Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Developmental Biology
Click here for the English version

Developmental Biology

آلية تنظيم أرقام خلية شحمية في الكائنات الكبار من خلال التمايز وموت الخلايا المبرمج التوازن

Published: June 3, 2016 doi: 10.3791/53822
Automatic Translation
1,2, 1,2
1Department of Medicine 3, Rheumatology and Immunology, Universitätsklinikum Erlangen, 2Nikolaus Fiebiger Center of Molecular Medicine, Universitätsklinikum Erlangen

Introduction

ووفقا لتقرير 2014 من منظمة الصحة العالمية، 39٪ من سكان العالم البالغين من زيادة الوزن، و 13٪ يعانون من السمنة المفرطة 1. في المستقبل القريب، والناس سوف يعانون من زيادة الوزن يشكلون نسبة كبيرة من السكان المسنين. سمة هامة من السمنة والشيخوخة هي التقلبات من الدهون بالنسبة للمراضة والوفيات 2. Adipokines والبروتينات التي يفرزها الأنسجة الدهنية (AT)، يمكن أن تؤدي إلى متلازمة أيضية مثل البدانة والسكري من النوع 2 3. هي سبب الأمراض الاستقلابية في الغالب من قبل التخزين المفرط للطاقة في قطرات الدهون من الخلايا الشحمية، مما يؤدي إلى التوسع 4. ولذلك من مصلحة لتحديد الأسباب والآليات الجزيئية للتوسع AT من أجل إيجاد فرص للسيطرة عليها.

الإفراط في التغذية يؤدي إلى AT التوسع، الذي ينظمه حدثين: التخزين المفرط للطاقة في قطرات الدهون من الخلايا الشحمية، وهي عمليةمما يؤدي إلى تضخم (الزيادة في حجم خلية شحمية)، وزيادة تكون الشحم، المعروف أيضا باسم خلية شحمية تضخم 5. تكون الشحم هو عملية تمايز الخلايا متعددة القدرات الجذعية الوسيطة (MSC) في الخلايا الشحمية. أولا، اللجان الدائمة تتطور إلى preadipocytes خلال مرحلة الالتزام. ثانيا، preadipocytes يفرق أيضا على اكتساب خصائص الخلايا الشحمية ناضجة وظيفية 6. وقد تم تحديد عدة عوامل النسخ كجهة تنظيمية رئيسية لتحديد preadipocyte، مثل البروتين إصبع الزنك 423 (Zfp423) وأوائل B عامل خلية 1 (Ebf1). في حين Zfp423 يدفع الالتزام المبكر، مطلوب Ebf1 للجيل الأسلاف خلية شحمية 6. يتم التحكم التمايز النهائي بإحكام من قبل تتالي النسخي، حيث بيروكسية γ المستقبلات التي تنشط ناشر (PPARγ) هو عامل النسخ أساسيا 7. مزيد من العوامل النسخي الرئيسية هي CCAAT / ملزم محسن بروتين (C/ EBP) أفراد الأسرة (أي، C / EBPα، C / EBPβ، وC / EBPδ)، عوامل مثل kruppel (KLFs)، مخيم عنصر استجابة ملزمة البروتين (CREB) واستجابة النمو في وقت مبكر 20 (Krox20) 6.

في الآونة الأخيرة، وقد تبين أن البروتين 1 (AP-1) أسرة المنشط تشارك في 8،9 خلية شحمية عملية التمايز. يتم تشكيل عائلة AP-1 من قبل مجمع البروتين مثنوي، تتألف من فوس، يونيو و / أو تفعيل عامل النسخ (ATF) أعضاء. مستضد المتعلقة فو-1 و 2 (فرنسا-1 وفرا-2) قادرون على تنظيم خلية شحمية التمايز. فرا-1 يضعف خلية شحمية التمايز عن طريق تثبيط C / EBPα 8، بينما فرا-2 ضوابط خلية شحمية دوران 9. فرا-2 وبالتالي لا ينقص سوى عدد خلية شحمية من قمع التعبير PPARγ2 خلال التمايز خلية شحمية، ولكن أيضا يقلل خلية شحمية موت الخلايا المبرمج من خلال القمع المباشر من عوامل نقص الأكسجين محرض التعبير (HIFs). الأسرة هي مؤسسة الحرمين HETErodimeric مجمع عامل النسخ، ويتألف من مؤسسة الحرمين، 1α، مؤسسة الحرمين، 2α ومؤسسة الحرمين، 1β. تتألف heterodimers من البروتين حساسة للأكسجين مؤسسة الحرمين، α (مؤسسة الحرمين، 1α أو مؤسسة الحرمين، 2α) و-مؤسسة الحرمين 1β الوحيدات الأكسجين حساسة 10. خلال normoxia، البروتينات مؤسسة الحرمين ألفا هي بولي-ubiquitinylated والمتدهورة أخيرا جسيم بروتيني 11. تحت ظروف نقص الأوكسجين، والتي تحدث في AT خلال التوسع، البروتينات مؤسسة الحرمين ألفا لم تعد الهيدروكسيلية. وبالتالي تصبح استقرت وشكل dimers مع أعربت جوهري مؤسسة الحرمين، 1β. تفعيل النسخي من الجينات التي تسيطر عليها عناصر استجابة مؤسسة الحرمين وتشارك في تنظيم الأوعية الدموية، والتمثيل الغذائي، والتهاب 12. في الواقع، مؤسسة الحرمين، 1α يعزز AT الخلل عن طريق حفز تحمل الغلوكوز، مما يعوق استهلاك الطاقة واستخدام الطرفية من الدهون، وكذلك عن طريق زيادة مستوى هرمون الليبتين وHFD التي يسببها تشحم الكبد 13. وعلاوة على ذلك، مؤسسة الحرمين، 1α ينظم adipocyالشركة المصرية للاتصالات الخلايا في الجسم الحي في المختبر 9.

يصف هذا البروتوكول طرق للدراسة في وضع لكشف الخصائص الجزيئية للخلية شحمية التوازن في فئران بالغة. فإنه يدل على مدى الخلايا وانتشارها وتمايز الخلايا الشحمية في الجسم الحي في المختبر يمكن أن ينظمها نقص الأكسجين. للقيام بذلك، ونحن نستخدم الفئران مع خلية شحمية حذف معين من فرا-2 الناتجة عن عبور الفئران تحمل فرا-2 الأليلات floxed مع الفئران Fabp4-CreERT 9. باستخدام Fabp4-لجنة المساواة العرقية الفئران ERT، والحذف خلية شحمية محددة ومحرض عن طريق الحقن تاموكسيفين 14. لنموذج بالغ، يتم تنفيذ الحقن البريتوني داخل عقار تاموكسيفين على مدى 5 أيام متتالية بدءا من سن 6 أسابيع. وهكذا، وتعرض الفئران لنظام غذائي طبيعي أو ارتفاع الدهون في النظام الغذائي لمدة 6 أسابيع قبل إجراء التحليل. كانت الفئران المستخدمة في هذه الدراسة من الذكور بناء على خلفية C57Bl6 لتجنب الهرمونات الأنثوية، مثل هرمون الاستروجين، كما هو موضح لتنظيم هيئة توزيع الدهون 15. قد باستخدام خلفية وراثية أخرى أيضا تغيير النمط الظاهري الأيض، بسبب الخلافات المتعلقة السلالة في إدارة الدهون 16.

يوضح هذا البروتوكول كيفية تحليل AT تحت نقص الأكسجين باستخدام الأنسجة وكيفية تحديد الخلايا خلية شحمية، وانتشار والتمايز في الجسم الحي باستخدام المناعية والجينية ويحلل التنميط. الانتهاء من دراسة قام بها في التجارب المختبرية، والتي تبين كيفية تحليل التمايز خلية شحمية الابتدائي وموت الخلايا المبرمج تعديلها من قبل التعرض لنقص الأكسجين.

Protocol

الأخلاق بيان: إيواء الحيوانات في ظروف موحدة فقا للمبادئ التوجيهية للقانون رعاية الحيوان الألمانية. ويتم تغذية الحيوانات معيار النظام الغذائي والمياه الإعلانية بالمال وبالشهرة أيضا وأبقى مع دورة اليوم / ليلة 12 ساعة. أذن كل التجارب على الحيوانات من قبل لجنة الأخلاق المحلية.

1. في تحليل فيفو من خلية شحمية التوازن في الذكور البالغين

  1. لتحديد نقص الأكسجين في الجسم الحي، أولا تحديد وزن الجسم من الفئران، ثم حقن 60 مجم / كجم من وزن الجسم من هيدروكلوريد pimonidazole الصلبة داخل peritoneally (على سبيل المثال: ضخ 1.5 ملغ إلى 25 غراما الماوس). Pimonidazole هو علامة ميتة فعالة، والتي تشكل adducts مع مجموعة ثيول في البروتينات، والببتيدات والأحماض الأمينية وتم الكشف من قبل الأجسام المضادة المحددة.
  2. التضحية الفئران وإزالة منصات الدهون perigonadal (الشكل 1).
    1. 45 دقيقة بعد الحقن، والتضحية الفئران عن طريق CO 2 الخنق وخلع عنق الرحم لاحق. </ لى>
    2. أحدد أطرافه من الفئران (كما هو موضح في الشكل رقم 1) وفتح التجويف البريتوني. إزالة اليسار واليمين perigonadal وحة (بربخي) الدهون داخل التجويف البريتوني.
      ملاحظة: لوحة الدهون لا بد أن البربخ من قبل منشورات البريتوني كما هو مبين في الشكل رقم 1 (perigonadal يشار إلى منصات الدهون التي كتبها السهام).
    3. الحرص على إزالة أنسجة الغدد التناسلية من لوحة الدهون. تحديد الأوزان وسادة دهنية لحساب النسبة: وزن الوسادة الدهنية (ز) في وزن الجسم (ز).

شكل 1
الشكل 1: موقع منصات الدهون perigonadal في التجويف البريتوني من الفئران. صورة لتوطين الدهون perigonadal في فئران بالغة بعد التضحية. يشار إلى منصات الدهون Perigonadal من السهام. الرجاء النقر هنا لضدiew نسخة أكبر من هذا الرقم.

  1. تجميع لمحة التعبير الجيني الكمي، استخدم واحد سادة دهنية perigonadal لعزل الحمض النووي الريبي. ملاحظة: حتى تتم معالجة الأنسجة، وعينات الأنسجة مخزن في حل استقرار الحمض النووي الريبي في -80 درجة مئوية أو في النيتروجين السائل.
    1. لتجانس منصة الدهون، إضافة لوحة الدهون إلى 1 مل على مرحلة واحدة حل ثيوسيانات غوانيدين والفينول. استخدام الأنابيب التي تحتوي على حبات السيراميك (1.4 ملم) لسحق أنسجة في الخالط في 6500 دورة في الدقيقة (2 مرات 20 ثانية، مع 30 ثانية وقفة).
    2. عزل الحمض النووي الريبي على النحو التالي (طريقة خطوة واحدة من قبل Chomczynski وساكي 17).
      1. لفصل مراحل، ونقل متجانسة منصة الدهون إلى أنبوب microcentrifuge، إضافة 0.2 مل حجم الكلوروفورم، يهز لمدة 15 ثانية، واحتضان لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة وأجهزة الطرد المركزي 12000 x ج لمدة 5 دقائق. نقل المرحلة المائية العليا (حوالي 400 ميكرولتر)، التي تحتوي على الحمض النووي الريبي، في أنبوب microcentrifuge جديد. لا تشمل الحمض النووي يحتوي علىجي البيني أو مرحلة الفينول التي تحتوي على البروتين.
      2. لترسيب الحمض النووي الريبي، إضافة 1 حجم الأيزوبروبانول، ومزيج احتضان لمدة 15 دقيقة في 4 درجات مئوية (من الممكن أيضا لاحتضان عند -20 درجة مئوية خلال الليل). أجهزة الطرد المركزي في 12000 x ج لمدة 10 دقيقة. إزالة الأيسوبروبانول طاف بعناية. يغسل مرتين مع 75٪ من الإيثانول مع الخطوات الطرد المركزي من 12000 x ج لمدة 10 دقيقة.
      3. بعد تجفيف الحمض النووي الريبي عجل لحوالي 10 دقيقة في درجة حرارة الغرفة، ويحل في 50 ميكرولتر H 2 O (ريبونوكلياز خالية). لتسهيل هذا، واحتضان لمدة 2 دقيقة عند 65 درجة مئوية.
        ملاحظة: حافظ على الحمض النووي الريبي في 75٪ من الإيثانول في -80 درجة مئوية أو في النيتروجين السائل لتخزين على المدى الطويل.
      4. قياس الاستعدادات RNA التي كتبها A 260/280 (حاصل الأمثل هو بين 1.8 و 2.2) وحساب تركيز بواسطة A 260:
        المعادلة 1
    3. لتجنب التلوث الحمض النووي، وهضم 1 ميكروغرام من إعداد RNAمع 1 يو الدناز أنا لمدة 30 دقيقة عند 37 درجة مئوية في حجم 10 ميكرولتر. تعطيل عند 65 درجة مئوية لمدة 10 دقيقة.
      ملاحظة: هذه الخطوة اختيارية.
    4. استخدام 10 ميكرولتر من إعداد الحمض النووي الريبي التي تحتوي على 1 ميكروغرام RNA لالناسخ رد فعل عكسي لتوليد واحد الذين تقطعت بهم السبل [كدنا]، ومناسبة لتطبيق PCR الكمي. يتم سرد المكونات ومقاديرها في الجدول 1.
    5. استخدام ميكس ماجستير PCR لالكمي في الوقت الحقيقي PCR رد فعل. لتحديد التغيرات الأيضية في لوحة الدهون كلها، استخدام بادئات محددة لجينات لها دور في AT التوازن (الجدول 2) وشروط الاسترداد الواردة في الجدول 3.
    6. في الوقت الحقيقي تحليل البيانات PCR.
      1. تحديد خط الأساس (الشكل 2)، وعادة دورة 1-15، حيث لا يوجد أي تغيير في إشارات مضان. وPCR البرمجيات في الوقت الحقيقي طبيعتها إشارات مضان محددة لمضان خط الأساس والصبغة إشارة الداخلي، ROX، مما أدى إلىحجم إشارات محددة من قبل الاشعال، دلتا آكانيوز (ΔRn).
      2. تعيين عتبة ضمن المرحلة الأسي لمنحنى التضخيم. يحدد تقاطع دورة عتبة (CT). واستنادا إلى قيمة CT، حساب التعبير النسبي (ΔCt) وتغيير أضعاف (ΔΔCt):
        المعادلة 1
        المعادلة 1
مكون حجم ميكرولتر / رد فعل
10X RT العازلة 2.0
25X dNTP ميكس (100 ملم) 0.8
10X RT الاشعال عشوائية 2.0
MultiScribe الناسخ العكسي 1.0
Nuclease خالية من H 2 O 4.2
1 ميكروغرامRNA 10
مجموع في رد الفعل 20

الجدول 1: المكونات مع حجم كل منها لالناسخ رد فعل عكسي لتوليد [كدنا احد الذين تقطعت بهم السبل.

الاسم الكامل الرسمي رمز تسلسل 3'-> 5'
إلى الأمام عكسي
تكون الشحم دلتا مثل 1 homolog (PREF-1) Dlk1 GACACTCGAAGCTCA
CCTGG 		GGAAGGCTGGGACGG
GAAAT
في وقت مبكر B عامل خلية 1 Ebf1 CCACCATCGACTACGG
CTTC 		TCCTGGTTGTTGTGGGG
CATC
الزنك البروتين الاصبع 423 Zfp423 GTGCCCAGGAAGAAGA
CGTA 		GGCGACGTGGATCTGA
ATCT
الأحماض الدهنية بروتين ملزمة 4 (AP2) Fabp4 TCACCTGGAAGACAGCT
CCTC 		AAGCCCACTCCCACTTC
TTTC
CCAAT / محسن ملزم بروتين (C / EBP)، ألفا Cebpa AAGAGCCGCGACA
AGGC 		GTCAGCTCCAGCACCT
TGTG
CCAAT / محسن ملزم بروتين (C / EBP)، بيتا Cebpb TTTCGGGACTTGATGC
AATC 		CCGCAGGAACATCTTT
AAGG
مخيم عنصر استجابة البروتين 1 ملزمة Creb1 ACTCAGCCGGGTACT
ACCAT 		TTGCTGCCTCCCTGTT
CTTC
CCAAT / محسن ملزم بروتين (C / EBP)، دلتا Cebpd CAGCGCCTACATTGAC
TCCA 		GTTGAAGAGGTCGGCG
AAGA
Kruppel مثل عامل 4 Klf4 GCAGTCACAAGTCCCC
TCTC TAGTCACAAGTGTGGG
TGGC
استجابة النمو في وقت مبكر 2 (Krox20) Egr2 AGGCGGTAGACAAAATC
التعديلات الدستورية المركزية 		GATACGGGAGATCCAG
GGGT
بيروكسية ناشر تنشيط مستقبلات غاما Pparg AGAGGTCCACAGAGCTG
ATTC 		GATGCACTGCCTATGAGC
ACTT
تكون الدهون أسيتيل التميم A ألفا كربوكسيلاز Acaca TGGGGACCTTGTCTTCA
TCAT 		ATGGGCGGAATGGTCTC
TTTC
الدهنية سينسيز حامض FASN ACATCCTAGGCATCC
غاغا 		CCGAGTTGAGCTGGGT
TAGG
ستيرويل الإنزيم التميمي-أنزيم desaturase 1 Scd1 CGGGATTGAATGTTCTTG
TCGT 		TTCTTGCGATACACTCTG
GTGC
تحلل الدهون containi نطاق فسفوليباز مثل Patatinنانوغرام 2 Pnpla2 AAGGACCTGATGACCA
CCCT 		CCAACAAGCGGATGGT
جاج
الدهنية امتصاص حمض البروتين الدهني الليباز LPL GTATCGGGCCCAGCAA
CATTATCC 		GCCTTGCTGGGGTTTTC
TTCATTC
CD36 مستضد Cd36 GTCTTCCCAATAAGCATGT
CTCC 		ATGGGCTGTGATCGGA
ACTG
نقص الأكسجة نقص الأكسجة عامل محرض 1، فرعية ألفا Hif1a CCTGCACTGAATCAAGAG
GTGC 		CCATCAGAAGGACTTGCT
GGCT
البطانية PAS البروتين نطاق 1 (المعروف أيضا باسم: مؤسسة الحرمين، 2alpha) Epas1 CAAGCTGAAGCTAAAG
CGGC 		TTGGGTGAATTCATCG
GGGG
فون هيبل لينداو الكابتة للورم VHL ACCGAGGTCATCTTTG
GCTC 		TTCCGCACACTTGGGT
AGTC
translocator النووي أريل الهيدروكربونية مستقبلات (المعروف أيضا باسم: مؤسسة الحرمين، 1beta) ارنت TGGGTCATCTTCTCGC
GGTT 		TGTCCTATCTGAGCAT
CGTG

الجدول 2: قائمة من الجينات مع تسلسل الاشعال منها تستخدم لتحليل خلية شحمية التوازن.

خطوة درجة الحرارة (° C) الوقت (دقيقة: ثانية)
تفعيل البلمرة عقد 95 10:00
PCR 40 دورة Denaturize 95 00:15
الصلب / تمديد 60 01:00
منحنى ذوبان 60-95 0.5 ° C / ثانية

الجدول 3: في الوقت الحقيقي شروط الاسترداد.

الشكل 2
الشكل 2: خصائص الوقت الحقيقي منحنى PCR التضخيم الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

  1. لإجراء التحليل النسيجي للتوازن خلية شحمية، استخدم الثانية وحة الدهون perigonadal. لا يجفف النسيج!
    1. إصلاح لوحة الدهون في 3.7٪ الفورمالديهايد مخزنة برنامج تلفزيوني بين عشية وضحاها، تضمينها في البارافين (اتبع التعليمات كما هو موضح في مكان آخر 18) وقطع الأنسجة جزءا لا يتجزأ في 2-5 ميكرون أبواب سميكة (بحد أقصى 5 ميكرون).
    2. تحديد عدد الخلايا الشحمية في الميدان، وحجم خلية شحمية تحت المجهر مشرق الميدان بعد الهيماتوكسيلين ويوزين (H & E) تلطيخ: <رأ>
    3. Deparaffinize أقسام عن طريق الغسيل 3 مرات لمدة 5 دقائق في الزيلين وترطيب الجزء 2 مرات لمدة 2 دقيقة في الإيثانول بنسبة 100٪ و 2 مرات لمدة 2 دقيقة في 96٪ من الإيثانول. وأخيرا، وغسل القسم في H المقطر 2 O لمدة 5 دقائق.
    4. وصمة عار مع الهيماتوكسيلين، المخفف 1: 5 مع H المقطر 2 O، لمدة 10 دقيقة في درجة حرارة الغرفة، ويغسل في H 2 O لمدة 5 دقائق. وصمة عار مع حل يوزين (20 مل 5٪ يوزين Y / 210 مل المقطر H 2 O / 25 ميكرولتر حمض الخليك الجليدي) لمدة 30 ثانية، وأغسلها مرة أخرى مع H 2 O لمدة 5 دقائق.
    5. يذوى المقاطع باستخدام 96٪ من الإيثانول و 100٪ من الإيثانول 2 مرات كل لمدة 2 دقيقة، والزيلين 3 مرات لمدة 5 دقائق. جبل الأقسام مع وكيل تصاعد اللامائية.
    6. تقييم أقسام تحت المجهر مشرق الميدان. ويرد مثال ممثل كيفية تحليل الخلايا الشحمية مع يماغيج 1.48v 19 في الشكل. 3: عدد الخلايا في منطقة (ميكرون 2)، مساحة الخلية (× 10 3 ميكرون 2
    7. فتح صورة للقسم مع 1.48v يماغيج. إذا يشار إلى معالم الصورة في بكسل بدلا من وحدة الطول، وضبط الحجم.
    8. حدد * خط * مستقيم في شريط الأدوات وضبط الخط لمسافة يعرف بالرجوع إلى شريط النطاق. الذهاب إلى تحليل -> مجموعة مقياس يتم عرض المسافة من خط بالبكسل،. إضافة مسافة معروفة وحدة طول، على سبيل المثال، ميكرون. مع تأكيد موافق. يشار إلى أن حجم الصورة وتحليل المعلمات في وحدة طول معين.
    9. لتحديد معالم الخلايا الشحمية، وضبط عتبة. الذهاب إلى صورة -> ضبط -> عتبة لفتح نافذة عتبة. اختر الإعدادات التالية: طريقة استيفاء الحد الأدنى: افتراضي؛ اللون عتبة: B & W، مساحة اللون: HSB. ويظهر في الصورة الآن باللونين الأبيض والأسود. ضبطسطوع لمسح الخلايا الشحمية البيضاء ولإغلاق المساحات بين الخلايا السوداء، كما في الشكل. 3B.
    10. حساب عدد من خلية شحمية في ميكرون 2 (الشكل 3E) مع * متعدد نقطة * التحديد في شريط الأدوات وعلامة كل خلية لفرز الأصوات.
    11. لتحديد حجم خلية شحمية، حدد * خط * مستقيم مرة أخرى في شريط الأدوات ورسم قطر لخلية شحمية (الشكل 3C). الذهاب إلى تحليل -> قياس ونافذة جديدة ستظهر، مع طول قطرها في ميكرومتر.
    12. لتحديد منطقة خلية شحمية، حدد * العصا (تتبع) أداة * وانقر داخل خلية شحمية. يتم تحديد الجدار الداخلي للخلية شحمية في الحمراء (الشكل 3D). الذهاب إلى تحليل -> قياس ونافذة جديدة ستظهر، مع مساحة هذا خلية شحمية في ميكرون 2.
  • لimmunohistochemistry، وإعداد قسم للأجسام المضادة وبوساطة TDT-dUTP البيوتين نيك نهاية الوسم (النفق) تلطيخ على النحو التالي:
    1. Deparaffinize أقسام عن طريق الغسيل 3 مرات لمدة 5 دقائق في الزيلين وترطيب الجزء 2 مرات لمدة 2 دقيقة في الإيثانول بنسبة 100٪ و 2 مرات لمدة 2 دقيقة في 96٪ من الإيثانول. وأخيرا، وغسل القسم المقطر H 2 O.
    2. لاسترجاع مستضد، هضم قسم الأنسجة لمدة 30 دقيقة عند 37 درجة مئوية مع بروتين K الحل العمل (20 ميكروغرام / مل في 10 ملي تريس / حمض الهيدروكلوريك، ودرجة الحموضة 7،4-8) وشطف مع برنامج تلفزيوني.
  • أداء تلوين الأجسام المضادة في غرف رطبة:
    1. لمنع البيروكسيداز الذاتية، استخدام 3٪ بيروكسيد الهيدروجين في برنامج تلفزيوني لمدة 10 دقيقة، مع غسل في وقت لاحق 2 مرات لمدة 5 دقائق في برنامج تلفزيوني. لمنع الربط غير محددة من الأجسام المضادة، استخدم 10٪ مصل في برنامج تلفزيوني. استخدام المصل من مجموعة من الأجسام المضادة الثانوية، في هذه الحالة الماعز.
    2. لتلطيخ، استخدام الأجسام المضادة لموت الخلايا المبرمج وانتشارها والكشف عن نقص الأكسجة (
    3. لتعزيز إشارة استخدام الأجسام المضادة الثانوية المعقدة البيروكسيديز، مع التخفيف على النحو المبين في الجدول رقم 5. للكشف عن نقص الأكسجة، واستخدام برنامج الصحة الإنجابية أرنب مترافق مكافحة FITC كما الأجسام المضادة الثانوية. احتضان لمدة 1 ساعة في درجة حرارة الغرفة. غسل أقسام 2 مرات 5 دقائق مع برنامج تلفزيوني.
      ملاحظة: للحصول على تلطيخ نقص الأكسجة مع FITC-MAb1، تخطي الخطوة 1.4.4.4) وتابع الخطوة 1.4.4.5).
    4. لكل شريحة، قبل احتضان 50 ميكرولتر حل أفيدين مع 50 ميكرولتر البيروكسيديز البيروكسيديز H لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة (ويشار إلى هذه الطريقة أيضا على أنها أفيدين / البيوتين ABC صياغة معقدة) ثم إضافة إلى أقسام لمدة 45 دقيقة أخرى. غسل 2 مرات لمدة 5 دقائق مع برنامج تلفزيوني.
    5. احتضان المقاطع في حل البيروكسيديز الركيزة حتى تصبح تلطيخ أكثر كثافة (ما بين 5 إلى 10 دقيقة). يغسل لمدة 5 دقائق مع المقطرH 2 O.
    6. لcounterstaining، وصمة عار مع الهيماتوكسيلين المخفف 1: 5 مع H المقطر 2 O لمدة 10 دقيقة في درجة حرارة الغرفة، وأغسلها في H 2 O لمدة 5 دقائق.
    7. يذوى المقاطع في 96٪ من الإيثانول و 100٪ من الإيثانول 2 مرات كل لمدة 2 دقيقة، والزيلين 3 مرات لمدة 5 دقائق. ختم الأجزاء مع coverslips وكيل تصاعد اللامائية. تقييم أقسام تحت المجهر مشرق الميدان.
  • تحديد الخلايا التي النفق فحص واتبع تعليمات الشركة الصانعة:
    1. إضافة 50 ميكرولتر حل الانزيم في 450 حل التسمية ميكرولتر. ثم تطبيق 50 ميكرولتر النفق رد فعل الخليط على أقسام نسيجية واحتضان لمدة 60 دقيقة في +37 درجة مئوية في جو مرطب في الظلام. غسل أقسام 3 مرات مع برنامج تلفزيوني لمدة 5 دقائق وجبل مع مضان تصاعد المتوسطة بما في ذلك دابي (4، 6 diamidino-2-phenylindole) لcounterstaining.
    2. تقييم قسم تحت المجهر مضان مع 100 تعظم أضعاف أيون. لقياس فلوريسئين استخدام الطول الموجي الإثارة من 488 نانومتر، وكشف ما بين 515-565 نانومتر (ليزر أخضر)؛ دابي يثير في حوالي 360 نانومتر، وتنبعث عند حوالي 460 نانومتر عند منضمة إلى الحمض النووي (الليزر الأزرق).
    3. قياس تراكب من دابي وفلوريسئين:
      المعادلة 1

    • الشكل (3)
    الشكل 3: تحليل خصائص خلية شحمية في أقسام وحة الدهون الصور قسم لوحة الدهون perigonadal من ذكور الفئران تعامل مع اتباع نظام غذائي عالي الدهون (HFD) أو النظام الغذائي العادي (ND) مع المجهر مشرق الميدان (أ)؛ يتم ضبط عتبة إلى حجم خلية شحمية أبيض وأسود (ب) و (الطول؛ ج) ومنطقة (د) وعدد الخلايا خلية شحمية في مم 2 (ه) وكميا مع 1.48v يماغيج.و = "https://www.jove.com/files/ftp_upload/53822/53822fig3large.jpg" الهدف = "_ فارغة"> الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

    تركيز الأسهم تخفيف
    موت الخلايا المبرمج ملصوق كاسباس 3 (Asp175) (5A1E) الأرنب ماب 1: 2000
    تكاثر تنقيته ماوس مكافحة البشري كي-67 استنساخ B56 (RUO) 01:50
    نقص الأكسجة مؤسسة الحرمين، 1 ألفا المضاد 1: 100
    FITC-MAb1 1: 100

    الجدول 4: الأجسام المضادة مع التخفيف منها تستخدم لتلطيخ immunohistological من أقسام AT.

    الجسم المضاد تخفيف
    المضادة المعقدة البيروكسيديزالماوس مفتش (H + L) 1: 200
    المعقدة البيروكسيديز مفتش الماوس المضادة (H + L) 1: 200
    برنامج الصحة الإنجابية تقارن أرنب مكافحة FITC 1: 100

    الجدول 5: الأجسام المضادة الثانوية مع تخفيف تستخدم لتلطيخ immunohistological.

    2. في تحليل المختبر من خلية شحمية التوازن تأثر نقص الأكسجة

    1. التضحية الفئران وإزالة الأنسجة الدهنية تحت الجلد.
      1. التضحية الفئران عن طريق CO 2 الخنق وخلع عنق الرحم لاحق.
      2. أحدد أطرافه من الفئران كما هو موضح في الشكل (4). فصل الجلد من الساق العلوية، الخاصرة والجناح ويعلقون عليه مع الإبر كما في الشكل (4). ثم إزالة الأنسجة الدهنية تحت الجلد، والذي يقع الخلفي في قاعدة رجليه الخلفيتين، المحيطة الغدد الليمفاوية الأربية (كما هو موضح في الشكل (4)، اليسار: تحت الجلد لوحة الدهونق المشار إليها السهام. الحق: العقدة الليمفاوية الأربية الذي يشير إليه السهم).

    الشكل (4)
    الشكل 4: موقع منصات الدهون تحت الجلد. صورة لوحة الدهون تحت الجلد. الأسهم اليسرى تشير لوحة الدهون تحت الجلد والسهم الأيمن يشير إلى العقدة الليمفاوية الأربية. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

    1. عزل الخلايا الجذعية الدهنية المشتقة (ADSC) كما هو موضح سابقا 20.
    2. البذور ADSC 4000 خلية / سم 2 والتي Dulbecco تعديل النسر متوسطة هام من طراز F-12 تستكمل مع 10٪ مصل طبيعي في ربلة الساق، 1٪ البنسلين / الستربتومايسين، 0.5٪ الأمفوتريسين B، 16 ميكرومتر البيوتين، 18 ميكرومتر حمض البانتوثنيك و 100 حمض ميكرومتر الاسكوربيك و تنمو ثقافة للالتقاء حول 70-80٪ التي تم التوصل إليها بعد 4-6 أيام من الثقافة.
    3. حمل مكون الشحم التمايز.
      1. إزالة ADSC ملتصقة من السطح بواسطة التربسين العلاج.
        1. إزالة المتوسطة، ويغسل مع برنامج تلفزيوني وإضافة 0.025٪ محلول التربسين (مسخن إلى 37 درجة مئوية) لمدة 2 دقيقة (حتى فصل الخلايا من السطح). على الفور إضافة المتوسطة وغسل الخلايا.
      2. عد الخلايا باستخدام غرفة نويباور.
        1. وضع غطاء زجاجي على المنطقة الوسطى من غرفة نويباور. تمييع تعليق خلية 01:10 وتحميل غرفة مع 10 ميكرولتر المخفف تعليق خلية. عدد الخلايا في 4 مربعات تقع في زوايا، ويتألف من 16 مربعات صغيرة لكل منهما. حساب عدد الخلايا لكل مل:
          المعادلة 1
      3. ADSC البذور (كما هو موضح في النقطة 2.2) في لوحات ثقافة 12-جيدا وتنمو ثقافة لالتقاء حوالي 70 إلى 80٪ (تم التوصل إليها بعد 4-6 أيام).
      4. حمل adipogeالتمايز شركة الاستثمارات الوطنية عن طريق إضافة 5 ميكروغرام / مل الانسولين، ديكساميثازون 1 ميكرومتر و 5 ميكرومتر 3-إيسوبوتيل-1-الميثيل (IBMX) إلى الثقافات. تجديد المتوسط ​​كل يوم 2. سيتم التفريق بين الخلايا تماما بعد 7 أيام.
    4. لتحليل التمايز مكون الشحم، وصمة عار مع النفط الأحمر O، التي بقع الدهون الثلاثية في الخلايا الشحمية ناضجة.
      ملاحظة: يجب تنفيذ العمل تحت غطاء الدخان!
      1. إزالة المتوسطة، وغسل الخلايا الشحمية بلطف مع برنامج تلفزيوني وإصلاح الخلايا لمدة 60 دقيقة مع 2 مل 10٪ من الفورمالين.
      2. لإعداد النفط الأحمر يا حل تلطيخ، خلط 3 أجزاء من الحل الأحمر النفط يا الأوراق المالية (300 ملغ الأحمر النفط يا مسحوق يذوب في 100 مل 99٪ الأيزوبروبانول) مع 2 أجزاء المقطر H 2 O، واحتضان لمدة 10 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. تصفية حل العاملة النفط الأحمر O من خلال مرشح حقن 0.2 ميكرومتر.
        ملاحظة: الحل العملي هو مستقر لمدة 2 ساعة.
      3. لتلطيخ النفط الأحمر O، إزالة الفورمالين، وغسل الخلايا الشحمية مع H 2
      4. تقييم لوحات تحت المجهر النقيض من المرحلة مع 100 التكبير أضعاف. فإن الدهون من الخلايا الشحمية تظهر أحمر وسوف تظهر نواة الأزرق.
    5. خطوة اختيارية: إسكات الجينات من الاهتمام من قبل ترنسفكأيشن مع shRNA.
      1. تغيير المتوسطة وإضافة المصل خالية المتوسطة.
      2. لترنسفكأيشن من الخلايا الشحمية، استخدم lipofection. اتبع إرشادات الشركة المصنعة واستخدام 1 ميكروغرام shRNA في لوحات الأنسجة 12-جيدا. بعد إضافة دهون، الحمض النووي معقد، واحتضان الخلايا الشحمية لمدة 48 ساعة على 37 درجة مئوية.
    6. لتحليل الخلايا الشحمية تعرض لنقص الأكسجين، واستخدام محطة عمل ميتة أو حاضنة نقص الأوكسجين للحفاظ على الخلايا تحت ظروف نقص الأوكسجين. حسب الدراسة، نقص الأكسجة جولد يكون 0.5، 1 أو 2٪ من الأكسجين.
      1. تحليل الخلايا عن طريق FITC المسمى Annexin الخامس وتدفق لاحقة يحلل الخلوي.
        1. جمع الخلايا الشحمية مع مكشطة خلية لينة اضافية، ويغسل مع برنامج تلفزيوني وإضافة 1 × 10 6 خلايا إلى 100 ​​ميكرولتر Annexin عازلة ملزم الخامس (10 ملي HEPES / هيدروكسيد الصوديوم، ودرجة الحموضة 7.4، 140 مم كلوريد الصوديوم، 2.5 ملي CaCl 2). إضافة كمية من Annexin V-FITC الموصى بها من قبل الشركة المصنعة ويحضن في درجة حرارة الغرفة لمدة 15 دقيقة.
        2. لالتدفق الخلوي القياس، إضافة 200 ميكرولتر Annexin عازلة ملزم V و 1 ميكرومتر من مباين النووية. تحديد مضان في القناة الخضراء والبنفسجي. يتم تعريف Annexin V + / مباين النووية + الخلايا كما نخرية الثانوي وAnnexin V + / مباين النووية - وتعرف الخلايا كما الخلايا أفكارك (الشكل 5).
      2. كميا تحليل مستوى الحمض النووي الريبي خلية شحمية لتحديد التوازن تحت ظروف نقص الأوكسجين.
        1. إضافة1 مل من محلول على مرحلة واحدة من ثيوسيانات غوانيدين والفينول إلى كل بئر وعزل الحمض النووي الريبي [باستخدام طريقة خطوة واحدة من قبل Chomczynski وساكي 17 (الخطوة 1.3.2)]، والمضي قدما كما هو الحال في الخطوات 1.3.2.1) ل1.3.5.2) .

    الرقم 5
    الرقم 5: تحليل الخلايا خلية شحمية التدفق الخلوي. نقطة العروض مؤامرة من نظام مراقبة الأصول الميدانية لAnnexin-V FITC وTO-PRO-3 تلطيخ الخلايا الشحمية. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

    Representative Results

    وتبين لنا كيفية تحديد خلية شحمية التوازن في الجسم الحي في المختبر باستخدام المثال من فرا-2 فلوريدا / فلوريدا الفئران Fabp4-CreERT مقارنة البرية من نوع تتزاحم. ويحدد بروتوكول لدينا كيف يرتبط ارتباطا وزيادة التعبير مؤسسة الحرمين من نقص الأكسجين مع اختلال وظيفي خلية شحمية كما يدل على زيادة الخلايا خلية شحمية.

    الفئران زيادة حجم خلية شحمية ومنطقة في اتباع نظام غذائي عالي الدهون (HFD) يعامل

    الإفراط في التغذية، من بين عوامل أخرى، يؤدي إلى تضخم خلية شحمية، بسبب التخزين المفرط للطاقة في قطرات الدهون. حجم خلية شحمية والمنطقة هو مؤشر تضخم. أقسام لوحة الدهون من الطبيعي (ND، الشكل 6A) واتباع نظام غذائي عالي الدهون (HFD، الشكل 6B) الفئران وكذلك التحديد الكمي لحجم خلية شحمية ومنطقة تظهر بوضوح خلية شحمية تضخم بعد 6 أسابيعالصورة من HFD، وهو ما أشار إليه عن طريق زيادة حجم خلية شحمية في الفئران HFD المعالجة (الشكل 6C ود).

    زيادة نقص الأكسجة في الأنسجة الدهنية (AT) من الكبار فرا-2 فلوريدا / فلوريدا Fabp4-CreERT الفئران يؤدي إلى زيادة مستوى مؤسسة الحرمين، 1α وموت الخلايا المبرمج خلية شحمية

    لتحديد حالة في الجسم الحي من نقص الأكسجين في AT، فرا-2 فلوريدا / فلوريدا ويتم تحليل الفئران Fabp4-CreERT 6 أسابيع بعد فرا-2 الحذف في سن 12 أسبوعا ومقارنة مع من النوع البري تتزاحم. يدار Pimonidazole للفئران داخل الصفاق باعتباره علامة نقص الأكسجة فعالة؛ فمن غير سامة وقادرة على توزيع في AT. وتعرف الخلايا الشحمية نقص الأوكسجين في AT في الجسم الحي من قبل تلوين الأجسام المضادة المناعية (الشكل 7A). وعلاوة على ذلك، ويرافق زيادة حالة نقص الأوكسجين من AT في الفئران عن طريق زيادة مؤسسة الحرمين، 1α ADIP إيجابيocytes كما يدل على ذلك المناعى تلطيخ الشكل 7B)، وهو ما يؤكده الكمي لمستويات التعبير عن مؤسسة الحرمين 1α والجينات أهدافها 9. بالإضافة إلى ذلك، النفق تلطيخ أقسام AT من فرا-2 فلوريدا / فلوريدا الفئران Fabp4-CreERT وتتزاحم التحكم (الشكل 7C) تبين أن زيادة يرتبط موت الخلايا المبرمج خلية شحمية مع وجود نقص الأكسجة والتعبير عن مؤسسة الحرمين 1α.

    زيادة التعبير عن مؤسسة الحرمين 1α في الخلايا الشحمية الأولية من خلال نقص الأكسجة الناجم عن خلية شحمية موت الخلايا المبرمج

    لتحليل خلية شحمية الخلايا في المختبر، ونحن نستخدم الخلايا الشحمية الناتجة عن منصات الدهون تحت الجلد كما هو موضح في مكان آخر (20). كما هو متوقع، يتم زيادة التعبير عن مؤسسة الحرمين 1α في الخلايا الشحمية بعد 24 ساعة من نقص الأكسجة (الشكل 8A). لمزيد من تحليل أنشطة مؤسسة الحرمين 1α، ومستويات الحمض النووي الريبي الهدف مؤسسة الحرمينوكميا الجينات مثل Inos (محرض أكسيد النيتريك سينسيز) من خلال QPCR الشكل يظهر 8B أن زيادة تعبير عن مؤسسة الحرمين، 1α تحت ظروف نقص الأوكسجين يؤدي إلى زيادة مستوى Inos مرنا. منذ أظهرنا بالفعل في الجسم الحي (الشكل 8) أن زيادة التعبير عن مؤسسة الحرمين 1α في الخلايا الشحمية يرتبط مع زيادة الخلايا خلية شحمية، وكميا موت الخلايا المبرمج أيضا في المختبر في الثقافات التي كتبها Annexin V تلطيخ تحت ظروف نقص الأوكسجين. وتمشيا مع المجراة البيانات (الشكل 7)، ويرافق زيادة مستوى مؤسسة الحرمين، 1α عن طريق زيادة الخلايا خلية شحمية الناجمة عن ظروف نقص الأوكسجين (الشكل 8B). وعلاوة على ذلك، لإثبات أن الخلايا التي يسببها نقص الأوكسجين هي التي تعتمد على مؤسسة الحرمين. وأسكت مؤسسة الحرمين، 1α أو مؤسسة الحرمين، 2α التي تدخل الحمض النووي الريبي في الخلايا الشحمية المستمدة من النوع البري أو فرا-2 الفئران ناقص. استعادة زيادة الخلايا خلية شحمية عن طريق إسكات مؤسسة الحرمين، 1α أو مؤسسة الحرمين، 2α كما هو مبين من قبل Annexin V تلطيخ في الشكل 8B، مما يثبت أن أجهزة الاستشعار نقص الأكسجة مؤسسة الحرمين، α ينظم موت الخلايا المبرمج خلية شحمية.

    الشكل (6)
    الشكل 6: زيادة حجم خلية شحمية والمنطقة في ارتفاع الدهون في النظام الغذائي (HFD) الفئران (أ، ب) H & E تلطيخ مقاطع من لوحة الدهون perigonadal من الذكور الفئران من النوع البري تتغذى على نظام غذائي عادي (بدون تاريخ) (أ) أو عالية. النظام الغذائي -fat (HFD) (ب) لمدة 6 أسابيع. تمثل القضبان 500 ميكرون. (ج، د) التحديد الكمي لحجم خلية شحمية (ج) ومنطقة (د) من لوحة الدهون perigonadal البرية من نوع الفئران التي تغذت على ND (أ) أو HFD (ب) لمدة 6 أسابيع. ن = ترد 10. بيانات القيم المتوسطة كما ± SEM. تم إجراء التحليل الإحصائي باستخدام Student's ر -test. *** ع <0.0001.: //www.jove.com/files/ftp_upload/53822/53822fig6large.jpg "الهدف =" _ فارغة "> الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

    الرقم 7
    الرقم 7: زيادة مستوى مؤسسة الحرمين، 1α وموت الخلايا المبرمج في الخلايا الشحمية من الكبار فرا-2 فلوريدا / فلوريدا الفئران Fabp4-CreERT. نقص الأكسجة (أ) ومؤسسة الحرمين، 1α (ب) تلطيخ في AT من الذكور فرا-2 فلوريدا / فلوريدا الفئران Fabp4-creERT وتتزاحم سيطرة الذكور 6 أسابيع بعد الحقن تاموكسيفين. التكبير 20X، 40X إدراج. وتشير السهام السوداء مناطق ميتة والخلايا إيجابية-مؤسسة الحرمين 1α. (ج) النفق تلطيخ في فرا-2 فلوريدا / فلوريدا الفئران Fabp4-CreERT وتتزاحم تحكم في 6 أسابيع بعد الحقن تاموكسيفين. التكبير 20X، 40X إدراج. السهام السوداء تشير الخلايا إيجابية النفق. تم تعديل هذا الرقم من لوثر وآخرونآل 9. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

    الرقم 8
    الرقم 8: زيادة التعبير عن مؤسسة الحرمين 1α وخلية شحمية موت الخلايا المبرمج في الخلايا الشحمية الأولية الناجمة عن نقص الأكسجة (أ) تحليل PCR في الوقت الحقيقي من مؤسسة الحرمين، 1α وHIFs الهدف مستويات Inos مرنا في الخلايا الشحمية الأولية وضعها في غرف ميتة التحليل على النقاط الزمنية المشار إليها. (ب) الكمي لموت الخلايا المبرمج من قبل تلطيخ Annexin V نظام مراقبة الأصول الميدانية في الخلايا الشحمية الأولية معزولة عن فرا-2 فلوريدا / فلوريدا الفئران Fabp4-CreERT أو ضوابط من النوع البري transfected مع سيطرة ش أو البلازميد ش ضد مؤسسة الحرمين، 1α أو مؤسسة الحرمين، 2α وضعت تحت نقص الأكسجين (1٪ O 2) لمدة 24 ساعة. تم تعديل هذا الرقم من لوثر وآخرون. تي الطالب. * P <0.05 و** P <تم قبول 0.01 بالمهم. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

    Discussion

    وتتميز الخلايا الشحمية ظاهريا من حجمها، وأرقام والمنطقة، وكشف عن تضخم خلية شحمية وتضخم، الناجمة عن تخزين الطاقة المفرط بسبب الإفراط في التغذية 5. هذه الأحداث التي أدت إلى التقلبات الأحماض الدهنية ومتلازمة أيضية اللاحقة ينص أيضا على زيادة كتلة الدهون مع الأيض الحفاظ عليها، والذي يشار إليه أيضا باسم التوسع الدهون "بصحة جيدة". على سبيل المثال، Kusminski وآخرون. 21 أظهرت أن الفئران مع التوسع الهائل الدهون تبقى صحية عملية الأيض، مما يشير إلى أن التوسع الدهون ليست مرتبطة بالضرورة إلى متلازمات الأيض ويجب أن يكون مصمما بعناية لتقييم خصائص الخلايا الشحمية. الأنسجة الدهنية (AT) تلعب دورا محوريا في تنظيم التمثيل الغذائي في الجسم. ايه هو أكبر جهاز الغدد الصماء التي يمكن أن تؤثر اضطراب شحوم الدم، وتصلب الشرايين، فرط وارتفاع السكر في الدم 3. تقييم AT التوازن وم الجزيئيechanisms تنظيم يمكن أن تسمح لفهم أفضل للاضطرابات الجهاز الأيضية. ولذلك، كشف آليات تنظيم خلية شحمية التمايز، وحجم خلية شحمية والدهون وسادة كتلة شأنه أن يساعد على تطوير علاجية جديدة لمعالجة اضطرابات السمنة. استخدام في الجسم الحي وفي أساليب المختبر، فمن الممكن لتحديد دور التأثيرات الغذائية والتعبير الجيني على التمايز خلية شحمية والنشاط. لتحديد التوازن AT، تحديد التوازن بين التمايز خلية شحمية وانتشارها وموت الخلايا المبرمج على النحو الذي اقترحه بروتوكول لدينا لا يقل أهمية عن تحليل الجلوكوز والأنسولين الأيض استجابة 22-24.

    يحلل التنميط التعبير عن جينات لها دور في تكون الشحم، تكون الدهون، تحلل الدهون، امتصاص الأحماض الدهنية، نقص الأكسجين، وموت الخلايا المبرمج وتكاثر في الخلايا الشحمية الابتدائية والحشوية AT هو أسلوب إنتاجية عالية للحصول على نظرة عامة على توازن خلية شحمية واختلال وظيفي في إمكانية.وينبغي مواصلة تحليل المرشحين للاهتمام على مستوى البروتين لطخة غربية أو تلطيخ immunohistological. للحصول على أفضل النتائج من خلال الوقت الحقيقي نظام PCR باستخدام cyanine الأصباغ غير متماثل، يجب اختبار تركيزات كدنا] تتراوح ما بين 1 إلى 10 نانوغرام وتركيزات التمهيدي المثلى تتراوح 50-900 نانومتر للحد من التضخيم غير محددة. العناصر الأساسية هي الاشعال. لكل شوط، تحتاج إلى رقابة صارمة لضمان خصوصية واستبعاد تشكيل dimers التمهيدي منحنيات ذوبان. لذلك، وذلك باستخدام السيطرة السلبية مع H 2 O بدلا من كدنا] ينصح. وعلاوة على ذلك، يتم توفير التجارية المتاحة cyanine الأصباغ غير متماثل كما يمزج الرئيسية التي تحتوي على صبغة إشارة سلبية (مثل ROX) لتوفير إشارة المرجعية الداخلية. وتطبيع إشارة [كدنا خلال تحليل البيانات إلى إشارات ROX لتصحيح تقلبات إشارة جيدة إلى جيدة. وثمة نقطة أخرى للنظر من أجل إنشاء غود نظام QPCR هو اختيار الجينات التدبير المنزلي. لكل حالة، وتستخدم العديد من الجينات التدبير المنزلي، وعلى سبيل المثال، HPRT، بيتا الأكتين، GAPDH، β-2-MG أو HSP90.

    البروتينات مؤسسة الحرمين استقرت ظروف نقص الأوكسجين والمنظمين سيد تحديد ليس فقط الخلايا الشحمية البقاء على قيد الحياة، ولكن أيضا تغيرات التمثيل الغذائي، مثل الجلوكوز والتسامح الأنسولين واستقلاب الشحوم 11،25،26. للتأكد من مناطق ميتة في لوحة الدهون، ويتم تحديد مؤسسة الحرمين، 1α في AT أقسام المناعية. منذ تدهورت البروتينات مؤسسة الحرمين السريع في غضون 5 إلى 10 دقيقة في ظل ظروف normoxic والداخلي وتثبيت لوحة الدهون للتحليل النسيجي يجب أن تخضع لرقابة مشددة لتجنب الوقت الكمون. لذلك، لضمان نقص الأكسجة ليس فقط من خلال تلطيخ مؤسسة الحرمين، ويستخدم pimonidazole لتحديد مناطق ميتة في AT. Pimonidazole قادر على توزيع في الأنسجة، كما تبين بالفعل في العظام 27احتفال، وفعالية مناطق ميتة من قبل ملزم للبروتينات التي تحتوي على ثيول تحديدا في خلايا ميتة، الذي هو مزيد من الكشف في أقسام النسيجية بواسطة الأجسام المضادة المحددة ملزمة 28. ومع ذلك، علامات وأساليب أخرى يمكن استخدامها لتحليل مسار نقص الأكسجة. على سبيل المثال، وإشراك prolyl هيدروكسيلاز (PHD) الإنزيم، مما يحفز الهيدروكسيل من بقايا البرولين تحت normoxia، وكذلك البروتين فون هيبل لينداو (VHL)، والتي تعترف prolines الهيدروكسيلية وحمل بولي ubiquitination للتوسط proteasomal مؤسسة الحرمين تدهور، تحتاج إلى تحليل لمحة كاملة من 29،30 المسار. وعلاوة على ذلك، فإن الكشف في كل مكان من HIFs أيضا تحديد استقرار البروتين وتدهور التي يمكن تغيير 31،32.

    وعلاوة على ذلك، يتم تحديد انتشار من قبل Ki67 وموت الخلايا المبرمج من قبل النفق تلطيخ في الجسم الحي من خلال تلطيخ أقسام النسيجية AT. الكمي الانتشار من قبل Ki67 وويتم poptosis من النفق أو Annexin V تلطيخ من خلال تحليل التدفق الخلوي أيضا إلى 33. يمكن بالطبع أن يقاس الانتشار من خلال تقنيات أخرى مثل تحليل دورة الخلية خلية شحمية، والتي لم يتم تناولها من قبل قياس خلايا إيجابية Ki67. وعلاوة على ذلك، يمكن إكمال الدراسة موت الخلايا المبرمج من قبل النفق من قبل نظام مراقبة الأصول الميدانية تحليل Annexin الخامس وTOP-PR-3 والتي ستحدد مستويات نخر مقابل عملية موت الخلايا المبرمج. موت الخلايا المبرمج هو عملية أساسية لبرنامج موت الخلية، وهو أمر مهم لشركة AT التوازن. في الواقع، وقد تورط التقلبات موت الخلايا المبرمج خلية شحمية سابقا في العمليات التي تسهم في البدانة والحثل الشحمي 34. وعلاوة على ذلك، في عام 2011، Keuper آخرون مرتبطة الدهنية التهاب الأنسجة إلى موت الخلايا المبرمج خلية شحمية. وأظهر الباحثون أن الضامة التي يسببها موت الخلايا المبرمج في preadipocytes والخلايا الشحمية، والذي بدوره جذب الضامة. تجنيد الضامة يسرع الالتهاب، والتي مقاولاتibutes لمتلازمة أيضية مثل الجلوكوز والأنسولين التسامح 35. ومع ذلك، خلية شحمية الخلايا لا تزال ظاهرة دراستها ضعيفة، على الرغم من فرضية أن يسببها موت الخلايا المبرمج خلية شحمية يمكن أن يؤدي إلى انخفاض الوزن.

    يستخدم هذا البروتوكول النهج المناعى لدراسة ظاهرة مختلفة مثل انتشار الأسلحة النووية، موت الخلايا المبرمج ونقص الأكسجين في الجسم الحي. لذلك، تم إصلاح الأنسجة مع 4٪ الفورمالديهايد، وهو خطوة حاسمة. وقت تثبيت الأنسجة الموسعة يؤدي إلى تغيير في الحواتم، والتي أصبحت غير متاحة للأجسام المضادة. في المقابل، وقت التثبيت قصيرة يزيد من حساسية الحواتم إلى الكواشف. وأوصى الوقت الأمثل للتثبيت هو 24 ساعة. وعلاوة على ذلك، سمك أقسام أيضا يؤثر على الأجسام المضادة ملزمة لالحواتم بها؛ سمك الأمثل ما بين 2 و 5 ميكرون. سوف أقسام سمكا من 5 ميكرون تعطي نتائج إيجابية كاذبة بسبب زيادة مواقع الربط. في المقابل، قections أرق من 2 ميكرون يحتوي على مواقع أقل ملزمة ولم يتم تعريف المناطق إيجابية أيضا. وعلاوة على ذلك العوامل الحاسمة هي الأجسام المضادة نفسها، فترة حضانة والتركيز وحتى درجة الحرارة، والتي تؤثر على نوعية محددة ملزمة لالحواتم. ولذلك، التحقق من صحة الأجسام المضادة التركيز وحضانة الوقت الضروري لكل حالة.

    لاستكمال الدراسة، ونحن نقدم في المختبر بروتوكول التمايز خلية شحمية، والتي يمكن أن تمتد من العلاجات المختلفة، وتحفيز أو المشترك الثقافات. باستخدام في الثقافات خلية شحمية المختبر، فمن الممكن لتحديد العيوب في التمايز خلية شحمية وظائف. للحصول على نتائج موثوقة، كما لجميع الخلايا الأولية، والسلوك الصحي ومظهر من ADSCs والخلايا الشحمية مهم جدا. وتحبب، vacuolations هيولية و / أو انفصال هي علامات التدهور، مما يشير إلى عدم كفاية المتوسطة، التلوث الميكروبي أو الشيخوخة من المرحلة الابتدائيةالخلايا. هذا البروتوكول يستخدم الخلايا الشحمية معزولة عن الأنسجة منصة الدهون، في حين أنه من الممكن كذلك استخدام الخلايا الجذعية الوسيطة معزولة عن نخاع العظام كما وصفها البروتوكولات الأخرى 36. أحدث يتضمن الخلايا الاولية اللحمية، والتي قد تعكس مشاكل التمايز إضافية التي تحدث في خطوة مبكرة جدا من التمايز خلية شحمية، وهذا قد يكون غاب في البروتوكول الحالي. وعلاوة على ذلك، ADSCs يمكن توسيعها بسرعة (أكثر من 10 مرات في غضون أسبوع واحد)، وADSCs مثقف على المدى الطويل بعد بعض المقاطع لا تزال تحتفظ الوسيطة تعدد القدرات على 37،38. ميزة أخرى باستخدام ADSCs هو أن واحدة يمكن ان تتحول بسهولة إلى الإنسان، منذ ADSCs يمكن أن تحصد من المرضى عن طريق شفط الدهون وهي طريقة بسيطة والغازية الحد الأدنى.

    كما AT يؤثر عدة أجهزة أخرى بطريقة الغدد الصماء، وينبغي تمديد بروتوكول لadipokines. Adipokines، مثل هرمون الليبتين، اديبونيكتين، عامل نخر الورم α (TNF) لومن المعروف الثانية رزيستين، التي يفرزها الخلايا الشحمية أن تؤثر على أمراض التمثيل الغذائي عن طريق التحكم في التمثيل الغذائي للدهون، توازن الطاقة والحساسية للانسولين 39. لذلك، يجب أن يتم تنفيذ المصل وsecretome خلية شحمية التحليلات. في حالة AT الخلل، adipokines والسيتوكينات الموالية للالتهابات، مثل IL-6، يمكن أن يؤدي إلى التقلبات الأعضاء مثل الكبد والبنكرياس، وظيفة العضلات 4. من أجل استبعاد ضعف الجهاز النظامية، ويمكن اختبار نماذج حيوانية أو مزارع الخلايا لاستجابتها إلى جلوكوز التحفيز وامتصاص.

    نحن هنا نقدم بروتوكول لتحليل الحالة الأساسية للAT والخلايا الشحمية في الجسم الحي في المختبر للكشف عن الآليات الجزيئية للخلية شحمية التوازن والأداء الوظيفي.

    Disclosures

    الكتاب ليس لديهم ما يكشف.

    Acknowledgments

    فإن الكتاب أود أن تتكرم شكرا الدكتور J. لوثر وك Ubieta لإعداد البيانات والدكتور B. Grötsch لتنقيح الكتابة المخطوطة. وأيد هذا العمل من قبل جمعية الألمانية للبحوث (BO3811 / 1-1-إيمي نويثر).

    Materials

    Name Company Catalog Number Comments
    RNAlater solution Ambion AM7021 RNA stabilization solution
    High-Capacity cDNA Reverse Transcription Kit Applied Biosystems 4368813
    SYBR Select Master Mix 4472908
    Purified Mouse Anti-Human Ki-67 BD Biosciences 550609 Clone B56 (RUO)
    Purified Mouse Anti-Human Ki-67 Clone B56 (RUO) 550609 Proliferation marker
    FITC Annexin V BioLegend 640906
    Cleaved Caspase-3 Rabbit mAb Cell signalling 9664S Clone 5A1E
    Cleaved Caspase-3 (Asp175) (5A1E) Rabbit mAb 9664 Apoptosis marker
    Lipofectamine2000 Reagent  Invitrogen 11668-027
    TO-PRO-3 Iodide T3605 Nuclear counterstain, Monomeric cyanine nucleic acid stain, Excitation⁄Emission: 642⁄661 nm
    Mayer’s hemalum Merck 109249 hematoxylin
    pegGOLD TriFast Peqlab 30-2030 TRIzol, single-phase solution of guanidine isothiocyanate and phenol
    Percellys Ceramic Kit 1.4 mm 91-PCS-CK14 tubes containing ceramic beads (1.4 mm)
    Precellys 24 91-PCS24 homogenizer
    HIF-1 alpha Antibody Pierce PA1-16601
    HIF-1 alpha Antibody, 16H4L13 700505 Hypoxia marker
    In Situ Cell Death Detection Kit, Fluorescein Roche 11 684 795 001 TdT-mediated dUTP-biotin nick end labeling (TUNEL) 
    Eosin Sigma 318906
    DNase I Solution (1 unit/µl) Thermo Scientific EN0525
    biotinylated anti mouse IgG (H+L) Vector Laboratories BA-9200
    biotinylated anti mouse IgG (H+L) BA-1000
    Vectastain ABC Kit PK-4000
    VECTASHIELD Mounting Medium with DAPI H-1200

    DOWNLOAD MATERIALS LIST

    References

    1. Obesity and Overweight. Fact Sheet °113. WHO. , (Jan 2014) (2014).
    2. Gong, Z., Muzumdar, R. H. Pancreatic function, type 2 diabetes, and metabolism in aging. Int J Endocrinol. , 320482 (2012).
    3. Deng, Y., Scherer, P. E. Adipokines as novel biomarkers and regulators of the metabolic syndrome. Ann N Y Acad Sci. 1212, 1-19 (2010).
    4. Rezaee, F., Dashty, M. Role of Adipose Tissue in Metabolic System Disorders Adipose Tissue is the Initiator of Metabolic Diseases. J Diabetes Metab. , 008 (2013).
    5. Rutkowski, J. M., Stern, J. H., Scherer, P. E. The cell biology of fat expansion. J Cell Biol. 208, 501-512 (2015).
    6. Ma, X., Lee, P., Chisholm, D. J., James, D. E. Control of adipocyte differentiation in different fat depots; implications for pathophysiology or therapy. Front Endocrinol (Lausanne). 6, 1 (2015).
    7. Farmer, S. R. Transcriptional control of adipocyte formation. Cell Metab. 4, 263-273 (2006).
    8. Luther, J., et al. Elevated Fra-1 expression causes severe lipodystrophy. J Cell Sci. 124, 1465-1476 (2011).
    9. Luther, J., et al. Fra-2/AP-1 controls adipocyte differentiation and survival by regulating PPARgamma and hypoxia. Cell Death Differ. , (2014).
    10. Semenza, G. L. Regulation of mammalian O2 homeostasis by hypoxia-inducible factor 1. Annu Rev Cell Dev Biol. 15, 551-578 (1999).
    11. Kim, W., Kaelin, W. G. The von Hippel-Lindau tumor suppressor protein: new insights into oxygen sensing and cancer. Curr Opin Genet Dev. 13, 55-60 (2003).
    12. Aragones, J., Fraisl, P., Baes, M., Carmeliet, P. Oxygen sensors at the crossroad of metabolism. Cell Metab. 9, 11-22 (2009).
    13. Sun, K., Halberg, N., Khan, M., Magalang, U. J., Scherer, P. E. Selective inhibition of hypoxia-inducible factor 1alpha ameliorates adipose tissue dysfunction. Mol Cell Biol. 33, 904-917 (2013).
    14. Imai, T., Jiang, M., Chambon, P., Metzger, D. Impaired adipogenesis and lipolysis in the mouse upon selective ablation of the retinoid X receptor alpha mediated by a tamoxifen-inducible chimeric Cre recombinase (Cre-ERT2) in adipocytes. Proc Natl Acad Sci U S A. 98, 224-228 (2001).
    15. Clegg, D. J., Brown, L. M., Woods, S. C., Benoit, S. C. Gonadal hormones determine sensitivity to central leptin and insulin. Diabetes. 55, 978-987 (2006).
    16. Haluzik, M., et al. Genetic background (C57BL/6J versus FVB/N) strongly influences the severity of diabetes and insulin resistance in ob/ob mice. Endocrinology. 145, 3258-3264 (2004).
    17. Chomczynski, P., Sacchi, N. Single-step method of RNA isolation by acid guanidinium thiocyanate-phenol-chloroform extraction. Analytical biochemistry. 162, 156-159 (1987).
    18. Paraffin Processing of Tissue. Protocolsonline. , Available from: http://protocolsonline.com/histology/sample-preparation/paraffin-processing-of-tissue/ (2012).
    19. Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis. Nat Methods. 9, 671-675 (2012).
    20. Planat-Benard, V., et al. Plasticity of human adipose lineage cells toward endothelial cells: physiological and therapeutic perspectives. Circulation. 109, 656-663 (2004).
    21. Kusminski, C. M., et al. MitoNEET-driven alterations in adipocyte mitochondrial activity reveal a crucial adaptive process that preserves insulin sensitivity in obesity. Nat Med. 18, 1539-1549 (2012).
    22. Trajcevski, K. E., et al. Enhanced lipid oxidation and maintenance of muscle insulin sensitivity despite glucose intolerance in a diet-induced obesity mouse model. PLoS One. 8, 71747 (2013).
    23. Montgomery, M. K., et al. Mouse strain-dependent variation in obesity and glucose homeostasis in response to high-fat feeding. Diabetologia. 56, 1129-1139 (2013).
    24. de Queiroz, K. B., et al. Molecular mechanism driving retroperitoneal adipocyte hypertrophy and hyperplasia in response to a high-sugar diet. Mol Nutr Food Res. 58, 2331-2341 (2014).
    25. Ye, J. Emerging role of adipose tissue hypoxia in obesity and insulin resistance. Int J Obes (Lond). 33, 54-66 (2009).
    26. Xiong, Y., et al. The local corticotropin-releasing hormone receptor 2 signalling pathway partly mediates hypoxia-induced increases in lipolysis via the cAMP-protein kinase A signalling pathway in white adipose tissue. Mol Cell Endocrinol. 392, 106-114 (2014).
    27. Bozec, A., et al. Osteoclast size is controlled by Fra-2 through LIF/LIF-receptor signalling and hypoxia. Nature. 454, 221-225 (2008).
    28. Varia, M. A., et al. Pimonidazole: a novel hypoxia marker for complementary study of tumor hypoxia and cell proliferation in cervical carcinoma. Gynecol Oncol. 71, 270-277 (1998).
    29. Park, M. H., Choi, K. Y., Jung, Y., Min do, S. Phospholipase D1 protein coordinates dynamic assembly of HIF-1alpha-PHD-VHL to regulate HIF-1alpha stability. Oncotarget. 5, 11857-11872 (2014).
    30. Tennant, D. A., et al. Reactivating HIF prolyl hydroxylases under hypoxia results in metabolic catastrophe and cell death. Oncogene. 28, 4009-4021 (2009).
    31. Kim, J., So, D., Shin, H. W., Chun, Y. S., Park, J. W. HIF-1alpha Upregulation due to Depletion of the Free Ubiquitin Pool. Journal of Korean medical science. 30, 1388-1395 (2015).
    32. Amelio, I., et al. TAp73 opposes tumor angiogenesis by promoting hypoxia-inducible factor 1alpha degradation. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112, 226-231 (2015).
    33. Suga, H., et al. Adipose tissue remodeling under ischemia: death of adipocytes and activation of stem/progenitor cells. Plast Reconstr Surg. 126, 1911-1923 (2010).
    34. Moreno-Indias, I., Tinahones, F. J. Impaired adipose tissue expandability and lipogenic capacities as ones of the main causes of metabolic disorders. J Diabetes Res. 2015, 970375 (2015).
    35. Keuper, M., et al. An inflammatory micro-environment promotes human adipocyte apoptosis. Mol Cell Endocrinol. 339, 105-113 (2011).
    36. Sera, Y., et al. Hematopoietic stem cell origin of adipocytes. Experimental hematology. 37, 1108-1120 (2009).
    37. Zuk, P. A., et al. Multilineage cells from human adipose tissue: implications for cell-based therapies. Tissue engineering. 7, 211-228 (2001).
    38. Zuk, P. A., et al. Human adipose tissue is a source of multipotent stem cells. Molecular biology of the cell. 13, 4279-4295 (2002).
    39. Scherer, P. E. Adipose tissue: from lipid storage compartment to endocrine organ. Diabetes. 55, 1537-1545 (2006).

    Tags

    علم الأحياء التنموي، العدد 112، الخلايا الشحمية، الخلايا الشحمية التمايز، خلية شحمية التقلبات، الأنسجة الدهنية، نقص الأكسجين، HIF1α، ومتلازمة التمثيل الغذائي والسمنة والشيخوخة
    آلية تنظيم أرقام خلية شحمية في الكائنات الكبار من خلال التمايز وموت الخلايا المبرمج التوازن
    Play Video
    PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

    Cite this Article

    Bozec, A., Hannemann, N. Mechanism… More

    Bozec, A., Hannemann, N. Mechanism of Regulation of Adipocyte Numbers in Adult Organisms Through Differentiation and Apoptosis Homeostasis. J. Vis. Exp. (112), e53822, doi:10.3791/53822 (2016).

    Less
    Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
    View Video

    Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

    Waiting X
    Simple Hit Counter