Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Immunology and Infection

Nitel ve Nicel Saptanması için Tahliller ve Protein Antimikrobiyal karakterizasyonu

doi: 10.3791/53819 Published: April 10, 2016

Protocol

Bakteriyel ve peptidoglikan Yüzeyler 1. hazırlanması

Not: Bütün hücre bakteri alt-tabakalar ve saflaştırılmış peptidoglikanlar mikroslayd difüzyon testi ile ve boya salım deneyinde, her iki enzim alt tabaka olarak kullanılır. Bu yüzeyler enzim reaksiyonları iletken öncesinde hazırlık gerektirir. Aşağıdaki protokol bunların hazırlanmasını tarif etmektedir.

  1. Tüm Bakteri Hücre Yüzey
    1. Bacillus subtilis 168 2 ml gecelik kültürü ile besleyici et suyu 500 mi inoküle bakteriyel hücre alt-tabakanın üretir (American Type Culture Collection ATCC 23857). Kültür bakteri kültürü ikiye katlanması ile elde edilen hızlı bir büyüme fazı olarak tanımlanan büyüme üstel bir faz ulaşana kadar (125 rpm) çalkalama ile 30 ° C'de inkübe edin. Salmonella enterica subsp ekimi için. Enterica (ATCC 10708), (125 rpm) çalkalanarak 37 ° C'de büyüme ortamı olarak besin sıvısı kullanır. basınç 3 atmosfer altında, 121 ° C'de 10 dakika süre ile otoklavlama sureti her kültürün ısı öldürür.
    2. 5,000 x g'de 20 dakika boyunca santrifüj ile ısı ile öldürülmüş bakteriyel substrat hasat edilir. Tip 1 su ile pelet üç kez yıkayın ve su az miktarda yeniden askıya. Bu çalışmada, 1200 ul yüzeylerde askıya.
    3. Kısım 20 ° C'de 1.5 ml mikrofüj tüplerine ve saklamak için bakteriyel hücre alt tabakalar 300 ul.
  2. Arıtılmış peptidoglikan Yüzey
    1. (Malzemeler ve Ekipmanları Tablosuna bakınız) hedef alt tabaka bakteriden 7-10 den peptidoglikan arındırmak ya da bir satıcıdan kazanır. aksesuar hücre duvarı polimerlerden ham peptidoglikan hazırlıkları arındırın.

2. Nitel mikroslayd difüzyon deneyi [Lachica değişikliğe uğratılmış ve ark., 11]

Not: mikroslayd difüzyon deneyidirbir numunedeki antimikrobiyal enzimin varlığını tespit etmek için olan bir metottur. Enzim bir agaroz matrisine ihtiva eden alt-tabaka ile yayılır zamanda enzim substratı hidroliz gibi, açıklığın bir bölge geliştirir. Aşağıdaki protokol niteliksel proteini antimikrobik varlığını tespit etmek için mikroslayd difüzyon deneyi hazırlanması ve performansı açıklanmaktadır.

  1. üreticinin protokolüne göre bir Bikinkoninik asit (BCA) Protein Deney Kiti kullanılarak değerlendirilebilir antimikrobiyal enzim konsantrasyonunun belirlenmesi.
  2. bir enzim tampon olarak fosfat tamponlu tuzlu su (PBS) kullanmaktadır; Bununla birlikte, deneysel olarak verilen enzim için tampon uygun olan belirler.
  3. reaksiyon tampon olarak fosfat tamponlu tuzlu su (PBS) ile antimikrobiyal enzim seri seyreltme gerçekleştirin. Bu mikroslayd difüzyon deneylerinde kullanılan seri seyreltme 0 ug, 10 ug, 100 ug, 1 ng, 10 ng, 100 ng, 1 ug, 1 nihai deney proteini kitleleri üretilebilirreaksiyon hacmi ortalama 0 mg.
  4. Bireysel mikrofüj tüplerine, protein kitleleri koyun ve reaksiyon, kuyu mikroslayd ek hazırlık olarak PBS kullanılarak ul 20 protein seviyesini ayarlamak.
  5. PBS, 50 ml agaroz 0.25 g eritilmesi ile% 0.5 agaroz çözeltisi olun. agaroz tamamen eriyene kadar kaynama noktasına çözelti ısıtılır. ağırlıkça eritme işlemi sırasında kaybolan su belirlemek ve çözüm geri ekleyin.
  6. Agaroz çözeltiye, su içerisinde% 10 sodyum azid, 50 ul ekleyin ve bir su banyosu içinde 50 ° C'ye kadar çözeltinin sıcaklığını ayarlamak. Sodyum azit mikroslayd difüzyon deneyinin inkübasyon sırasında bakteri büyümesini kirletici inhibe etmek için ilave edildi. canlı hücreler alt-tabaka olarak kullanılması halinde, agaroz çözeltisi sodyum azid sayın.
  7. buz üzerinde ısı ile öldürülmüş bakteri substrat çözülme.
  8. Yeniden askıya yaklaşık agaroz çözeltisi 12 ml bakteri alt-tabaka bir 2.0 MCF bulanıklığının eşleşenArland (Malzeme Tablo) standart eşdeğerlik. yaklaşık bulanıklık elde edilene kadar agaroz bakteriyel maddesinin eklenmesi, çözümlerle beyaz arka plan üzerinde siyah bir çizgi görselleştirerek çözümler bulanıklığı karşılaştırın.
  9. Hemen, her mikroslayd (25 x 75 x 1 mm 3) agaroz-alt-tabaka çözeltisi 3 mL pipet.
  10. slaytlar kuvvetlendirmek sonra bir mantar delici (4.8 mm çap) kullanarak her mikroslayd agaroz-alt tabakanın üç kuyu yumruk. ilgili kuyucuklara her biri ayarlanabilir bir protein seri seyreltme 20 ul ekle.
  11. de bir negatif kontrol olarak PBS (20 ul) ya da sığır serum albümini (20 ul PBS içinde 5 ug) kullanın. Bir pozitif kontrol olarak, bu tür lizozim şekilde alt-tabaka için uygun bilinen bakteriyolitik enzimler kullanın.
  12. 37 ° C'de bir nem odasında slayt veya enzimin optimum aktivitesi sıcaklığı inkübe edin. inkübasyon süresi konsantrasyonuna bağlıdır veAntimikrobiyal enzimin spesifik aktivitesi. Tipik reaksiyon süresi, bir gece boyunca (yaklaşık 16 saat).
  13. inkübasyondan sonra, yaklaşık 30 cm odak mesafe 60 mm lens ile dijital tek lensli refleks kamera kullanarak gelişmekte olan testinin dolaylı ışık ve yakalama görüntüler altında slaytlar uyun.
    Not: Verilen alt tabaka için protein antimikrobiyal Enzimatik aktivite enzim agaroz içine yayılır yanı etrafında oluşturan hidroliz net bir bölge gelişimi ile ilişkilidir.
  14. enzimatik aktivitesini hak kazanmak için, her iyi etrafında oluşturan bölgelerin boyutlarını gözlemleyin. Düşük enzimatik aktivitesi niteliksel daha küçük bir bölgeye ilgili olsa da yüksek enzimatik etkinlik nitelik, daha büyük bir bölgesi ile ilgilidir.

3. Yüzey Etiketleme - Remazol Brillant Blue R Boya Etiketleme [Zhou 12 Modifiye]

Not: boya salım deneyinde, alt-tabaka kovalent linke oland parlak mavi R boyası Remazol için. Aşağıdaki protokol, boyanmış enzim substratları hazırlanmasını tarif etmektedir.

  1. Tip I su 99 ml 1 g NaOH çözülmesiyle 250 mM sodyum hidroksit (NaOH) çözeltisi yapmak 200 mM Remazol Parlak Mavi R boyası (RBB) çözeltisi yapmak için kullanılır.
  2. Taze 250 mM NaOH çözeltisi (adım 3.1) 98.75 ml ± 1 ml 1.25 g RBB eriterek 200 mM RBB çözüm olun.
  3. RBB çözeltisi, 30 ml 0.5 g ıslak ağırlık konsantrasyonunda ısı ile öldürülmüş bakteriyel hücreler yeniden askıya. saflaştınldı peptidoglikan için, RBB çözeltisi, 30 ml 0.3 g ıslak ağırlık konsantrasyonunda peptidoglikan yeniden askıya.
  4. yumuşak bir karıştırma ile, 37 ° C'de 6 saat süreyle dönüşlü bir platform üzerinde bir Erlenmeyer şişesi içinde, reaksiyon karışımının inkübe edin.
  5. 4 ° C inkübatör Reaksiyon karışımı aktarın ve yumuşak karıştırma ile ilave bir 12 saat daha inkübe edilir.
  6. İnkübasyondan sonra, 3000 x g'de santrifüj ile boyanmış alt-tabakanın hasat30 dakika karıştırıldı. alt-tabaka pelet boya çözeltisini süzün.
  7. ardından santrifüj Tip I su ile tekrar tekrar (yaklaşık 3-5 yıkama) boya etiketli hücreler veya peptidoglikan yıkanarak substrattan kovalent olmayan bir şekilde bağlanmış çözünebilir boya çıkarın. Her su ilavesi ile iyice pelet yeniden askıya.
    Not: ilişkisiz, çözünür boya artık santrifüj sonra suyla yıkayın görünür olduğunda. alt-tabaka bir ek yıkama verilmelidir. Son yıkama yüzer açık olacak ise alt tabaka, mavi kalacağını unutmayın.
  8. daha sonra kullanılmak üzere -20 ° C'de bir su az miktarda süspanse boyanmış substratlar saklayın.

4. Kantitatif Boya-release Deneyi

Not: boya-release Deney sırasında reaksiyon süpernatant içine ürünleri boyalı enzimatik reaksiyon sürümlerde RBB-boyalı substrat hidrolizi. salınan boya miktarının kolorimetrik bir ölçümü amo gösterirBelirli bir enzimin numune içinde mevcut enzim etkinliğinin etkili olduğu akla. Kantitatif bir yöntem alt tabakalar üzerindeki farklı enzimlerin karşılaştırmasını sağlar ve enzimatik reaksiyonu (örneğin, sıcaklık, tuz ve pH) etkileyen çevresel koşulların varyasyona izin verir. Aşağıdaki protokol kantitatif protein antimikrobik enzimatik aktivitesini tespit etmek için, boya salimli bir tayinin hazırlanması ve performansı açıklanmaktadır.

  1. Boya salım analizi için hazırlık
    1. Dondurulmuş, boyanmış alt-tabaka, oda sıcaklığına dönmesi ve ampirik olarak verilen enzim için belirlenen deney tamponu (PBS) ile iki kere yıkayın izin verin.
    2. yapılacak boya salma tahlilleri sayısına göre 200 ul reaksiyon hacmi çarpılarak gerekli olan alt-tabaka süspansiyonu hacmi hesaplanır.
    3. (Optik yoğunluk elde edilene dek, 4.1.2 belirlenen deney tamponu hacmi, boyanmış alt-tabakanın eklenmesiyle alt-tabaka süspansiyonu hazırlamak2.0 OD) bir spektrofotometre kullanılarak 595 nm'de elde edilmiştir. Konsantre çözeltinin 1 seyreltme: spektrofotometre fonksiyonel sınırlar dahilinde kalması için, 1 için 1.0 olarak 2.0 OD 595 ölçün. boş olarak deney tamponu kullanın.
      Not: Reaksiyon için alt-tabaka bulanıklığının yüksek verimli enzimlerin aktivite düzeylerinin eşleştirmek için 2.0 dışına kaldırılabilir.
    4. Protein antimikrobik Askıda 1 mg / ml'lik bir tahmini konsantrasyonda deney tamponu içinde değerlendirilmelidir.
    5. imalatçının protokolüne göre bir BCA Protein Deney Kiti mikroplaka testi kullanılarak, protein örneğinin gerçek konsantrasyon tahlil edilecek belirler. mi deney tamponu kullanılarak 1 mg / hazır süspansiyonun konsantrasyonu ayarlayın.
  2. Bir Protein Antimikrobiyal için Optimal Kuluçka Şartları belirleme Boya-release Testi kullanarak
    1. 100 ng / ul stok proteini antimikrobiyal süspansiyon sulandırmak. Bu konsantrasyon af verirhacme (10 ul) başına protein 1 ug nominal reaksiyon kütlesi deney reaksiyona ilave edildi.
    2. Termal aralığını belirlemek bakteriyolitik protein için değerlendirilmelidir. Bu deneylerde ısı aralığı 5 ° C, 15 ° C, 25 ° C, 35 ° C, 45 ° C, 55 ° C ve 65 ° C 'de yer.
    3. 0.5 mi mikrofüj tüplerinde Reaksiyon tahlilleri gerçekleştirin. her bir termal bir durum için, hazırlanan alt-tabaka süspansiyonu 200 ul stok protein 10 ul ekle.
    4. saatte bir kez ters çevirme ile karıştırılarak 8 saat, bir termal döngü içinde inkübe edin.
    5. inkübasyondan sonra, etanol 25 ul ekleyerek reaksiyonlar tutuklama.
    6. 2 dakika boyunca 3000 x g'de santrifüj ile Sindirilmemiş, çözünmeyen substrat çıkarın ve sindirilmemiş substratın pelet bozmak için dikkatli bir şekilde bir 96-gözlü düz dipli mikroplakanın her bir reaksiyon karışımı, reaksiyon yüzer 150 ul aktarın.
    7. Protein Antimicrob enzimatik aktivitesini ölçmekçözünebilir RBB boya miktarının belirlenmesi ile verilen alt tabaka için ial enzimatik hidroliz sonrasında substrat ayrışmış. enzimatik aktivitesini ölçmek için, bir mikrolevha spektrofotometre kullanılarak 595 nm'de süpernatanın absorbansı ölçülür. etiketli substrattan süpernatan salınan çözünebilir boya ile artan emme enzimatik aktivitesinin kantitatif ölçüsüdür.
      Not: absorbanstaki değişiklik aktivitesi birimi (AU) ile temsil edilir burada 595 nm'de boya salimli Reaksiyon yüzen maddelerinin optik yoğunluğu bir 0.01 artış 1. Tüm sonuçlar. enzim hariç bütün reaksiyon bileşenleri ile kuluçkalanmıştır boş Reaksiyon, RBB-etiketli substrattan bağlı inkübasyondan bırakan herhangi bir boya çıkarma için kullanılır. Optimal enzimatik sıcaklık pik aktivite ünitesi ölçüm sağlar.
    8. Tekrarlayın 4.2.7 ile 4.2.1 antimikrobiyal enzimi için en uygun tampon koşulları belirlemek için çeşitli inkübasyon tamponlar kullanarak adımları. these deneyler, PBS kullanın.
  3. Boya-release Testi kullanarak bir Protein Antimikrobiyal için Optimal inkübasyon Sıcaklığında minimal Aktif Konsantrasyon belirleme
    1. deney tamponu kullanılarak hazır antimikrobiyal bir protein süspansiyonu bir seri seyreltme gerçekleştirin. seyreltme serisi aralığı antimikrobiyal enzim aktivitesi ile değişecektir. Bu deneylerde kullanılan seri seyreltme 0 ug, 10 ug, 100 ug, 1 ng, 10 ng, 100 ng, 1 ug ve 10 ug son deney proteini miktarlarda üretilmektedir.
    2. 48-gözlü düz tabanlı bir mikrolevhadaki her Reaksiyon deneyi gerçekleştirmek. Her bir deney koşulu için, hazırlanan alt-tabaka süspansiyonu 200 ul ilgili protein süspansiyonu 10 ul ekle. Reaksiyon tamponu kullanılarak 10 ul reaksiyona ilave protein çözeltisinin hacmi herhangi bir değişiklik yapın.
    3. buharlaşma nedeniyle hacim değişimini önlemek için plaka sızdırmazlık film ile mikroplağı mühür. Belirlenen optimum olarak bir çalkalama inkübatörçalkalanarak 16 saat antimikrobiyal verilen protein için cubation sıcaklığı.
    4. ardından her etanol 25 ul ekleyerek reaksiyonu, durdurur ve 2 dakika boyunca 3000 x g'de santrifüj ile sindirilmemiş substrat çıkarın.
    5. Sindirilmemiş substratın pelet bozmak için dikkatli bir şekilde bir 96-gözlü düz dipli mikroplakanın her bir reaksiyon karışımı, reaksiyon yüzer 150 ul aktarın.
    6. enzimatik aktivitesini ölçmek için, bir mikrolevha spektrofotometre kullanılarak 595 nm'de süpernatanın absorbansı ölçülür. enzim hariç bütün reaksiyon bileşenleri ile kuluçkalanmıştır boş Reaksiyon, RBB-etiketli substrattan bağlı inkübasyondan bırakan herhangi bir boya çıkarma için kullanılır. etiketli substrattan süpernatan salınan çözünebilir boya ile artan emme enzimatik aktivite için niceliksel ölçümünü sağlar.
      Not: absorbanstaki değişiklik aktivitesi birimi (AU), 1. Tüm sonuçlar ile temsil edilir595 nm 'de bir boya salimli Reaksiyon yüzen maddelerinin optik yoğunluğu bir 0.01 artış.

Representative Results

mikroslayd difüzyon deneyi ve kantitatif boya-salınım testi tarama ve yeni bir protein antimikrobik ilk soruşturma ölçmek için etkili yöntemlerdir. Her deney avantajları ve sınırlamaları vardır; bağlantılı olarak gerçekleştirilen, ancak, bunlar, hızlı ilk tarama ve bir antimikrobiyal temel özelliklerini sağlar.

mikroslayd difüzyon deneyi etkin protein antimikrobiyal üreten mikrop kütüphanelerinin hızlı taranması için izin verir. Enzim konsantrasyonu seviyeleri endişe, algılama kısıtlamaları duyarlılığı reaksiyonu, daha boya salım deneyinde eklenecek enzimin daha büyük bir miktarda gerektiren deneyi sınırlayabilir. Şekil 1 'de gösterildiği gibi, tahlilin niteliksel özellikler gözlemci her bir mesafede bulunan göreli enzim miktarları karşılaştırma sağlar.

Şekil 1A gösterilen lizis gelişmekte olan bölgesi, içinde (25 enzim ug), bölgenin öncü, alt tabakanın bulanık veya eksik parçalanma görüntüler ise de en yakın bölge daha eksiksiz bir alt tabaka lizis gösterir. Bu olgu, ön kenarda difüzyon enzimin azalan konsantrasyonunun bir ürünü, bölge çapının doğru ölçüm zorlaştırmaktadır. Şekil 1 'de görülen oyuklar B (15 ug), C (10 ug), D (5 ug), D (1.0 ug), ve F (0.1 ug) ve tam lizis bölgesinin çapı yok olmasına dağıtır enzimin düşük miktarda ilişkilendirilmesi. Durum F (0.1 ug) için, agaroz içinde enzim konsantrasyonu bu alt-tabakanın hidrolize, agaroz içinde hareket ederken yayılan enzim görüntülenmiştir sağlayacak sınırının altındadır. Mikroslayd difüzyon deneyi de saflaştırılmış Bacillus subtilis peptidleri kullanılarak çalıştırıldıalt-tabaka olarak doglycan (Şekil 2). Bölge nedeniyle eşit agaroz askıya peptidoglikan isteksizliği bütün hücre Salmonella enterica ile gözlenen daha az tanımlanmış olmasına rağmen, bilinmeyen antimikrobiyal enzimi ile peptidoglikan hidroliz açıktır.

boya salım deneyi enzim reaksiyonu etkileyen çevresel faktörlerin bir alt saptama sınırı ve varyasyon sağlayan, mikroslayd difüzyon deneyi daha hassas ve çok yönlü bir testtir. Örnek deneyler, sıcaklık antimikrobik enzim için optimum sıcaklık saptanması için değiştirilmiştir, 35 ° C PBS içinde (Şekil 3) olarak belirlendi. Bu, en uygun mavi renk (Şekil 3B) ve 595 nm (Şekil 3A) absorbans ölçümlerinden elde edilen aktivite birimleri temsil edildiği gibi fazla miktarda Reaksiyon süpernatanları açıkça görülmektedir.boya salım deneyinde çok yönlülüğü araştırmacının hızlı bir şekilde belirli bir enzim için uygun kuluçkalama koşulları belirlemek için sıcaklık, aynı zamanda, reaksiyon tampon ve tampon bileşenleri sadece değişmesini sağlar.

Bilinmiyor antimikrobik enzim (Şekil 4) ve α-kimotripsin kontrol enzimi (Şekil 5) arasında aktivite düzeyi RBB-etiketli Bacillus subtilis ısı ile öldürülmüş alt-tabakaya karşı PBS içinde 35 ° C'de belirlenen uygun inkübasyon sıcaklığında ölçüldü. Şekil 4 ve Şekil 5 ile ilgili sonuçların karşılaştırılması bilinmiyor antimikrobiyal enzim B. neredeyse iki katı bir afiniteye sahip olduğunu göstermektedir subtilis alt-tabaka. Buna ek olarak, α-kimotripsin kontrol tamamen ısı ile öldürülmüş B. sindirmek vermedi oyuk içindeki subtilis alt-tabaka (veriler gösterilmemiştir). α-kimotripsin kontrol aktivitesi plaka başlarau 0.3 ug bilinmiyor antimikrobik enzim (Şekil 4 ve Şekil 5) Tüm enzim miktarları arasında aktivitesi birim olarak sürekli artış ile karşılaştırıldığında. Bu bilinmeyen enzim daha büyük bir kalıcı etkinliğe sahip olduğunu veya B içindeki enzime uygun yarılma bölgeleri daha fazla sayıda olduğu gösterebilir subtilis alt-tabaka.

Şekil 1
Şekil 1:. Salmonella enterica Tüm Hücre alt-tabakaya karşı Enzim Aktivitesi mikroslayd difüzyon deneyi niteliksel ısı ile öldürülmüş Salmonella enterica subsp karşı bilinmeyen bir protein antimikrobik etkinliğini değerlendirmek için kullanılan enterica (ATCC 10708).. ilgili kuyucuklara ilave edildi, fosfat tamponlu salin (PBS) içinde süspansiyon haline bilinmiyor antimikrobik protein kütlelerislaytlar dahil 25 mikrogram (iyi A) ug (kuyu B), 10 ug 15 (iyi C), 5 mg (iyi D), 1 ug (iyi E) ve 0.1 ug (iyi F). Sadece PBS deneylerinin negatif kontroller kullanılmıştır. Lizis Bölgeleri 6 saat inkübasyondan sonra görüntülendi. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

şekil 2
Şekil 2:. Enzim Aktivitesi Bacillus subtilis karşı peptidoglikan Hücre duvarı mikroslayd difüzyon deneyi niteliksel Bacillus subtilis 168 peptidoglikan karşı bilinmeyen bir protein antimikrobik etkinliğini değerlendirmek için kullanıldı. PBS 20 ul, bilinmeyen bir antimikrobik 10 ug içinde süspansiyon haline de bir mikroskopta ilave edildi. Sadece PBS negatif olarak kullanılmıştırtahlil (kuyu B) kontrolü. Lizis zon 37 ° C'de 6 saatlik inkübasyondan sonra görüntülendi. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

Şekil 3,
Şekil 3: a. Protein optimal reaksiyon sıcaklığı Antimikrobiyal boya salım deneyinde çok yönlülüğü ilgi 6 enzim aktivitesi üzerindeki etkilerini belirlemek üzere inkübasyon sıcaklığı ve tamponlar gibi fiziksel ve kimyasal parametreler, farklılaştınlabilmektedir. Bu şekilde gösterildiği gibi, bilinmeyen bir protein, antimikrobik (1 ug) aktivitesi inkübasyon bir sıcaklık aralığı altında RBB-etiketli ısı ile öldürülmüş, Bacillus subtilis karşı PBS içinde değerlendirilmiştir. Aktivite birimleri (AU) (A), RBB-b absorpsiyon olarak görüntülenirHidroliz Bir mikrolevha spektrofotometre kullanılarak 595 nm'de ölçülmüştür sonra ound ürün yüzer bırakıldı. her bir sıcaklık koşulu da eklenmiş bir enzim ile reaksiyonları çeşitli sıcaklıklarda inkübasyon sonucunda salınan boya etkisini çıkarmak için kullanıldı. Her inkübasyon sıcaklığına karşılık gelen reaksiyon süpernatanları absorbans ölçümü (B) öncesinde görüntülendi. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

Şekil 4,
Şekil 4: a. Protein faaliyet sahası Antimikrobiyal bilinmeyen bir protein antimikrobiyal için aktivite aralığı 0, 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, ve 1000 ng gece boyunca inkubasyon sonrası aktivite birimleri olarak ölçülmüştür BCA prot ile ölçülenEin deney (A). Bu reaksiyonlar için, RBB-etiketli B. subtilis için yüzey enzim (1.000 ng) en yüksek miktar ile reaksiyonu tamamen Reaksiyon inkübasyon süresi içinde mevcut bulunan tüm alt-tabakanın hidrolize etmedi sağlamak için 595 nm 'de 5.0 bir optik yoğunluk elde yükseltilmiştir. ilave enzimsiz kontrol reaksiyonları tek inkübe kaynaklanan salınan boya etkisini çıkarmak için kullanıldı. Her enzim miktarına karşılık gelen reaksiyon süpernatanları absorbans ölçümleri (B) öncesinde görüntülendi. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

Şekil 5,
Şekil 5:. Α-kimotripsin için α-kimotripsin aktivitesi aralığı için Etkinlik Aralığı activ olarak ölçüldügecede inkubasyon sonrası lık birim 0, 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, ve enzim (A) 1000 ng. Bu reaksiyonlar için, RBB-etiketli B. subtilis için yüzey enzim (1.000 ng) en yüksek miktar ile reaksiyonu tamamen Reaksiyon inkübasyon süresi içinde mevcut bulunan tüm alt-tabakanın hidrolize etmedi sağlamak için 595 nm 'de 5.0 bir optik yoğunluk elde yükseltilmiştir. ilave enzimsiz kontrol reaksiyonları tek inkübe kaynaklanan salınan boya etkisini çıkarmak için kullanıldı. Her enzim miktarına karşılık gelen reaksiyon süpernatanları absorbans ölçümleri (B) öncesinde görüntülendi. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

Discussion

mikroslayd difüzyon deneyi ve boya-salınım testi tespit ve daha önce tanımlanmamış, protein antimikrobiyal karakterize etmek için avantaj sağlamaktadır. Bu hızlı ve hassas yöntemler büyük araştırma bilgi yatırım önce yararlı enzimler tanımlanması için bir organizma kaynağı kütüphanelerin yüksek verimli tarama sağlar. üst düzey hedef enzim tanımlanır gibi, tespit deneylerinin varyasyonları enzimi hızla tespit etmek veya enzim biyokimyasal özelliklerini belirlemek için kullanılabilir. Örneğin, bir çok basamaklı protein saflaştırma şemasının, mikroslayd difüzyon deneyi hızlı konusu enzimi ihtiva eden fraksiyonlar algılayabilir. Buna ek olarak, enzim reaksiyon Optima boya salım deneyinde Reaksiyon tampon ve kuluçkalama sıcaklıklarının değiştirilmesiyle belirlenebilir.

mikroslayd difüzyon testinde tespiti için gerekli enzim olan kütle aralığı enzim karakterize eden bir fonksiyonudurampüller. Deneyin tarama sınırlamalar genellikle, boya-salım analizi daha enzimin yüksek miktarlarda kullanılmasını gerektirir. Bu çalışmada, boya salım analizi (Şekil 4) mikroslayd difüzyon deneyi (Şekil 1) tespit limitleri karşılaştırması mikroslayd difüzyon deneyi boya salım deneyinde daha az hassas bir teknik olduğunu gösterilen. Enzim konsantrasyonu bir endişe olmadığı zaman, mikroslayd tahlil düşük işgücü ve ekipman talepleri hedef yüzeylerde karşı protein Antimikrobiyal maddelerin üretimi için kütüphanelerin hızlı başlangıç ​​taranması için izin verir. daha fazla çaba ve ekipman gerektiren birlikte, boya salınım testi, belirli bir alt-tabaka için aynı ya da farklı enzimler, boya-salım deneyleri ile karşılaştırma yapmak kantitatif sonuçlar hasıl daha hassas ve tekrarlanabilir. iki yöntem kolayca çok özel enstrümantasyon gerek olmadan en mikrobiyolojik laboratuvarlarda yapılır. temsilcilerimiz içindemikroslayd difüzyon testinde tespit az miktarda 1 ug (veriler gösterilmemiştir) ise tive deneyler, kontrol enzimi, α-kimotripsin, boya salım deneyi kullanılarak 100 ng (Şekil 5) gibi düşük bir miktarda tespit edilmiştir.

Antimikrobiyal enzimler için kalitatif tespitinde olarak kullanıma sunan, difüzyon deneyi varyasyonları bir dizi 11,13 bildirilmiştir. Bu deneyleri incelerken, mikroslayd difüzyon deneyi ilk ekran olarak nispeten yüksek hassasiyet ve tepki gözetilmesi kolaylığı için geliştirilmiştir. Proteini ile de yayılır şekilde agaroz bindirmeleri Staphylococcus aureus suşları tarafından nükleazlara üretimini tespit etmek için kullanılan edildiği Lachica ve ark., 11 çalışması, değişikliğe uğratılmış mikroslayd difüzyon deneyi radyal immünodifüzyon yöntemi 14 ile benzer biçimde çalıştırılır agaroz alt tabaka ihtiva etmektedir. radyal immunodiffuSistem agaroz içinde yayılma antijen ve antikor arasındaki bir kompleks oluşumu denge ulaştığında yon yöntemi immünopresipitasyon bölgenin genişleme durur. Bunun aksine, mikroslayd difüzyon deneyinin alt-tabaka, ilk başta açıklanan çevreleyen liziz bir sürekli genişleyen bölgede yayılan bir protein antimikrobik ile sindirilmiştir. enzim aktivitesi, kaybeder ya da alt-tabaka bitene kadar bölge artan çapı devam eder. liziz bölgesinin üretim oranı enzim, saflık ve böylece belirli bir etkinlik olarak hızlandı veya enzim konsantrasyonu de artar ilave edildi.

Kantitatif ısı ile öldürülmüş B'ye karşı protein antimikrobik enzimatik aktivitesini değerlendirmek için subtilis boya salınım testi seçildi. Remazol parlak mavi R boyası (RBB) kullanılarak kolorimetrik analizler yüzeyler protein antimikrobiyal eylemlerinde çok yönlü ve hassas değerlendirilmesine imkan -etiketlity. hali hazırda 595 nm'de bir spektrofotometre ile ölçülebilir çözünebilen, mavi ürünlerin açıklamasında RBB-etiketli Substrat enzimatik hidrolizi. diğer protein antimikrobik enzimler karakterize etmek için geliştirilmiş RBB boya salım deneyinde çeşitli varyasyonları, diğer substratlar ile uygulama için, bu deneyde esnekliğini göstermektedir. Örneğin, bir bakteriyolitik lysostaphin etkisini belirlemede, Zhou ve ark., RBB-boyalı stafılokok hücreleri ve alt tabakalar 12 olarak stafilokokal peptidoglikan kullanılarak bir boya salım deneyi bildirilmiştir. Bu RBB boya salım deneyinde uygulanmasının bir modifikasyonunda, RBB-etiketli Micrococcus luteus alt-tabaka, örneğin bakteriyel enfeksiyon ve habis karsinom varlığında gibi hastalıkların teşhis etmek için bir hızlı ve hassas bir araç olarak kullanımı ve ekran için önerilmiştir hangi olabilir kan serumunda 15 insan lizozim ekspresyon düzeyleri ile korele edilebilir. Buna ek olarak, RBB-etiketli bakteriyel hücre substratları olduğu birLSO lizozim 16 tespit edilmesi için bir zimogram yöntemi kullanılmıştır.

Bu enzim üretimi için hızlı bir arşiv taraması için izin boya salım deneyinde alçaltılmış saptama limiti, kolaylık ve tekrarlanabilirlik göstermektedir. Deneyin değişiklikler sıcaklık, pH, tuzluluk etkilerinin yanı sıra antimikrobiyal proteinlerin 6 aktivitesi diğer proteolitik enzimlerin etkilerini de dahil olmak üzere alt niceliksel biyokimyasal karakterizasyonu deneyleri, izin verir. Buna ek olarak, sayısal boya salınım testi, belirli bir alt-tabaka için çok sayıda enzimlerin aktivitelerini karşılaştırmak için kullanılabilir. RBB boya salma tahlili karakterizasyonu ve protein antimikrobik maddelerin tespitine ek olarak, polisakaritler karşı aktivitesi olan enzimler için yardımcı bildirmiştir. Pettersson ve Eriksson selüloz, ksilan, manan ve pusula amorf, RBB-boyanmış polisakarid boncuklar kullanılarak endoglycanase aktivitesi tespit etmek için bir deney rapor17'sinde. Bu bulgular, bir genleşme Bacillus thuringiensis Bt-107 tarafından üretilen kitinaz enzimlerin saptanması için hassas bir yöntem RBB 18 ile etiketlenmiş kolloidal kitin kullanılarak geliştirilmiştir. Bu ve diğer çalışmalardan, RBB-boyanmış substratlar Ticari kaynaklar keratin, amilopektin, amiloz, glikojen, Laminarin, D-ksilan, azo-arpa glukan ve nişasta karşı da dahil olmak üzere glikolitik aktivitesi, saptanmasında kullanım için ortaya çıkmıştır.

Bu çalışmada, kolorimetrik bir sonuç elde etmek için gereken RBB-etiketli substrat ve enzim hacmini azaltır, bir mikroplaka formatında boya salım deneyinde yararını göstermektedir. Şekil 4 ve Şekil 5 'de gösterildiği üzere, mikro boya salma tahlili enzimatik etkinlik algılaması için mikroslayd difüzyon deneyi daha düşük bir belirleme sınırına içerir. yorumlama hızlı kullanımı ile ilgili olarak, emeğin korunması ve kolaylığı ile, mikrofonroslide difüzyon deneyi, antimikrobiyal aktivitenin varlığı hem de alt baş protein izolasyon ve arıtma aşamalarında antimikrobiyal proteinin varlığının gösterilmesi için başlangıç, yüksek verimli taramalara bir fayda sağlar. Bu iki testin kombinasyonu yeni protein antimikrobik ilk tarama ve son karakterizasyonu birbirini tamamlayan

Disclosures

Yazarlar hiçbir rakip mali çıkarları olduğunu beyan ederim. MITRE Corporation, birden federal olarak finanse edilen araştırma ve geliştirme merkezleri (FFRDCs) faaliyet gösteren bir değil, kar amacı gütmeyen bir şirkettir.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
48-well flat-bottom microplate with low evaporation lid Becton Dickinson 3078
96-well flat-bottom microplate (Costar 3595) Corning, Inc. 3595
agarose Fisher Scientific BP162-100
α-chymotrypsin MP Biomedicals 215227205
Bacillus subtilis 168 American Type Culture Collection 23857
C1000 Touch Thermal Cycler Bio-Rad
cork borer Humboldt H-9661
lysozyme Sigma-Aldrich L6876-1G
McFarland equivalence standard (2.0) Fisher Scientific R20412
microslides Fisher Scientific 22-38-103
nutrient broth Fisher Scientific S25959B
peptidoglycan of Bacillus subtilis 168 Sigma-Aldrich 69554-10MG-F
phosphate-buffered saline (1x) Teknova P0200
Pierce BCA Protein Assay Kit Life Technologies 23227
Synergy HT microplate spectrophotometer BioTek Instruments, Inc.
Remazol brilliant blue R dye (RBB) Sigma-Aldrich R8001
Salmonella enterica subsp. enterica American Type Culture Collection 10708
sodium azide Fisher Scientific S227-100
sodium hydroxide (NaOH) Fisher Scientific S318-500
Titer Tops pre-cut adhesive polyethylene film Diversified Biotechnology T-TOPS-50
UltraPure distilled water Invitrogen 10977-015
Name Company Catalog Number Comments
Solution
agarose solution
50 ml PBS
0.25 g agarose
Add 10% sodium azide to the molten PBS/agarose solution
nutrient broth medium
4 g nutrient broth
500 ml Type I water
250 mM sodium hydroxide (NaOH) solution
1 g NaOH
99 ml Type I water
200 mM Remazol brilliant blue R dye (RBB)
1.25 g RBB
98.75 ml 250 mM NaOH solution

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Anand, T. P., et al. Antimicrobial activity of marine bacteria associated with sponges from the waters off the coast of South East India. Microbiol Res. 161, 252-262 (2006).
  2. Tagg, J. R., Dajani, A. S., Wannamaker, L. W. Bacteriocins of gram-positive bacteria. Bacteriol Rev. 40, 722-756 (1976).
  3. Hibbing, M. E., Fuqua, C., Parsek, M. R., Peterson, S. B. Bacterial competition: surviving and thriving in the microbial jungle. Nat Rev Microbiol. 8, 15-25 (2010).
  4. Riley, M. A., Gordon, D. M. The ecological role of bacteriocins in bacterial competition. Trends Microbiol. 7, 129-133 (1999).
  5. Tenover, F. C. Mechanisms of antimicrobial resistance in bacteria. Am J Med. 119, S3-S10 (2006).
  6. Farris, M. H., Steinberg, A. D. Mitrecin A, an endolysin-like bacteriolytic enzyme from a newly isolated soil streptomycete. Lett Appl Microbiol. 58, 493-502 (2014).
  7. Dehart, H. P., Heath, H. E., Heath, L. S., Leblanc, P. A., Sloan, G. L. The Lysostaphin Endopeptidase Resistance Gene (epr) Specifies Modification of Peptidoglycan Cross Bridges in Staphylococcus simulans and Staphylococcus aureus. Appl Environ Microbiol. 61, 2811 (1995).
  8. Srivastava, K. K., Siddique, I. H. Quantitative chemical composition of peptidoglycan of Listeria monocytogenes. Infect Immun. 7, 700-703 (1973).
  9. Heilmann, H. D. On the peptidoglycan of the cell walls of Pseudomonas aeruginosa. Eur J Biochem. 31, 456-463 (1972).
  10. Schumann, P. Taxonomy of Prokaryotes. Rainey, F., Oren, A. 38, Academic Press. (2011).
  11. Lachica, R. V., Genigeorgis, C., Hoeprich, P. D. Metachromatic agar-diffusion methods for detecting staphylococcal nuclease activity. Appl Microbiol. 21, 585-587 (1971).
  12. Zhou, R., Chen, S., Recsei, P. A dye release assay for determination of lysostaphin activity. Anal Biochem. 171, 141-144 (1988).
  13. Osserman, E. F., Lawlor, D. P. Serum and urinary lysozyme (muramidase) in monocytic and monomyelocytic leukemia. J Exp Med. 124, 921-952 (1966).
  14. Mancini, G., Carbonara, A. O., Heremans, J. F. Immunochemical quantitation of antigens by single radial immunodiffusion. Immunochemistry. 2, 235-254 (1965).
  15. Ito, Y., Yamada, H., Imoto, T. Colorimetric assay for lysozyme using Micrococcus luteus labeled with a blue dye, Remazol brilliant blue R, as a substrate. Chem Pharm Bull. (Tokyo). 40, 1523-1526 (1992).
  16. Hardt, M., Guo, Y., Henderson, G., Laine, R. A. Zymogram with Remazol brilliant blue-labeled Micrococcus lysodeikticus cells for the detection of lysozymes: example of a new lysozyme activity in Formosan termite defense secretions. Anal Biochem. 312, 73-76 (2003).
  17. Pettersson, B., Eriksson, K. E. A standardized spectrophotometric assay of endoglycanase activities using dyed, amorphous polysaccharides. Anal Biochem. 285, 220-224 (2000).
  18. Gomez Ramirez, M., Rojas Avelizapa, L. I., Rojas Avelizapa, N. G., Cruz Camarillo, R. Colloidal chitin stained with Remazol Brilliant Blue R, a useful substrate to select chitinolytic microorganisms and to evaluate chitinases. J Microbiol Methods. 56, 213-219 (2004).
Nitel ve Nicel Saptanması için Tahliller ve Protein Antimikrobiyal karakterizasyonu
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Farris, M. H., Ford, K. A., Doyle, R. C. Qualitative and Quantitative Assays for Detection and Characterization of Protein Antimicrobials. J. Vis. Exp. (110), e53819, doi:10.3791/53819 (2016).More

Farris, M. H., Ford, K. A., Doyle, R. C. Qualitative and Quantitative Assays for Detection and Characterization of Protein Antimicrobials. J. Vis. Exp. (110), e53819, doi:10.3791/53819 (2016).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter