Introduction
Selon le rapport 2014 de l'Organisation mondiale de la Santé, 39% de la population adulte du monde est en surpoids, et 13% est obèse 1. Dans un avenir proche, les personnes en surpoids comprendront une proportion importante de la population âgée. Une caractéristique importante de l' obésité et le vieillissement est dysrégulation de la graisse par rapport à la morbidité et la mortalité 2. Adipokines, des protéines sécrétées par le tissu adipeux (AT), peuvent déclencher des syndromes métaboliques tels que l' obésité et le diabète de type 2 3. Les maladies métaboliques sont le plus souvent causés par le stockage d'énergie excessive dans les gouttelettes de lipides des adipocytes, ce qui se traduit par l' expansion AT 4. Il est donc intéressant de déterminer les causes et les mécanismes moléculaires de l'expansion AT afin de trouver des opportunités pour le contrôler.
Over-nutrition conduit à l'expansion AT, qui est régie par deux événements: le stockage d'énergie excessive dans les gouttelettes lipidiques des adipocytes, un processusconduisant à une hypertrophie (augmentation du volume des adipocytes), et l' augmentation de l' adipogenèse, également connu sous adipocytes hyperplasie 5. Adipogenèse est un processus de différenciation des cellules multipotentes souches mésenchymateuses (MSC) en adipocytes. Tout d'abord, MSCs se développent en préadipocytes au cours de la phase d'engagement. Deuxièmement, préadipocytes différencier davantage pour acquérir les caractéristiques des adipocytes matures et fonctionnels 6. Plusieurs facteurs de transcription ont été identifiés en tant que régulateurs de base pour la détermination de pré-adipocyte, telles que la protéine à doigt de zinc 423 (Zfp423) et au début de B cell factor 1 (EBF1). Considérant que Zfp423 induit engagement précoce, EBF1 est nécessaire pour la génération de progéniteurs adipocytaires 6. La différenciation terminale est étroitement contrôlée par une cascade de transcription, dans lequel γ des récepteurs activés par les proliférateurs de peroxysomes (PPARy) est le facteur de transcription essentiel 7. D'autres facteurs de transcription essentiels sont les CCAAT / protéine activatrice de liaison (C/ EBP) membres de la famille (c. -à- C / EBPα, C / EBPß et C / EBPδ), les facteurs de Kruppel-like (KLFs), AMPc élément sensible de liaison aux protéines (CREB) et d' intervention précoce de croissance 20 (Krox20) 6.
Récemment, il a été montré que l'activateur de la protéine-1 (AP-1) de la famille est impliquée dans le processus de 8,9 différenciation adipocytaire. L'AP-1 famille est constituée par un complexe protéique dimère, composé de Fos, juin et / facteur d'activation de la transcription (ATF) ou des membres. antigène Fos lié 1 et 2 (Fra-1 et Fra-2) sont capables de réguler la différenciation des adipocytes. Fra-1 altère la différenciation des adipocytes en inhibant C / EBPα 8, alors que Fra-2 le chiffre d' affaires des contrôles adipocytaire 9. Fra-2 ainsi non seulement diminue le nombre des adipocytes en réprimant l'expression PPARy2 lors de la différenciation adipocytaire, mais diminue également l'apoptose des adipocytes par la répression directe des facteurs inductibles par l'hypoxie (HIF) expression. La famille de HIF est un heterodimeric complexe de facteur de transcription, composé de HIF-1α, 2α et HIF-HIF-1β. Les hétérodimères sont constitués d'une protéine sensible à l'oxygène HIF-α (HIF-1α ou HIF-2α) et la sous - unité HIF-1β en oxygène non photosensible 10. Au cours de normoxie, les protéines HIF-α sont poly-ubiquitinylée et sont finalement dégradées par protéasomes 11. Dans des conditions hypoxiques, survenant chez au cours de l'expansion, les protéines HIF-α ne sont plus hydroxylé. donc ils deviennent stabilisés et forment des dimères avec le HIF-1β constitutivement exprimé. L' activation transcriptionnelle des gènes contrôlés par des éléments de réponse de HIF est impliqué dans la régulation de l' angiogenèse, le métabolisme et l' inflammation 12. En effet, HIF-1α AT favorise le dysfonctionnement en induisant une tolérance au glucose, l' inhibition de la dépense énergétique et l' utilisation périphérique du lipide, ainsi que par l' augmentation du niveau de la leptine et SIH induite stéatose hépatique 13. En outre, HIF-1α régule adipocyte apoptose in vivo et in vitro 9.
Le présent protocole décrit les méthodes pour l'étude AT état de démêler les caractéristiques moléculaires des adipocytes homéostasie chez les souris adultes. Elle montre comment l' apoptose, la prolifération et la différenciation des adipocytes in vivo et in vitro peuvent être régulés par l' hypoxie. Pour ce faire, nous utilisons des souris avec des adipocytes deletion spécifique de Fra-2 produite par le croisement des souris portant les Fra-2 allèles floxés avec des souris FABP4-CreERT 9. En utilisant des souris ERT FABP4-Cre, la suppression est adipocyte spécifique et inductible par injection tamoxifène 14. Pour le modèle adulte, les injections intra-péritonéale du tamoxifène sont effectuées sur 5 jours consécutifs à partir de l'âge de 6 semaines. Ainsi, les souris sont soumises à un régime alimentaire normal de régime ou riche en graisses pendant 6 semaines avant l'analyse est effectuée. Les souris utilisées dans cette étude mâle étaient fondées sur un fond C57BL6 pour éviter les hormones femelles, telles que les oestrogènes, Montré pour réguler la distribution de la graisse corporelle 15. En utilisant un autre fond génétique pourrait également modifier le phénotype métabolique, en raison des différences liées à la souche-dans la gestion des lipides 16.
Ce protocole montre comment analyser AT sous hypoxie en utilisant l' histologie et comment quantifier l' apoptose des adipocytes, la prolifération et la différenciation in vivo par immunohistochimie et le gène analyse le profilage. L'étude est complétée par des expériences in vitro, montrant comment analyser la différenciation des adipocytes primaires et l' apoptose modifié par l' exposition à l' hypoxie.
Protocol
ÉTHIQUE ÉTAT: Les animaux sont logés dans des conditions normalisées suivant les directives de la Loi sur la protection des animaux allemand. Les animaux sont nourris avec un libitum de régime et de l' eau standard et conservés avec un cycle jour / nuit de 12 h. Toutes les expériences avec les animaux sont autorisés par le comité d'éthique local.
1. Analyse in vivo des adipocytes homéostasie dans Hommes adultes
- Pour quantifier l' hypoxie in vivo, d' abord déterminer le poids corporel des souris, puis injecter 60 mg / kg de poids corporel de chlorhydrate de pimonidazole solide intra-péritonéale (par exemple: injecter 1,5 mg dans 25 g de souris). Pimonidazole est un marqueur hypoxique efficace, ce qui forme des adduits avec des groupes thiol dans des protéines, des peptides et des acides aminés et est détectée par un anticorps spécifique.
- Sacrifiez les souris et enlever les coussinets adipeux perigonadal (Figure 1).
- 45 minutes après l' injection, sacrifier la souris par asphyxie au CO2 et dislocation cervicale ultérieure. </ Li>
- Pin vers le bas des membres de la souris (comme illustré sur la figure 1) et ouvrir la cavité péritonéale. Retirez la gauche et la droite perigonadal pad (épididyme) de graisse à l'intérieur de la cavité péritonéale.
Note: pad Fat sont liés à l'épididyme par les tracts péritonéale comme le montre la figure 1 (perigonadal coussinets adipeux sont indiquées par des flèches). - Prendre soin d'enlever les tissus gonadiques du coussinet adipeux. Déterminer le poids de la tablette de graisse pour calculer le rapport: poids de coussinet adipeux (g) par poids corporel (g).
Figure 1: Emplacement des coussinets adipeux perigonadal dans la cavité péritonéale de souris. Photo de perigonadal localisation de la graisse chez les souris adultes après le sacrifice. Coussinets adipeux Perigonadal sont indiquées par les flèches. S'il vous plaît cliquez ici pour vIEW une version plus grande de cette figure.
- Pour compiler un profil quantitatif de l'expression des gènes, utiliser un coussinet adipeux perigonadal pour isoler l'ARN. Nota: Tant que le tissu est traité, des échantillons de tissus de stockage dans une solution de stabilisation de l'ARN à -80 ° C ou dans l'azote liquide.
- Pour homogénéiser le coussinet adipeux, ajouter le tampon de graisse pour 1 ml de solution à phase unique de guanidine isothiocyanate et de phénol. Utiliser des tubes contenant des billes en céramique (1,4 mm) pour écraser le tissu dans un homogénéisateur à 6500 rpm (2 fois 20 sec, avec 30 sec pause).
- Isoler l'ARN de la manière suivante (procédé en une seule étape de Chomczynski et Sacchi 17).
- Pour séparer les phases, transfert coussinet adipeux homogénéisé au tube à centrifuger, ajouter 0,2 ml de volume de chloroforme, agiter pendant 15 sec, incuber pendant 5 min à température ambiante et centrifuger 12.000 xg pendant 5 min. Transférer la phase aqueuse supérieure (environ 400 pi), qui contient l'ARN, dans un nouveau tube. Ne pas inclure l'ADN contiennentment interphase ou de la phase phénolique contenant des protéines.
- Pour précipiter l'ARN, ajouter 1 volume d'isopropanol, mélanger et incuber pendant 15 min à 4 ° C (il est également possible d'incuber à 20 ° C pendant une nuit). Centrifuger à 12000 xg pendant 10 min. Retirer isopropanol surnageant avec précaution. Laver deux fois avec 75% d'éthanol avec des étapes de centrifugation de 12 000 g pendant 10 min.
- Après séchage , le précipité d' ARN pendant environ 10 min à température ambiante, on le dissout dans 50 ul de H 2 O (sans RNase). Pour faciliter cela, incuber pendant 2 min à 65 ° C.
Remarque: Conservez l'ARN dans 75% d'éthanol à -80 ° C ou dans l'azote liquide pour le stockage à long terme. - Quantifier les préparations d'ARN par A 260/280 (quotient optimale se situe entre 1,8 et 2,2) et calculer la concentration en A 260:
- Afin d'éviter la contamination de l'ADN, digérer 1 pg de la préparation d'ARNavec 1 U de DNase I pendant 30 minutes à 37 ° C dans un volume de 10 ul. Inactivent à 65 ° C pendant 10 min.
Remarque: Cette étape est facultative. - Utiliser 10 ul de préparation d'ARN contenant de 1 ug d'ARN pour la réaction de transcriptase inverse pour produire l'ADNc simple brin, convenant à une application par PCR quantitative. Les composants et leurs quantités sont indiqués dans le tableau 1.
- Utilisez un PCR Master Mix pour une réaction quantitative PCR en temps réel. Pour déterminer les changements métaboliques dans l' ensemble du coussinet adipeux, utiliser des amorces spécifiques de gènes impliqués dans l' homéostasie AT (tableau 2) et les conditions de PCR énumérées dans le tableau 3.
- PCR en temps réel l'analyse des données.
- Définir le niveau de référence (figure 2), normalement le cycle 1 à 15, où il n'y a pas de changement dans les signaux de fluorescence. Le logiciel de PCR en temps réel normalise les signaux de fluorescence spécifiques de la fluorescence de base et le colorant de référence interne, ROX, ce qui entraînel'amplitude des signaux spécifiques par les amorces delta Rn (ARn).
- Régler le seuil dans la phase exponentielle de la courbe d'amplification. L'intersection définit le cycle de seuil (Ct). Sur la base de la valeur de CT, calculer l'expression relative (ACt) et le changement de pliage (ΔΔCt):
| Composant | Volume ul / réaction |
| 10x RT Buffer | 2.0 |
| 25x mélange dNTP (100 mM) | 0,8 |
| 10x RT Random Primers | 2.0 |
| MultiScribe transcriptase inverse | 1.0 |
| Exempte de nucléase H 2 O | 4.2 |
| 1 pgARN | dix |
| réaction par total | 20 |
Tableau 1: les composants dont le volume respectif de la réaction de transcriptase inverse pour produire un ADNc simple brin.
| Nom officiel complet | symbole | Séquence 3 '-> 5' | ||
| Vers l'avant | Sens inverse | |||
| adipogenesis | Delta-like 1 homolog (pref-1) | DLK1 | GACACTCGAAGCTCA CCTGG | GGAAGGCTGGGACGG GAAAT |
| Early B cell factor 1 | EBF1 | CCACCATCGACTACGG CTTC | TCCTGGTTGTTGTGGGG CATC | |
| Zinc finger protein 423 | Zfp423 | GTGCCCAGGAAGAAGA ACCAT | GGCGACGTGGATCTGA ATCT | |
| la protéine de liaison des acides gras 4 (Ap2) | FABP4 | TCACCTGGAAGACAGCT CCTC | AAGCCCACTCCCACTTC TTTC | |
| CCAAT / enhancer liaison protéique (C / EBP), alpha | CEBPA | AAGAGCCGCGACA AGGC | GTCAGCTCCAGCACCT TGTG | |
| CCAAT / enhancer liaison protéique (C / EBP), bêta | CEBPB | TTTCGGGACTTGATGC AATC | CCGCAGGAACATCTTT AAGG | |
| AMPc protéine 1 de liaison élément sensible | CREB1 | ACTCAGCCGGGTACT ACCAT | TTGCTGCCTCCCTGTT CTTC | |
| CCAAT / enhancer liaison protéique (C / EBP), delta | Cebpd | CAGCGCCTACATTGAC TCAC | GTTGAAGAGGTCGGCG AAGA | |
| facteur Kruppel-like 4 | Klf4 | GCAGTCACAAGTCCCC TCTC TAGTCACAAGTGTGGG TGGC | ||
| Une réponse précoce de croissance 2 (Krox20) | EGR2 | AGGCGGTAGACAAAATC CCAG | GATACGGGAGATCCAG GGGT | |
| Peroxisome proliferator activated receptor gamma | PPARG | AGAGGTCCACAGAGCTG CIFA | GATGCACTGCCTATGAGC ACTT | |
| lipogénèse | Acétyl-coenzyme A carboxylase alpha | ACACA | TGGGGACCTTGTCTTCA TCAT | ATGGGCGGAATGGTCTC TTTC |
| Fatty acid synthase | FASN | ACATCCTAGGCATCC GAGA | CCGAGTTGAGCTGGGT Tagg | |
| Stéaroyl-coenzyme A désaturase 1 | scd1 | CGGGATTGAATGTTCTTG TCGT | TTCTTGCGATACACTCTG GTGC | |
| lipolyse | containi de domaine phospholipase Patatín-like2 ng | Pnpla2 | AAGGACCTGATGACCA CCCT | CCAACAAGCGGATGGT GAAG |
| Fatty l'absorption de l'acide | lipoprotéine lipase | Lpl | GTATCGGGCCCAGCAA CATTATCC | GCCTTGCTGGGGTTTTC TTCATTC |
| antigène CD36 | CD36 | GTCTTCCCAATAAGCATGT CTCC | ATGGGCTGTGATCGGA ACTG | |
| hypoxie | Hypoxie inducible factor 1, sous-unité alpha | HIF1A | CCTGCACTGAATCAAGAG GTGC | CCATCAGAAGGACTTGCT GGCT |
| Endothelial PAS protéine du domaine 1 (également connu sous le nom: HIF-2alpha) | APE1 | CAAGCTGAAGCTAAAG CGGC | TTGGGTGAATTCATCG GGGG | |
| suppresseur de tumeur Von Hippel-Lindau | Vhl | ACCGAGGTCATCTTTG GCTC | TTCCGCACACTTGGGT AGTC | |
| translocateur nucléaire du récepteur d'hydrocarbure aryle (également connu sous le nom: HIF-1 béta) | Arnt | TGGGTCATCTTCTCGC GGTT | TGTCCTATCTGAGCAT CGTG | |
Tableau 2: Liste des gènes ayant la séquence des amorces respectives utilisées pour l' analyse des adipocytes homéostasie.
| Étape | Température (° C) | Temps (min: sec) | ||
| l'activation de la polymérase | Tenir | 95 | 10:00 | |
| PCR | 40 cycles | Denaturize | 95 | 00h15 |
| Recuit / Extension | 60 | 01h00 | ||
| Courbe de fusion | 60-95 | 0,5 ° C / s | ||
Tableau 3: Les conditions de PCR en temps réel.
Figure 2:. Caractéristiques du temps réel courbe d'amplification PCR S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
- Pour effectuer l'analyse histologique de l'homéostasie adipocytaire, utilisez le second coussinet adipeux perigonadal. Ne pas dessécher le tissu!
- Fixer le coussinet adipeux dans 3,7% de formaldéhyde PBS tamponnée pendant une nuit, intégrer dans de la paraffine (suivez les instructions comme décrit ailleurs 18) et couper le tissu incorporé dans 2-5 um sections épaisses (maximum de 5 um).
- Déterminer le nombre d'adipocytes par champ et la taille des adipocytes dans un microscope à champ clair après hématoxyline et l'éosine (H & E) coloration: <ol>
- Déparaffiner sections par lavage 3 fois pendant 5 min dans du xylène et réhydrater la section 2 fois pendant 2 min à 100% d'éthanol et 2 fois pendant 2 minutes dans 96% d'éthanol. Enfin, laver la section H 2 O distillée pendant 5 min.
- Tache avec de l' hématoxyline, dilué à 1: 5 avec du H 2 O distillée, pendant 10 min à température ambiante et laver à l' H 2 O pendant 5 min. Stain avec une solution d'éosine (20 ml 5% éosine Y / 210 ml distillée H 2 O / 25 ul d'acide acétique glacial) pendant 30 sec et laver à nouveau avec H 2 O pendant 5 min.
- Déshydrater sections à l'aide d'éthanol à 96% et 100% d'éthanol 2 fois chacun pendant 2 min, et le xylène 3 fois pendant 5 min. Monter les sections avec l'agent de montage anhydre.
- Évaluer les sections sous un microscope à champ clair. Un exemple représentatif de la manière d'analyser les adipocytes avec ImageJ 1.48v 19 est représentée sur la Fig. 3: nombre de cellules par zone (pm 2), zone de cellules (x 10 3 pm 2
- Ouvrez l'image de la section avec ImageJ 1.48v. Si les paramètres de l'image sont indiquées en pixels au lieu d'une unité de longueur, ajuster l'échelle.
- Sélectionnez * Linéaire * dans la barre d' outils et d' ajuster la ligne à une distance connue par référence à la barre d'échelle. Aller à Analyse -> Set Echelle La distance de la ligne est affichée en pixels;. ajouter la distance connue et l'unité de longueur, par exemple, um. Validez avec OK. La taille de l'image et l'analyse des paramètres sont indiqués dans l'unité de longueur donnée.
- Pour déterminer les paramètres des adipocytes, régler le seuil. Aller à l' image -> Réglages -> Seuil pour ouvrir la fenêtre de seuil. Sélectionnez les paramètres suivants: méthode de seuillage: Par défaut, la couleur de seuil: B & W; espace couleur: HSB. L'image est maintenant affichée en noir et blanc. Ajuste leLuminosité pour effacer adipocytes blancs et pour fermer les espaces intercellulaires noirs, comme dans la figure. 3b.
- Comptez le nombre de adipocyte par um 2 (Figure 3e) avec le * multi-point * sélection dans la barre d' outils et marquer chaque cellule pour le comptage.
- Pour déterminer la taille des adipocytes, sélectionnez * Linéaire * nouveau dans la barre d' outils et d'en tirer le diamètre d'un adipocyte (Figure 3c). Aller à Analyse -> Mesure et une nouvelle fenêtre apparaîtra, avec la longueur du diamètre en microns.
- Pour déterminer la zone de adipocyte, sélectionnez * Wand (traçage) outil * et cliquez dans l'adipocyte. La paroi interne de l'adipocyte est sélectionné en rouge (Figure 3d). Aller à Analyse -> Mesure et une nouvelle fenêtre apparaîtra, avec la zone de cette adipocyte en pm 2.
- Déparaffiner sections par lavage 3 fois pendant 5 min dans du xylène et réhydrater la section 2 fois pendant 2 min à 100% d'éthanol et 2 fois pendant 2 minutes dans 96% d'éthanol. Enfin, laver la section distillée H 2 O.
- Pour la récupération des antigènes, digèrent la section de tissu pendant 30 minutes à 37 ° C avec une solution de travail de la proteinase K (20 ug / ml dans du Tris 10 mM / HCl, pH 7,4 à 8) et rincer avec du PBS.
- Pour bloquer la peroxydase endogène, utiliser 3% de peroxyde d'hydrogène dans du PBS pendant 10 min, avec lavage ensuite 2 fois pendant 5 min dans du PBS. Pour bloquer la liaison non spécifique d'anticorps, en utilisant 10% de sérum dans du PBS. Utilisez le sérum de l'hôte de l'anticorps secondaire, dans ce cas chèvre.
- Pour la coloration, utiliser les anticorps pour l'apoptose, la prolifération et la détection de l'hypoxie (
- Pour améliorer le signal utiliser un anticorps secondaire biotinylé, avec la dilution comme indiqué dans le tableau 5. Pour la détection de l' hypoxie, utilisez HRP de lapin conjugué anti-FITC comme anticorps secondaire. Incuber pendant 1 heure à température ambiante. Laver les sections 2 fois 5 min avec du PBS.
Remarque: Pour la coloration de l'hypoxie avec FITC-Mab1, ignorez l'étape 1.4.4.4) et passez à l'étape 1.4.4.5).- Pour chaque diapositive, pré-incuber 50 ul solution avidine avec 50 ul biotinylé peroxydase H pendant 30 min à température ambiante (cette méthode est aussi appelée avidine / biotine ABC formulation complexe), puis ajouter les sections pendant 45 min. Laver 2 fois pendant 5 min avec du PBS.
- Incuber les sections dans une solution de substrat de peroxydase jusqu'à ce que la coloration devient plus intense (entre 5 et 10 minutes). Laver pendant 5 min à l'eau distilléeH 2 O.
- Pour contre - coloration, coloration à l' hématoxyline dilué 1: 5 avec H 2 O distillée pendant 10 min à température ambiante et laver à l' H 2 O pendant 5 min.
- Déshydrater les articles dans 96% d'éthanol et 100% d'éthanol 2 fois chacun pendant 2 min, et le xylène 3 fois pendant 5 min. Sceller les sections avec des lamelles et de l'agent de montage anhydre. Évaluer les sections sous un microscope à champ clair.
- Pour améliorer le signal utiliser un anticorps secondaire biotinylé, avec la dilution comme indiqué dans le tableau 5. Pour la détection de l' hypoxie, utilisez HRP de lapin conjugué anti-FITC comme anticorps secondaire. Incuber pendant 1 heure à température ambiante. Laver les sections 2 fois 5 min avec du PBS.
- Ajouter une solution enzymatique de 50 pi dans 450 solution d'étiquette ul. Appliquer ensuite 50 ul mélange réactionnel TUNEL sur des coupes histologiques et incuber pendant 60 min à +37 ° C dans une atmosphère humidifiée dans l'obscurité. Laver les sections 3 fois avec du PBS pendant 5 min et monter avec la fluorescence moyenne de montage comprenant DAPI (4 ', 6-diamidino-2-phénylindole) pour la contre-coloration.
- Évaluer la section sous un microscope à fluorescence avec 100 fois magnificat ion. Pour la mesure de la fluorescéine utiliser une longueur d'onde d'excitation de 488 nm et de détecter entre 515-565 nm (laser vert); DAPI excite à environ 360 nm et émet à environ 460 nm lorsqu'il est lié à l'ADN (laser bleu).
- Quantifier les superpositions de DAPI et fluorescéine:
Figure 3:. Analyse des caractéristiques des adipocytes dans les sections de pad graisse Section images du coussinet adipeux perigonadal des souris mâles traités avec un régime alimentaire riche en matières grasses (SIH) ou un régime alimentaire normal (ND) avec un microscope à champ lumineux (a); le seuil est ajusté en noir et blanc (b) et de la taille des adipocytes (longueur; c), zone (d) et adipocyte nombre de cellules par mm 2 (e) sont quantifiées avec ImageJ 1.48v.f = "https://www.jove.com/files/ftp_upload/53822/53822fig3large.jpg" target = "_ blank"> S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
| concentration en Stock | dilution | |
| apoptose | Caspase-3 (Asp175) (5A1E) Lapin mAb | 1: 2000 |
| Prolifération | Ki-67 Souris Purifié Anti-Human Clone B56 (ORU) | 1h50 |
| hypoxie | HIF-1 alpha Anticorps | 1: 100 |
| FITC Mab1 | 1: 100 |
Tableau 4: Anticorps avec dilution respective utilisée pour la coloration immunohistochimique des sections AT.
| Anticorps | dilution |
| biotinylé antiIgG de souris (H + L) | 1: 200 |
| IgG anti-souris biotinylé (H + L) | 1: 200 |
| HRP conjugués de lapin anti-FITC | 1: 100 |
Tableau 5: Les anticorps secondaires avec dilution utilisés pour la coloration immunohistochimique.
2. Analyse in vitro des adipocytes homéostasie Influencé par hypoxie
- Sacrifiez les souris et enlever le tissu adipeux sous-cutané.
- Sacrifiez les souris par asphyxie au CO2 et dislocation cervicale postérieure.
- Pin vers le bas des membres de souris comme illustré sur la figure 4. Détachez la peau de la cuisse, longe et flanc et épingler le bas avec des aiguilles comme dans la figure 4. Ensuite , retirer le tissu adipeux sous - cutané, qui est situé postérieure à la base de la pattes postérieures, qui entourent les ganglions lymphatiques inguinaux (comme le montre la figure 4, à gauche: coussinet adipeux sous - cutanés indiqué par les flèches; droite: ganglion lymphatique inguinal indiqué par la flèche).
Figure 4: Emplacement des coussinets adipeux sous - cutané. Photo de tampon de graisse sous-cutanée; les flèches gauche indiquent le coussinet adipeux sous - cutané et la flèche de droite indique le ganglion lymphatique inguinal. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
- Isoler les cellules souches dérivées de tissu adipeux (ADSC) comme précédemment décrit 20.
- Semences ADSC 4000 cellules / cm2 dans Dulbecco Modified Eagle le moyen de Ham F-12 supplémenté avec 10% de sérum normal de veau, 1% de pénicilline / streptomycine, 0,5% d' amphotéricine B, 16 uM de biotine, 18 uM d' acide pantothénique et de 100 l' acide uM ascorbique et développer la culture jusqu'à la confluence autour 70 à 80%, Qui est atteint après 4 à 6 jours de culture.
- Provoquer Adipogenic Différenciation.
- Retirer la ADSC adhérente de la surface par traitement à la trypsine.
- Éliminer le milieu, laver avec du PBS et on ajoute une solution de trypsine à 0,025% (préalablement chauffée à 37 ° C) pendant 2 minutes (jusqu'à ce que les cellules se détachent de la surface). Immédiatement ajouter moyen et laver les cellules.
- Compter les cellules en utilisant une chambre de Neubauer.
- Mettez le couvercle en verre sur la zone centrale de la chambre de Neubauer. Diluer la suspension cellulaire 01:10 et charger la chambre avec 10 ul de suspension cellulaire diluée. Compter les cellules à 4 carrés situés au niveau des coins, chacun étant composé de 16 petits carrés. Calculer le nombre de cellules par ml:
- Mettez le couvercle en verre sur la zone centrale de la chambre de Neubauer. Diluer la suspension cellulaire 01:10 et charger la chambre avec 10 ul de suspension cellulaire diluée. Compter les cellules à 4 carrés situés au niveau des coins, chacun étant composé de 16 petits carrés. Calculer le nombre de cellules par ml:
- Seed ADSC (comme décrit au point 2.2) dans des plaques de culture de 12 puits et de grandir la culture jusqu'à la confluence d'environ 70 à 80% (atteint après 4 à 6 jours).
- Provoquer adipogela différenciation nic par addition de 5 ug / ml d'insuline, 1 uM de dexaméthasone et de 5 uM de 3-isobutyl-1-méthylxanthine (IBMX) aux cultures. Renouveler le moyen tous les 2 jours. Les cellules seront pleinement différenciées au bout de 7 jours.
- Retirer la ADSC adhérente de la surface par traitement à la trypsine.
- Pour analyser la différenciation adipocytaire, tache avec Oil Red O, qui colore les triglycérides d'adipocytes matures.
Remarque: Le travail doit être effectué sous une hotte!- Retirer le milieu, laver les adipocytes doucement avec du PBS et fixer les cellules pendant 60 minutes avec 2 ml 10% de formaline.
- Pour préparer la solution de coloration Oil Red O, mélanger 3 parties de la solution mère de l' huile rouge O (300 mg huile rouge O en poudre dissous dans 100 ml de 99% d' isopropanol) avec 2 parties distillée H 2 O et incuber pendant 10 min à température ambiante. Filtrer la solution de travail à l'huile rouge O à travers un filtre d'injection de 0,2 um.
Remarque: La solution de travail est stable pendant 2 heures. - Pour la coloration Oil Red O, retirer la formaline, laver adipocytes avec H 2
- Évaluer les plaques sous un microscope à contraste de phase avec 100 fois grossissement. Les lipides des adipocytes apparaissent en rouge et les noyaux apparaissent en bleu.
- Etape facultative: Silence du gène d'intérêt par transfection avec shRNA.
- Changer le support et ajouter du milieu sans sérum.
- Pour la transfection des adipocytes, utilisez lipofection. Suivez les instructions du fabricant et utiliser 1 pg shRNA par des plaques de tissu de 12 puits. Après addition de la lipide-ADN complexe, laisser incuber adipocytes pendant 48 heures à 37 ° C.
- Pour analyser les adipocytes soumis à une hypoxie, utiliser un poste de travail hypoxiques ou incubateur hypoxique pour maintenir les cellules dans des conditions hypoxiques. En fonction de l'étude, l'hypoxie could 0,5, 1 ou 2% d'oxygène.
- Analyser l'apoptose par FITC annexine V et l'écoulement ultérieur des analyses de cytométrie.
- Collecter des adipocytes avec un racleur supplémentaire cellulaire souple, laver avec du PBS et on ajoute 1 x 10 6 cellules à 100 V tampon de liaison à l' annexine ul (10 mM de Hepes / NaOH, pH 7,4, NaCl 140 mM, 2,5 mM de CaCl2). Ajouter la quantité d'annexine V-FITC recommandé par le fabricant et laisser incuber à la température ambiante pendant 15 min.
- Pour cytométrie mesure, ajouter 200 pi de tampon de V liaison Annexin et 1 uM de contre-coloration nucléaire. Déterminer la fluorescence dans le canal vert et violet. + Cellules / de contre - coloration nucléaire + annexine V sont définis comme nécrotique secondaire et annexine V + / contre - coloration nucléaire de - cellules sont définies comme étant des cellules apoptotiques (figure 5).
- analyser Quantitativement niveau de l'ARN adipocytaire pour déterminer l'homéostasie dans des conditions hypoxiques.
- Ajouter1 ml de solution à phase unique de guanidine isothiocyanate et de phénol à chaque puits et d' isoler l'ARN [ en utilisant la méthode en une seule étape par Chomczynski et Sacchi 17 (étape 1.3.2)] et procéder comme dans les étapes 1.3.2.1) à 1.3.5.2) .
- Analyser l'apoptose par FITC annexine V et l'écoulement ultérieur des analyses de cytométrie.
Figure 5: Analyse de l' apoptose des adipocytes par cytométrie de flux. Dot présentations de tracé des FACS pour V-FITC et TO-PRO-3 coloration des adipocytes Annexin. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Representative Results
Nous montrons comment déterminer adipocyte homéostasie in vivo et in vitro en utilisant l'exemple de Fra-2 fl / fl souris FABP4-CreERT par rapport à la même portée de type sauvage. Notre protocole définit comment une expression accrue de HIF par l'hypoxie est corrélée avec le dysfonctionnement des adipocytes comme indiqué par l'augmentation de l'apoptose des adipocytes.
souris taille des adipocytes accrue et de la zone dans le régime alimentaire, riche en matières grasses (SIH) traités
Surnutrition, entre autres facteurs, entraîne l'hypertrophie adipocytaire, provoquée par un stockage d'énergie excessive dans les gouttelettes lipidiques. La taille de l'adipocyte et la zone est un indicateur de l'hypertrophie. Les sections du coussinet adipeux de la normale (ND; Figure 6a) et le régime alimentaire riche en matières grasses (HFD; Figure 6b) des souris ainsi que les quantifications de la taille des adipocytes et la zone montrent clairement l' hypertrophie adipocytaire après 6 semainess de HFD, qui est indiquée par une augmentation de la taille des adipocytes chez les souris traitées (figure HFD 6c et d).
Hypoxie accrue dans le tissu adipeux (AT) de l' adulte Fra-2 fl / fl-souris FABP4 CreERT conduit à l' augmentation du niveau de HIF-1α et l' apoptose des adipocytes
Pour déterminer l'état in vivo de l' hypoxie en AT, Fra-2 fl / fl souris FABP4-CreERT sont analysées 6 semaines après Fra-2 suppression à l'âge de 12 semaines et comparés aux congénères de type sauvage. Pimonidazole est administrée aux souris par voie intraperitoneale comme marqueur d'hypoxie efficace; il est non toxique et capable de distribuer dans l'AT. Adipocytes hypoxiques dans l'AT in vivo sont définis par la coloration immunohistochimique des anticorps (figure 7a). En outre, le statut hypoxique accrue de l'AT chez la souris est accompagnée par une augmentation de HIF-1α positif ADIPocytes comme indiqué par la coloration immunohistochimique figure 7b), ce qui est confirmé par la quantification des niveaux d'expression de HIF-1α et ses cibles gènes 9. De plus, la coloration TUNEL de sections à partir de Fra-2 fl / fl-souris FABP4 CreERT et la même portée de contrôle (Figure 7C) montre que l' accroissement de l' apoptose des adipocytes est corrélée avec la présence de l' hypoxie et de l' expression de HIF-1α.
Augmentation de l'expression de HIF-1α dans les adipocytes primaires par l'hypoxie induite par l'apoptose des adipocytes
Pour analyser l' apoptose des adipocytes in vitro, nous utilisons adipocytes générés à partir des plaquettes de graisse sous - cutanée comme décrit ailleurs 20. Comme on s'y attendait, l'expression de HIF-1α dans les adipocytes est augmentée après 24 h d'hypoxie (figure 8a). Afin d'analyser davantage les activités HIF-1α, les niveaux de cible d'ARN de HIFdes gènes tels que Inos (inductible de l'oxyde nitrique synthase) sont quantifiés par PCR quantitative. La figure 8b montre que l'augmentation de l' expression de HIF-1α dans des conditions hypoxiques conduit à l' augmentation du niveau Inos ARNm. Étant donné que nous avons déjà démontré in vivo (figure 8) que l' augmentation de l' expression de HIF-1α dans les adipocytes est corrélée à une augmentation de l' apoptose des adipocytes, l' apoptose est également quantifié dans des cultures in vitro par coloration à l' Annexine V dans des conditions hypoxiques. En accord avec les données in vivo (figure 7), un niveau de HIF-1α est accompagnée d' une augmentation de l' apoptose accrue des adipocytes induite par des conditions hypoxiques (Figure 8b). De plus, pour prouver que l'apoptose induite par hypoxie est HIF-dépendante; HIF-1α ou HIF-2α est réduit au silence par l'interférence d'ARN dans les adipocytes dérivés de type sauvage ou Fra-2 souris déficientes. L'apoptose des adipocytes accrue est restauré en faisant taire HIF-1α ou HIF-2α comme indiqué par Annexin V coloration sur la figure 8b, ce qui prouve que le capteur d'hypoxie HIF-α régule l'apoptose des adipocytes.
Figure 6: Augmentation de la taille des adipocytes et la région chez les souris au régime alimentaire riche en graisses (HFD) (a, b) coloration H & E des sections du coussinet adipeux perigonadal de souris de type sauvage mâles nourris avec un régime alimentaire normal (ND) (a) ou élevé. alimentation -Fat (SIH) (b) pendant 6 semaines. Les barres représentent 500 um. (C, d) quantifications de la taille des adipocytes (c) et la zone (d) du coussinet adipeux perigonadal des souris de type sauvage nourris avec ND (a) ou HFD (b) pendant 6 semaines. n = 10. Les données sont représentées sous forme de valeurs moyennes ± SEM. L' analyse statistique a été réalisée à l' aide de Student t -test. *** P <0,0001.: //www.jove.com/files/ftp_upload/53822/53822fig6large.jpg "Target =" _ blank "> S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 7: Augmentation du niveau HIF-1α et de l' apoptose dans les adipocytes des adultes Fra 2-fl / fl souris FABP4-CreERT. Hypoxie (a) et HIF-1α (b) coloration à l'AT de Fra-2 fl / fl-souris FABP4 creERT et congénères de contrôle mâles de 6 semaines après l' injection tamoxifène mâle. Grossissement 20X, 40X insérer. Les flèches noires indiquent les zones hypoxiques et de cellules positives HIF-1α. (C) coloration TUNEL en Fra-2 fl / fl souris FABP4-CreERT et littermates de contrôle à 6 semaines après l' injection du tamoxifène. Grossissement 20X, 40X insérer. Les flèches noires indiquent les cellules positives TUNEL. Ce chiffre a été modifié depuis Luther etal. 9. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 8:. Augmentation de l' expression de HIF-1α et adipocytaire l' apoptose dans les adipocytes primaires induites par hypoxie (a) une analyse PCR en temps réel de cibles HIF niveaux Inos ARNm de HIF-1α et dans les adipocytes primaires placés dans des chambres hypoxiques analysé aux points temporels indiqués. (B) Quantification de l' apoptose par Annexin V coloration FACS dans les adipocytes primaires isolées à partir de Fra-2 fl / fl souris FABP4-CreERT ou des contrôles de type sauvage transfectées avec commande sh ou sh plasmide contre HIF-1α ou HIF-2α et placés sous hypoxie (1% de O 2) pendant 24 heures. Ce chiffre a été modifié depuis Luther et al.
Discussion
Les adipocytes sont caractérisés phénotypiquement par leur taille, leur nombre et la superficie, révélant l' hyperplasie des adipocytes et de l' hypertrophie, induite par le stockage d'énergie excessive due à la surnutrition 5. Ces événements menant à la dysrégulation d'acides gras et les syndromes métaboliques subséquents sont indique également l'augmentation de la masse grasse avec des métabolismes conservés, qui est aussi appelé que l'expansion de la graisse "en bonne santé". Par exemple, Kusminski et al. 21 ont montré que les souris avec l' expansion de la graisse massifs restent métaboliquement sains, ce qui suggère que l' expansion de la graisse est pas nécessairement liée à des syndromes métaboliques et doit être soigneusement déterminé à évaluer les caractéristiques des adipocytes. Le tissu adipeux (AT) joue un rôle central dans la régulation du métabolisme du corps. AT est le plus grand organe endocrine qui pourrait influer sur la dyslipidémie, l' athérosclérose, l' hyperinsulinémie et l' hyperglycémie 3. Évaluation AT homéostasie et la m moléculaireECANISMES régulation il pourrait permettre une meilleure compréhension des troubles du système métabolique. Par conséquent, démêler les mécanismes de régulation de la différenciation des adipocytes, la taille des adipocytes et la graisse pad masse contribuerait à développer de nouveaux traitements thérapeutiques pour les troubles de l'obésité. L' utilisation in vivo et des méthodes in vitro, il est possible de déterminer le rôle des effets de l' alimentation et l' expression des gènes et l' activité sur la différenciation adipocytaire. Pour déterminer l'homéostasie AT, la détermination de l'équilibre entre la différenciation des adipocytes, la prolifération et l' apoptose comme suggéré par notre protocole est aussi important que l' analyse du glucose et de l' insuline métabolique réponse 22-24.
analyse du profil d'expression des gènes impliqués dans l'adipogenèse, la lipogenèse, la lipolyse, l'absorption des acides gras, l'hypoxie, l'apoptose et la prolifération dans les adipocytes primaires et viscéral est une méthode à haut débit pour obtenir une vue d'ensemble sur les adipocytes homéostasie et leur éventuel dysfonctionnement.candidats intéressants devraient être analysés plus au niveau des protéines par western blot ou coloration immunohistochimique. Pour obtenir des résultats optimaux à travers le système de PCR en temps réel en utilisant des colorants cyanines non symétriques, les concentrations d'ADNc allant de 1 à 10 ng et les concentrations d'amorces optimales allant de 50 à 900 nm devraient être testés pour réduire l'amplification non spécifique. Les composants critiques sont les amorces; pour chaque essai, les courbes de fusion doivent être strictement contrôlés pour garantir la spécificité et d'exclure la formation de dimères d'amorces. Par conséquent, en utilisant un témoin négatif avec H 2 O à la place de l' ADNc est recommandée. En outre, les colorants de cyanine disponibles dissymétriques commerciales sont fournies sous forme de mélanges maîtres qui contiennent un colorant de référence passive (comme ROX) pour fournir un signal de référence interne. Le signal d'ADNc est normalisé lors de l'analyse de données pour les signaux de ROX pour corriger les fluctuations du signal du puits à puits. Un autre point à prendre en considération afin d'établir un good système qPCR est le choix du gène de ménage. Pour chaque condition, plusieurs gènes de ménage sont utilisés, par exemple, HPRT, β-actine, la GAPDH, β-2-MG ou HSP90.
Protéines HIF stabilisées par des conditions hypoxiques sont les principaux régulateurs qui déterminent non seulement la survie des adipocytes, mais aussi des changements métaboliques tels que le glucose, la tolérance à l'insuline et du métabolisme des lipides 11,25,26. Pour déterminer les zones hypoxiques dans le coussinet adipeux, HIF-1α est déterminée au niveau des sections par immunohistochimie. Puisque les protéines HIF sont rapidement dégradées dans les 5 à 10 minutes dans des conditions normoxiques, la procédure et la fixation du coussinet adipeux pour l'analyse histologique doivent être étroitement contrôlées pour éviter le temps de latence. Par conséquent, pour assurer une hypoxie non seulement par HIF coloration, pimonidazole est utilisé pour déterminer les zones hypoxiques dans l'AT. Pimonidazole est en mesure de distribuer dans les tissus, comme il a déjà été montré dans les os 27Marquer, et efficacement les zones hypoxiques en se liant aux protéines contenant des thiols spécifiquement dans les cellules hypoxiques, qui est en outre détecté dans les coupes histologiques par liaison de l' anticorps spécifique 28. Cependant, d'autres marqueurs et procédés peuvent être utilisés pour analyser la voie de l'hypoxie. Par exemple, l'implication de l'enzyme prolyl-hydroxylase (PHD) qui induisent hydroxylation des résidus proline de moins de normoxie, ainsi que la protéine de von Hippel-Lindau (VHL), qui reconnaissent des prolines hydroxylés et induisent la poly-ubiquitination à médiation par le protéasome HIF la dégradation, doivent être analysés pour un aperçu complet de la 29,30 de la voie. En outre, la détection ubiquitaire de HIF également de déterminer la stabilité de la protéine et de la dégradation que l' on peut modifier 31,32.
En outre, la prolifération par Ki67 et de l' apoptose par coloration TUNEL sont déterminées in vivo grâce à la coloration des coupes histologiques AT. La quantification de la prolifération par Ki67 etpoptosis par TUNEL , ou par coloration à l' Annexine V par cytométrie en flux analyse est également effectuée 33. Prolifération pourrait bien entendu être mesurée par d'autres techniques telles que l'analyse du cycle cellulaire de l'adipocyte, qui est non traité par la mesure des cellules positives à Ki67. Par ailleurs, l'étude de l'apoptose par TUNEL peut être complétée par des analyses FACS de Annexin V et TOP-PR-3, qui permettra de déterminer les niveaux de nécrose par rapport au processus de mort cellulaire de l'apoptose. L'apoptose est un processus fondamental pour le programme de mort cellulaire, ce qui est important pour l'AT homéostasie. En effet, la dérégulation de l' apoptose des adipocytes a été impliquée précédemment dans les processus contribuant à l' obésité et la lipodystrophie 34. De plus, en 2011, keuper et al. , Une inflammation du tissu adipeux liées à l' apoptose des adipocytes. Ils ont montré que les macrophages induit l'apoptose dans les préadipocytes et adipocytes, qui à leur tour attirent les macrophages. Le recrutement des macrophages accélère l'inflammation, qui contributes de syndromes métaboliques tels que la tolérance au glucose et de l' insuline 35. Cependant, l'apoptose des adipocytes est encore un phénomène peu étudié, en dépit de l'hypothèse que l'apoptose induite par des adipocytes pourrait conduire à une diminution du poids.
Le présent protocole utilise des approches immunohistochimique pour étudier différents phénomènes tels que la prolifération, l' apoptose et l' hypoxie in vivo. Par conséquent, le tissu a été fixé avec 4% de formaldehyde, qui est une étape critique. Un temps de fixation tissulaire prolongée conduit à modifier des épitopes, qui deviennent non-accessibles pour l'anticorps. En revanche, un temps de fixation court augmente la sensibilité des épitopes aux réactifs. Le temps optimal recommandé de fixation est 24 h. En outre, l'épaisseur des sections influe également sur les anticorps se liant à leurs épitopes; épaisseur optimale est comprise entre 2 et 5 um. Les articles plus épais que 5 um donneront des résultats faussement positifs en raison de l'augmentation des sites de liaison. En revanche, sexions plus mince que 2 um contiennent des sites moins contraignants et des zones positives ne sont pas bien définis. En outre les facteurs critiques sont les anticorps lui-même, le temps d'incubation, la concentration et la même température, qui influent sur la qualité de la liaison aux épitopes spécifiques. Par conséquent, la validation de l'anticorps concentration et la durée d'incubation est nécessaire pour chaque condition.
Pour compléter l'étude, nous fournissons une vitro adipocyte protocole de différenciation, qui pourrait être étendu par des traitements différents, la stimulation ou co-cultures. En utilisant des cultures d'adipocytes in vitro, il est possible de déterminer des défauts dans la différenciation et la fonction des adipocytes. Pour obtenir des résultats fiables, comme pour toutes les cellules primaires, le comportement sain et l'apparence des ADSCs et adipocytes est très important. La granularité, vacuolisations et / ou le détachement cytoplasmiques sont des signes de détérioration, indiquant moyen inadéquat, la contamination microbienne ou la sénescence de la primairecellules. Ce protocole utilise des adipocytes isolés à partir du tissu de coussinet adipeux, alors qu'il est ainsi possible d'utiliser les cellules souches mésenchymateuses isolées à partir de la moelle osseuse , comme décrit par d' autres protocoles 36. La dernière comprend des cellules progénitrices stromales, ce qui pourrait refléter des problèmes de différenciation supplémentaires qui se produisent à l'étape très précoce de la différenciation adipocytaire, cela pourrait manquer dans notre protocole actuel. En outre, ADSCs peut être étendu rapidement (plus de 10 fois en une semaine), et ADSCs cultivées à long terme après quelques passages conservent leur mésenchymateuses pluripotence 37,38. Un autre avantage en utilisant ADSCs est que l'on peut facilement passer à l'homme, puisque ADSCs peuvent être récoltées à partir de patients par liposuccion qui est une méthode simple et peu invasive.
Comme AT influence plusieurs autres organes de manière endocrinien, le protocole devrait être étendu à adipokines. Adipokines, tels que la leptine, l'adiponectine, le facteur onconécrosant-α (TNF) ae résistine, sécrétée par les adipocytes sont connus pour affecter les maladies métaboliques en contrôlant le métabolisme des lipides, l' homéostasie énergétique et la sensibilité à l'insuline 39. Par conséquent, les analyses du sérum et adipocytaire secrétome doivent être effectués. Dans le cas d' un dysfonctionnement, AT adipokines et des cytokines pro-inflammatoires, comme l' IL-6, peut conduire à un dérèglement des organes tels que le foie et le pancréas, et de la fonction musculaire 4. Afin d'exclure un dysfonctionnement systémique des organes, des modèles animaux ou des cultures cellulaires peuvent être testés pour leur réponse à la stimulation et l'absorption du glucose.
Ici , nous fournissons un protocole d'analyse de l'état de base de l'AT et des adipocytes in vivo et in vitro pour révéler des mécanismes moléculaires de l' homéostasie des adipocytes et de fonctionnalité.
Disclosures
Les auteurs n'ont rien à dévoiler.
Acknowledgments
Les auteurs tiennent à remercier aimablement Dr. J. Luther et K. Ubieta pour la préparation des données et le Dr B. Grötsch pour la relecture du manuscrit. Ce travail a été soutenu par la Deutsche Forschungsgemeinschaft (BO3811 / 1-1-Emmy Noether).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| RNAlater solution | Ambion | AM7021 | RNA stabilization solution |
| High-Capacity cDNA Reverse Transcription Kit | Applied Biosystems | 4368813 | |
| SYBR Select Master Mix | 4472908 | ||
| Purified Mouse Anti-Human Ki-67 | BD Biosciences | 550609 | Clone B56 (RUO) |
| Purified Mouse Anti-Human Ki-67 Clone B56 (RUO) | 550609 | Proliferation marker | |
| FITC Annexin V | BioLegend | 640906 | |
| Cleaved Caspase-3 Rabbit mAb | Cell signalling | 9664S | Clone 5A1E |
| Cleaved Caspase-3 (Asp175) (5A1E) Rabbit mAb | 9664 | Apoptosis marker | |
| Lipofectamine2000 Reagent | Invitrogen | 11668-027 | |
| TO-PRO-3 Iodide | T3605 | Nuclear counterstain, Monomeric cyanine nucleic acid stain, Excitation⁄Emission: 642⁄661 nm | |
| Mayer’s hemalum | Merck | 109249 | hematoxylin |
| pegGOLD TriFast | Peqlab | 30-2030 | TRIzol, single-phase solution of guanidine isothiocyanate and phenol |
| Percellys Ceramic Kit 1.4 mm | 91-PCS-CK14 | tubes containing ceramic beads (1.4 mm) | |
| Precellys 24 | 91-PCS24 | homogenizer | |
| HIF-1 alpha Antibody | Pierce | PA1-16601 | |
| HIF-1 alpha Antibody, 16H4L13 | 700505 | Hypoxia marker | |
| In Situ Cell Death Detection Kit, Fluorescein | Roche | 11 684 795 001 | TdT-mediated dUTP-biotin nick end labeling (TUNEL) |
| Eosin | Sigma | 318906 | |
| DNase I Solution (1 unit/µl) | Thermo Scientific | EN0525 | |
| biotinylated anti mouse IgG (H+L) | Vector Laboratories | BA-9200 | |
| biotinylated anti mouse IgG (H+L) | BA-1000 | ||
| Vectastain ABC Kit | PK-4000 | ||
| VECTASHIELD Mounting Medium with DAPI | H-1200 |
References
- Obesity and Overweight. Fact Sheet °113. WHO. , (Jan 2014) (2014).
- Gong, Z., Muzumdar, R. H. Pancreatic function, type 2 diabetes, and metabolism in aging. Int J Endocrinol. , 320482 (2012).
- Deng, Y., Scherer, P. E. Adipokines as novel biomarkers and regulators of the metabolic syndrome. Ann N Y Acad Sci. 1212, 1-19 (2010).
- Rezaee, F., Dashty, M. Role of Adipose Tissue in Metabolic System Disorders Adipose Tissue is the Initiator of Metabolic Diseases. J Diabetes Metab. , 008 (2013).
- Rutkowski, J. M., Stern, J. H., Scherer, P. E. The cell biology of fat expansion. J Cell Biol. 208, 501-512 (2015).
- Ma, X., Lee, P., Chisholm, D. J., James, D. E. Control of adipocyte differentiation in different fat depots; implications for pathophysiology or therapy. Front Endocrinol (Lausanne). 6, 1 (2015).
- Farmer, S. R.
- Luther, J., et al. Elevated Fra-1 expression causes severe lipodystrophy. J Cell Sci. 124, 1465-1476 (2011).
- Luther, J., et al. Fra-2/AP-1 controls adipocyte differentiation and survival by regulating PPARgamma and hypoxia. Cell Death Differ. , (2014).
- Semenza, G. L. Regulation of mammalian O2 homeostasis by hypoxia-inducible factor 1. Annu Rev Cell Dev Biol. 15, 551-578 (1999).
- Kim, W., Kaelin, W. G. The von Hippel-Lindau tumor suppressor protein: new insights into oxygen sensing and cancer. Curr Opin Genet Dev. 13, 55-60 (2003).
- Aragones, J., Fraisl, P., Baes, M., Carmeliet, P. Oxygen sensors at the crossroad of metabolism. Cell Metab. 9, 11-22 (2009).
- Sun, K., Halberg, N., Khan, M., Magalang, U. J., Scherer, P. E. Selective inhibition of hypoxia-inducible factor 1alpha ameliorates adipose tissue dysfunction. Mol Cell Biol. 33, 904-917 (2013).
- Imai, T., Jiang, M., Chambon, P., Metzger, D. Impaired adipogenesis and lipolysis in the mouse upon selective ablation of the retinoid X receptor alpha mediated by a tamoxifen-inducible chimeric Cre recombinase (Cre-ERT2) in adipocytes. Proc Natl Acad Sci U S A. 98, 224-228 (2001).
- Clegg, D. J., Brown, L. M., Woods, S. C., Benoit, S. C. Gonadal hormones determine sensitivity to central leptin and insulin. Diabetes. 55, 978-987 (2006).
- Haluzik, M., et al. Genetic background (C57BL/6J versus FVB/N) strongly influences the severity of diabetes and insulin resistance in ob/ob mice. Endocrinology. 145, 3258-3264 (2004).
- Chomczynski, P., Sacchi, N. Single-step method of RNA isolation by acid guanidinium thiocyanate-phenol-chloroform extraction. Analytical biochemistry. 162, 156-159 (1987).
- Paraffin Processing of Tissue. Protocolsonline. , Available from: http://protocolsonline.com/histology/sample-preparation/paraffin-processing-of-tissue/ (2012).
- Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis. Nat Methods. 9, 671-675 (2012).
- Planat-Benard, V., et al. Plasticity of human adipose lineage cells toward endothelial cells: physiological and therapeutic perspectives. Circulation. 109, 656-663 (2004).
- Kusminski, C. M., et al. MitoNEET-driven alterations in adipocyte mitochondrial activity reveal a crucial adaptive process that preserves insulin sensitivity in obesity. Nat Med. 18, 1539-1549 (2012).
- Trajcevski, K. E., et al. Enhanced lipid oxidation and maintenance of muscle insulin sensitivity despite glucose intolerance in a diet-induced obesity mouse model. PLoS One. 8, 71747 (2013).
- Montgomery, M. K., et al. Mouse strain-dependent variation in obesity and glucose homeostasis in response to high-fat feeding. Diabetologia. 56, 1129-1139 (2013).
- de Queiroz, K. B., et al. Molecular mechanism driving retroperitoneal adipocyte hypertrophy and hyperplasia in response to a high-sugar diet. Mol Nutr Food Res. 58, 2331-2341 (2014).
- Ye, J. Emerging role of adipose tissue hypoxia in obesity and insulin resistance. Int J Obes (Lond). 33, 54-66 (2009).
- Xiong, Y., et al. The local corticotropin-releasing hormone receptor 2 signalling pathway partly mediates hypoxia-induced increases in lipolysis via the cAMP-protein kinase A signalling pathway in white adipose tissue. Mol Cell Endocrinol. 392, 106-114 (2014).
- Bozec, A., et al. Osteoclast size is controlled by Fra-2 through LIF/LIF-receptor signalling and hypoxia. Nature. 454, 221-225 (2008).
- Varia, M. A., et al. Pimonidazole: a novel hypoxia marker for complementary study of tumor hypoxia and cell proliferation in cervical carcinoma. Gynecol Oncol. 71, 270-277 (1998).
- Park, M. H., Choi, K. Y., Jung, Y., Min do, S. Phospholipase D1 protein coordinates dynamic assembly of HIF-1alpha-PHD-VHL to regulate HIF-1alpha stability. Oncotarget. 5, 11857-11872 (2014).
- Tennant, D. A., et al. Reactivating HIF prolyl hydroxylases under hypoxia results in metabolic catastrophe and cell death. Oncogene. 28, 4009-4021 (2009).
- Kim, J., So, D., Shin, H. W., Chun, Y. S., Park, J. W. HIF-1alpha Upregulation due to Depletion of the Free Ubiquitin Pool. Journal of Korean medical science. 30, 1388-1395 (2015).
- Amelio, I., et al. TAp73 opposes tumor angiogenesis by promoting hypoxia-inducible factor 1alpha degradation. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112, 226-231 (2015).
- Suga, H., et al. Adipose tissue remodeling under ischemia: death of adipocytes and activation of stem/progenitor cells. Plast Reconstr Surg. 126, 1911-1923 (2010).
- Moreno-Indias, I., Tinahones, F. J. Impaired adipose tissue expandability and lipogenic capacities as ones of the main causes of metabolic disorders. J Diabetes Res. 2015, 970375 (2015).
- Keuper, M., et al. An inflammatory micro-environment promotes human adipocyte apoptosis. Mol Cell Endocrinol. 339, 105-113 (2011).
- Sera, Y., et al.
- Zuk, P. A., et al. Multilineage cells from human adipose tissue: implications for cell-based therapies. Tissue engineering. 7, 211-228 (2001).
- Zuk, P. A., et al. Human adipose tissue is a source of multipotent stem cells. Molecular biology of the cell. 13, 4279-4295 (2002).
- Scherer, P. E. Adipose tissue: from lipid storage compartment to endocrine organ. Diabetes. 55, 1537-1545 (2006).
