Introduction
De acuerdo con el informe de 2014 de la Organización Mundial de la Salud, el 39% de la población adulta mundial tiene sobrepeso, y el 13% es obeso 1. En un futuro próximo, las personas con sobrepeso comprenderán una proporción significativa de la población de edad avanzada. Una característica importante de la obesidad y el envejecimiento es la desregulación de grasa en relación con la morbilidad y mortalidad 2. Adipoquinas, las proteínas secretadas por el tejido adiposo (AT), pueden provocar síndromes metabólicos como la obesidad y la diabetes tipo 2 3. Las enfermedades metabólicas son causados principalmente por el almacenamiento de energía excesivo en las gotitas de lípidos de los adipocitos, que se traduce en AT expansión 4. Por tanto, es de interés para determinar las causas y los mecanismos moleculares de la ampliación AT con el fin de encontrar oportunidades para su control.
El exceso de nutrición conduce a la expansión de AT, que está regulada por dos acontecimientos: el almacenamiento excesivo de energía en las gotas de lípidos de adipocitos, un procesoque conduce a la hipertrofia (aumento en el tamaño de los adipocitos), y el aumento de la adipogénesis, también conocida como hiperplasia de adipocitos 5. Adipogénesis es un proceso de diferenciación de las células multipotentes madre mesenquimales (MSC) en adipocitos. En primer lugar, las MSC se convierten en preadipocitos durante la fase de compromiso. En segundo lugar, los preadipocitos diferenciar aún más para adquirir las características de los adipocitos maduros y funcionales 6. Varios factores de transcripción se han identificado como reguladores maestros para la determinación de preadipocitos, como la proteína de dedo de cinc 423 (Zfp423) y principios de factor de células B 1 (EBF1). Considerando Zfp423 induce compromiso temprano, EBF1 se requiere para la generación de los progenitores de adipocitos 6. La diferenciación terminal está estrechamente controlada por una cascada transcripcional, en el que γ receptores de proliferador de peroxisoma activados (PPAR?) Es el factor de transcripción esencial 7. Otros factores de transcripción clave son la proteína CCAAT / potenciador de unión (CMiembros de la familia / EBP) (es decir, C / EBP, C / EBPb, y C / EBPδ), factores Krüppel similar (KLFs), cAMP elemento sensible a la proteína de unión (CREB) y el crecimiento inicial de respuesta 20 (Krox20) 6.
Recientemente, se ha demostrado que la proteína-1 (AP-1) de la familia activador está involucrado en el proceso de diferenciación de los adipocitos 8,9. La familia AP-1 está formado por un complejo de la proteína dimérica, compuesta de Fos, Jun y / o la activación de factor de transcripción (ATF) miembros. antígeno relacionado con fos 1 y 2 (Fra-1 y Fra-2) son capaces de regular la diferenciación de adipocitos. Fra-1 altera la diferenciación de adipocitos mediante la inhibición de C / EBP 8, mientras que Fra-2 rotación de los controles de los adipocitos 9. Fra-2 con ello no sólo se reduce el número de adipocitos mediante la represión de la expresión de PPAR? 2 durante la diferenciación de los adipocitos, sino que también disminuye la apoptosis de los adipocitos a través de represión directa a los factores inducibles por hipoxia expresión (HIF). La familia HIF es una HETErodimeric factor de transcripción complejo, compuesto de HIF-1α, HIF-2α y HIF-1β. Los heterodímeros se componen de una proteína sensible al oxígeno HIF-α (HIF-1α o HIF-2α) y la subunidad HIF-1β 10 no sensible al oxígeno. Durante la normoxia, proteínas HIF-α son poli-ubiquitinylated y finalmente están degradados por proteasomas 11. Bajo condiciones de hipoxia, se producen en al durante la expansión, las proteínas HIF-α ya no son hidroxilado. Por lo tanto, se convierten en dímeros estabilizados y forma con el HIF-1β se expresa constitutivamente. La activación transcripcional de los genes controlados por los elementos de respuesta a HIF está implicado en la regulación de la angiogénesis, el metabolismo y la inflamación 12. De hecho, HIF-1α promueve AT disfunción mediante la inducción de tolerancia a la glucosa, la inhibición de gasto de energía y la utilización periférica de lípidos, así como mediante el aumento de nivel de leptina y HFD inducida por esteatosis hepática 13. Por otra parte, HIF-1α regula adipocyte apoptosis in vivo e in vitro 9.
El presente protocolo describe métodos para el estudio de AT estado de desentrañar las características moleculares de la homeostasis de los adipocitos en ratones adultos. Se muestra cómo la apoptosis, la proliferación y la diferenciación de adipocitos in vivo e in vitro pueden ser reguladas por la hipoxia. Para ello, utilizamos ratones con deleción específica de adipocitos de Fra-2 generado por el cruce de ratones que portan los Fra-2 alelos floxed con ratones FABP4-CreERT 9. Mediante el uso de ratones ERT FABP4-Cre, la supresión de los adipocitos es específica e inducible por inyección tamoxifeno 14. Para el modelo de adulto, inyecciones intraperitoneal de tamoxifeno se llevan a cabo durante 5 días consecutivos, comenzando a la edad de 6 semanas. Por lo tanto, los ratones son sometidos a una dieta normal o dieta alta en grasas durante 6 semanas antes de realizar el análisis. Los ratones utilizados en este estudio se basan masculina sobre un fondo C57Bl6 para evitar las hormonas femeninas, como los estrógenos, Que se muestra para regular la distribución de grasa corporal 15. El uso de otro fondo genético también podría alterar el fenotipo metabólico, debido a las diferencias relacionadas con el esfuerzo en el manejo de los lípidos 16.
Este protocolo demuestra cómo analizar AT en condiciones de hipoxia usando histología y cómo cuantificar la apoptosis de los adipocitos, la proliferación y la diferenciación in vivo mediante inmunohistoquímica y análisis de genes de perfiles. El estudio se completa por los experimentos in vitro, que muestran cómo analizar la diferenciación de adipocitos primaria y apoptosis alterada por la exposición a la hipoxia.
Protocol
DECLARACIÓN DE ÉTICA: Los animales se alojan en condiciones estandarizadas siguiendo las directrices de la Ley de Bienestar Animal alemán. Los animales son alimentados con una dieta y agua ad libitum estándar y se mantuvieron con un ciclo día / noche de 12 horas. Todos los experimentos con animales están autorizados por el comité de ética local.
1. Análisis in vivo de los adipocitos homeostasis en los varones adultos
- Para cuantificar la hipoxia in vivo, determinar primero el peso corporal de los ratones, a continuación, inyectar 60 mg / kg de peso corporal de clorhidrato de pimonidazole sólido intraperitonealmente (por ejemplo: inyectar 1,5 mg en un 25 g de ratón). Pimonidazole es un marcador de hipoxia eficaz, que forma aductos con grupos tiol en las proteínas, péptidos y aminoácidos y es detectada por un anticuerpo específico.
- Sacrificar los ratones y quitar las almohadillas de grasa perigonadal (Figura 1).
- 45 min después de la inyección, sacrificar los ratones por asfixia con CO2 y dislocación cervical posterior. </ Li>
- Precisar las extremidades de ratones (como se ilustra en la Figura 1) y abra la cavidad peritoneal. Retire la izquierda y la derecha perigonadal almohadilla (epidídimo) de grasa dentro de la cavidad peritoneal.
Nota: almohadilla de grasa se unen al epidídimo por los folletos peritoneales, como se muestra en la Figura 1 (perigonadal almohadillas de grasa se indican con flechas). - Tenga cuidado de eliminar los tejidos gonadales de la almohadilla de grasa. Determinar los pesos almohadilla de grasa para calcular la relación: peso almohadilla de grasa (g) por peso corporal (g).
Figura 1: Localización de las almohadillas de grasa perigonadal en la cavidad peritoneal de ratones. Cuadro de localización de la grasa perigonadal en ratones adultos después del sacrificio. Almohadillas de grasa Perigonadal están indicadas por las flechas. Por favor, haga clic aquí para vIEW una versión más grande de esta figura.
- Para compilar un perfil de expresión génica cuantitativa, utilizar una almohadilla de grasa perigonadal para aislar el ARN. Nota: Hasta que se procesa el tejido, almacenar muestras de tejido en una solución de estabilización de ARN a -80 ° C o en nitrógeno líquido.
- Para homogeneizar la almohadilla de grasa, agregue la almohadilla de grasa de solución de fase única de 1 ml de isotiocianato de guanidina y fenol. Use tubos que contienen los granos de cerámica (1,4 mm) para aplastar el tejido en un homogeneizador a 6.500 rpm (2 veces 20 segundos, con 30 segundos de pausa).
- Aislar el RNA como sigue (método de un solo paso por Chomczynski y Sacchi 17).
- Para separar las fases, la transferencia de almohadilla de grasa homogeneizada al tubo de microcentrífuga, añadir 0,2 ml de cloroformo volumen, agitar durante 15 segundos, se incuba durante 5 minutos a temperatura ambiente y centrifugar 12.000 xg durante 5 min. Transferir la fase acuosa superior (alrededor de 400 l), que contiene el ARN, en un nuevo tubo de microcentrífuga. No incluya el ADN de contenering interfase o en la fase de fenol que contiene proteínas.
- Para precipitar el ARN, añadir 1 volumen de isopropanol, mezclar e incubar durante 15 min a 4 ° C (también es posible incubar a -20 ° C durante la noche). Centrifugar a 12.000 xg durante 10 min. Aspirar el sobrenadante con cuidado isopropanol. Lavar dos veces con 75% de etanol con pasos de centrifugación de 12.000 xg durante 10 min.
- Después de secar el ARN precipitado por alrededor de 10 min a temperatura ambiente, se disuelven en 50 l H 2 O (libre de RNasa). Para facilitar esta tarea, se incuba durante 2 min a 65 ° C.
Nota: Mantenga ARN en 75% de etanol a -80 ° C o en nitrógeno líquido para almacenamiento a largo plazo. - Cuantificar las preparaciones de ARN por A 260/280 (cociente óptimo está entre 1.8 y 2.2) y calcular la concentración de A 260:
- Para evitar la contaminación del ADN, digerir 1 g de la preparación de ARNcon 1 U de ADNasa I durante 30 minutos a 37 ° C en un volumen de 10 l. Inactivar a 65 ° C durante 10 min.
Nota: Este paso es opcional. - Utilice 10 l de la preparación de ARN que contiene 1 mg de ARN para la reacción de la transcriptasa inversa para generar ADNc de cadena sencilla, adecuado para la aplicación de PCR cuantitativa. Los componentes y sus cantidades se listan en la Tabla 1.
- Use una mezcla maestra de PCR para una reacción de PCR cuantitativa en tiempo real. Para determinar los cambios metabólicos en toda la almohadilla de grasa, utilizar cebadores específicos para genes implicados en la homeostasis AT (Tabla 2) y las condiciones de PCR enumerados en la Tabla 3.
- análisis de los datos de PCR en tiempo real.
- Definir la línea de base (Figura 2), normalmente ciclo de 1 a 15, donde no hay cambio en las señales de fluorescencia. El software de PCR en tiempo real se normaliza señales de fluorescencia específicas de la fluorescencia de línea de base y para el colorante de referencia interna, ROX, resultando enla magnitud de las señales específicas por los cebadores, delta Rn (ΔRn).
- Establecer el umbral dentro de la fase exponencial de la curva de amplificación. La intersección define el ciclo umbral (Ct). Basándose en el valor CT, el cálculo de la expresión relativa (Ct) y el factor de cambio (ΔΔCt):
| Componente | l de volumen / reacción |
| RT Buffer 10x | 2.0 |
| 25x dNTP Mix (100 mM) | 0,8 |
| 10x RT Random Primers | 2.0 |
| MultiScribe transcriptasa inversa | 1.0 |
| Libre de nucleasa H2O | 4.2 |
| 1 gARN | 10 |
| reacción total por | 20 |
Tabla 1: Componentes con volumen respectivo para la reacción de la transcriptasa inversa para generar ADNc de cadena sencilla.
| Nombre oficial completo | Símbolo | Secuencia 3 '-> 5' | ||
| Adelante | Marcha atrás | |||
| adipogénesis | Delta-como 1 homólogo (pref-1) | Dlk1 | GACACTCGAAGCTCA CCTGG | GGAAGGCTGGGACGG GAAAT |
| factor de células B temprano 1 | EBF1 | CCACCATCGACTACGG CTTC | TCCTGGTTGTTGTGGGG CATC | |
| proteína de dedo de cinc 423 | Zfp423 | GTGCCCAGGAAGAAGA CGTA | GGCGACGTGGATCTGA ATCT | |
| proteína de unión de ácidos grasos 4 (Ap2) | FABP4 | TCACCTGGAAGACAGCT CCTC | AAGCCCACTCCCACTTC TTTC | |
| CCAAT / potenciador de la proteína de unión (C / EBP), alfa | CEBPA | AAGAGCCGCGACA AGGC | GTCAGCTCCAGCACCT TGTG | |
| CCAAT / potenciador de la proteína de unión (C / EBP), beta | CEBPB | TTTCGGGACTTGATGC AATC | CCGCAGGAACATCTTT AAGG | |
| cAMP proteína 1 de unión al elemento de respuesta | Creb1 | ACTCAGCCGGGTACT ACCAT | TTGCTGCCTCCCTGTT CTTC | |
| CCAAT / potenciador de la proteína de unión (C / EBP), delta | Cebpd | CAGCGCCTACATTGAC ATCC | GTTGAAGAGGTCGGCG AAGA | |
| Kruppel como factor de 4 | KLF4 | GCAGTCACAAGTCCCC TCTC TAGTCACAAGTGTGGG TGGC | ||
| crecimiento inicial de respuesta 2 (Krox20) | Egr2 | AGGCGGTAGACAAAATC CCAG | GATACGGGAGATCCAG GGGT | |
| Proliferador de peroxisoma receptor gamma activado | PPARg | AGAGGTCCACAGAGCTG ATTC | GATGCACTGCCTATGAGC ACTT | |
| lipogénesis | Acetil-coenzima A carboxilasa alfa | Acaca | TGGGGACCTTGTCTTCA TCAT | ATGGGCGGAATGGTCTC TTTC |
| Sintasa de ácidos grasos | Fasn | ACATCCTAGGCATCC GAGÁ | CCGAGTTGAGCTGGGT TAGG | |
| Estearoil-Coenzima A desaturasa 1 | scd1 | CGGGATTGAATGTTCTTG TCGT | TTCTTGCGATACACTCTG GTGC | |
| lipólisis | containi dominio fosfolipasa patatina-como2 ng | Pnpla2 | AAGGACCTGATGACCA CCCT | CCAACAAGCGGATGGT GAAG |
| Fatty la absorción de ácidos | lipoproteína lipasa | LPL | GTATCGGGCCCAGCAA CATTATCC | GCCTTGCTGGGGTTTTC TTCATTC |
| antígeno CD36 | CD36 | GTCTTCCCAATAAGCATGT CTCC | ATGGGCTGTGATCGGA ACTG | |
| La hipoxia | Factor inducible por hipoxia 1, subunidad alfa | HIF1A | CCTGCACTGAATCAAGAG GTGC | CCATCAGAAGGACTTGCT GGCT |
| proteína del dominio PAS endotelial 1 (también conocido como: HIF-2 alfa) | EPAS1 | CAAGCTGAAGCTAAAG CGGC | TTGGGTGAATTCATCG GGGG | |
| supresor tumoral de von Hippel-Lindau | BVS | ACCGAGGTCATCTTTG GCTC | TTCCGCACACTTGGGT AGTC | |
| receptor de aril hidrocarburos translocador nuclear (también conocido como: HIF-1 beta) | Arnt | TGGGTCATCTTCTCGC GGTT | TGTCCTATCTGAGCAT CGTG | |
Tabla 2: Lista de los genes con secuencia de los cebadores respectivos utilizados para el análisis de la homeostasis de los adipocitos.
| Paso | Temperatura (° C) | Tiempo (min: seg) | ||
| activación de la polimerasa | Sostener | 95 | 10:00 | |
| PCR | 40 ciclos | desnaturalizar | 95 | doce y quince |
| El recocido / extensión | 60 | 01:00 | ||
| curva de fusión | 60-95 | 0,5 ° C / seg | ||
Tabla 3: en tiempo real las condiciones de PCR.
Figura 2:. Las características de tiempo real curva de amplificación por PCR Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
- Para llevar a cabo el análisis histológico de la homeostasis de los adipocitos, utilizar la segunda almohadilla de grasa perigonadal. No desecar el tejido!
- Fijar la almohadilla de grasa en el 3,7% de formaldehído tamponado con PBS durante la noche, incrustar en parafina (siga las instrucciones como se describe en otro lugar 18) y cortar el tejido incrustado en 2-5 micras de grosor (máximo 5 m).
- Determinar el número de adipocitos por campo y el tamaño de los adipocitos en un microscopio de campo brillante después de hematoxilina y eosina (H & E) tinción: <ol>
- Desparafinar secciones por lavado 3 veces durante 5 min en xileno y rehidratar la sección 2 veces durante 2 minutos en 100% de etanol y 2 veces durante 2 minutos en 96% de etanol. Por último, lavar la sección en H 2 O destilada durante 5 minutos.
- La mancha con hematoxilina, se diluyó 1: 5 con H 2 O destilada, durante 10 minutos a temperatura ambiente y lavar en H 2 O durante 5 min. Mancha con una solución de eosina (20 ml 5% eosina Y / 210 ml de H2O / 25 l de ácido acético glacial destilada) durante 30 segundos y volver a lavarse con H 2 O durante 5 min.
- Deshidratar secciones usando 96% de etanol y 100% de etanol 2 veces cada uno durante 2 min, y xileno 3 veces durante 5 min. Montar las secciones con medio de montaje anhidro.
- Evaluar las secciones en un microscopio de campo brillante. Un ejemplo representativo de cómo analizar los adipocitos con ImageJ 1.48v 19 se muestra en la Fig. 3: número de células por área (micras 2), área de la celda (10 x 3 m 2
- Abra el cuadro de la sección con 1.48v ImageJ. Si los parámetros de la imagen se indican en píxeles en lugar de una unidad de longitud, la cuantía.
- Seleccionar * * línea recta en la barra de herramientas y ajustar la línea a una distancia conocida por referencia a la barra de escala. Ir a Analizar -> Escala de ajuste de la distancia de la línea se muestra en píxeles;. añadir la distancia conocida y la unidad de longitud, por ejemplo, m. Confirmar con la tecla OK. El tamaño de la imagen y el análisis de los parámetros se indican en la unidad de longitud dada.
- Para determinar los parámetros de los adipocitos, ajustar el umbral. Ir a Imagen -> Ajustar -> Umbral para abrir la ventana Umbral. Seleccione los valores siguientes: Método de Umbral: Por defecto, el color Umbral: B & W; Espacio de color: HSB. La imagen que se muestra ahora en blanco y negro. Ajustar elBrillo para borrar los adipocitos blancos y para cerrar los espacios intercelulares negro, como en la Fig. 3b.
- Contar el número de adipocitos por m 2 (Figura 3e) con el * * de múltiples puntos de selección en la barra de herramientas y marque cada celda para el recuento.
- Para determinar el tamaño de los adipocitos, seleccione * * línea recta de nuevo en la barra de herramientas y dibujar el diámetro de un adipocito (Figura 3c). Ir a Analizar -> Medida y una nueva ventana aparecerá, con la longitud del diámetro en micras.
- Para determinar el área de los adipocitos, seleccione * Varita herramienta (rastreo) * y haga clic dentro del adipocito. La pared interior del adipocito se selecciona en rojo (Figura 3d). Ir a Analizar -> Medida y una nueva ventana aparecerá, con el área de este adipocitos en m 2.
- Desparafinar secciones por lavado 3 veces durante 5 min en xileno y rehidratar la sección 2 veces durante 2 minutos en 100% de etanol y 2 veces durante 2 minutos en 96% de etanol. Por último, lavar la sección de H2O destilada
- Para la recuperación de antígenos, digerir la sección de tejido durante 30 minutos a 37 ° C con proteinasa K solución de trabajo (20 mg / ml en Tris 10 mM / HCl, pH 7,4-8) y enjuagar con PBS.
- Para bloquear la peroxidasa endógena, usar 3% de peróxido de hidrógeno en PBS durante 10 min, con posteriormente lavar 2 veces durante 5 min en PBS. Para bloquear la unión no específica de anticuerpos, utilizar 10% de suero en PBS. Utilizar el suero del huésped del anticuerpo secundario, en este caso de cabra.
- Para la tinción, utilizar los anticuerpos para la apoptosis, la proliferación y la detección de hipoxia (
- Para mejorar la señal de utilizar un anticuerpo secundario biotinilado, con la dilución como se indica en la Tabla 5. Para la detección de hipoxia, utilice HRP de conejo conjugado con anti-FITC como anticuerpo secundario. Incubar durante 1 hora a temperatura ambiente. Se lavan las secciones 2 veces 5 min con PBS.
Nota: Para la tinción con FITC-hipoxia mAb1, omita el paso 1.4.4.4) y continúe con el paso 1.4.4.5).- Para cada diapositiva, pre-incubar 50 l solución de avidina con 50 l biotinilados peroxidasa H durante 30 minutos a temperatura ambiente (este método también se conoce como avidina biotina formulación complejo / ABC) y a continuación, añadir a las secciones durante otros 45 min. Lavar 2 veces durante 5 min con PBS.
- Se incuban las secciones en solución de sustrato de peroxidasa hasta que la tinción se hacen más intensos (entre 5 a 10 min). Lavar durante 5 minutos con agua destiladaH2O
- Para la contratinción, mancha con hematoxilina diluyó 1: 5 con H2O destilada durante 10 minutos a temperatura ambiente y lavar en H 2 O durante 5 min.
- Deshidratar secciones en etanol al 96% y 100% de etanol 2 veces cada uno durante 2 min, y xileno 3 veces durante 5 min. Sellar las secciones con cubreobjetos y un medio de montaje anhidro. Evaluar las secciones en un microscopio de campo brillante.
- Para mejorar la señal de utilizar un anticuerpo secundario biotinilado, con la dilución como se indica en la Tabla 5. Para la detección de hipoxia, utilice HRP de conejo conjugado con anti-FITC como anticuerpo secundario. Incubar durante 1 hora a temperatura ambiente. Se lavan las secciones 2 veces 5 min con PBS.
- Añadir solución de enzima en 50 l 450 l solución de marca. A continuación, aplicar 50 l TUNEL mezcla de reacción en secciones histológicas e incubar durante 60 minutos a 37 ° C en una atmósfera húmeda en la oscuridad. Se lavan las secciones 3 veces con PBS durante 5 min y montar con fluorescencia medio de montaje que incluye DAPI (4 ', 6-diamino-2-fenilindol) para la tinción de contraste.
- Evaluar la sección bajo un microscopio de fluorescencia con 100 magnificat veces ion. Para la medición de fluoresceína utilizar una longitud de onda de excitación de 488 nm y detección de entre 515 a 565 nm (láser verde); DAPI excita a alrededor de 360 nm y emite a aproximadamente 460 nm cuando se unen al ADN (láser azul).
- Cuantificar las superposiciones de DAPI y fluoresceína:
Figura 3:. Analizar las características de los adipocitos en las secciones almohadilla de grasa sección de los cuadros de la almohadilla de grasa perigonadal de ratones machos tratados con una dieta rica en grasa (HFD) o dieta normal (ND) con un microscopio de campo brillante (a); el umbral se ajusta en blanco (b) y el negro y el tamaño de los adipocitos (longitud; c), el área (d) y el número de células de adipocitos por mm 2 (e) se cuantifican con 1.48v ImageJ.f = "https://www.jove.com/files/ftp_upload/53822/53822fig3large.jpg" target = "_ blank"> Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
| de la concentración | dilución | |
| La apoptosis | Exfoliados caspasa-3 (Asp175) (5A1E) Conejo mAb | 1: 2000 |
| Proliferación | Ki-67 purificada de ratón anti-humano clon B56 (OBA) | 1:50 |
| La hipoxia | Anticuerpo HIF-1 alfa | 1: 100 |
| FITC-mAb1 | 1: 100 |
Tabla 4: Los anticuerpos con la dilución respectiva utilizado para la tinción inmunohistoquímico de las secciones de AT.
| Anticuerpo | dilución |
| biotinilado antiIgG de ratón (H + L) | 1: 200 |
| biotinilado de IgG de ratón anti (H + L) | 1: 200 |
| HRP anti-conejo conjugados con FITC | 1: 100 |
Tabla 5: Los anticuerpos secundarios con la dilución utilizados para la tinción inmunohistoquímico.
2. El análisis in vitro de la homeostasis del adipocito influenciada por hipoxia
- Sacrificar los ratones y eliminar el tejido adiposo subcutáneo.
- Sacrificar los ratones mediante asfixia con CO2 y dislocación cervical posterior.
- Inmovilizar las extremidades de los ratones como se ilustra en la Figura 4. Separar la piel de la pierna superior, lomo y el flanco y el pin hacia abajo con agujas como en la figura 4. A continuación, retire el tejido adiposo subcutáneo, que se encuentra posterior en la base de la patas traseras, que rodean los ganglios linfáticos inguinales (como se muestra en la Figura 4, izquierda: almohadilla de grasa subcutáneas indicada por las flechas; derecha: ganglio linfático inguinal indicada por la flecha).
Figura 4: Localización de las almohadillas de grasa subcutánea. Cuadro de la almohadilla de grasa subcutánea; las flechas izquierda indican la almohadilla de grasa subcutánea y la flecha hacia la derecha indica el ganglio linfático inguinal. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
- Aislar las células madre derivadas de tejido adiposo (ADSC) como se ha descrito previamente 20.
- ADSC Seed 4.000 células / cm 2 en Dulbecco modificado de Eagle de medio Ham F-12 suplementado con 10% de suero normal de ternera, 1% de penicilina / estreptomicina, 0,5% de anfotericina B, 16 mM de biotina, 18 mM de ácido pantoténico y 100 ácido M ascórbico y crecer la cultura hasta la confluencia alrededor de 70 a 80%, Al que se llega después de 4 a 6 días de cultivo.
- Inducir la diferenciación adipogénica.
- Retire el ADSC adherente de la superficie mediante tratamiento con tripsina.
- Quitar medio, lavar con PBS y añadir solución de tripsina al 0,025% (precalentado a 37 ° C) durante 2 min (hasta que las células se desprenden de la superficie). Inmediatamente se añade medio y lavar las células.
- Contar las células utilizando una cámara de Neubauer.
- Ponga la cubierta de cristal en la zona central de la cámara de Neubauer. Se diluye la suspensión celular 01:10 y la carga de la cámara con 10 l diluidas suspensión celular. Contar las células en 4 cuadrados situados en las esquinas, cada uno compuesto por 16 cuadrados más pequeños. Calcular el número de células por ml:
- Ponga la cubierta de cristal en la zona central de la cámara de Neubauer. Se diluye la suspensión celular 01:10 y la carga de la cámara con 10 l diluidas suspensión celular. Contar las células en 4 cuadrados situados en las esquinas, cada uno compuesto por 16 cuadrados más pequeños. Calcular el número de células por ml:
- ADSC semillas (como se describe en el punto 2.2) en placas de cultivo de 12 pocillos y hacer crecer la cultura hasta la confluencia alrededor de 70 a 80% (alcanzado después de 4 a 6 días).
- Inducir adipogediferenciación nic mediante la adición de 5 mg / ml de insulina, dexametasona 1 mM y 5 mM 3-isobutil-1-metilxantina (IBMX) a los cultivos. Renovar el medio cada 2 días. Las células se diferencian totalmente después de 7 días.
- Retire el ADSC adherente de la superficie mediante tratamiento con tripsina.
- Para analizar la diferenciación adipogénica, tinción con Oil Red O, que tiñe los triglicéridos de los adipocitos maduros.
Nota: El trabajo debe realizarse bajo una campana de humos!- Se elimina el medio, lavar los adipocitos suavemente con PBS y fijar las células durante 60 minutos con 2 ml de formalina al 10%.
- Para preparar la solución de tinción Oil Red O, mezclar 3 partes de la solución de color rojo aceite O stock (300 mg Red Aceite O en polvo disuelto en 100 ml 99% de isopropanol) con 2 partes destilada H 2 O y se incuba durante 10 min a temperatura ambiente. Se filtra la solución de trabajo de Oil Red O a través de un filtro de inyección de 0,2 micras.
Nota: La solución de trabajo es estable durante 2 horas. - Para la tinción con Oil Red O, retire la formalina, lavar los adipocitos con H2
- Evaluar las placas bajo un microscopio de contraste de fase con 100 de ampliación de plegado. Los lípidos de los adipocitos aparecerán rojos y los núcleos aparecerá azul.
- Paso opcional: silenciar el gen de interés por transfección con shRNA.
- Cambiar el medio y añadir medio libre de suero.
- Para la transfección de los adipocitos, el uso de lipofección. Siga las instrucciones del fabricante y utilizar 1 g shRNA por placas de tejido de 12 pocillos. Después de la adición del lípido-DNA-complejo, incubar adipocitos durante 48 horas a 37 ° C.
- Para analizar los adipocitos sometidos a hipoxia, utilice una estación de trabajo de hipoxia hipóxica o una incubadora para mantener las células en condiciones hipóxicas. Dependiendo del estudio, la hipoxia could ser 0,5, 1 o 2% de oxígeno.
- Analizar la apoptosis mediante la Anexina V marcada con FITC y posterior análisis de citometría de flujo.
- Reunir los adipocitos con un rascador de células extra suave, lavar con PBS y añadir 1 x 10 6 células de tampón de unión V-l Anexina 100 (10 mM Hepes / NaOH, pH 7,4; NaCl 140 mM; 2,5 mM CaCl2). Añadir la cantidad de anexina V-FITC recomendado por el fabricante y se incuba a temperatura ambiente durante 15 min.
- Por citometría de flujo de medición, añadir 200 l de tampón de unión Anexina V-1 y M de contratinción nuclear. Determinar la fluorescencia en el canal verde y violeta. Células de contraste + / + nuclear anexina V se definen como necrótica secundaria y Anexina V + / contratinción nuclear - células se definen como células apoptóticas (Figura 5).
- Analizar cuantitativamente el nivel de ARN de los adipocitos para determinar la homeostasis en condiciones de hipoxia.
- Añadir1 ml de solución de una sola fase de isotiocianato de guanidina y fenol a cada pocillo y aislar el ARN [utilizando el método de un solo paso por Chomczynski y Sacchi 17 (etapa 1.3.2)] y proceder como en los pasos 1.3.2.1) a 1.3.5.2) .
- Analizar la apoptosis mediante la Anexina V marcada con FITC y posterior análisis de citometría de flujo.
Figura 5: Análisis de la apoptosis por citometría de flujo de adipocitos. Dot presentaciones trama de la FACS para V-FITC y TO-PRO-3 tinción de anexina adipocitos. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Representative Results
Mostramos cómo determinar la homeostasis de adipocitos in vivo e in vitro utilizando el ejemplo de Fra-2 fl / fl ratones FABP4-CreERT en comparación con sus compañeros de camada de tipo salvaje. El protocolo define cómo el aumento de expresión de HIF por la hipoxia se correlaciona con la disfunción de los adipocitos, como se indica por el aumento de la apoptosis de los adipocitos.
El aumento del tamaño de los adipocitos de ratones y el área en la dieta alta en grasa (HFD) tratados
El exceso de nutrición, entre otros factores, los resultados en la hipertrofia de los adipocitos, causada por el almacenamiento de energía excesivo en las gotitas de lípidos. El tamaño de los adipocitos y la zona es un indicador de la hipertrofia. Las secciones de la almohadilla de grasa de lo normal (ND; Figura 6a) y la dieta rica en grasa (HFD; Figura 6b) los ratones, así como cuantificaciones del tamaño de los adipocitos y el área muestran claramente la hipertrofia de los adipocitos después de 6 semanass de HFD, que se indica por el aumento de tamaño de los adipocitos en los ratones HFD tratados (Figura 6C y D).
El aumento de la hipoxia en el tejido adiposo (AT) de adulto Fra-2 fl / fl ratones FABP4-CreERT conduce a un mayor nivel de HIF-1α y la apoptosis de los adipocitos
Para determinar el estado in vivo de la hipoxia en AT, Fra-2 fl / fl ratones FABP4-CreERT se analizan las 6 semanas después de Fra-2 supresión a la edad de 12 semanas y se compararon con los compañeros de camada de tipo salvaje. Pimonidazole se administra a los ratones por vía intraperitoneal como un marcador de hipoxia eficaz; que no es tóxico y es capaz de distribuir en el AT. Adipocitos hipóxica en el AT en vivo se definen por la tinción de anticuerpos de inmunohistoquímica (Figura 7a). Además, el aumento del estado hipóxico del AT en ratones se acompaña de ADIP positivo aumento de HIF-1αocytes como se indica por la tinción inmunohistoquímica Figura 7b), que se confirma mediante la cuantificación de los niveles de expresión de HIF-1α y sus objetivos de genes 9. Además, la tinción de TUNEL de secciones a partir de Fra-2 fl / fl ratones FABP4-CreERT y compañeros de camada control (Figura 7C) muestra que el aumento de la apoptosis de los adipocitos se correlaciona con la presencia de la hipoxia y la expresión de HIF-1α.
El aumento de expresión de HIF-1α en los adipocitos primarios a través de la hipoxia inducida por la apoptosis de los adipocitos
Para analizar la apoptosis de los adipocitos in vitro, utilizamos adipocitos generados a partir de las almohadillas de grasa subcutánea como se describe en otro lugar 20. Como era de esperar, la expresión de HIF-1α en los adipocitos se incrementa después de 24 h de la hipoxia (Figura 8a). A fin de analizar las actividades de HIF-1α, los niveles de ARN diana de HIFgenes tales como Inos (óxido nítrico sintasa inducible) se cuantifican por qPCR. La figura 8b muestra que el aumento de la expresión de HIF-1α en condiciones de hipoxia conduce a un mayor nivel de ARNm de iNOS. Como ya hemos demostrado in vivo (Figura 8) que el aumento de la expresión de HIF-1α en los adipocitos se correlaciona con aumento de la apoptosis de los adipocitos, la apoptosis también se cuantifica en cultivos in vitro por tinción con Anexina V en condiciones de hipoxia. En consonancia con los datos in vivo (Figura 7), un nivel de HIF-1α aumento se acompaña por un aumento de la apoptosis de los adipocitos inducida por condiciones hipóxicas (Figura 8b). Por otra parte, para demostrar que la apoptosis inducida por hipoxia-es HIF-dependiente; HIF-1α o HIF-2α es silenciada por la interferencia de ARN en los adipocitos derivados de tipo salvaje o Fra-2 ratones deficientes. El aumento de la apoptosis de los adipocitos se restaura silenciando HIF-1α o HIF-2α como se muestra por Anexina V tinción en la figura 8b, lo que demuestra que el sensor de la hipoxia HIF-α regula la apoptosis de los adipocitos.
Figura 6: El aumento del tamaño de los adipocitos y el área en ratones de la dieta alta en grasa (HFD) (a, b) H & E tinción de secciones de la almohadilla de grasa perigonadal de ratones de tipo salvaje macho alimentados con dieta normal (ND) (a) o alta. dieta -fat (HFD) (b) durante 6 semanas. Las barras representan 500 micras. (C, d) cuantificaciones de tamaño de los adipocitos (c) y el área (d) de la almohadilla de grasa perigonadal de ratones de tipo salvaje alimentados con ND (a) o HFD (b) durante 6 semanas. n = 10. Los datos se muestran como valores medios ± SEM. El análisis estadístico se realizó mediante el test t de Student. *** P <0,0001.: //www.jove.com/files/ftp_upload/53822/53822fig6large.jpg "Target =" _ blank "> Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 7: Aumento del nivel de HIF-1α y la apoptosis en los adipocitos de adultos-2 Fra fl / fl ratones FABP4-CreERT. La hipoxia (a) y HIF-1α (b) tinción en el AT de Fra-2 fl ratones FABP4-creERT y compañeros de camada de control macho de 6 semanas después de la inyección macho / fl tamoxifeno. Magnificación 20X, 40X insertar. Las flechas negras indican las zonas hipóxicas y células positivas HIF-1α. (C) la tinción de TUNEL en Fra-2 fl / fl ratones FABP4-CreERT y hermanos de camada de control a las 6 semanas después de la inyección tamoxifeno. Magnificación 20X, 40X insertar. Las flechas negras indican las células TUNEL positivas. Esta cifra ha sido modificado a partir de Luther etal., 9. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 8:. El aumento de expresión de HIF-1α y adipocitos apoptosis en los adipocitos primarios inducidos por hipoxia (a) en tiempo real el análisis de PCR de HIF-1α y de destino HIF niveles de iNOS mRNA en los adipocitos primarios colocados en cámaras de hipoxia analizó en los puntos de tiempo indicados. (B) La cuantificación de la apoptosis mediante tinción con anexina V FACS en los adipocitos primarios aislados de Fra-2 fl / fl ratones FABP4-CreERT o controles de tipo salvaje transfectadas con el control sh o plásmido sh contra HIF-1α o HIF-2α y colocados en condiciones de hipoxia (1% de O2) durante 24 horas. Esta cifra ha sido modificado a partir de Luther et al.
Discussion
Los adipocitos se caracterizan fenotípicamente por su tamaño, número y área, revelando la hiperplasia e hipertrofia de los adipocitos, inducida por la acumulación de energía excesiva debido a la sobre-nutrición 5. Estos acontecimientos que condujeron a la desregulación de ácidos grasos y síndromes metabólicos posteriores son también estados de aumento de la masa grasa con metabolismos conservados, que también se conoce como expansión de grasas "saludables". Por ejemplo, Kusminski et al. 21 mostraron que los ratones con una expansión masiva de grasa permanecen metabólicamente sanos, lo que sugiere que la expansión de la grasa no está necesariamente ligada a los síndromes metabólicos y necesita ser cuidadosamente determinada para evaluar las características de los adipocitos. El tejido adiposo (AT) juega un papel fundamental en la regulación del metabolismo del cuerpo. AT es el mayor órgano endocrino que podrían influir en la dislipidemia, la ateroesclerosis, la hiperinsulinemia y la hiperglucemia 3. Evaluación de AT homeostasis y el m molecularecanismos lo regulan podrían permitir una mejor comprensión de los trastornos metabólicos del sistema. Por lo tanto, desentrañar los mecanismos que regulan la diferenciación de los adipocitos, el tamaño de los adipocitos y la masa almohadilla de grasa podrían ayudar a desarrollar un nuevo tratamiento terapéutico para los trastornos de la obesidad. Uso in vivo y métodos in vitro, es posible determinar el papel de los efectos de los alimentos y de la expresión génica en la diferenciación y la actividad de los adipocitos. Para determinar la homeostasis AT, la determinación del equilibrio entre la diferenciación de adipocitos, la proliferación y la apoptosis como se sugiere por nuestro protocolo es tan importante como el análisis de la glucosa y la insulina metabólica respuesta 22-24.
De perfiles de expresión análisis de genes implicados en la adipogénesis, lipogénesis, lipolisis, absorción de ácidos grasos, la hipoxia, la apoptosis y la proliferación en los adipocitos primarios y visceral AT es un método de alto rendimiento para la obtención de una visión general sobre la homeostasis de los adipocitos y su posible disfunción.interesantes candidatos deben ser analizados a nivel de proteínas por Western blot o tinción inmunohistoquímico. Para obtener resultados óptimos a través del sistema de PCR en tiempo real utilizando tintes de cianina asimétrica, las concentraciones de cDNA que van de 1 a 10 ng y las concentraciones óptimas de cebadores que van desde 50 hasta 900 nM deben ser probados para reducir al mínimo la amplificación no específica. Los componentes críticos son los iniciadores; para cada ejecución, las curvas de fusión deben ser controladas estrictamente para garantizar la especificidad y excluir la formación de dímeros de cebadores. Por lo tanto, se recomienda el uso de un control negativo con H 2 O en lugar de ADNc. Por otra parte, tintes de cianina asimétrica disponibles comerciales se proporcionan como mezclas de reacción que contienen un colorante de referencia pasiva (como ROX) para proporcionar una señal de referencia interna. La señal de ADNc se normalizó durante el análisis de datos de las señales ROX para corregir fluctuaciones de la señal del pozo a pozo. Otro punto a tener en cuenta con el fin de establecer una sustancia viscosad sistema qPCR es la elección de la limpieza de genes. Para cada condición, se usan varios genes de limpieza, por ejemplo, HPRT, β-actina, GAPDH, β-2-MG o HSP90.
Proteínas HIF estabilizadas por condiciones de hipoxia son reguladores maestros que determinan no sólo adipocitos supervivencia, sino también los cambios metabólicos, tales como la glucosa, la tolerancia a la insulina y el metabolismo de lípidos 11,25,26. Para determinar las zonas hipóxicas en la almohadilla de grasa, HIF-1α se determina de AT secciones mediante técnicas de inmunohistoquímica. Dado que las proteínas HIF se degradan rápidamente dentro de 5 a 10 min en condiciones de normoxia, el procedimiento y la fijación de la almohadilla de grasa para el análisis histológico deben ser estrechamente controlados para evitar el tiempo de latencia. Por lo tanto, para garantizar la hipoxia no sólo a través de la tinción de HIF, pimonidazole se utiliza para determinar las áreas hipóxicas en el AT. Pimonidazole es capaz de distribuir en los tejidos, como ya se muestra en los huesos 27, Y efectivamente marcar áreas de hipoxia mediante la unión a proteínas que contienen tiol específicamente en las células hipóxicas, que se detecta adicionalmente en secciones histológicas por el anticuerpo específico de unión 28. Sin embargo, otros marcadores y métodos se pueden utilizar para analizar la vía de hipoxia. Por ejemplo, la participación de la enzima prolil hidroxilasa (PHD), que inducen la hidroxilación de residuos de prolina bajo normoxia, así como la proteína de von Hippel-Lindau (VHL), que reconocen prolinas hidroxiladas e inducir la poli-ubiquitinación para mediar HIF proteasomal la degradación, deben ser analizados para obtener una descripción completa de la vía de 29,30. Además, la detección ubicua de HIF también determinar la estabilidad de la proteína y la degradación que se pueden alterar 31,32.
Por otra parte, la proliferación de Ki67 y la apoptosis mediante tinción TUNEL se determinan in vivo mediante la tinción de secciones histológicas de AT. La cuantificación de la proliferación de Ki67 y unapoptosis por TUNEL tinción con anexina V o mediante citometría de flujo análisis también se lleva a cabo 33. Proliferación podría por supuesto ser medida por otras técnicas tales como el análisis del ciclo celular de los adipocitos, que no se aborda mediante la medición de las células Ki67 positivas. Por otra parte, el estudio de apoptosis por TUNEL puede ser completado por FACS análisis de Anexina V y TOP-PR-3 que va a determinar los niveles de necrosis en comparación con el proceso de muerte celular apoptosis. La apoptosis es un proceso fundamental para el programa de muerte celular, que es importante para AT homeostasis. De hecho, la desregulación de la apoptosis de los adipocitos se ha implicado previamente en los procesos que contribuyen a la obesidad y lipodistrofia 34. Por otra parte, en 2011, Keuper et al. Vinculado la inflamación del tejido adiposo a la apoptosis de los adipocitos. Ellos mostraron que los macrófagos inducen apoptosis en preadipocitos y adipocitos, que a su vez atraen a los macrófagos. El reclutamiento de macrófagos acelera la inflamación, que contributes de síndromes metabólicos, tales como la glucosa y la insulina tolerancia 35. Sin embargo, la apoptosis de los adipocitos sigue siendo un fenómeno poco estudiado, a pesar de la hipótesis de que la apoptosis inducida por los adipocitos podría conducir a una disminución del peso.
El presente protocolo utiliza métodos inmunohistoquímicos para estudiar fenómenos diferentes, tales como la proliferación, la apoptosis y la hipoxia in vivo. Por lo tanto, el tejido se fijó con 4% de formaldehído, que es un paso crítico. Una vez extendida la fijación del tejido conduce al cambio de los epítopos, que se convierten no accesible para el anticuerpo. En contraste, un tiempo de fijación corto aumenta la sensibilidad de los epítopos a los reactivos. El momento óptimo recomendado de fijación es de 24 horas. Por otra parte, el espesor de las secciones también influye en los anticuerpos que se unen a sus epítopos; espesor óptimo es entre 2 y 5 micras. Las secciones más gruesas que 5 micras darán resultados falsos positivos debido al aumento de los sitios de unión. En contraste, sexiones más fina que 2 micras contienen sitios de unión y menos áreas positivas no están bien definidos. Otros factores críticos son el propio anticuerpo, tiempo de incubación, la concentración y uniforme de la temperatura, que influyen en la calidad de la unión a los epítopos específicos. Por lo tanto, la validación de la concentración y el tiempo de incubación de anticuerpo es necesario para cada condición.
Para completar el estudio, proporcionar un protocolo de diferenciación in vitro de los adipocitos, que podría extenderse por diferentes tratamientos, la estimulación o co-cultivos. Mediante el uso en cultivos de adipocitos in vitro, es factible para determinar defectos en la diferenciación y funciones de los adipocitos. Para obtener resultados fiables, como para todas las células primarias, el comportamiento saludable y el aspecto de las ADSC y adipocitos es bastante importante. La granularidad, vacuolations y / o desprendimiento citoplasmáticos son signos de deterioro, lo que indica medio inadecuado, la contaminación microbiana o la senescencia de la primariaCélulas. Este protocolo está usando adipocitos aislados a partir del tejido de la almohadilla de grasa, mientras que es también posible utilizar células madre mesenquimales aisladas de la médula ósea como se describe por otros protocolos 36. La última incluye células progenitoras del estroma, lo que podría reflejar problemas de diferenciación adicional que se produzca en la etapa muy temprana de la diferenciación de adipocitos, esto podría faltar en nuestro protocolo actual. Por otra parte, ADSC se pueden expandir rápidamente (más de 10 veces en una semana), y ADSC cultivadas a largo plazo después de algunos pasajes todavía conservan su pluripotencia mesenquimales 37,38. Otra ventaja usando ADSC es que se puede cambiar fácilmente a humano, ya ADSC se pueden cosechar a partir de pacientes de la liposucción, que es un método simple y mínimamente invasiva.
Como AT influye en varios otros órganos de una manera endocrina, el protocolo debe extenderse a adipoquinas. Adipoquinas, tales como la leptina, la adiponectina, factor de necrosis tumoral-α (TNF) unand resistina, secretada por los adipocitos se sabe que afectan enfermedades metabólicas mediante el control de metabolismo de las grasas, la homeostasis energética y la sensibilidad a la insulina 39. Por lo tanto, los análisis de suero y secretoma adipocitos se deben realizar. En el caso de AT disfunción, adipoquinas y citoquinas proinflamatorias, como la IL-6, puede conducir a la desregulación de órganos como el hígado y el páncreas, y de la función muscular 4. Con el fin de excluir disfunción orgánica sistémica, modelos animales o cultivos celulares podrían ser probados por su respuesta a la estimulación de glucosa y la captación.
Aquí se proporciona un protocolo para el análisis del estado básico de la AT y adipocitos in vivo e in vitro para revelar los mecanismos moleculares de la homeostasis de los adipocitos y funcionalidad.
Disclosures
Los autores no tienen nada que revelar.
Acknowledgments
Los autores desean dar las gracias amablemente el Dr. J. Luther y K. Ubieta para la preparación de los datos y el Dr. B. Grötsch para la corrección del manuscrito. Este trabajo fue apoyado por la Deutsche Forschungsgemeinschaft (BO3811 / 1-1-Emmy Noether).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| RNAlater solution | Ambion | AM7021 | RNA stabilization solution |
| High-Capacity cDNA Reverse Transcription Kit | Applied Biosystems | 4368813 | |
| SYBR Select Master Mix | 4472908 | ||
| Purified Mouse Anti-Human Ki-67 | BD Biosciences | 550609 | Clone B56 (RUO) |
| Purified Mouse Anti-Human Ki-67 Clone B56 (RUO) | 550609 | Proliferation marker | |
| FITC Annexin V | BioLegend | 640906 | |
| Cleaved Caspase-3 Rabbit mAb | Cell signalling | 9664S | Clone 5A1E |
| Cleaved Caspase-3 (Asp175) (5A1E) Rabbit mAb | 9664 | Apoptosis marker | |
| Lipofectamine2000 Reagent | Invitrogen | 11668-027 | |
| TO-PRO-3 Iodide | T3605 | Nuclear counterstain, Monomeric cyanine nucleic acid stain, Excitation⁄Emission: 642⁄661 nm | |
| Mayer’s hemalum | Merck | 109249 | hematoxylin |
| pegGOLD TriFast | Peqlab | 30-2030 | TRIzol, single-phase solution of guanidine isothiocyanate and phenol |
| Percellys Ceramic Kit 1.4 mm | 91-PCS-CK14 | tubes containing ceramic beads (1.4 mm) | |
| Precellys 24 | 91-PCS24 | homogenizer | |
| HIF-1 alpha Antibody | Pierce | PA1-16601 | |
| HIF-1 alpha Antibody, 16H4L13 | 700505 | Hypoxia marker | |
| In Situ Cell Death Detection Kit, Fluorescein | Roche | 11 684 795 001 | TdT-mediated dUTP-biotin nick end labeling (TUNEL) |
| Eosin | Sigma | 318906 | |
| DNase I Solution (1 unit/µl) | Thermo Scientific | EN0525 | |
| biotinylated anti mouse IgG (H+L) | Vector Laboratories | BA-9200 | |
| biotinylated anti mouse IgG (H+L) | BA-1000 | ||
| Vectastain ABC Kit | PK-4000 | ||
| VECTASHIELD Mounting Medium with DAPI | H-1200 |
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