehyd Buffer [MEMFA: 100 mM MOPS (pH 7,4), 2 mM EGTA, 1 mM MgSO4, 3,7% (vol / vol) formaldehyd].
- Ved hjælp af en overførsel pipette, sætte 10 - 20 trin 38 - 40 embryoner i et hætteglas. Tilsæt 10 pi 5% benzocain i 100% ethanol til hætteglasset og invertsukker hætteglas blandes. Vent 10 min til bedøve embryoner.
- Fjern MFR fra hætteglasset ved anvendelse af en glaspipette. Hvis behandling af flere hætteglas på samme tid, kan hætteglassene holdes oprejst i en 24-brønds celledyrkningsplade.
- Med et glasrørtte, fylde hætteglasset med MEMFA. Placer hætteglasset på en tredimensional vippeplatform i 1 time ved stuetemperatur.
- Fjern MEMFA fra hætteglasset ved anvendelse af en glaspipette. Fyld hætteglasset med 100% methanol. Placer hætteglasset på en tredimensional vippeplatform i 10 minutter ved stuetemperatur. Gentag dette vasketrin en gang mere, og gemme embryonerne i 100% methanol natten over ved -20 ° C.
- Forbered 1x phosphatpufret saltvand-bovint serumalbumin-Triton (PBT): 1x PBS, 2 mg / ml bovint serumalbumin, 0,1% Triton X-100.
- Forbered primære antistofopløsning: 1x PBT med 10% gedeserum med en 1: 5 fortynding af monoklonalt muse 4A6 antistof (til at mærke membranerne i de mellemliggende, distale og forbindende tubuli 20), en 1:30 fortynding af muse monoklonalt antistof 3G8 (til label lumen af den proximale tubuli 20), og en 1: 250 fortynding af kanin-polyklonalt RFP antistof (til at mærke MEM-RFP sporstof). Opbevares ved 4 ° C.
- Forbered secondary antistofopløsning: 1x PBT med 10% gedeserum, 1: 500 Alexa 488 gede-anti-muse-IgG (koncentration lager 2 mg / ml; at etiketten 4A6 og 3G8) og 1: 500 Alexa 555 gede-anti-kanin IgG (lager koncentration 2 mg / ml; at mærke MEM-RFP sporstof). Opbevares ved 4 ° C, som dækker røret i folie for at beskytte mod lys.
- Alternativt, indsamle de primære og sekundære antistoffer efter farvning, og gem ved 4 ° C til genanvendelse i fremtidige eksperimenter. Hvis antistoffet skal gemmes til genbrug, tilsættes 0,01% natriumazid.
- Immunfarvning embryoner under anvendelse af etablerede protokoller 18.
5. Visualisering af Embryoner og analyse af målrettet Pronephric Tissue
- Screen de immunofarvede embryoner for at kontrollere, at den korrekte blastomer blev injiceret ved at se fluorescensen af sporstof under en fluorescerende stereomikroskop ved 1X (for at se hele embryo) og 5X (se nyre) forstørrelse. Placer embryoner i en multi-brønd glasplade med viLLS fyldt med 1x PBT anvendelse af en overførsel pipette med spidsen skåret af. Manipulere embryoner med et hår løkke. Brug kun embryoner, som har co-injicerede sporstof stede i pronephros på venstre side af embryo (figur 3C, F og figur 4C, F) til gen-overekspression eller knockdown analyse.
- Alternativt rydde embryoner i Murrays Clear (2 dele benzyl benzoat: 1 del benzylalkohol) ved at placere embryoner i et hætteglas og fylde hætteglasset med Murray Clear. Visualisere embryoner under anvendelse af en glas-brønds plade.
Bemærk: Murrays Clear er et organisk opløsningsmiddel, og skal håndteres med forsigtighed. Bær handsker, og kun bruge hætteglas og pipetter med Murrays Clear. - Opbevar embryoner ved 4 ° C i 1 x PBT i 2 - 3 uger. For langtidsopbevaring af embryoner, dehydrere embryoner ved at vaske to gange i 100% methanol ved stuetemperatur i 10 min. Opbevar embryoner ved -20 ° C i 100% methanol.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Mikroinjektioner af 4- og 8-celle Xenopus embryoer med MEM-RFP mRNA viser forskellige niveauer af målretning til de pronephros. Figur 4 viser trin 40 embryoner med korrekte MEM-RFP mRNA ekspressionsmønstre. Embryoner blev injiceret i den venstre ventrale blastomer (figur 4A), og sorteret til den korrekte ekspressionsmønster af MEM-RFP mRNA. Ud over at udtrykke MEM-RFP i den proximale, mellemliggende, distal og forbindende tubuli i nyren, forventes korrekt injicerede embryoner til at vise fluorescens i epidermis af hoved, krop og hale. De bør også vise fluorescens i otocyst, cement kirtel, proctodeum, og somitter (figur 4C). Fordelingen af MEM-RFP fluorescens i nyrerne fra 8 korrekt injicerede embryoner blev bestemt med en fluorescerende stereomikroskop (figur 4B). Embryoner med høje niveauer af MEM-RFP udtryk i epidermis, somblokeret påvisning af nyre-regioner blev bedømt som "okkluderet". MEM-RFP-ekspression blev detekteret i den proximale, mellemliggende, distale og forbindende tubuli i alle embryoner, der ikke blev scoret som okkluderet. Stereoscope (figur 4D-F) og konfokale mikroskoper (Figur 4G-I) blev anvendt til at verificere co-lokalisering af MEM-RFP og nyrevæv immunfarvet med 3G8 og 4A6. Konfokal imaging verificeret co-lokaliseringen af MEM-RFP med den proximale, mellemliggende, distale og forbindende tubuli i nyren, hvilket indikerer, at mikroinjektion af MEM-RFP i den venstre ventrale blastomer korrekt målrettet mod nyre.
Embryoner injiceret med MEM-RFP-mRNA i 8-celle stadium (figur 5A) viser en snævrere område af væv, der udviser fluorescens, hvilket indikerer, at 8-cell injektioner reducerer potentialet for bivirkninger på nyre. Ligesom embryoner injiceret i 4-celle stadiet, brodeyos injiceret på 8 celler fase Vis fluorescens i den proximale, mellemliggende, distale og forbindende tubuli i nyren, samt somitter og proctodeum (figur 5C-F). I modsætning til embryoner injiceret på det 4-celle stadiet, er cement kirtel og otocyst ikke mærket med MEM-RFP. Ud af 10 ordentligt målrettede embryoner, viste en embryo MEM-RFP i næsten alle de proksimale tubuli, og 3 viste MEM-RFP i næsten alle de mellemliggende og distale tubuli i nyrerne (figur 5B). De forbinder tubuli på 7 embryoner blev delvist mærket med MEM-RFP. Desuden nyrerne embryoner injiceret i 8-celle stadium var lettere at visualisere, og kun en blev scoret som okkluderet. Co-lokalisering af MEM-RFP og mærkning af antistoffer nyren (3G8 og 4A6) blev bestemt ved anvendelse af et stereomikroskop (figur 5D-F), og kontrolleres ved hjælp af et konfokalt mikroskop (figur 5G-I). Den proksimale, mellemliggende, distal og tilslutning tubules af nyren blev mærket med MEM-RFP med embryoner injiceret i 8-celle stadiet, demonstrerer, at målrettet injektion af V2 blastomer etiketter nyrerne, mens der vises fluorescens i færre væv end embryoner injiceret i den venstre ventrale blastomer ved 4-celle scene.
Dette assay gør brug af en fluorescens mærket mRNA som sporstof at angive, hvilke væv blev målrettet ved mikroinjektion. Det er vigtigt at screene fostre for konsekvent sporstof lokalisering forud for analyse, og eventuelle embryoner, der for ikke vise det forventede røbestoffordeling mønster skal kasseres. Figur 6 viser et eksempel på et stadie 40 embryo, der fejlagtigt blev målrettet med MEM-RFP mRNA på 4-celle stadiet. MEM-RFP-mRNA-ekspression er placeret på højre side af embryonet stedet for den venstre side (figur 6A). Desuden er de fleste af mRNA-ekspression er i huden af den nedre krop og hale, medlidt udtryk i somitter. Ingen mRNA-ekspression ses i den proximale, mellemliggende, distal og forbindende tubuli (figur 6B), hvilket bekræfter ukorrekt målretning af nyren. Derfor bør denne embryo ikke anvendes til analyse.
Figur 1:. Xenopus fosternyreceller Diagram over nyrerne af en fase 35 Xenopus embryo, der viser den proximale, mellemliggende, distal, og forbindende tubuli. Baseret på Raciti et al. (2008) 6. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2: Xenopus Embryonale Fate Maps. maps Fate identificere og navngive blastomererne der bidrager til udviklingslandene pronephros. A) Fate kort over en 4-celle embryon. B) Fate kort over en 8-celle embryon. C) Fate kort over en 16-celle embryon. D) Fate kort over en 32-celle embryon. Blastomererne af 32-celle foster er også mærket ved hjælp af en alternativ blastomer navnesystem. Fate kort baseret på Moody (1987) 8, 9 og Moody og Kline (1990) 7. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3:. Injection Ordning for Målretning af Xenopus Pronephros Røde pile viser cellen at injicere. A) Animal og ventrale udsigt over en 4-celle embryon viser injektion af venstre ventrale blastomere at målrette den venstre pronephros. Røde pile angiver venstre ventrale blastomer. B) Animal og ventrale udsigt over en 8-celle embryo viser injektion af venstre V2 blastomer at målrette de venstre pronephros. Røde pile angiver venstre V2 blastomer. AB) Billeder af embryoner taget på en Stereoskopet på 4X forstørrelse. Injektioner baseret på Xenopus skæbne maps udviklet af Moody (1987) 8, 9 og Moody og Kline (1990) 7. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4:. Eksempler på Embryoner målrettede på det 4-cellet Stage immunofarvede etape 40 Xenopus embryoner viser målrettet injektion til venstre pronephros på det 4-celle stadie ved hjælp af MEM-RFP mRNA som sporstof. MEM-RFP etikettercellemembraner rød. A) Skematisk viser injektion af MEM-RFP mRNA til venstre ventrale blastomer af en 4-celle embryon. B) Tissue lokalisering af MEM-RFP fluorescens i nyrerne fra korrekt injicerede embryoner. C) Stage 40 embryo injiceret med MEM-RFP i venstre ventrale blastomer ved 4-celle stadiet. MEM-RFP lokalisering er vist med rødt, mens nyren er mærket grøn. 1X forstørrelse. D) Nyre farvet med 3G8 at mærke lumen i de proximale tubuli, og 4A6 at mærke membranerne i celler i de mellemliggende, distale og forbindende tubuli. 5X forstørrelse. E) Udvidelse af regionen i løbet nyrerne viser MEM-RFP lokalisering. 5X forstørrelse. F) sammenflettede billede viser co-lokalisering af MEM-RFP tracer med nyrerne. 5X forstørrelse. CF) Billeder af embryoner taget med et Olympus DP71 kamera på en Stereoskopet. G) Konfokal billede af nyren af en anden embryo farvet med 3G8 og 4A6. H) Lokalisering af MEM-RFP i nyre og omgivende væv. I) Flettede billede shovinge co-lokalisering af MEM-RFP, 3G8, og 4A6 i nyrerne. GI) Konfokal billeder ved hjælp af maksimal projektion på 20X forstørrelse. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 5:. Eksempler på Embryoner målrettede i 8-celle Stage immunofarvede etape 40 Xenopus embryoner viser målrettet injektion til venstre pronephros i 8-celle stadie ved hjælp af MEM-RFP mRNA som sporstof. MEM-RFP etiketter cellemembraner rød. A) Skematisk viser injektion af MEM-RFP mRNA til venstre V2 blastomer af en 8-celle embryon. B) Tissue lokalisering af MEM-RFP fluorescens i nyrerne fra korrekt injicerede embryoner. C) Stage 40 embryo injiceret med MEM-RFP i venstre V2 blastomer ved 8-cellestadiet. MEM-RFP lokalisering er visti rødt, mens nyren er mærket grøn. 1X forstørrelse. D) Nyre farvet med 3G8 at mærke lumen i de proximale tubuli, og 4A6 at mærke membranerne i celler i de mellemliggende, distale og forbindende tubuli. 5X forstørrelse. E) Udvidelse af regionen i løbet nyrerne viser MEM-RFP lokalisering. 5X forstørrelse. F) sammenflettede billede viser co-lokalisering af MEM-RFP tracer med nyrerne. 5X forstørrelse. CF) Billeder af embryoner taget med et Olympus DP71 kamera på en Stereoskopet. G) Konfokal billede af nyren af en anden embryo farvet med 3G8 og 4A6. H) Lokalisering af MEM-RFP i nyre og omgivende væv. I) sammenflettede billede viser co-lokalisering af MEM-RFP, 3G8, og 4A6 i nyrerne. GI) Konfokal billeder taget ved hjælp af maksimal projektion på 20X forstørrelse. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 6: Eksempel på embryo forkert rettet mod den 4-celle stadie immunofarvede etape 40 Xenopus embryo viser forkert målretning af de venstre pronephros på det 4-celle stadie ved hjælp af MEM-RFP mRNA som sporstof.. MEM-RFP etiketter cellemembraner rød. A) Stage 40 embryo viser forkert fordeling af MEM-RFP tegn på injektion i den forkerte blastomer. Ud over at have forkert røbestoffordeling indikerer injektion i den forkerte blastomer, var dette embryo injiceret i højre side. 1X forstørrelse. B) Merged billede af nyrerne og udviste mangel på co-lokalisering af MEM-RFP med antistoffer mærkning nyrerne (3G8, 4A6). 5X forstørrelse. AB) Billeder af embryo taget på en stereoscope. Klik her for at se en større version af dette tal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Målretning af pronephros udvikle Xenopus embryoer afhængig identificere og injicere den korrekte blastomer. Injektion af V2 blastomer 8-celle embryoer er rettet mod venstre pronephros 18. Dette efterlader kontralaterale rigtige pronephros som en intern kontrol. Hvis morpholino knockdown eller RNA-overekspression bruges til at ændre nyre udvikling, kan den kontralaterale højre pronephros anvendes til at sammenligne virkningerne af gen knockdown eller overekspression fra venstre i pronephros. I dette tilfælde bør passende kontrol, såsom et fejlparret kontrol morpholino eller dominant negativ RNA konstruktion anvendes som supplement til den kontralaterale intern kontrol for at analysere resultaterne af ændringer i genekspression. På grund af den relative gennemsigtighed i Xenopus embryo, kan nyre defekter let kvantificeres ved hjælp af flere teknikker. For eksempel kan gen knockdown eller overekspression simpelthen kvantificeres ved at beregne pronephric indeks af embryonerimmunfarvet med antistof 3G8 13, som sammenligner udviklingen af de proksimale tubuli på de injicerede og kontrol sider af embryoet. Ud over at studere pronephric udvikling, kan denne teknik let tilpasses til at målrette andre væv ved at vælge den rette blastomer at injicere ved anvendelse af anerkendt skæbne maps 7-10. Ud over at målrette andre vævstyper kunne denne protokol også anvendes til at studere nyre udvikling på forskellige stadier. Denne protokol så på trin 40 embryoner farvet med antistoffer 3G8 og 4A6, som detekterer differentieret nyrevæv. Yngre embryoner kunne immunfarvet med forskellige nyre antistoffer, eller udsat for in situ-hybridisering 5, 6, 20. For eksempel kan antistoffet LIM1 detektere udviklingslandene pronephros 21, 22. Ligeledes LIM1, kan pax8 og hnf1- p transkripter være påvist med in situ hybridisering starter fra trin 12.5 22-24 i situ hybridisering markører kan anvendes til at detektere forskellige regioner i nyren på senere udviklingsstadier. For eksempel prober designet til at detektere ekspression af nphs1, clckb, slc5a1, og atp1a1 i glomus, distale og forbindende tubuli, proksimale tubuli, og hele nyren henholdsvis er blevet beskrevet 25, 5, 26, 27. Vurdering af nyre tværs af flere faser ved hjælp af forskellige antistoffer eller in situ analyse vil give mulighed for en bedre forståelse af, hvordan en behandling ændrer nyre udvikling.
Et kritisk aspekt af denne protokol er den korrekte udvælgelse og identifikation af blastomer skal injiceres. I denne protokol, beskriver vi, hvordan at målrette pronephros ved at indsprøjte venstre V2 blastomer 8-celle embryoer eller venstre ventrale blastomer af 4-celle embryoer. Hvis den forkerte blastomer injiceres, vil pronephros ikke målrettes korrekt. Derfor er deter afgørende for at blive fortrolig med de udviklings- og celle spaltningsprodukter fly af tidlige Xenopus embryoer før mikroinjektion 28, er 29. Embryo spaltning ikke altid følge de etablerede udviklingsstadiet diagrammer, så det er nyttigt at kun injicerer embryoner, hvor de tidlige celle spaltninger ser "normal" og den rette blastomer let kan identificeres. Dette vil reducere antallet af embryoner, der er blevet uretmæssigt målrettet. Derudover er det også vigtigt for blastomererne af embryonet at være fuldstændig delt på tidspunktet for injektionen. For eksempel, hvis spaltning mellem blastomerer V1 og V2 af en 8-celle embryon er ikke komplet, før mikroinjektion, kan sporstoffet spredes i V1 samt V2. Dette ville formindske målretning effektiviteten af mikroinjektion, og det resulterende embryo kan vise røbestoffordeling der ser mere ligner et embryo injiceret i 4-celle stadiet i stedet for 8-cellestadiet.
enanden vigtig del af denne protokol er kontrol af, at pronephros var korrekt målrettet ved mikroinjektion. Dette skal gøres, inden analysere pronephric udvikling, fordi embryoner, der ikke har haft de pronephros ordentligt målrettede kan forvrænge det resulterende datasæt. For at verificere korrekt målretning analysere sporstof uddeling i hver injicerede embryo. Det injicerede (venstre) side af embryonet skal vise det store flertal af det fluorescerende sporstof. Hvis styringen (højre) side af embryo viser en væsentlig mængde fluorescens, så er denne embryo skal kasseres. Hvis det sker, var enten den forkerte blastomer injiceres, eller den injicerede blastomer havde ikke afsluttet spaltet før injektion. For det andet skal fluorescens på den injicerede (venstre) side af embryonet korrekt målrette pronephros. Hvis fosteret blev injiceret i 8-celle stadie, de dorsale og ventrale somitter, lateral plade, stortarmen, proctodeum forventes hud af stammen og neurale kam i bagagerummet for at vise influenzaorescence foruden de pronephros 6, 29. Ud over vævene er angivet for den 8-celle injektion, embryoner injiceret i 4-celle stadiet bør have bredere fordeling af det fluorescerende sporstof i huden og somitter samt målretning af cement kirtel, otocyst, linse og olfaktoriske placode. Hvis fosteret ikke viser den korrekte væv målretning, skal den kasseres før analyse (figur 5).
De målrettede injektioner beskrevet i denne protokol er et middel til at manipulere genekspression i et ønsket væv. En begrænsning ved denne teknik er, at selv disse injektioner er målrettet, de ikke påvirke kun den udviklende nyre. De 4- og 8-celle injektioner er beskrevet i denne teknik er mere målrettet end injektioner udfærdiget i den encellede fase, hvor genekspression vil blive ændret i hele embryo, og injektioner udført ved to-celle stadie, hvor halvdelen af embryo skærme ændret gen expression. De behøver imidlertid ikke kun for én væv. Selvom injektioner i de ventrale blastomeres af 4-celle embryoer og V2 blastomeres af 8-celle embryoer ændrer genekspression i pronephros, de også ændrer genekspression i andre væv. Andre påvirkede væv indbefatter huden, somitter, gut, og crista neuralis. Derfor er det vigtigt at forstå, at selvom 4- og 8-celle injektioner er mere målrettet end en- eller to-celle injektioner, vil de stadig ændrer genekspression i flere væv. Ud over at injicere embryoner på 4- og 8-celle stadier, kan injektioner også udføres ved 2-, 16-, og 32-celle stadier. Embryoner injiceret ved 2-celle stadie vil have en bredere vifte af væv ramt end embryoner injiceret på et senere tidspunkt. Selv om mere teknisk udfordrende, vil embryoner injiceret på 16- og 32-celle stadier har en smallere vifte af væv ramt end embryoner injiceret i 4- og 8-celle etaper.
MEM-RFP afstamning tracer anvendes i denne protokol for at verificere korrekt målretning efter mikroinjektion. MEM-RFP mRNA etiketter cellemembraner Efter at cellerne har oversat protein fra den injicerede RNA. Koncentrationen af MEM-RFP afstamning sporstof anvendes i denne protokol (0,1 ng MEM-RFP mRNA i en 10 nl injektion) bør ændres efter behov for at redegøre for fosterdød og ønskede intensitet af sporstof fluorescens. Ud over at modificere mængden af afstamning sporstof injiceres, en anden slægt sporstof, såsom rhodamin-dextran, quantum dots, eller histokemisk påviselig β-galactosidase, kan anvendes i stedet for MEM-RFP. Lineage sporstoffer bliver mere fortyndet som cellerne dele sig, hvilket får niveauet af fluorescens til at aftage med embryo udvikles. En yderligere anvendelse af denne teknik er at co-injicere en eksogen RNA eller morpholino med afstamning sporstof at overudtrykke eller vælte ekspressionen af et gen af interesse. Afstamning sporstof anvendes til at verificere korrekt målretning af pronephros, men ikkeat angive, hvor co-injicerede eksogen RNA eller morpholino lokaliserer i embryoet. Eksogent RNA og morpholinoer må ikke spredes gennem den injicerede blastomer med samme hastighed som co-injicerede sporstof, potentielt resulterer i datterceller, der har sporstof, men ikke den exogene RNA eller morpholino nuværende 30. Faktisk har vi observeret, at to forskellige RNA-konstruktioner injiceres i en enkelt celle ikke altid co-lokalisere (upublicerede data). Derfor tilstedeværelse af sporstoffet i en celle betyder ikke nødvendigvis, at den co-injicerede eksogen RNA eller morpholino er altid til stede i den celle.
Denne protokol beskriver en procedure til at målrette mikroinjektion til blastomererne der giver anledning til de pronephros udvikle Xenopus embryoer. Genekspression er ofte manipuleres i Xenopus embryoer ved injektion af morpholinos eller eksogen RNA, som begge kan forhindre forårsage tidlige udviklingsmæssige anomalier ved injektion i en- ellerto-celle embryoer. Embryoner injiceret i enkelt celle stadium udviser knockdown eller overekspression i alle cellerne i udviklende embryo. Hvis genet er nødvendig for korrekt tidlige udviklingsprocesser, kan embryoet ikke udvikle en pronephros. Injektioner udføres på et senere tidspunkt, såsom 8-celle injektioner detaljerede her, kan resultere i embryoner, der gennemgår gastrulation og eventuel pronephric udvikling 18. Derfor kan de målrettede injektioner diskuteret her overvinde gastrulation defekter forårsaget af ændring af ekspressionen af visse gener, således at embryonet at fremskridt gennem pronephric udvikling. I fremtiden kan denne protokol også anvendes til at målrette CRISPR konstruktioner til ønskede blastomeres.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Dette arbejde blev støttet af en National Institutes of Health NIDDK tilskud (K01DK092320) og opstart finansiering fra Institut for Pediatrics ved University of Texas McGovern Medical School.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Sodium chloride | Fisher | S271-3 | |
| Potassium chloride | Fisher | P217-500 | |
| Magnesium sulfate | Fisher | M63-500 | |
| Calcium chloride | Fisher | C79-500 | |
| HEPES | Fisher | BP310-500 | |
| EDTA | Fisher | S311-500 | |
| Gentamycin solution, 50 mg/ml | Amresco | E737-20ML | |
| L-Cysteine, 99%+ | Acros Organics | 52-90-4 | |
| Ficoll | Fisher | BP525-100 | |
| 100 mm x 15 mm Petri dish | Fisher | FB0875712 | |
| Mini Fridge II | Boekel | 260009 | Benchtop incubator for embryos. |
| Gap43-RFP plasmid | For making tracer RNA. Ref: Davidson et al., 2006. | ||
| Rhodamine dextran, 10,000 M.W. | Invitrogen | D1817 | Tracer. |
| Molecular biology grade, USP sterile purified water | Corning | 46-000-CI | |
| 7" Drummond replacement tubes | Drummond | 3-000-203-G/XL | Microinjection needles. |
| Needle puller | Sutter Instruments | P-30 | |
| Fine forceps | Dumont | 11252-30 | For breaking microinjection needle tip. |
| Nanoject II | Drummond | 3-000-204 | Microinjector. |
| Mineral oil, heavy | Fisher | CAS 8042-47-5 | Oil for needles. |
| 27 G Monoject hypodermic needle | Covidien | 8881200508 | For loading mineral oil into microinjection needle. |
| 5 ml Luer-Lok syringe | BD | 309646 | For loading mineral oil into microinjection needle. |
| 60 mm x 15 mm Petri dish | Fisher | FB0875713A | |
| 800 micron Polyester mesh | Small Parts | CMY-0800-C | |
| Transfer pipets | Fisher | 13-711-7M | For transferring embryos. Cut off the tip so that the embryos are easily taken up by the pipette. |
| 6-well cell culture plate | Nest Biotechnology | ||
| MOPS | Fisher | BP308-500 | |
| EGTA | Acros Organics | 67-42-5 | |
| Formaldehyde | Fisher | BP531-500 | |
| 15 mm x 45 mm Screw thread vial | Fisher | 03-339-25B | For fixing, staining, and storing embryos. |
| 24-well cell Culture plate | Nest Biotechnology | ||
| Benzocaine | Spectrum | BE130 | |
| Ethanol | Fisher | BP2818-4 | |
| Methanol | Fisher | A412-4 | |
| Phosphate buffered saline (PBS) 1x powder | Fisher | BP661-50 | |
| Bovine serum albumen | Fisher | BP1600-100 | |
| Triton X-100 | Fisher | BP151-500 | |
| 3D Mini rocker, model 135 | Denville Scientific | 57281 | |
| Goat serum, New Zealand origin | Invitrogen | 16210064 | |
| Sodium azide | Fisher | S227I-25 | |
| Monoclonal 3G8 antibody | European Xenopus Resource Centre | Primary antibody to label proximal tubules. | |
| Monoclonal 4A6 antibody | European Xenopus Resource Centre | Primary antibody to label intermediate, distal and connecting tubules. | |
| anti-RFP pAb, purified IgG/rabbit | MBL | PM005 | Primary antibody to label Gap43-RFP tracer. |
| Alexa Fluor 488 goat anti-mouse IgG | Life Technologies | A11001 | Secondary antibody to label kidney tubules. |
| Alexa Fluor 555 goat anti-rabbit IgG | Life Technologies | A21428 | Secondary antibody to label Gap43-RFP tracer. |
| 9 Cavity spot plate | Corning | 7220-85 | |
| Benzyl benzoate | Fisher | 105862500 | Optional - for clearing embryos |
| Benzyl alcohol | Fisher | A396-500 | Optional - for clearing embryos |
References
- Vize, P. D., Seufert, D. W., Carroll, T. J., Wallingford, J. B. Model systems for the study of kidney development: Use of the pronephros in the analysis of organ induction and patterning. Dev. Biol. 188 (2), 189-204 (1997).
- Brandli, A. W. Towards a molecular anatomy of the Xenopus pronephric kidney. Int. J. Dev. Biol. 43 (5), 381-395 (1999).
- Hensey, C., Dolan, V., Brady, H. R. The Xenopus pronephros as a model system for the study of kidney development and pathophysiology. Nephrol. Dial. Transplant. 17, (Suppl 9) 73-74 (2002).
- Carroll, T., Vize, P. D. Synergism between Pax-8 and lim-1 in embryonic kidney development. Dev. Biol. 214 (1), 46-59 (1999).
- Zhou, X., Vize, P. D. Proximo-distal specialization of epithelial transport processes within the Xenopus pronephric tubules. Dev. Biol. 271 (2), 322-338 (2004).
- Raciti, D., et al. Organization of the pronephric kidney revealed by large-scale gene expression mapping. Genome Biol. 9 (5), 84 (2008).
- Moody, S. A., Kline, M. J. Segregation of fate during cleavage of frog (Xenopus laevis) blastomeres. Anat. Embryol. Berl. 182 (4), 347-362 (1990).
- Moody, S. A. Fates of the blastomeres of the 16-cell stage of Xenopus embryo. Dev. Biol. 119 (2), 560-578 (1987).
- Moody, S. A. Fates of the blastomeres of the 32-cell stage of Xenopus embryo. Dev. Biol. 122 (2), 300-319 (1987).
- Bauer, D. V., Huang, S., Moody, S. A. The cleavage stage origin of Spemann's Organizer: Analysis of the movements of blastomere clones before and during gastrulation in Xenopus. Dev. 120 (5), 1179-1189 (1994).
- Karpinka, J. B., et al. Xenbase, the Xenopus model organism database; new virtualized system, data types and genomes. Nucleic Acids Res. 43, 756-763 (2015).
- Davidson, L. A., Marsden, M., Keller, R., Desimone, D. W. Integrin alpha5beta1 and fibronectin regulate polarized cell protrusions required for Xenopus convergence and extension. Curr. Biol. 16 (9), 833-844 (2006).
- Wallingford, J. B., Carroll, T. J., Vize, P. D. Precocious expression of the Wilms' tumor gene xWT1 inhibits embryonic kidney development in Xenopus laevis. Dev. Biol. 202, 103-112 (1998).
- Sive, H. L., Grainger, R. M., Harland, R. M. Early Development of Xenopus laevis. A Laboratory Manual. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. Cold Spring Harbor, NY. (2000).
- Miller, R. K., Lee, M., McCrea, P. D. The Xenopus pronephros: A kidney model making leaps toward understanding tubule development. Xenopus Development. Kloc, M., Kubiak, J. Z. , Wiley. 215-238 (2014).
- Lienkamp, S. S., et al. Vertebrate kidney tubules elongate using a planar cell polarity-dependent rosette-based mechanism of convergent extension. Nat. Genet. 44 (12), 1382-1387 (2012).
- Lyons, J. P., et al. Requirement of Wnt/β-catenin signaling in pronephric kidney development. Mech. Dev. 126 (3-4), 142-159 (2009).
- Miller, R. K., et al. Pronephric tubulogenesis requires Daam1-mediated planar cell polarity signaling. J. Am. Soc. Nephrol. 22, 1654-1667 (2011).
- Vize, P. D., Jones, E. A., Pfister, R.
- Miller, R. K., Lee, M., McCrea, P. D. Chapter 12: The Xenopus Pronephros: A Kidney Model Making Leaps toward Understanding Tubule Development. Xenopus Development. Kloc, M., Kubiak, J. Z. , Wiley and Sons. Oxford. (2014).
- Taira, M., Otani, H., Jamrich, M., Dawid, I. B. Expression of the LIM class homeobox gene Xlim-1 in pronephros and CNS cell lineages of Xenopus embryos is affected by retinoic acid and exogastrulation. Development. 120, 1525-1536 (1994).
- Weber, H., et al. Regulation and function of the tissue-specific transcription factor HNF1 alpha (LFB1) during Xenopus development. Int. Dev. Biol. 40 (1), 297-304 (1996).
- Carroll, T. J., Vize, P. D. Synergism between Pax-8 and lim-1 in embryonic kidney development. Dev. Biol. 214 (1), 46-59 (1999).
- Etkin, L. D., Pearman, B., Ansah-Yiadom, R. Replication of injected DNA templates in Xenopus embryos. Exp. Cell Res. 169 (2), 468-477 (1987).
- Vize, P. D. The chloride conductance channel ClC-K is a specific marker for the Xenopus pronephric distal tubule and duct. Gene Expr. Patterns. 3 (3), 347-350 (2003).
- Uochi, T. S., Takahashi, S., Ninomiya, H., Fukui, A., Asashima, M. The Na+, K+-ATPase alpha subunit requires gastrulation in the Xenopus embryo. Dev. Growth Differ. 39 (5), 571-580 (1997).
- Nieuwkoop, P. D., Faber, J. Normal table of Xenopus laevis (Daudin): A systematical & chronological survey of the development from the fertilized egg till the end of metamorphosis. , Garland Publishing, Inc. NY. (1994).
- Ubbels, G. A., Hara, K., Koster, C. H., Kirschner, M. W. Evidence for a functional role of the cytoskeleton in determination of the dorsoventral axis in Xenopus laevis eggs. J. Embryol. Exp. Morphol. 77, 15-37 (1983).
- Huang, S., Johnson, K. E., Wang, H. Z. Blastomeres show differential fate changes in 8-cell Xenopus laevis embryos that are rotated 90 degrees before the first cleavage. Dev. Growth Differ. 40 (2), 189-198 (1998).
- Colman, A., Drummond, D. The stability and movement of mRNA in Xenopus oocytes and embryos. J. Embryol. Exp. Morph. 97, 197-209 (1986).
