Introduction
על פי הדיווח 2014 של ארגון הבריאות העולמי, 39% מהאוכלוסייה הבוגרת בעולם סובלים מעודף משקל, ו -13% הם 1 שמנים. בעתיד הקרוב, אנשים הסובלים מעודף משקל יהוו חלק משמעותי של אוכלוסיית הקשישים. תכונה חשובה של השמנה והזדקנות היא חוסר ויסות של שומן ביחס לתחלואה ותמותה 2. Adipokines, חלבונים המופרשים על ידי רקמת השומן (AT), יכול לעורר התסמונת המטבולית כמו השמנה וסוכרת מסוג 2 3. מחלות מטבוליות נגרמות בעיקר על ידי אחסון אנרגיה מופרז טיפות השומנים של adipocytes, שתוצאתה AT הרחבה 4. לכן עניין לקבוע את הסיבות ואת המנגנונים המולקולריים של רחבת AT כדי למצוא הזדמנויות לשלוט בו.
יתר התזונה מוביל התרחבות AT, אשר מווסתת על ידי שני אירועים: אחסון אנרגיה מוגזם לתוך טיפות השומנים של adipocytes, תהליךמוביל היפרטרופיה (גידול בגודל adipocyte), ו adipogenesis גדל, הידוע גם בשם adipocyte היפרפלזיה 5. Adipogenesis הוא תהליך של התמיינות של תאי גזע mesenchymal מולטיפוטנטיים (MSC) לתוך adipocytes. ראשית, MSCs להתפתח preadipocytes בשלב המחויב. שנית, preadipocytes נוספת להבדיל לרכוש את התכונות של adipocytes בוגרת ופונקציונלי 6. כמה גורמי שעתוק זוהו רגולטורים לקביעת preadipocyte, כגון חלבון אצבע אבץ 423 (Zfp423) גורם תא מוקדם B 1 (Ebf1). בעוד Zfp423 גורם התחייבות מוקדמת, Ebf1 נדרש עבור הדור של אבות adipocyte 6. בידול מסוף נתונה לפיקוח הדוק על ידי מפל תעתיק, לפיה γ קולטן peroxisome המופעל proliferator (PPARγ) הוא הגורם 7 תעתיק חיוני. גורמי תעתיק מפתח נוספים הם חלבון CCAAT / מחייב המשפר (C/ EBP בני משפחה) (כלומר, C / EBPα, C / EBPβ, ו- C / EBPδ), גורמים דמויי kruppel (KLFs), חלבון מחייב אלמנט תגובה cAMP (CREB) ותגובה הצמיחה המוקדמים 20 (Krox20) 6.
לאחרונה, הוכיח כי מפעיל חלבון-1 (AP-1) המשפחה מעורבת 8,9 תהליך התמיינות adipocyte. מש' AP-1 נוצרה על ידי קומפלקס חלבון dimeric, מורכב Fos, יוני ו / או גורם שעתוק הפעלה (ATF) חברים. Fos הקשורות אנטיגן 1 ו -2 (FRA-1 והאח-2) מסוגלים לווסת בידול adipocyte. פרה-1 פוגעת בידול adipocyte ידי עיכוב C / EBPα 8, ואילו adipocyte שולטת פרא-2 מחזור 9. פרה-2 ובכך לא רק מקטין את מספר adipocyte ידי דיכוי הביטוי PPARγ2 במהלך התמיינות adipocyte, אלא גם מקטין אפופטוזיס adipocyte באמצעות דיכוי ישיר של גורמים מושרה היפוקסיה (HIFs) הביטוי. משפחת HIF הוא heteמורכבות גורם שעתוק rodimeric, מורכבת-1α HIF, HIF-2α ו-1β HIF. Heterodimers מורכבת למקטע HIF-1β חמצן רגיש HIF-α חלבון (HIF-1α או HIF-2α) ואת רגישות-חמצן 10. במהלך normoxia, חלבונים-α HIF הם פולי-ubiquitinylated והם מושפלים לבסוף על ידי פרוטאזומים 11. בתנאי חוסר חמצן, המתרחשים AT במהלך התרחבות, חלבונים-α HIF כבר לא hydroxylated. לכן הם הופכים הדימרים התייצב טופס עם HIF-1β הביע constitutively. הפעלת תעתיק של גנים בשליטת האלמנטים בתגובת HIF היא מעורבת בוויסות של אנגיוגנזה, מטבוליזם, ודלקת 12. ואכן, HIF-1α מקדם AT תפקוד ידי גרימת סבילות לגלוקוז, עיכוב הוצאה אנרגטית ושימוש היקפי של שומנים בדם, כמו גם על ידי הגדלת הרמה לפטין HFD-induced 13 steatosis בכבד. יתר על כן, HIF-1α מסדיר adipocyte אפופטוזיס in vivo ו במבחנה 9.
הפרוטוקול הנוכחי מתאר שיטות ללימוד AT המעמד לפענח את המאפיינים המולקולריים של הומאוסטזיס adipocyte בעכברים בוגרים. זה מראה עד כמה אפופטוזיס, שגשוג והתמיינות של adipocytes in vivo ו in vitro יכול להיות מוסדר על ידי היפוקסיה. לשם כך, אנו משתמשים בעכברים עם מחיקת adipocyte הספציפית של פרה-2 שנוצרה על ידי חציית עכברים שנשאו את אללים floxed פרא-2 עם Fabp4-CreERT עכברי 9. באמצעות Fabp4-Cre עכברי ERT, המחיקה היא adipocyte ספציפית מושרה בזריקת טמוקסיפן 14. עבור הדגם המבוגר, זריקות הצפק תוך של טמוקסיפן מבוצעות מעל 5 ימים רצופים החל בגיל 6 שבועות. כך, העכברים חשופים דיאטה רגילה או דיאטה עתירת שומן במשך 6 שבועות לפני הניתוח מתבצע. העכברים השתמשו במחקר זה זכר התבססו על רקע C57BL6 להימנע הורמונים נשיים, כגון אסטרוגניםלעין, כדי להסדיר את חלוקת השומן בגוף 15. שימוש אחר רקע גנטי עשויה גם לשנות את הפנוטיפ ומטבוליזם, בגלל הבדלים הקשורים למתח שומנים וניהול 16.
פרוטוקול זה מדגים כיצד לנתח AT תחת היפוקסיה באמצעות היסטולוגיה וכיצד לכמת אפופטוזיס adipocyte, התפשטות והבחנה in vivo באמצעות פרופיל אימונוהיסטוכימיה וגן מנתח. המחקר הושלם על ידי ניסויים במבחנה, מראים כיצד לנתח בידול adipocyte ראשוני אפופטוזיס לשנות על ידי חשיפה היפוקסיה.
Protocol
מסר אתיקה: בעלי חיים הם שוכנו בתנאים סטנדרטיים ביצוע ההנחיות של חוק צער בעלי החיים הגרמנים. בעלי חיים ניזונים מודע דיאטה ומי תקן כהרצון והמשיכו עם מחזור 12 שעות יום / לילה. כל הניסויים בבעלי חיים מאושרים על ידי ועדת האתיקה המקומית.
1. ניתוח Vivo של הומאוסטזיס adipocyte ב זכרים בוגרים
- כדי לכמת היפוקסיה in vivo, יש לקבוע תחילה את משקל הגוף של עכברים, ואז מזריקים 60 מ"ג / ק"ג משקל גוף של hydrochloride pimonidazole מוצק התוך peritoneally (למשל: להזריק 1.5 מ"ג לעכבר 25 גרם). Pimonidazole מהווה סמן היפוקסי יעיל, המהווה adducts עם קבוצות תיאול בחלבונים, פפטידים וחומצות אמינו, והוא זוהה על ידי נוגדן ספציפי.
- קורבן עכברים ולהסיר את רפידות שומן perigonadal (איור 1).
- 45 דקות לאחר ההזרקה, להקריב עכברים על ידי ה- CO 2 מחנק ו נקע בצוואר הרחם לאחר מכן. </ Li>
- להצמיד את הגפיים של העכברים (כפי שמודגם באיור 1) ולפתוח את חלל הצפק. הסר שמאל כרית perigonadal (epididymal) שומן ממש בתוך חלל הצפק.
הערה: כרית שומן מאוגדת יותרת האשך על ידי הכרוזים הצפק כפי שמוצגת באיור 1 (perigonadal רפידות שומן מסומנים על ידי חצים). - תשמור על עצמך כדי להסיר את רקמות אשכים מפנקס השומן. לקבוע משקולות כרית שומן כדי לחשב את היחס: משקל כרית שומן (ז) לפי משקל גוף (ז).
איור 1: מיקום של רפידות שומן perigonadal בתוך חלל הבטן של עכברים. תמונה של לוקליזציה שומן perigonadal בעכברים בוגרים לאחר הקרבה. רפידות שומן Perigonadal מסומנות על ידי החצים. נא ללחוץ כאן נiew גרסה גדולה יותר של דמות זו.
- לזהות פרופילים ביטוי גנים כמותיים, השתמש באחת כרית השומן perigonadal לבודד RNA. הערה: עד הרקמה מעובדת, דגימות רקמת חנות בתמיסת ייצוב RNA ב -80 ° C או בחנקן נוזלי.
- כדי homogenize כרית שומן, להוסיף את כרית השומן עד 1 מ"ל פתרון חד פאזיים של isothiocyanate guanidine ו פנול. השתמש צינורות המכילים חרוזי קרמיקה (1.4 מ"מ) כדי למחוץ את רקמת homogenizer 6,500 סל"ד (2 פעמים 20 שניות, עם 30 הפסקה שנייה).
- לבודד את הרנ"א כדלקמן (שיטה בשלב יחיד על ידי Chomczynski ו סאקי 17).
- כדי להפריד את שלבי, להעביר כרית השומן הומוגני צינור microcentrifuge, להוסיף כלורופורם נפח 0.2 מ"ל, ללחוץ במשך 15 שניות, דגירה של 5 דקות בטמפרטורת החדר צנטריפוגות XG 12,000 במשך 5 דקות. מעבירים את השלב מימית העליון (כ -400 μl), המכיל את הרנ"א, לתוך צינור microcentrifuge חדש. אין לכלול את ה- DNA-מכיליםשלבי ing או בשלב פנול המכילים חלבון.
- כדי לזרז את הרנ"א, להוסיף 1 נפח של isopropanol, לערבב דגירה במשך 15 דקות ב 4 ° C (אפשר גם כדי לדגור לילה -20 ° C). צנטריפוגה XG ב 12,000 במשך 10 דקות. הסר isopropanol supernatant בזהירות. שטפו פעמיים עם אתנול 75% בצעדים צנטריפוגות של XG 12,000 במשך 10 דקות.
- לאחר ייבוש RNA זירז עבור כ -10 דקות בטמפרטורת החדר, לפזר אותו 50 μl H 2 O (RNase ללא). כדי להקל על זה, דגירה במשך 2 דקות ב 65 מעלות צלזיוס.
הערה: שמור RNA באתנול 75% ב -80 ° C או בחנקן נוזלי עבור אחסון לטווח ארוך. - לכמת את הכנות RNA על ידי A 260/280 (מנה אופטימלית היא בין 1.8 ו -2.2) ולחשב את הריכוז ידי 260:
- כדי למנוע זיהום DNA, לעכל 1 מיקרוגרם של הכנת RNAעם 1 U DNase אני במשך 30 דקות ב 37 מעלות צלזיוס בהיקף של 10 μl. להשבית ב 65 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות.
הערה: שלב זה הוא אופציונלי. - השתמש 10 μl של הכנת RNA המכילה RNA 1 מיקרוגרם עבור תגובת transcriptase ההפוכה כדי ליצור cDNA חד גדילים, מתאים ליישום PCR כמוני. הרכיבים והיקפן מפורטים בטבלה 1.
- להשתמש בשילוב PCR מאסטר לתגובה PCR כמותי בזמן אמת. כדי לקבוע שינויים מטבוליים כרית השומן שלם, השתמש פריימרים ספציפיים עבור גנים המעורבים הומאוסטזיס AT (טבלה 2) ואת התנאים PCR המפורטים בטבלה 3.
- ניתוח נתונים בזמן אמת PCR.
- הגדר את הבסיס (איור 2), בדרך כלל מחזור 1 עד 15, שבו אין שינוי אותות קרינה. תוכנת real-time PCR מנרמלת אותות קרינה ספציפיים קרינת הבסיס וכדי לצבוע התייחסות הפנימית, רוקס, וכתוצאה מכךסדר הגודל של אותות ספציפיים על ידי פריימרים, דלתא Rn (ΔRn).
- הגדר את הסף במסגרת שלב המעריכים של עקומת ההגברה. ההצלבה מגדירה את מחזור הסף (CT). בהתבסס על השווי CT, לחשב את הביטוי היחסי (ΔCt) והשינוי לקפל (ΔΔCt):
| רְכִיב | μl נפח / תגובה |
| 10x RT חוצץ | 2.0 |
| מערבבים 25x dNTP (100 מ"מ) | 0.8 |
| Primers 10x RT אקראי | 2.0 |
| MultiScribe הפוך transcriptase | 1.0 |
| Nuclease ללא H 2 O | 4.2 |
| 1 מיקרוגרםRNA | 10 |
| תגובה לכל סה"כ | 20 |
טבלה 1: רכיבים עם נפח בהתאמה עבור התגובה transcriptase הפוכה כדי ליצור cDNA חד-גדילי.
| שם מלא רשמי | סֵמֶל | רצף 3'-> 5' | ||
| קָדִימָה | לַהֲפוֹך | |||
| Adipogenesis | דלתא דמוי 1 homolog (pref-1) | Dlk1 | GACACTCGAAGCTCA CCTGG | GGAAGGCTGGGACGG GAAAT |
| גורם תאי B מוקדם 1 | Ebf1 | CCACCATCGACTACGG CTTC | TCCTGGTTGTTGTGGGG catc | |
| אצבע אבץ חלבון 423 | Zfp423 | GTGCCCAGGAAGAAGA CGTA | GGCGACGTGGATCTGA ATCT | |
| חומצת שומן חלבון מחייב 4 (AP2) | Fabp4 | TCACCTGGAAGACAGCT CCTC | AAGCCCACTCCCACTTC TTTC | |
| CCAAT / חלבון מחייב משפר (C / EBP), אלפא | Cebpa | AAGAGCCGCGACA AGGC | GTCAGCTCCAGCACCT TGTG | |
| CCAAT / חלבון מחייב משפר (C / EBP), בטא | Cebpb | TTTCGGGACTTGATGC AATC | CCGCAGGAACATCTTT AAGG | |
| אלמנט תגובה cAMP חלבון מחייב 1 | Creb1 | ACTCAGCCGGGTACT ACCAT | TTGCTGCCTCCCTGTT CTTC | |
| CCAAT / חלבון מחייב משפר (C / EBP), דלתא | Cebpd | CAGCGCCTACATTGAC TCCA | GTTGAAGAGGTCGGCG AAGA | |
| Kruppel דמוי גורם 4 | Klf4 | GCAGTCACAAGTCCCC TCTC TAGTCACAAGTGTGGG TGGC | ||
| בתגובה 2 הצמיחה הקדומה (Krox20) | Egr2 | AGGCGGTAGACAAAATC CCAG | GATACGGGAGATCCAG GGGT | |
| גמא קולטן peroxisome מופעל proliferator | Pparg | AGAGGTCCACAGAGCTG ATTC | GATGCACTGCCTATGAGC ACTT | |
| Lipogenesis | אצטיל-קואנזים A אלפא carboxylase | Acaca | TGGGGACCTTGTCTTCA TCAT | ATGGGCGGAATGGTCTC TTTC |
| synthase חומצת שומן | Fasn | ACATCCTAGGCATCC קוּקוּ | CCGAGTTGAGCTGGGT Tagg | |
| Stearoyl-קואנזים A desaturase 1 | Scd1 | CGGGATTGAATGTTCTTG TCGT | TTCTTGCGATACACTCTG GTGC | |
| lipolysis | containi תחום פוספוליפאז Patatin דמויng 2 | Pnpla2 | AAGGACCTGATGACCA CCCT | CCAACAAGCGGATGGT גאאג |
| ספיגת חומצות שומן | lipase lipoprotein | LPL | GTATCGGGCCCAGCAA CATTATCC | GCCTTGCTGGGGTTTTC TTCATTC |
| אנטיגן CD36 | CD36 | GTCTTCCCAATAAGCATGT CTCC | ATGGGCTGTGATCGGA ACTG | |
| היפוקסיה | היפוקסיה מושרה גורם 1, למקטע אלפא | Hif1a | CCTGCACTGAATCAAGAG GTGC | CCATCAGAAGGACTTGCT GGCT |
| חלבון 1 תחום האנדותל PAS (ידוע גם בשם: HIF-2alpha) | Epas1 | CAAGCTGAAGCTAAAG CGGC | TTGGGTGAATTCATCG gggg | |
| פון היפל-לינדאו מדכא גידולים | VHL | ACCGAGGTCATCTTTG GCTC | TTCCGCACACTTGGGT AGTC | |
| translocator גרעיני קולטן פחמימנים Aryl (ידוע גם בשם: HIF-1beta) | Arnt | TGGGTCATCTTCTCGC GGTT | TGTCCTATCTGAGCAT CGTG | |
טבלה 2: רשימת גנים עם רצף של פריימרים בהתאמה המשמשים לניתוח הומאוסטזיס adipocyte.
| שלב | טמפרטורה (° C) | זמן (שניות: דקות) | ||
| הפעלת פולימראז | לְהַחזִיק | 95 | 10:00 | |
| PCR | 40 מחזורים | Denaturize | 95 | 00:15 |
| חישול / רחבה | 60 | 01:00 | ||
| עקומת התכה | 60 כדי 95 | 0.5 ° C / sec | ||
טבלה 3: תנאי PCR בזמן אמת.
איור 2:. מאפייני עקומת הגברה בזמן אמת PCR אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
- כדי לבצע ניתוח היסטולוגית של הומאוסטזיס adipocyte, השתמש כרית שומן perigonadal השנייה. אל לייבש הרקמה!
- תקן את כרית שומן 3.7% פורמלדהיד PBS שנאגר לילה, להטביע פרפין (פעל בהתאם להוראות תארו במקום 18) וחותך את הרקמה מוטבעת לתוך 2-5 חלקים עבים מיקרומטר (מיקרומטר מקסימום 5).
- לקבוע את מספר adipocytes לכל שדה וגודל adipocyte מיקרוסקופ שדה בהיר לאחר hematoxylin ו eosin (H & E) מכתים: <ol>
- Deparaffinize סעיפים ידי שטיפת 3 פעמים במשך 5 דקות קסילן ו רעננותם בסעיף 2 פעמים במשך 2 דקות ב 100% אתנול ו -2 פעמים במשך 2 דקות באתנול 96%. לבסוף, לשטוף את הסעיף ב H המזוקק 2 O למשך 5 דקות.
- הכתם עם hematoxylin, מדולל 1: 5 עם H 2 O מזוקקים, במשך 10 דקות בטמפרטורת החדר לשטוף ב H 2 O למשך 5 דקות. הכתם עם פתרון eosin (20 מ"ל 5% eosin Y / 210 מ"ל מזוקקים H 2 O / 25 μl חומצה אצטית קרחונית) למשך 30 שניות ולשטוף שוב עם H 2 O למשך 5 דקות.
- מייבשים חלקים באמצעות 96% אתנול ו 100% אתנול 2 פעמים בכל למשך 2 דקות, קסילן 3 פעמים במשך 5 דקות. הר החלק עם סוכן הרכבה נטול מים.
- להעריך את הסעיפים תחת מיקרוסקופ שדה בהיר. דוגמה מייצגת של איך לנתח adipocytes עם ImageJ 1.48v 19 מוצג באיור. 3: מספר התאים לכל אזור (מיקרומטר 2), באזור תא (x 10 3 מיקרומטר 2
- פתח את התמונה של הקטע עם 1.48v ImageJ. אם הפרמטרים של התמונה מסומנים בפיקסלים במקום יחידת אורך, להתאים את קנה המידה.
- בחר * קו ישר * בסרגל הכלים ולהתאים את הקו למרחק ידוע בהתייחס סרגל קנה המידה. עבור אל לנתח -> Scale Set המרחק של קו מוצג פיקסלים;. להוסיף את המרחק ידוע יחידת אורך, למשל, מיקרומטר. אשר עם אישור. הגודל של התמונה ואת הניתוח של הפרמטרים מצוינים יחידת האורך הנתונה.
- כדי לקבוע את הפרמטרים של adipocytes, להתאים את הסף. עבור אל תמונה -> התאם -> סף כדי לפתוח את חלון הסף. בחר את ההגדרות הבאות: שיטת קביעת ערכי סף: ברירת מחדל; צבע סף: B & W; מרחב צבע: HSB. התמונה מוצגת כעת שחור על גב לבן. התאם אתבהירות כדי לנקות adipocytes לבן לסגור חללים שחורים אינטר, כמו באיור. 3 ב.
- ספירת adipocyte לכל מיקרומטר 2 (3E איור) עם מבחר * ריבוי נקודות * בסרגל הכלים וסמן כל תא לספור.
- כדי לקבוע את גודל adipocyte, בחר * * קו ישר שוב בסרגל הכלים לצייר את הקוטר של (איור 3c) adipocyte. עבור אל לנתח -> מדוד וחלון חדש יופיע, עם אורך של בקוטר מיקרומטר.
- כדי לקבוע את אזור adipocyte, בחר * שרביט (התחקות) כלי * ולחץ בתוך adipocyte. הקיר הפנימי של adipocyte נבחר (איור 3D) אדום. עבור אל לנתח -> מדוד וחלון חדש יופיע, עם שטח של adipocyte זה מיקרומטר 2.
- Deparaffinize סעיפים ידי שטיפת 3 פעמים במשך 5 דקות קסילן ו רעננותם בסעיף 2 פעמים במשך 2 דקות ב 100% אתנול ו -2 פעמים במשך 2 דקות באתנול 96%. לבסוף, לשטוף את הסעיף ב מזוקק H 2 O.
- לאחזור אנטיגן, לעכל את קטע רקמה למשך 30 דקות ב 37 מעלות צלזיוס עם proteinase K הפתרון עובד (20 מיקרוגרם / מ"ל ב 10 מ"מ טריס / HCl, pH 7.4-8) ולשטוף עם PBS.
- כדי לחסום את peroxidase אנדוגני, להשתמש במי חמצן 3% ב PBS במשך 10 דקות, עם ובהמשך שטיפת 2 פעמים במשך 5 דקות ב- PBS. כדי לחסום את הכריכה של נוגדנים נוקבים, להשתמש בסרום 10% ב PBS. השתמש בסרום של המארח של נוגדנים משני, עז במקרה זה.
- עבור מכתים, השתמש נוגדנים אפופטוזיס, תפוצת נשק זיהוי היפוקסיה (
- כדי לשפר את האות להשתמש נוגדנים משני biotinylated, עם דילול כמפורט בטבלה 5. לגילוי היפוקסיה, השתמש ארנב HRP מצומדות אנטי FITC כמו נוגדנים משני. דגירה עבור שעה 1 בטמפרטורת החדר. שטוף את הסעיפים 2 פעמים 5 דקות עם PBS.
הערה: מכתים היפוקסיה עם FITC-MAb1, לדלג על שלב 1.4.4.4) ולהמשיך עם צעד 1.4.4.5).- עבור כל שקופית, טרום דגירה פתרון avidin 50 μl עם 50 μl biotinylated peroxidase H במשך 30 דקות בטמפרטורת החדר (שיטה זו נקראת גם בתור avidin / ביוטין כתרכובת ABC) ולאחר מכן להוסיף את הסעיפים במשך 45 דקות אחר. לשטוף 2 פעמים במשך 5 דקות עם PBS.
- דגירת מקטעי פתרון מצע peroxidase עד מכתים להיות אינטנסיביים יותר (בין 5 עד 10 דקות). שטפו במשך 5 דקות עם מזוקקיםH 2 O.
- לקבלת counterstaining, הכתם עם hematoxylin מדולל 1: 5 עם H 2 O מזוקקים במשך 10 דקות בטמפרטורת החדר לשטוף ב H 2 O למשך 5 דקות.
- מייבשי סעיפים 96% אתנול ו 100% אתנול 2 פעמים בכל למשך 2 דקות, קסילן 3 פעמים במשך 5 דקות. חותם את החלקים עם coverslips וסוכן הרכבה נטול מים. להעריך את הסעיפים תחת מיקרוסקופ שדה בהיר.
- כדי לשפר את האות להשתמש נוגדנים משני biotinylated, עם דילול כמפורט בטבלה 5. לגילוי היפוקסיה, השתמש ארנב HRP מצומדות אנטי FITC כמו נוגדנים משני. דגירה עבור שעה 1 בטמפרטורת החדר. שטוף את הסעיפים 2 פעמים 5 דקות עם PBS.
- הוסף פתרון אנזים 50 μl לתוך 450 פתרון תווית μl. ואז להחיל 50 μl תערובת התגובה TUNEL על סעיפים היסטולוגית ו דגירה במשך 60 דקות ב 37 ° C באווירה humidified בחושך. שטוף את הסעיפים 3 פעמים עם PBS במשך 5 דקות ו הר עם הרכבת קרינה בינונית כולל DAPI (4 ', 6-diamidino-2-phenylindole) עבור counterstaining.
- להעריך בסעיף תחת מיקרוסקופ פלואורסצנטי עם 100 מגניפיקט פי יוֹן. למדידת והעמסת להשתמש גל עירור של 488 ננומטר לזהות בין 515-565 ננומטר (לייזר ירוק); DAPI שמרגש בסביבות 360 ננומטר ופולט בסביבות 460 ננומטר כאשר חייב DNA (לייזר כחול).
- לכמת את השכבות של DAPI ו והעמסה:
איור 3:. ניתוח מאפייני adipocyte בסעיפי כרית שומן תמונות סעיף של כרית שומן perigonadal של עכברי זכרים שטופלו דיאטה עתירה שומן (HFD) או דיאטה רגילה (ND) עם מיקרוסקופ שדה בהיר (א); סף מותאם לשחור ולבן (ב) ואת גודל adipocyte (אורך; ג), אזור (ד) ומספר התא adipocyte לכל מ"מ 2 (ה) הם לכמת עם 1.48v ImageJ.f = "https://www.jove.com/files/ftp_upload/53822/53822fig3large.jpg" target = "_ blank"> לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
| ריכוז מניות | מְהִילָה | |
| אפופטוזיס | ביקע caspase-3 (Asp175) (5A1E) הארנב מב | 1: 2,000 |
| שִׂגשׂוּג | מטוהרים עכבר אנטי אנושי Ki-67 Clone B56 (RUO) | 01:50 |
| היפוקסיה | נוגדן אלפא HIF-1 | 1: 100 |
| FITC-MAb1 | 1: 100 |
לוח 4: נוגדנים בדילול בהתאמה המשמש מכתים immunohistological סעיפי AT.
| נוֹגְדָן | מְהִילָה |
| אנטי biotinylatedעכבר IgG (H + L) | 1: 200 |
| IgG עכבר אנטי biotinylated (H + L) | 1: 200 |
| HRP conjugates ארנב נגד FITC | 1: 100 |
לוח 5: נוגדנים משני בדילול המשמש מכתים immunohistological.
2. במבחנה ניתוח של הומאוסטזיס adipocyte בהשפעת היפוקסיה
- קורבן עכברים להסיר את רקמת השומן התת עורית.
- להקריב את העכברים בחנק CO 2 ו נקע בצוואר הרחם לאחר מכן.
- להצמיד את הגפיים של העכברים כפי שמודגם באיור 4. הפרידו את העור מהרגל, ירך ו האגף העליון ולהצמיד אותו עם מחטים כמו באיור 4. לאחר מכן להסיר את רקמת השומן התת עורית, הנמצא האחורי בבסיס של הרגליים האחוריות, המקיפים את בלוטות הלימפה מפשעתי (כפי שמוצג באיור 4, לשמאל: כרית השומן התת עוריתשעות על ידי החצים; מימין: בלוטת לימפה מפשעתי המצוין על ידי החץ).
איור 4: מיקום של רפידות שומן תת עורי. תמונה של כרית השומן התת עורית; החיצים שמאלה לציין את כרית השומן התת עורית ועל החץ הימני מציין את הלימפה מפשעתי. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
- לבודד תאי גזע שמקורם שומן (ADSC) כפי שתוארו לעיל 20.
- ADSC Seed 4,000 תאים / 2 ס"מ ב Dulbecco שונה של הנשרים בינוני-שינקין של F-12 בתוספת 10% עגל בסרום נורמלי, 1% פניצילין / סטרפטומיצין, B amphotericin 0.5%, 16 מיקרומטר ביוטין, 18 מיקרומטר חומצה פנטותנית ו -100 מיקרומטר חומצה אסקורבית לגדול תרבות מפגש סביב 70 עד 80%, אשר מגיע לאחר 4 עד 6 ימים של התרבות.
- להשרות Adipogenic בידול.
- הסר את ADSC החסיד מפני השטח על ידי טריפסין טיפול.
- הסר בינוני, לשטוף עם PBS ולהוסיף פתרון טריפסין 0.025% (שחומם מראש ל 37 מעלות צלזיוס) במשך 2 דקות (עד תאים להתנתק פני השטח). מיד להוסיף בינוני לשטוף את התאים.
- ספירת התאים באמצעות תא נויבאואר.
- החזר את מכסה הזכוכית על האזור המרכזי של חדר נויבאואר. לדלל את השעית תא 1:10 ו לטעון את החדר עם 10 μl מדוללים השעית תא. ספירת התאים ב 4 ריבועים ממוקמים בפינות, כל אחד מורכב 16 ריבועים קטנים יותר. לחשב את מספר התאים לכל מ"ל:
- החזר את מכסה הזכוכית על האזור המרכזי של חדר נויבאואר. לדלל את השעית תא 1:10 ו לטעון את החדר עם 10 μl מדוללים השעית תא. ספירת התאים ב 4 ריבועים ממוקמים בפינות, כל אחד מורכב 16 ריבועים קטנים יותר. לחשב את מספר התאים לכל מ"ל:
- ADSC Seed (כמתואר נקודת 2.2) צלחות תרבות 12 גם ולגדול תרבות מפגש סביב 70 עד 80% (הגיע לאחר 4 עד 6 ימים).
- להשרות adipogeבידול nic ידי הוספת אינסולין 5 מיקרוגרם / מ"ל, 1 dexamethasone מיקרומטר ו -5 מיקרומטר 3-isobutyl-1-methylxanthine (IBMX) לתרבויות. Renew המדיום כל 2 ימים. תאים יהיה להיות מובחן מלא לאחר 7 ימים.
- הסר את ADSC החסיד מפני השטח על ידי טריפסין טיפול.
- כדי לנתח את בידול adipogenic, כתם עם שמן אדום O, אשר מכתים טריגליצרידים של adipocytes הבוגרת.
הערה: העבודה חייבת להתבצע תחת במנדף!- הסר בינוני, לשטוף את adipocytes בעדינות עם PBS לתקן את התאים למשך 60 דקות עם פורמלין 2 מ"ל 10%.
- כדי להכין פתרון מכתים שמן האדום O, לערבב 3 חלקים של פתרון המניות האדום שמן O (300 מ"ג אבקת האדום שמן O מומס 100 מ"ל 99% isopropanol) עם 2 חלקים מזוקקים H 2 O ו דגירה במשך 10 דקות בטמפרטורת החדר. סנן את הפתרון עובד שמן האדום O דרך פילטר הזרקת 0.2 מיקרומטר.
הערה: הפתרון עובד יציב במשך שעה 2. - עבור מכתים O אדום שמן, להסיר את פורמלין, לשטוף adipocytes עם H 2
- להעריך את הצלחות תחת מיקרוסקופ לעומת שלב עם 100 בהגדלה של פי. השומנים של adipocytes יופיעו אדום ואת הגרעינים יופיעו כחול.
- שלב אופציונלי: להשתיק את הגן של עניין על ידי transfection עם shRNA.
- שנה את בינונית ומוסיפים סרום ללא בינוני.
- עבור transfection של adipocytes, השתמש lipofection. פעל על פי הוראות היצרן ולהשתמש 1 מיקרוגרם shRNA לכל צלחות רקמת 12 גם. לאחר תוספת של שומני DNA הקומפלקס, דגירת adipocytes במשך 48 שעות על 37 מעלות צלזיוס.
- כדי לנתח adipocytes נתון היפוקסיה, להשתמש תחנת עבודה היפוקסי או חממה היפוקסי לשמור על התאים בתנאי חוסר חמצן. בהתאם המחקר, ג היפוקסיהולד להיות חמצן% 0.5, 1 או 2.
- לנתח אפופטוזיס על ידי V Annexin שכותרתו FITC ותזרים עוקב cytometry מנתח.
- אסוף adipocytes עם מגרד תא רך נוספת, לשטוף עם PBS ולהוסיף 1 x 10 6 תאים עד 100 μl Annexin חיץ V מחייב (10 מ"מ Hepes / NaOH, pH 7.4, 140 מ"מ NaCl; 2.5 מ"מ CaCl 2). מוסיפים את כמות Annexin V-FITC המומלץ על ידי היצרן ו דגירה בטמפרטורת החדר למשך 15 דקות.
- עבור זרימה cytometry המדידה, להוסיף 200 μl חיץ V מחייב Annexin ו -1 מיקרומטר של counterstain גרעיני. קבע את הקרינה בערוץ ירוק וסגול. Annexin V + / גרעיני counterstain + תאים מוגדרים נמקי משני Annexin V + / counterstain גרעיני - תאים מוגדרים תאים אפופטוטיים (איור 5).
- כמותית לנתח ברמת RNA adipocyte לקבוע את הומאוסטזיס בתנאי חוסר חמצן.
- לְהוֹסִיףפתרון חד פאזיים 1 מ"ל של guanidine isothiocyanate פנול היטב כל ולבודד את RNA [בשיטה בשלב יחיד על ידי Chomczynski ו סאקי 17 (שלב 1.3.2)] והמשך כמו צעדים 1.3.2.1) כדי 1.3.5.2) .
- לנתח אפופטוזיס על ידי V Annexin שכותרתו FITC ותזרים עוקב cytometry מנתח.
איור 5: ניתוח אפופטוזיס adipocyte ידי cytometry הזרימה. מצגות העלילה Dot של FACS עבור Annexin FITC-V ו- TO-PRO-3 מכתים של adipocytes. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
Representative Results
אנו מראים כיצד לקבוע הומאוסטזיס adipocyte in vivo ו במבחנה באמצעות הדוגמה של פרה-2 fl / fl עכברים Fabp4-CreERT לעומת להמלטה wild-type. פרוטוקול שלנו מגדירה כיצד ביטוי HIF עלה ב היפוקסיה מתואם עם תפקוד לקוי adipocyte כפי שצוין על ידי אפופטוזיס adipocyte מוגברת.
גודל adipocyte מוגברת ושטח בתזונה עתירת שומן (HFD) העכברים שטופלו
יתר תזונה, בין היתר, כתוצאה מכך היפרטרופיה adipocyte, הנגרמת על ידי אחסון אנרגיה מופרזת טיפות השומנים. גודל adipocyte והאזור מהווה אינדיקטור היפרטרופיה. סעיפים של כרית השומן מן הרגיל (ND; איור 6 א) ו דיאטה עתירת שומן (HFD; 6b איור) עכברים וכן quantifications של גודל adipocyte ואזור מראים בבירור היפרטרופיה adipocyte לאחר 6 שבועים של HFD, אשר מסומן על ידי גודל adipocyte מוגברת העכברים שטופלו HFD (איור 6 ג ו-ד).
היפוקסיה מוגברת ברקמת השומן (AT) של מבוגר פרא-2 fl / fl עכברים Fabp4-CreERT מוביל ברמה אפופטוזיס adipocyte HIF-1α גדל
כדי לקבוע את המצב vivo של היפוקסיה ב AT, האח-2 fl / fl עכברים Fabp4-CreERT מנותחים 6 שבועות לאחר המחיקה פרא-2 בגיל 12 שבועות לעומת להמלטה wild-type. Pimonidazole מנוהל על עכברים intraperitoneally כסמן היפוקסיה יעיל; זה לא רעיל ומסוגל להפיץ לתוך AT. Adipocytes היפוקסי ב AT in vivo מוגדרים על ידי מכתים נוגדן immunohistochemical (איור 7 א). יתר על כן, את מצב חוסר החמצן המוגבר של AT בעכברים מלווה ADIP החיובית HIF-1α גדלocytes כפי שצוין על ידי 7b איור מכתים immunohistochemical), אשר אושר על ידי כימות של רמות הביטוי HIF-1α וגנים ביעדיה 9. בנוסף, מכתים TUNEL סעיפים AT מן פרה-2 fl / fl עכברים Fabp4-CreERT ו להמלטה מלאה (7c איור) מראה כי גדל אפופטוזיס adipocyte מתואם עם נוכחות של היפוקסיה וביטוי-1α HIF.
גברת ביטוי HIF-1α ב adipocytes הראשוני באמצעות אפופטוזיס adipocyte מושרה היפוקסיה
כדי לנתח אפופטוזיס adipocyte במבחנה, אנו משתמשים adipocytes המופק רפידות שומן תת עורי כמתואר במקום אחר 20. כצפוי, הביטוי HIF-1α ב adipocytes הוא גדל לאחר 24 שעות של היפוקסיה (איור 8 א). כדי להמשיך לנתח פעילויות HIF-1α, רמות RNA של היעד HIFגנים כגון אינוס (synthase תחמוצת החנקן מושרה) הם לכמת ידי qPCR. איור 8b מראה כי ביטוי מוגבר של HIF-1α בתנאים היפוקסי המוביל לעליה ברמת ה- mRNA אינוס. מכיוון שאנו כבר הראינו in vivo (איור 8) כי גדל ביטוי HIF-1α ב adipocytes בקורלציה עם אפופטוזיס adipocyte גדל, אפופטוזיס מכמת גם בתרבויות חוץ גופייה על ידי מכתים Annexin V בתנאי חוסר חמצן. בקנה אחד עם הנתונים vivo ב (איור 7), רמת HIF-1α הגדילה מלווה אפופטוזיס adipocyte מוגברת הנגרמת על ידי תנאי חוסר חמצן (איור 8 ב). יתר על כן, כדי להוכיח כי אפופטוזיס מושרה-היפוקסי הוא HIF תלוי; HIF-1α או HIF-2α מושתק על ידי התערבות RNA ב adipocytes נגזר wild-type או עכברים לקוי פרא-2. אפופטוזיס adipocyte גדל משוחזר ידי השתקת HIF-1α או-2α HIF כפי שמוצג על ידי Annexin מכתים V ב איור 8b, להוכיח כי חיישן היפוקסיה-α HIF מסדיר את אפופטוזיס adipocyte.
איור 6: מתגבר גודל adipocyte ואזור בתזונה עתירת שומן (HFD) עכברים (a, b) H & E מכתים סעיפים מהפנקס שומן perigonadal של עכברי-בר זכר נמאס עם תזונה נורמלית (ND) (א) או גבוה. דיאטת -fat (HFD) (ב) במשך 6 שבועות. ברים מייצגים 500 מיקרומטר. (ג, ד) Quantifications של גודל adipocyte (ג) ואזור (ד) מהפנקס שומן perigonadal של עכברי-בר נמאס עם ND (א) או HFD (ב) במשך 6 שבועות. n = 10. הנתונים מוצגים ערכים ממוצעים כמו ± SEM. ניתוח סטטיסטי בוצע באמצעות Student's t -test. *** P <0.0001.: //www.jove.com/files/ftp_upload/53822/53822fig6large.jpg "Target =" _ blank "> לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 7: רמת HIF-1α הגברת אפופטוזיס adipocytes של מבוגר פרא-2 fl / fl עכברים Fabp4-CreERT. היפוקסיה (א) ו- HIF-1α (ב) מכתים את AT של fl פרא-2 זכר / fl עכברים Fabp4-CreERT ו להמלטה שליטה גברית 6 שבועות לאחר ההזרקה טמוקסיפן. הגדלה 20X, הכנס 40X. חיצים שחורים מציינים אזורים היפוקסי ותא חיוביים-1α HIF. (ג) מכתים TUNEL ב פרא-2 fl / fl עכברים Fabp4-CreERT ו להמלטה מלאה AT 6 שבועות לאחר ההזרקה טמוקסיפן. הגדלה 20X, הכנס 40X. חיצים שחורים מצביעים תאים חיוביים TUNEL. נתון זה יש הבדל בין et לוותרal. 9. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 8:. הביטוי HIF-1α מוגברת adipocyte אפופטוזיס adipocytes העיקרית הנגרמת על ידי היפוקסיה (א) ניתוח PCR בזמן אמת של-1α HIF ויעד HIFs אינוס mRNA רמות adipocytes העיקרי להציב תאי היפוקסי ניתח בנקודות הזמן המצוין. (ב) כימות של אפופטוזיס על ידי מכתים Annexin V FACS ב adipocytes העיקרי שבודד פרא-2 fl / fl עכברים Fabp4-CreERT או בקרות wild-type טרנספקציה עם שליטה sh או פלסמיד sh נגד HIF-1α או HIF-2α והניח תחת היפוקסיה (1% O 2) עבור 24 שעות. נתון זה יש הבדל בין והאח לוותר.
Discussion
Adipocytes מאופיין phenotypically על ידי גודלם, מספרים באזור, חושף היפרפלזיה adipocyte ו היפרטרופיה, הנגרמת על ידי אחסון אנרגיה מוגזם בשל יתר התזונה 5. אירועים אלה המוביל dysregulation חומצות שומן ו תסמונת המטבולית לאחר מכן הם גם קובעים של מסת שומן גדלה עם חילוף חומרים משומרים, אשר גם הוא המכונה רחב שומן "בריא". לדוגמה, Kusminski et al. 21 הראו שעכברים עם התרחבות שומן מאסיבית להישאר בריאים מבחינה מטבולית, דבר המצביע על כך הרחבה שומן אינו קשור בהכרח התסמונת המטבולית ועליו להיות נחוש בקפידה כדי להעריך את המאפיינים של adipocytes. הרקמה השומנית (AT) ממלא תפקיד מרכזי בוויסות חילוף החומרים בגוף. AT הוא האיבר הגדול ביותר האנדוקרינית שיכול להשפיע דיסליפידמיה, טרשת עורקים, היפראינסולינמיה והיפרגליקמיה 3. הערכת AT הומאוסטזיס ואת מ המולקולריתechanisms ויסות זה יכול לאפשר הבנה טובה יותר של הפרעות במערכת חילוף חומרים. לכן, לפרום את מנגנוני ויסות בידול adipocyte, גודל adipocyte ומסת כרית שומן יעזרו לפתח טיפול טיפולי חדש לטיפול בהפרעות להשמנה. שימוש in vivo ו שיטות במבחנה, אפשר לקבוע את התפקיד של השפעות מזון ביטוי גנים על בידול adipocyte ופעילות. כדי לקבוע את הומאוסטזיס AT, קביעת האיזון בין דיפרנציאציה adipocyte, התפשטות אפופטוזיס כפי שהוצע על ידי פרוטוקול שלנו חשובה כמו בניתוח מטבולית גלוקוז ואינסולין בתגובה 22-24.
פרופיל ביטוי המנתח של גני המעורבים adipogenesis, lipogenesis, ליפוליזה, ספיגת חומצות שומן, היפוקסיה, אפופטוזיס ובחלוקה ב adipocytes העיקרי ו- AT הקרבי הוא שיטת תפוקה גבוהה לקבלת סקירה על הומאוסטזיס adipocyte וחוסר התפקוד האפשרי שלהם.יש לנתח מועמדים מעניינים נוספים ברמת החלבון על ידי כתם המערבי או מכתים immunohistological. כדי להשיג תוצאות אופטימליות באמצעות מערכת בזמן האמת PCR באמצעות צבעים לא-סימטרית cyanine, הריכוזים של cDNA בטווח שבין 1 ל 10 ng ועל ריכוזי פריימר האופטימליים הנעים בין 50 ל 900 ננומטר צריכים להיבדק כדי למזער הגברה ספציפית. הרכיבים הקריטיים הם פריימרים; עבור כל מחזור, עקומות ההיתוך צריך להיות מבוקרת בקפידה כדי להבטיח את הספציפיות, ובו בזמן למנוע היווצרות של הדימרים פריימר. לכן, באמצעות בקרה שלילית באות O H 2 במקום cDNA מומלץ. יתר על כן, צבעי cyanine לא-סימטרית מסחריים זמינים ניתנים תערובות מאסטר המכילים צבע הפניה פסיבי (כגון רוקס) לספק אות ייחוס פנימית. את cDNA האות מנורמל במהלך ניתוח הנתונים לאותות רוקס לתקן תנודות האות גם ל-כן. נקודה נוספת שיש לקחת בחשבון על מנת להקים gooמערכת ד qPCR היא הבחירה של גן המשק. עבור כל תנאי, גני משק כמה משמשים, למשל, HPRT, β-תקטין, GAPDH, β-2-MG או Hsp90.
חלבוני HIF על מנת לייצב את תנאי חוסר חמצן הם רגולטורים בקביעה לא רק הישרדות adipocytes, אלא גם שינויים מטבוליים, כגון גלוקוז, סבילות לאינסולין ומטבוליזם שומנים 11,25,26. כדי לברר אזורים היפוקסי של כרית השומן, HIF-1α נקבע בקטעים ידי אימונוהיסטוכימיה. מאז חלבוני HIF מפורקים במהירות בתוך 5 עד 10 דקות בתנאי normoxic, ההליך ואת הקיבעון של כרית השומן לניתוח היסטולוגית יש פיקוח הדוק כדי למנוע זמן חביון. לכן, כדי להבטיח היפוקסיה לא רק באמצעות מכתים HIF, pimonidazole משמש לקביעת אזורים היפוקסי של AT. Pimonidazole הוא מסוגל להפיץ לרקמות, כפי שהוא כבר הוצג בעצמות 27, וביעילות לסמן אזורים היפוקסי באמצעות קשירה המכיל חלבונים תיאול ספציפי בתאי חוסר חמצן, אשר מזוהים יותר בסעיפים היסטולוגית על ידי נוגדנים ספציפיים מחייבים 28. עם זאת, סמנים ושיטות אחרים ניתן להשתמש כדי לנתח את מסלול היפוקסיה. לדוגמה, מעורבות של hydroxylase prolyl (PHD) אנזים, אשר לגרום hydroxylation של שאריות פרולין תחת normoxia, כמו גם את פון היפל-לינדאו (VHL) חלבון, אשר מכירים prolines hydroxylated וגם להביא את-ubiquitination פולי לתווך HIF proteasomal שפלה, צריכה להיות מנותחת עבור סקירה מלאה של 29,30 המסלול. יתר על כן, איתור בכל מקום של HIFs היה גם לקבוע את יציבות החלבון והשפלה שניתן לשנות 31,32.
יתר על כן, התפשטות ידי Ki67 ו אפופטוזיס על ידי מכתים TUNEL נקבעים in vivo באמצעות מכתים סעיפים היסטולוגית AT. כימות של התפשטות ידי Ki67 וpoptosis ידי TUNEL או Annexin מכתים V באמצעות ניתוח תזרים cytometry מתבצעת גם 33. הפצת נשק יכול כמובן להיות נמדדת טכניקות אחרות כגון ניתוחים של מחזור התא adipocyte, אשר אינה מקבלת מענה מדידת תאים חיוביים Ki67. יתר על כן, מחקר אפופטוזיס על ידי TUNEL ניתן להשלים על ידי FACS המנתח של V Annexin ו TOP-PR-3 אשר יקבע את הרמות של נימק מול תהליך המוות של תאי אפופטוזיס. אפופטוזיס הוא תהליך בסיסי עבור התוכנית של מוות של תאים, שהינה חשובה הומאוסטזיס AT. אכן, חוסר וויסות של אפופטוזיס adipocyte היה מעורב בעבר בתהליכי תורם להשמנה lipodystrophy 34. יתר על כן, בשנת 2011, ואח Keuper. צמוד דלקת רקמת שומן לאפופטוזיס adipocyte. הם הראו כי מקרופאגים לאפופטוזיס ב preadipocytes ו adipocytes, אשר בתורו למשוך מקרופאגים. הגיוס של מקרופאגים מאיץ דלקת, אשר contributes כדי התסמונת המטבולית כגון סבילות לגלוקוז ואינסולין 35. עם זאת, אפופטוזיס adipocyte הוא עדיין תופעה גרועה למדה, למרות ההשערה לאפופטוזיס adipocyte יכול להביא לפגיעה במשקל.
הפרוטוקול הנוכחי משתמש גישות immunohistochemical לחקור תופעה שונה כגון התפשטות, אפופטוזיס היפוקסיה in vivo. לכן, הרקמה הייתה קבועה עם 4% פורמלדהיד, אשר הוא שלב קריטי. זמן קיבעון רקמות מורחב מוביל לשנות של אפיטופים, אשר הופכים בלתי נגיש עבור הנוגדן. לעומת זאת, זמן קצר קיבעון מגביר את הרגישות של אפיטופים כדי ריאגנטים. הזמן האופטימלי המומלץ של קיבעון הוא 24 שעות. יתר על כן, העובי של החלקים גם משפיע על הנוגדנים מחייבים אפיטופים שלהם; עובי אופטימלי הוא בין 2 ל 5 מיקרומטר. סעיפים עבים מ -5 מיקרומטר ינתנו תוצאות חיוביות כוזבות בשל אתרי קישור גדלו. לעומת זאת, זהections יותר רזה 2 מיקרומטר מכילים פחות אתרי קישור ושטחים חיוביים אינם מוגדרים היטב. גורמים קריטיים נוסף הם הנוגדן עצמו, זמן דגירה, הריכוז ואפילו הטמפרטורה, אשר משפיע על האיכות הספציפית מחייב את אפיטופים. לכן, אימות שעת ריכוז דגירת נוגדן היא הכרחית עבור כל תנאי.
כדי להשלים את המחקר, אנו מספקים פרוטוקול בידול במבחנה adipocyte, אשר יכול להיות מורחבת על ידי טיפולים שונים, גירוי או שיתוף תרבויות. באמצעות בתרבויות adipocyte במבחנה, זה אינו ריאלי לקבוע פגמים בידול adipocyte ופונקציות. להשגת תוצאות מהימנות, כמו עבור כל התאים הראשוניים, את ההתנהגות והמראה הבריא של ADSCs ו adipocytes חשובה למדי. הגרעיניות, vacuolations cytoplasmic ו / או ניתוק הם סימנים של הידרדרות, המציין בינוני לקוי, זיהום מיקרוביאלי או הזדקנות של בפריימריזתאים. פרוטוקול זה משתמש adipocytes מבודד מן רקמת כרית שומן, בעוד הוא גם ניתן להשתמש בתאי גזע mesenchymal המבודדים מח עצם כפי שתואר על ידי פרוטוקולים אחרים 36. האחרון כולל ובתאי סטרומה, אשר עשוי לשקף בעיות בידול נוספות המתרחשות הצעד מאוד מוקדם של בידול adipocyte, זה עלול לפספס בפרוטוקול הנוכחי שלנו. יתר על כן, ADSCs ניתן להרחיב במהירות (יותר מ -10 פעמים בתוך שבוע אחד), ו ADSCs בתרבית לטווח ארוך לאחר בקטעים מסוימים עדיין שומרים mesenchymal שלהם pluripotency 37,38. יתרון נוסף באמצעות ADSCs הוא שאפשר לעבור אדם בקלות, מאז ADSCs ניתן לקצור מחולים ידי שאיבת שומן שהיא שיטה פשוטה פולשנית.
ליום משפיע כמה איברים אחרים בצורה האנדוקרינית, הפרוטוקול צריך להיות מורחב adipokines. Adipokines, כגון לפטין, אדיפונקטין, נמק הגידול-α גורם (TNF) אnd resistin, מופרש על ידי adipocytes ידועים בהשפעתם מחלות מטבוליות ידי שליטה חילוף החומרים של השומן, הומאוסטזיס אנרגיה אינסולין רגישות 39. לכן, סרום וניתוחי adipocyte secretome צריכות להתבצע. במקרה של חוסר תפקוד AT, adipokines וציטוקינים פרו-דלקתיים, כגון IL-6, יכול להוביל חוסר ויסות של איברים כמו הכבד והלבלב, ושל שריר פונקציה 4. על מנת לשלול בעיות בתפקוד איבר מערכתיים, במודלים של בעלי חיים או תרביות תאים יכולים להיבדק לתגובתם לגלוקוז גירוי ספיג.
כאן אנו מספקים פרוטוקול לניתוח המדינה היסוד של AT ו adipocytes in vivo ו במבחנה כדי לחשוף את המנגנונים המולקולריים של הומאוסטזיס adipocyte ופונקציונליות.
Disclosures
החוקרים אין לי מה לחשוף.
Acknowledgments
המחברים מבקשים בחביבות להודות לד"ר י'לותר ק Ubieta להכנת הנתונים וד"ר ב Grötsch להגהה את כתב היד. עבודה זו נתמכה על ידי דויטשה Forschungsgemeinschaft (BO3811 / 1-1-אמי נתר).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| RNAlater solution | Ambion | AM7021 | RNA stabilization solution |
| High-Capacity cDNA Reverse Transcription Kit | Applied Biosystems | 4368813 | |
| SYBR Select Master Mix | 4472908 | ||
| Purified Mouse Anti-Human Ki-67 | BD Biosciences | 550609 | Clone B56 (RUO) |
| Purified Mouse Anti-Human Ki-67 Clone B56 (RUO) | 550609 | Proliferation marker | |
| FITC Annexin V | BioLegend | 640906 | |
| Cleaved Caspase-3 Rabbit mAb | Cell signalling | 9664S | Clone 5A1E |
| Cleaved Caspase-3 (Asp175) (5A1E) Rabbit mAb | 9664 | Apoptosis marker | |
| Lipofectamine2000 Reagent | Invitrogen | 11668-027 | |
| TO-PRO-3 Iodide | T3605 | Nuclear counterstain, Monomeric cyanine nucleic acid stain, Excitation⁄Emission: 642⁄661 nm | |
| Mayer’s hemalum | Merck | 109249 | hematoxylin |
| pegGOLD TriFast | Peqlab | 30-2030 | TRIzol, single-phase solution of guanidine isothiocyanate and phenol |
| Percellys Ceramic Kit 1.4 mm | 91-PCS-CK14 | tubes containing ceramic beads (1.4 mm) | |
| Precellys 24 | 91-PCS24 | homogenizer | |
| HIF-1 alpha Antibody | Pierce | PA1-16601 | |
| HIF-1 alpha Antibody, 16H4L13 | 700505 | Hypoxia marker | |
| In Situ Cell Death Detection Kit, Fluorescein | Roche | 11 684 795 001 | TdT-mediated dUTP-biotin nick end labeling (TUNEL) |
| Eosin | Sigma | 318906 | |
| DNase I Solution (1 unit/µl) | Thermo Scientific | EN0525 | |
| biotinylated anti mouse IgG (H+L) | Vector Laboratories | BA-9200 | |
| biotinylated anti mouse IgG (H+L) | BA-1000 | ||
| Vectastain ABC Kit | PK-4000 | ||
| VECTASHIELD Mounting Medium with DAPI | H-1200 |
References
- Obesity and Overweight. Fact Sheet °113. WHO. , (Jan 2014) (2014).
- Gong, Z., Muzumdar, R. H. Pancreatic function, type 2 diabetes, and metabolism in aging. Int J Endocrinol. , 320482 (2012).
- Deng, Y., Scherer, P. E. Adipokines as novel biomarkers and regulators of the metabolic syndrome. Ann N Y Acad Sci. 1212, 1-19 (2010).
- Rezaee, F., Dashty, M. Role of Adipose Tissue in Metabolic System Disorders Adipose Tissue is the Initiator of Metabolic Diseases. J Diabetes Metab. , 008 (2013).
- Rutkowski, J. M., Stern, J. H., Scherer, P. E. The cell biology of fat expansion. J Cell Biol. 208, 501-512 (2015).
- Ma, X., Lee, P., Chisholm, D. J., James, D. E. Control of adipocyte differentiation in different fat depots; implications for pathophysiology or therapy. Front Endocrinol (Lausanne). 6, 1 (2015).
- Farmer, S. R.
- Luther, J., et al. Elevated Fra-1 expression causes severe lipodystrophy. J Cell Sci. 124, 1465-1476 (2011).
- Luther, J., et al. Fra-2/AP-1 controls adipocyte differentiation and survival by regulating PPARgamma and hypoxia. Cell Death Differ. , (2014).
- Semenza, G. L. Regulation of mammalian O2 homeostasis by hypoxia-inducible factor 1. Annu Rev Cell Dev Biol. 15, 551-578 (1999).
- Kim, W., Kaelin, W. G. The von Hippel-Lindau tumor suppressor protein: new insights into oxygen sensing and cancer. Curr Opin Genet Dev. 13, 55-60 (2003).
- Aragones, J., Fraisl, P., Baes, M., Carmeliet, P. Oxygen sensors at the crossroad of metabolism. Cell Metab. 9, 11-22 (2009).
- Sun, K., Halberg, N., Khan, M., Magalang, U. J., Scherer, P. E. Selective inhibition of hypoxia-inducible factor 1alpha ameliorates adipose tissue dysfunction. Mol Cell Biol. 33, 904-917 (2013).
- Imai, T., Jiang, M., Chambon, P., Metzger, D. Impaired adipogenesis and lipolysis in the mouse upon selective ablation of the retinoid X receptor alpha mediated by a tamoxifen-inducible chimeric Cre recombinase (Cre-ERT2) in adipocytes. Proc Natl Acad Sci U S A. 98, 224-228 (2001).
- Clegg, D. J., Brown, L. M., Woods, S. C., Benoit, S. C. Gonadal hormones determine sensitivity to central leptin and insulin. Diabetes. 55, 978-987 (2006).
- Haluzik, M., et al. Genetic background (C57BL/6J versus FVB/N) strongly influences the severity of diabetes and insulin resistance in ob/ob mice. Endocrinology. 145, 3258-3264 (2004).
- Chomczynski, P., Sacchi, N. Single-step method of RNA isolation by acid guanidinium thiocyanate-phenol-chloroform extraction. Analytical biochemistry. 162, 156-159 (1987).
- Paraffin Processing of Tissue. Protocolsonline. , Available from: http://protocolsonline.com/histology/sample-preparation/paraffin-processing-of-tissue/ (2012).
- Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis. Nat Methods. 9, 671-675 (2012).
- Planat-Benard, V., et al. Plasticity of human adipose lineage cells toward endothelial cells: physiological and therapeutic perspectives. Circulation. 109, 656-663 (2004).
- Kusminski, C. M., et al. MitoNEET-driven alterations in adipocyte mitochondrial activity reveal a crucial adaptive process that preserves insulin sensitivity in obesity. Nat Med. 18, 1539-1549 (2012).
- Trajcevski, K. E., et al. Enhanced lipid oxidation and maintenance of muscle insulin sensitivity despite glucose intolerance in a diet-induced obesity mouse model. PLoS One. 8, 71747 (2013).
- Montgomery, M. K., et al. Mouse strain-dependent variation in obesity and glucose homeostasis in response to high-fat feeding. Diabetologia. 56, 1129-1139 (2013).
- de Queiroz, K. B., et al. Molecular mechanism driving retroperitoneal adipocyte hypertrophy and hyperplasia in response to a high-sugar diet. Mol Nutr Food Res. 58, 2331-2341 (2014).
- Ye, J. Emerging role of adipose tissue hypoxia in obesity and insulin resistance. Int J Obes (Lond). 33, 54-66 (2009).
- Xiong, Y., et al. The local corticotropin-releasing hormone receptor 2 signalling pathway partly mediates hypoxia-induced increases in lipolysis via the cAMP-protein kinase A signalling pathway in white adipose tissue. Mol Cell Endocrinol. 392, 106-114 (2014).
- Bozec, A., et al. Osteoclast size is controlled by Fra-2 through LIF/LIF-receptor signalling and hypoxia. Nature. 454, 221-225 (2008).
- Varia, M. A., et al. Pimonidazole: a novel hypoxia marker for complementary study of tumor hypoxia and cell proliferation in cervical carcinoma. Gynecol Oncol. 71, 270-277 (1998).
- Park, M. H., Choi, K. Y., Jung, Y., Min do, S. Phospholipase D1 protein coordinates dynamic assembly of HIF-1alpha-PHD-VHL to regulate HIF-1alpha stability. Oncotarget. 5, 11857-11872 (2014).
- Tennant, D. A., et al. Reactivating HIF prolyl hydroxylases under hypoxia results in metabolic catastrophe and cell death. Oncogene. 28, 4009-4021 (2009).
- Kim, J., So, D., Shin, H. W., Chun, Y. S., Park, J. W. HIF-1alpha Upregulation due to Depletion of the Free Ubiquitin Pool. Journal of Korean medical science. 30, 1388-1395 (2015).
- Amelio, I., et al. TAp73 opposes tumor angiogenesis by promoting hypoxia-inducible factor 1alpha degradation. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112, 226-231 (2015).
- Suga, H., et al. Adipose tissue remodeling under ischemia: death of adipocytes and activation of stem/progenitor cells. Plast Reconstr Surg. 126, 1911-1923 (2010).
- Moreno-Indias, I., Tinahones, F. J. Impaired adipose tissue expandability and lipogenic capacities as ones of the main causes of metabolic disorders. J Diabetes Res. 2015, 970375 (2015).
- Keuper, M., et al. An inflammatory micro-environment promotes human adipocyte apoptosis. Mol Cell Endocrinol. 339, 105-113 (2011).
- Sera, Y., et al.
- Zuk, P. A., et al. Multilineage cells from human adipose tissue: implications for cell-based therapies. Tissue engineering. 7, 211-228 (2001).
- Zuk, P. A., et al. Human adipose tissue is a source of multipotent stem cells. Molecular biology of the cell. 13, 4279-4295 (2002).
- Scherer, P. E. Adipose tissue: from lipid storage compartment to endocrine organ. Diabetes. 55, 1537-1545 (2006).
