Introduction
Volgens het rapport van de World Health Organization 2014, 39% van 's werelds volwassen bevolking lijdt aan overgewicht en 13% zwaarlijvig is 1. In de nabije toekomst zullen mensen met overgewicht een belangrijk deel van de oudere bevolking omvatten. Een belangrijk kenmerk van obesitas en veroudering ontregeling van vet in relatie tot morbiditeit en mortaliteit 2. Adipokines, eiwitten gesecreteerd door vetweefsel (AT), kan leiden metabool syndroom, zoals obesitas en type 2 diabetes 3. Stofwisselingsziekten worden meestal veroorzaakt door overmatige energieopslag in de vetdruppels van adipocyten, waardoor AT expansie 4. Het is daarom van belang om de oorzaken en de moleculaire mechanismen van AT expansie te bepalen met het oog op de mogelijkheden om het onder controle te vinden.
Over-voeding leidt tot AT uitbreiding, die wordt geregeld door twee gebeurtenissen: overmatige opslag van energie in de vetdruppels van adipocyten, een proceswaardoor hypertrofie (toename van adipocyten grootte) en verhoogde adipogenese, ook bekend als adipocyten hyperplasie 5. Adipogenese is een proces van differentiatie van multipotente mesenchymale stamcellen (MSC) tot adipocyten. Ten eerste, MSC's zich ontwikkelen tot preadipocyten tijdens de inzet fase. In de tweede plaats, preadipocyten verder te differentiëren naar de kenmerken van de volwassen en functionele adipocyten 6 te verwerven. Verscheidene transcriptiefactoren zijn geïdentificeerd als master regelaars voor preadipocyt bepaling, zoals zinkvingereiwit 423 (Zfp423) en vroege B-cel factor 1 (Ebf1). Overwegende Zfp423 induceert vroege betrokkenheid, is Ebf1 nodig is voor het genereren van adipocyten voorlopers 6. Terminale differentiatie wordt streng gecontroleerd door een transcriptionele cascade, waarbij peroxisoom proliferator geactiveerde receptor γ (PPARy) is de essentiële transcriptiefactor 7. Andere belangrijke factoren zijn de transcriptie CCAAT / enhancer-bindend eiwit (C/ EBP) familieleden (dat wil zeggen, C / EBPα, C / EBPB en C / EBPδ), Krüppel-achtige factoren (KLFs), cAMP responsief element-bindend eiwit (CREB) en vroege groei respons 20 (Krox20) 6.
Recentelijk is aangetoond dat de activator proteïne-1 (AP-1) familie is betrokken bij de adipocyten differentiatieproces 8,9. De AP-1 familie wordt gevormd door een dimeer eiwitcomplex, samengesteld Fos, Jun en / of activerende transcriptiefactor (ATF) leden. Fos-gerelateerde antigen 1 en 2 (Fra-1 en Fra-2) kunnen adipocytdifferentiatie regelen. Fra-1 schaadt adipocytdifferentiatie door remming van C / EBPα 8, terwijl Fra-2 controles adipocyten omzet 9. Fra-2 daarbij niet alleen vermindert het aantal vetcellen door het onderdrukken van PPARγ2 expressie tijdens differentiatie van adipocyten, maar vermindert ook adipocyten apoptose door middel van directe onderdrukking van hypoxie-induceerbare factoren (HIFs) expressie. Het HIF familie is een heterodimeric transcriptiefactor complex, bestaande uit HIF-1α HIF-2α en HIF-1β. De heterodimeren bestaan uit een zuurstofgevoelige HIF-α eiwit (HIF-1α en HIF-2α) en het zuurstof-ongevoelige HIF-1β subeenheid 10. Tijdens normoxia, HIF-α eiwitten poly-ubiquitinylated en worden uiteindelijk afgebroken door proteasomen 11. Onder hypoxische omstandigheden bij ten tijdens expansie, HIF-α eiwitten niet meer gehydroxyleerde. Zij derhalve gestabiliseerd en dimeren vormen met constitutief tot expressie HIF-1β worden. Transcriptionele activering van genen beheerst door de HIF responselementen is betrokken bij de regulatie van angiogenese, metabolisme en ontsteking 12. Inderdaad, HIF-1α bevordert AT dysfunctie door het induceren glucosetolerantie remmen energieverbruik en perifere gebruik van lipide, en door verhogen leptinespiegel en HFD-geïnduceerde hepatische steatosis 13. Bovendien HIF-1α regelt adipocyte apoptose in vivo en in vitro 9.
Het huidige protocol beschrijft methoden voor het bestuderen van AT status aan de moleculaire eigenschappen van adipocyten homeostase te ontrafelen in volwassen muizen. Het laat zien hoe apoptosis, proliferatie en differentiatie van adipocyten in vivo en in vitro kan worden gereguleerd door hypoxie. Om dit te doen, maken we gebruik van muizen met adipocyten specifieke deletie van Fra-2 geproduceerd door het kruisen van muizen die het Fra-2 floxed allelen met Fabp4-CreERT muizen 9. Door het gebruik van Fabp4-Cre ERT muizen, de verwijdering is adipocyten specifiek en geïnduceerd door tamoxifen injectie 14. Voor de volwassen model worden intra peritoneale injecties van tamoxifen uitgevoerd meer dan 5 opeenvolgende dagen vanaf de leeftijd van 6 weken. Aldus worden de muizen onderworpen aan een normaal dieet of een vetrijk dieet gedurende 6 weken voordat de analyse wordt uitgevoerd. De muizen gebruikt in deze studie werden mannelijke gebaseerd op een C57Bl6 achtergrond vrouwelijke hormonen zoals estrogenen voorkomen, Aangetoond dat de verdeling van lichaamsvet 15 reguleren. Een andere genetische achtergrond Ook veranderen de metabole fenotype, door stam-gerelateerde verschillen in lipide beheer 16.
Dit protocol laat zien hoe AT analyseren onder hypoxie met behulp van histologie en hoe adipocyten apoptose, proliferatie en differentiatie in vivo te kwantificeren met behulp van immunohistochemie en gen profilering analyses. Het onderzoek is voltooid door in vitro experimenten laten zien hoe primaire adipocyten differentiatie en apoptose veranderd door blootstelling aan hypoxie analyseren.
Protocol
ETHIEK STATEMENT: dieren zijn ondergebracht in gestandaardiseerde omstandigheden volgens de richtlijnen van de Duitse Animal Welfare Act. Dieren worden gevoed met een standaard dieet en water ad libitum en hield met een 12 uur dag / nacht cyclus. Alle experimenten met dieren worden goedgekeurd door de lokale ethische commissie.
1. In vivo analyse van Adipocyte Homeostasis bij volwassen mannen
- Hypoxie kwantificeren in vivo, eerst bepalen het lichaamsgewicht van de muizen, injecteer 60 mg / kg lichaamsgewicht vast pimonidazole hydrochloride intraperitoneaal (bijvoorbeeld: injecteer 1,5 mg in een 25 g muis). Pimonidazole is een effectieve hypoxische marker, die adducten vormen met thiolgroepen in eiwitten, peptiden en aminozuren en wordt gedetecteerd door een specifiek antilichaam.
- Offer muizen en verwijder de perigonadal vetkussentjes (figuur 1).
- 45 min na injectie, offeren muizen door CO 2 stikken en daaropvolgende cervicale dislocatie. </ Li>
- Vastpinnen de benen van muizen (zie figuur 1) en open de buikholte. Verwijder de linker en rechter perigonadal (epididymaire) vetkussentje in de peritoneale holte.
Noot: vetkussentje zijn gebonden aan de bijbal de peritoneale bladen zoals getoond in figuur 1 (perigonadal vetkussentjes zijn aangegeven met pijlen). - Zorg ervoor dat de gonadale weefsels uit het vet pad te verwijderen. Bepaal vetkussentje gewichten om de verhouding te berekenen: vetkussentje gewicht (g) per lichaamsgewicht (g).
Figuur 1: Plaats van de perigonadal vetkussentjes in de peritoneale holte van muizen. Beeld van perigonadal vet lokalisatie in volwassen muizen na offer. Perigonadal vetkussentjes worden aangegeven door de pijlen. Klik hier om vIEW een grotere versie van deze figuur.
- Om een kwantitatieve genexpressie profiel samen te stellen, gebruikt u een perigonadal vet pad om RNA te isoleren. Opmerking: Tot het weefsel wordt verwerkt, opslag weefselmonsters in RNA stabilisatie oplossing bij -80 ° C of in vloeibare stikstof.
- Om het vet pad te homogeniseren, voeg de vetkussentje tot 1 ml éénfase oplossing van guanidine isothiocyanaat en fenol. Gebruik buisjes met keramiek kralen (1,4 mm) om het weefsel in een homogenisator bij 6500 rpm verpletteren (2 maal 20 seconden met 30 sec pauze).
- Isoleer de RNA als (single-step methode Chomczynski en Sacchi 17) volgt.
- Om de fasen te scheiden, overdragen gehomogeniseerd vetkussentje tot microcentrifugebuis, voeg 0,2 ml volume chloroform, schud gedurende 15 sec, incubeer gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur en centrifugeer 12.000 xg gedurende 5 minuten. Breng de bovenste waterige fase (ongeveer 400 ui), waarin het RNA bevat, in een nieuwe microcentrifugebuis. Laat de niet omvatten DNA-bevattening interfase of het eiwithoudende fenol fase.
- Aan het RNA te precipiteren, voeg 1 volume isopropanol, meng en incubeer gedurende 15 minuten bij 4 ° C (het is ook mogelijk om te incuberen bij -20 ° C gedurende de nacht). Centrifugeer bij 12.000 xg gedurende 10 min. Verwijder isopropanol supernatant voorzichtig. Was tweemaal met 75% ethanol centrifugestappen van 12.000 xg gedurende 10 min.
- Na drogen van de geprecipiteerde RNA ongeveer 10 minuten bij kamertemperatuur oplossen in 50 ui H2O (RNase-vrij). Om dit te vergemakkelijken, incubeer gedurende 2 minuten bij 65 ° C.
Opmerking: Bewaar RNA in 75% ethanol bij -80 ° C of in vloeibare stikstof voor langdurige opslag. - Kwantificeren van de RNA voorbereidingen door A 260/280 (optimale quotiënt is tussen 1,8 en 2,2) en bereken de concentratie door A 260:
- DNA verontreiniging te voorkomen, te verteren 1 ug van het RNA preparaatmet 1 U DNase I gedurende 30 minuten bij 37 ° C in een volume van 10 pl. Inactiveren bij 65 ° C gedurende 10 minuten.
Opmerking: Deze stap is optioneel. - Gebruik 10 pl RNA preparaat dat 1 ug RNA voor de reverse transcriptase reactie enkelstrengs cDNA geschikt voor kwantitatieve PCR applicatie versturen. De componenten en hun hoeveelheden worden in tabel 1.
- Gebruik een PCR Master Mix van kwantitatieve real-time PCR reactie. Metabole veranderingen in de gehele vetkussentje bepalen gebruiksspecifieke primers voor genen betrokken bij homeostase AT (tabel 2) en de in tabel 3 vermelde PCR-omstandigheden.
- Real-time PCR data-analyse.
- Definieer de basislijn (figuur 2), gewoonlijk cyclus 1 tot 15, waarbij er geen verandering in fluorescentiesignalen. De real-time PCR software normaliseert specifieke fluorescentie signalen naar de basislijn fluorescentie en de interne referentie kleurstof, ROX, waardoorde grootte van de specifieke signalen van de primers, delta Rn (ΔRn).
- Stel de drempel in de exponentiële fase van de amplificatiecurve. Het snijpunt definieert de drempelcyclus (Ct). Op basis van de CT waarde, berekent de relatieve expressie (ACt) en de veelvoudverandering (ΔΔCt):
| bestanddeel | Volume ul / reactie |
| 10x RT Buffer | 2.0 |
| 25x dNTP Mix (100 mM) | 0.8 |
| 10x RT Random Primers | 2.0 |
| MultiScribe Reverse Transcriptase | 1.0 |
| Nuclease-vrij H2O | 4.2 |
| 1 ugRNA | 10 |
| Totaal per reactie | 20 |
Tabel 1: Bestanddelen met respectieve volume voor de reverse transcriptase reactie enkelstrengig cDNA te genereren.
| Officiële volledige naam | Symbool | Sequence 3'-> 5' | ||
| vooruit | Omgekeerde | |||
| adipogenese | Delta-like 1 homoloog (pref-1) | Dlk1 | GACACTCGAAGCTCA CCTGG | GGAAGGCTGGGACGG GAAAT |
| Vroege B-cel factor 1 | Ebf1 | CCACCATCGACTACGG CTTC | TCCTGGTTGTTGTGGGG CATC | |
| Zinkvingereiwit 423 | Zfp423 | GTGCCCAGGAAGAAGA CGTA | GGCGACGTGGATCTGA ATCT | |
| Vetzuur bindend eiwit 4 (Ap2) | Fabp4 | TCACCTGGAAGACAGCT CCTC | AAGCCCACTCCCACTTC TTTC | |
| CCAAT / versterker bindend eiwit (C / EBP), alfa | Cebpa | AAGAGCCGCGACA AGGC | GTCAGCTCCAGCACCT TGTG | |
| CCAAT / versterker bindend eiwit (C / EBP), beta | Cebpb | TTTCGGGACTTGATGC AATC | CCGCAGGAACATCTTT AAGG | |
| cAMP responsief element-bindend eiwit 1 | Creb1 | ACTCAGCCGGGTACT ACCAT | TTGCTGCCTCCCTGTT CTTC | |
| CCAAT / versterker bindend eiwit (C / EBP), delta | Cebpd | CAGCGCCTACATTGAC TCCA | GTTGAAGAGGTCGGCG AAGA | |
| Krüppel-achtige factor 4 | Klf4 | GCAGTCACAAGTCCCC TCTC TAGTCACAAGTGTGGG TGGC | ||
| Vroege groei reactie 2 (Krox20) | Egr2 | AGGCGGTAGACAAAATC CCAG | GATACGGGAGATCCAG GGGT | |
| Peroxisoomproliferator activated gamma | PPARg | AGAGGTCCACAGAGCTG ATTC | GATGCACTGCCTATGAGC ACTT | |
| lipogenese | Acetyl-Coenzyme A carboxylase alpha | Acaca | TGGGGACCTTGTCTTCA TCAT | ATGGGCGGAATGGTCTC TTTC |
| Vetzuur synthase | FASN | ACATCCTAGGCATCC GAGA | CCGAGTTGAGCTGGGT TAGG | |
| Stearoyl-Coenzyme A desaturase 1 | SCD1 | CGGGATTGAATGTTCTTG TCGT | TTCTTGCGATACACTCTG GTGC | |
| lipolyse | Patatin-achtige fosfolipase domein containing 2 | Pnpla2 | AAGGACCTGATGACCA CCCT | CCAACAAGCGGATGGT GAAG |
| Vetzuur opname | lipoproteïne lipase | LPL | GTATCGGGCCCAGCAA CATTATCC | GCCTTGCTGGGGTTTTC TTCATTC |
| CD36 antigen | CD36 | GTCTTCCCAATAAGCATGT CTCC | ATGGGCTGTGATCGGA ACTG | |
| hypoxie | Hypoxie-induceerbare factor 1, alfa subeenheid | HIF1a | CCTGCACTGAATCAAGAG GTGC | CCATCAGAAGGACTTGCT GGCT |
| Endotheel PAS-domeineiwit 1 (eveneens bekend als HIF-2alpha) | EPAS1 | CAAGCTGAAGCTAAAG CGGC | TTGGGTGAATTCATCG GGGG | |
| Von Hippel-Lindau tumor suppressor | VHL | ACCGAGGTCATCTTTG GCTC | TTCCGCACACTTGGGT AGTC | |
| Arylkoolwaterstofreceptor nucleaire translocator (eveneens bekend als HIF-1 beta) | Arnt | TGGGTCATCTTCTCGC GGTT | TGTCCTATCTGAGCAT CGTG | |
Tabel 2: Lijst van genen met sequentie van de respectievelijke primers die voor de analyse van adipocyten homeostase.
| Stap | Temperatuur (° C) | Tijd (min: sec) | ||
| polymerase activering | Greep | 95 | 10:00 | |
| PCR | 40 cycli | Denaturize | 95 | 00:15 |
| Annealing / Extension | 60 | 01:00 | ||
| smeltcurve | 60-95 | 0,5 ° C / sec | ||
Tabel 3: Real-time PCR-omstandigheden.
Figuur 2:. Kenmerken van de real-time PCR-amplificatie curve Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
- Om histologische analyse van de adipocyten homeostase te voeren, gebruikt u de tweede perigonadal vet pad. Mis het weefsel niet uitdrogen!
- Bevestig het vet pad in 3,7% PBS-gebufferde formaldehyde 's nachts, inbedden in paraffine (volg de instructies zoals elders 18 beschreven) en snijd de ingebedde weefsel in 2-5 pm dikke secties (maximaal 5 pm).
- Bepaal het aantal adipocyten per veld en adipocyten grootte in een bright-field microscoop na hematoxyline en eosine (H & E) kleuring: <ol>
- Deparaffinize secties door wassen 3 maal gedurende 5 minuten in xyleen en hydrateren sectie 2 keer gedurende 2 minuten in 100% ethanol en 2 maal gedurende 2 minuten in 96% ethanol. Tenslotte was het gedeelte in gedestilleerd H 2 O 5 min.
- Vlek met hematoxyline, verdund 1: 5 met gedestilleerd H2O, gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur en wassen in H2O gedurende 5 min. Vlek met eosine-oplossing (20 ml 5% eosine Y / 210 ml gedestilleerd H2 O / 25 ul ijsazijn) gedurende 30 sec en nawassen met H 2 O 5 min.
- Uitdrogen gebieden af met 96% ethanol en 100% ethanol elk 2 maal gedurende 2 min, en xyleen 3 maal gedurende 5 min. Monteer de secties met watervrije montage middel.
- Evalueer de secties onder een stralend-veld microscoop. Een representatief voorbeeld van adipocyten analyseren ImageJ 1.48v 19 wordt getoond in Fig. 3: aantal cellen per gebied (um 2), mobiele omgeving (10 x 3 urn 2
- Open het beeld van de sectie met ImageJ 1.48v. Als de parameters van de afbeelding in pixels in plaats van een eenheid van lengte zijn aangegeven, de omvang.
- Selecteer * Rechte lijn * in de knoppenbalk en stel de lijn naar een bekende afstand aan de hand van de schaal bar. Ga naar Analyseren -> Set Schaal, de afstand van de lijn wordt weergegeven in pixels;. voeg de bekende afstand en de lengte-eenheid, bijvoorbeeld urn. Bevestig met OK. De grootte van het beeld en de analyse van de parameters zijn aangegeven in de lengte-eenheid gegeven.
- Om de parameters van de adipocyten te bepalen, passen de drempel. Ga naar Afbeelding -> Aanpassen -> Drempel om de drempel te openen. Selecteer de volgende instellingen: Thresholding: Standaard; Threshold kleur: B & W; Kleurruimte: HSB. De afbeelding wordt nu weergegeven in zwart-wit. Pas de .... aanHelderheid witte adipocyten wissen en zwarte intercellulaire ruimten te sluiten, zoals in Fig. 3b.
- Tel het aantal adipocyten per micrometer 2 (figuur 3e) met de * multi-point * selectie in de werkbalk en markeer elke cel voor het tellen.
- Om de adipocyten maat te bepalen, selecteert u * rechte lijn * opnieuw in de werkbalk en teken de diameter van een adipocyten (figuur 3c). Ga naar Analyseren -> Meten en een nieuw venster verschijnt, met de lengte van de diameter in micrometer.
- Om de adipocyten gebied te bepalen, selecteert u * Wand (tracing) gereedschap * en klikt u in de adipocyten. De binnenwand van de adipocyten is geselecteerd in rood (figuur 3d). Ga naar Analyseren -> Meten en een nieuw venster verschijnt, met de oppervlakte van deze vetcellen in um 2.
- Deparaffinize secties door wassen 3 maal gedurende 5 minuten in xyleen en hydrateren sectie 2 keer gedurende 2 minuten in 100% ethanol en 2 maal gedurende 2 minuten in 96% ethanol. Tenslotte was het gedeelte in gedestilleerd H2O
- Voor antigen retrieval, verteren het gedeelte weefsel voor 30 min bij 37 ° C met proteïnase K werkoplossing (20 ug / ml in 10 mM Tris / HCl, pH 7,4-8) en spoelen met PBS.
- De endogene peroxidase te blokkeren, gebruikt 3% waterstofperoxide in PBS gedurende 10 min, vervolgens wassen met 2 maal gedurende 5 min in PBS. Om de aspecifieke binding van antilichamen blokkeren, gebruikt 10% serum in PBS. Gebruik het serum van de gastheer van het secundaire antilichaam, in dit geval geit.
- Voor de kleuring gebruikt de antilichamen van apoptose, proliferatie en hypoxie detectie (
- Ter verbetering van het signaal gebruikt een gebiotinyleerd secundair antilichaam, met de verdunning zoals vermeld in tabel 5. Voor hypoxia detectie Gebruik HRP geconjugeerd konijn anti-FITC als secundair antilichaam. Incubeer gedurende 1 uur bij kamertemperatuur geroerd. Was de secties 2 keer 5 min met PBS.
Opmerking: Voor de hypoxie kleuring met FITC-MAb1, slaat u stap 1.4.4.4) en ga verder met stap 1.4.4.5).- Voor elk objectglaasje, pre-incubeer 50 ul avidine-oplossing met 50 ul gebiotinyleerd peroxidase H gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur (deze methode wordt ook wel avidine / biotine ABC complex formulering) en vervolgens aan de secties nog 45 min. Was 2 keer gedurende 5 min met PBS.
- Incubeer de secties peroxidase substraatoplossing tot kleuring intenser (5 tot 10 min). Wassen 5 minuten met gedestilleerdH 2 O.
- Voor tegenkleuring, kleuring met hematoxyline verdund 1: 5 met gedestilleerd H2O gedurende 10 min bij kamertemperatuur en wassen in H2O gedurende 5 min.
- Uitdrogen secties in 96% ethanol en 100% ethanol elk 2 maal gedurende 2 min, en xyleen 3 maal gedurende 5 min. Sluit de secties met dekglaasjes en watervrij montage middel. Evalueer de secties onder een stralend-veld microscoop.
- Ter verbetering van het signaal gebruikt een gebiotinyleerd secundair antilichaam, met de verdunning zoals vermeld in tabel 5. Voor hypoxia detectie Gebruik HRP geconjugeerd konijn anti-FITC als secundair antilichaam. Incubeer gedurende 1 uur bij kamertemperatuur geroerd. Was de secties 2 keer 5 min met PBS.
- Voeg 50 ul enzymoplossing in 450 ul labeloplossing. Breng vervolgens 50 pi reactiemengsel TUNEL op histologische secties en incubeer gedurende 60 minuten bij 37 ° C in een bevochtigde atmosfeer in het donker. Was de secties 3 keer met PBS gedurende 5 minuten en monteer met fluorescentie montage medium met inbegrip van DAPI (4 ', 6-diamidino-2-phenylindole) voor tegenkleuring.
- Evalueer de afdeling onder een fluorescentiemicroscoop met 100-voudige magnificat ion. Voor het meten van fluoresceïne gebruik van een excitatiegolflengte van 488 nm en detecteert tussen 515-565 nm (groen laser); DAPI windt bij ongeveer 360 nm en emitteert bij ongeveer 460 nm wanneer gebonden aan DNA (blauwe laser).
- Kwantificeren van de overlays van DAPI en Fluoresceïne:
Figuur 3:. Analyseren adipocyte kenmerken vetkussentje paneel- Foto de perigonadal vetkussentje van mannelijke muizen behandeld met een vetrijk dieet (HFD) of normaal dieet (ND) met een helder-veld microscoop (a); de drempel wordt aangepast in zwart en wit (b) en de adipocyten grootte (lengte, c), ruimte (d) en adipocyten aantal cellen per mm 2 (e) worden gekwantificeerd met ImageJ 1.48v.f = "https://www.jove.com/files/ftp_upload/53822/53822fig3large.jpg" target = "_ blank"> Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
| voorraadconcentratie | verdunning | |
| apoptose | Gesplitst caspase-3 (Asp175) (5A1E) Rabbit mAb | 1: 2000 |
| Proliferatie | Gezuiverd Mouse Anti-Human Ki-67 Clone B56 (RUO) | 01:50 |
| hypoxie | HIF-1 alpha Antilichaam | 1: 100 |
| FITC-MAb1 | 1: 100 |
Tabel 4: antilichamen met respectievelijke verdunning voor de immunohistologische kleuring van secties AT.
| Antilichaam | verdunning |
| gebiotinyleerde antimuis IgG (H + L) | 1: 200 |
| gebiotinyleerd anti-muizen IgG (H + L) | 1: 200 |
| HRP conjugaten konijn anti-FITC | 1: 100 |
Tabel 5: Secundaire antilichamen met verdunningswater voor immunohistologische kleuring.
2. In vitro Analyse van Adipocyte Homeostasis Beïnvloed door hypoxie
- Offer muizen en verwijder het onderhuidse vetweefsel.
- Offer de muizen door CO 2 stikken en de daaropvolgende cervicale dislocatie.
- Vastpinnen de benen van muizen weergegeven in figuur 4. Verwijder de huid van het bovenbeen, lendenen en vang en pin hem met pennen zo in figuur 4. Verwijder daarna het onderhuidse vetweefsel, dat zich posterieur aan de basis van de achterpoten, rond de inguinale lymfeknopen (zie figuur 4, nog subcutaan vetkussentjes aangeduid door de pijlen; rechts: inguinale lymfeklier aangegeven door de pijl).
Figuur 4: Plaats van het onderhuidse vet pads. Beeld van onderhuids vet pad; de linker pijlen geven de onderhuidse vet pad en de juiste pijl geeft de lies lymfeklier. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
- Isoleer adipeus afgeleide stamcellen (ADSC) zoals eerder beschreven 20.
- Zaad ADSC 4000 cellen / cm2 in Dulbecco's gemodificeerd Eagle's medium-Ham's F-12 aangevuld met 10% normaal kalfserum, 1% penicilline / streptomycine, 0,5% amfotericine B, 16 pM biotine, 18 uM pantotheenzuur en 100 uM ascorbinezuur en cultuur groeien tot confluentie ongeveer 70 tot 80%, Die wordt bereikt na 4-6 dagen van de cultuur.
- Induceren adipogenic Differentiatie.
- Verwijder de hechtende ADSC van het oppervlak door trypsine behandeling.
- Verwijderen medium, wassen met PBS en voeg 0,025% trypsine-oplossing (voorverwarmd tot 37 ° C) gedurende 2 minuten (totdat cellen los van het oppervlak). Voeg onmiddellijk medium en was de cellen.
- Tel de cellen met behulp van een Neubauer kamer.
- Plaats het glazen deksel op de centrale ruimte van de Neubauer kamer. Verdun de celsuspensie 01:10 en laad de kamer met 10 pi verdunde celsuspensie. Tel de cellen in 4 vierkantjes gelegen op de hoeken, elk opgebouwd uit 16 kleine vierkanten. Bereken het aantal cellen per ml:
- Plaats het glazen deksel op de centrale ruimte van de Neubauer kamer. Verdun de celsuspensie 01:10 en laad de kamer met 10 pi verdunde celsuspensie. Tel de cellen in 4 vierkantjes gelegen op de hoeken, elk opgebouwd uit 16 kleine vierkanten. Bereken het aantal cellen per ml:
- Zaad ADSC (zoals beschreven in punt 2.2) in 12-putjes en te groeien cultuur tot confluentie ongeveer 70 tot 80% (bereikt na 4-6 dagen).
- induceren adipogenic differentiatie door toevoeging van 5 ug / ml insuline, 1 uM dexamethason en 5 uM 3-isobutyl-1-methylxanthine (IBMX) aan de kweken. Vervang het medium elke 2 dagen. Cellen worden volledig gedifferentieerd na 7 dagen.
- Verwijder de hechtende ADSC van het oppervlak door trypsine behandeling.
- Om de adipogene differentiatie, vlek met Oil Red O, die triglyceriden van mature adipocyten vlekken te analyseren.
Opmerking: De werkzaamheden moeten worden uitgevoerd onder een zuurkast!- Verwijder het medium, was de adipocyten voorzichtig met PBS en bevestig de cellen gedurende 60 minuten met 2 ml 10% formaline.
- Oil Red O kleuring te bereiden, meng 3 delen van de rode olie O voorraadoplossing (300 mg Oil Red O poeder opgelost in 100 ml 99% isopropanol) met 2 delen gedestilleerd H2O en incubeer gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur. Filter de Oil Red O werkende oplossing door een 0,2 um injectie filter.
Opmerking: De werkende oplossing is 2 uur. - Voor de Oil Red O vlekken, verwijder de formaline, wassen adipocyten met H2
- Evalueer de platen onder een fase contrast microscoop met 100-voudige vergroting. De lipiden van de adipocyten verschijnt rood en de kernen wordt blauw weergegeven.
- Optionele stap: Stilte het gen van belang door transfectie met shRNA.
- Verander het medium en voeg serum-vrij medium.
- Voor de transfectie van adipocyten, lipofectie gebruikt. Volg de instructies van de fabrikant en het gebruik van 1 ug shRNA per 12-well weefselkweek platen. Na toevoeging van het lipide-DNA-complex, adipocyten incubeer gedurende 48 uur bij 37 ° C.
- Om adipocyten onderworpen aan hypoxie te analyseren, gebruik dan een hypoxische werkstation of hypoxische incubator aan de cellen onder hypoxische condities te handhaven. Afhankelijk van de studie, hypoxie cOuld 0,5, 1 of 2% zuurstof.
- Analyseer apoptose door FITC-gemerkte Annexine V en daaropvolgende flowcytometrie geanalyseerd.
- Verzamel adipocyten met extra zachte celschraper, wassen met PBS en voeg 1 x 10 6 cellen 100 ui Annexine V-bindingsbuffer (10 mM Hepes / NaOH, pH 7,4, 140 mM NaCl, 2,5 mM CaCl2). Voeg de hoeveelheid Annexine V-FITC aanbevolen door de fabrikant en incuberen bij kamertemperatuur gedurende 15 min.
- Voor flowcytometrie meting voeg 200 ul Annexine V-bindingsbuffer en 1 uM van nucleaire tegenkleuring. Bepaal de fluorescentie in het groen en violet kanaal. Annexine V + / nucleaire tegenkleuring + cellen worden gedefinieerd als secundaire necrotische en annexine V + / nucleaire tegenkleuring - cellen worden gedefinieerd als apoptotische cellen (figuur 5).
- Kwantitatief te analyseren adipocyten RNA-niveau om de homeostase onder hypoxische condities te bepalen.
- Toevoegen1 ml enkelfasige oplossing van guanidine isothiocyanaat en fenol aan elk putje en isoleren RNA [middels éénfasige methode Chomczynski en Sacchi 17 (stap 1.3.2)] en ga verder zoals in stappen 1.3.2.1) tot 1.3.5.2) .
- Analyseer apoptose door FITC-gemerkte Annexine V en daaropvolgende flowcytometrie geanalyseerd.
Figuur 5: Adipocyte apoptose analyse door flowcytometrie. Puntdiagram presentaties van de FACS voor annexine V-FITC en TO-PRO-3 kleuring van adipocyten. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Representative Results
We zien hoe adipocyten homeostase bepalen in vivo en in vitro gebruik van het voorbeeld van Fra-2 fl / fl Fabp4 CreERT-muizen in vergelijking met wildtype nestgenoten. Ons protocol definieert hoe verhoogde HIF expressie door hypoxie gecorreleerd is met adipocyten disfunctioneren, zoals aangegeven door de toegenomen adipocyten apoptose.
Toegenomen adipocyten grootte en het gebied in vetrijk dieet (HFD) behandelde muizen
Overvoeding, naast andere factoren, leidt tot vetcellen hypertrofie, veroorzaakt door overmatige energieopslag in de vetdruppels. De adipocyten grootte en omgeving is een indicator van hypertrofie. Delen van het vetkussentje van normaal (ND Figuur 6a) en vetrijk dieet (HFD Figuur 6b) muizen en kwantificering van de adipocyten grootte en oppervlakte duidelijk vetcellen hypertrofie na 6 wekens van HFD, hetgeen wordt aangegeven door verhoogde adipocyte grootte in de HFD behandelde muizen (figuur 6c en d).
Verhoogde hypoxie in het vetweefsel (AT) van de volwassen Fra-2 fl / fl Fabp4-CreERT muizen leidt tot verhoogde HIF-1α niveau en adipocyten apoptose
Om de in vivo status van hypoxie in AT, bepalen Fra-2 fl / fl Fabp4-CreERT muizen worden geanalyseerd 6 weken na Fra-2 deletie op de leeftijd van 12 weken en vergeleken met wild-type nestgenoten. Pimonidazole wordt toegediend aan de muizen intraperitoneaal als een effectieve hypoxie merker; Het is niet giftig en kan distribueren naar de AT. Hypoxische adipocyten in het AT in vivo worden bepaald door immunohistochemische antilichaam kleuring (Figuur 7a). Bovendien is de verhoogde hypoxische status van de AT in muizen gepaard met een verhoogde HIF-1α positieve ADIPocytes zoals aangegeven door de immunohistochemische kleuring Figuur 7b), hetgeen wordt bevestigd door kwantificering van HIF-1α expressieniveaus en de doelwitgenen 9. Bovendien, TUNEL kleuring van secties van AT Fra-2 fl / fl Fabp4-CreERT muizen en controle nestgenoten (Figuur 7c) laat zien dat verhoogde adipocyten apoptose gecorreleerd met de aanwezigheid van hypoxie en HIF-1α expressie.
Verhoogde HIF-1α expressie in primaire adipocyten door middel van hypoxie geïnduceerde apoptose adipocyten
Om adipocyten apoptose analyseren in vitro, maken we gebruik van adipocyten gegenereerd uit onderhuids vet pads zoals elders 20 beschreven. Zoals verwacht, is de HIF-1α expressie in adipocyten verhoogd na 24 uur van hypoxia (figuur 8a). Om verder te analyseren HIF-1α activiteiten, het RNA niveaus van HIF doelgenen zoals Inos (induceerbaar stikstofoxide synthase) worden gekwantificeerd door qPCR. Figuur 8b toont dat de verhoogde expressie van HIF-1α onder hypoxische omstandigheden leidt iNOS mRNA-niveau verhoogd. Aangezien we eerder in vivo (figuur 8) dat HIF-1α expressie in adipocyten verhoogd correleert met verhoogde adipocyten apoptosis gebleken, is apoptose ook gekwantificeerd in vitro kweken door Annexine V kleuring onder hypoxische omstandigheden. Consistent met in vivo-gegevens (figuur 7), wordt een verhoogde HIF-1α niveau vergezeld van verhoogde adipocyten apoptose geïnduceerd door hypoxische omstandigheden (figuur 8b). Bovendien bewijzen dat zuurstofgebrek geïnduceerde apoptose HIF-; HIF-1α of HIF-2α wordt het zwijgen opgelegd door RNA interferentie in adipocyten afgeleid van wild-type of Fra-2 deficiënte muizen. De verhoogde adipocyten apoptose wordt hersteld door silencing HIF-1α en HIF-2α zoals door Annexine V kleuring in figuur 8b, waaruit blijkt dat de hypoxie sensor HIF-α regelt de adipocyten apoptose.
Figuur 6: Verhoogde adipocyten grootte en gebied vetrijk dieet (HFD) muizen (a, b) H & E-kleuring van secties van de perigonadal vetkussentje mannelijke wild-type muizen gevoed met normale voeding (ND) (a) of hoog. -vet dieet (HFD) (b) gedurende 6 weken. Bars vertegenwoordigen 500 urn. (C, d) De kwantificering van adipocyte grootte (c) en het gebied (d) vanaf het perigonadal vetkussentje van wildtype muizen gevoed met ND (a) of HFD (b) gedurende 6 weken. n = 10. Gegevens zijn getoond als gemiddelde waarden ± SEM. Statistische analyse werd uitgevoerd met individuele student t-test. *** P <0,0001.: //www.jove.com/files/ftp_upload/53822/53822fig6large.jpg "Target =" _ blank "> Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 7: Verhoogde HIF-1α niveau en apoptose in adipocyten van de volwassen Fra-2 fl / fl Fabp4-CreERT muizen. Hypoxie (a) en HIF-1α (b) kleuring in de AT mannelijke Fra-2 fl / fl Fabp4-creERT muizen en mannelijke controle nestgenoten 6 weken na injectie tamoxifen. Vergroting 20X, plaatst 40X. Zwarte pijlen geven hypoxische gebieden en HIF-1α positieve cellen. (C) TUNEL kleuring in Fra-2 fl / fl Fabp4-CreERT muizen en controle nestgenoten AT 6 weken na tamoxifen injectie. Vergroting 20X, plaatst 40X. Zwarte pijlen geven TUNEL positieve cellen. Dit cijfer is gewijzigd ten opzichte van Luther etal. 9. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 8:. Verhoogde HIF-1α expressie en adipocyten apoptose in primaire adipocyten geïnduceerd door hypoxie (a) real-time PCR-analyse van HIF-1α en HIFs doel Inos mRNA in primaire adipocyten geplaatst hypoxische kamers geanalyseerd op de aangegeven tijdstippen. (B) Kwantificering van apoptose door annexine V FACS kleuring in primaire adipocyten geïsoleerd van Fra-2 fl / fl Fabp4-CreERT muizen of wild-type controles getransfecteerd met sh controle of sh plasmide tegen HIF-1α of HIF-2α en onder hypoxie geplaatst (1% O2) gedurende 24 uur. Dit cijfer is gewijzigd ten opzichte van Luther et al.
Discussion
Adipocyten worden fenotypisch gekenmerkt door hun grootte, aantallen en het gebied, het onthullen van vetcellen hyperplasie en hypertrofie, geïnduceerd door overmatige opslag van energie als gevolg van over-voeding 5. Deze gebeurtenissen leiden tot vetzuur dysregulatie en daaropvolgende metabool syndroom ook bepaald verhoogde vetmassa met gekonfijte metabolisme, die ook wordt aangeduid als "gezond" fat expansie. Bijvoorbeeld Kusminski et al. 21 aangetoond dat muizen met massieve dikke expansie blijven metabolisch gezonde, wat suggereert dat vet expansie niet beperkt hoeft te metabool syndroom en moet zorgvuldig bepaald om de eigenschappen van de adipocyten evalueren zijn. Het vetweefsel (AT) speelt een centrale rol in de regulering van de stofwisseling. AT is de grootste endocrien orgaan dat van invloed dyslipidemie, atherosclerose, hyperinsulinemie en hyperglycemie 3. Evalueren AT homeostase en moleculaire mechanisms reguleren het zou een beter begrip van de metabole aandoeningen mogelijk te maken. Daarom is het ontrafelen van de mechanismen tot regeling van adipocytdifferentiatie, adipocyten grootte en vet pad massa zou helpen om nieuwe therapeutische behandeling voor obesitas stoornissen te ontwikkelen. Gebruik in vivo en in vitro methoden, is het mogelijk om de rol van voeding en genexpressie effecten op differentiatie van adipocyten en activiteit te bepalen. Om de AT homeostase bepalen de afweging tussen adipocyte differentiatie, proliferatie en apoptose zoals door ons protocol is even belangrijk als het analyseren van glucose en insuline metabole respons 22-24.
Expressieprofiel analyse van genen betrokken bij adipogenese, lipogenese, lipolyse, vetzuur opname, hypoxie, apoptose en proliferatie in primaire adipocyten en viscerale AT is een hoge doorvoer werkwijze voor het verkrijgen van een overzicht van adipocyt homeostase en de mogelijke dysfunctie.Interessante kandidaten kunnen verder worden geanalyseerd op eiwitniveau door Western blot of immunohistologische kleuring. Optimale resultaten door real-time PCR systeem aanvragen met symmetrische cyaninekleurstoffen moeten de concentraties van cDNA variërend van 1 tot 10 ng en de optimale primer concentraties van 50 tot 900 nm worden getest om specifieke amplificatie te minimaliseren. De kritische componenten zijn de primers; Voor elke serie hebben de smeltcurven strikt worden gecontroleerd om de specificiteit te waarborgen en om de vorming van primer dimeren te sluiten. Daarom worden bij een negatieve controle met H2O plaats van cDNA wordt aanbevolen. Verder worden in de handel verkrijgbare niet-symmetrische cyaninekleurstoffen verschaft als mastermengsels dat een passieve referentie kleurstof bevatten (zoals ROX) een interne referentie signaal. De cDNA signaal wordt genormaliseerd tijdens de data-analyse van de ROX signalen naar well-to-well signaal schommelingen te corrigeren. Een ander punt dat moet worden overwogen om een goo vestigend qPCR systeem is de keuze van het huishoud-gen. Voor elke voorwaarde, worden meerdere housekeeping genen gebruikt, bijvoorbeeld HPRT, β-actine, GAPDH, β-2-MG of HSP90.
HIF eiwitten gestabiliseerd door hypoxische condities meester regulatoren bepalen niet alleen adipocyten overleving, maar ook metabole veranderingen, zoals glucose, insuline tolerantie en vetmetabolisme 11,25,26. Om hypoxische gebieden vast te stellen in het vet pad, wordt HIF-1α bepaald AT secties door immunohistochemie. Omdat HIF eiwitten snel binnen 5 tot 10 minuten onder normoxische omstandigheden worden afgebroken, moet de procedure en de vastlegging van het vet pad voor de histologische analyse strak worden gecontroleerd om wachttijd te voorkomen. Daarom, om hypoxie zorgen niet alleen door HIF kleuring wordt pimonidazole gebruikt om hypoxische gebieden in de AT bepalen. Pimonidazole kan gedistribueerd naar weefsels, zoals reeds in de botten 27 kreegEn effectief markeer hypoxische gebieden door binding aan thiol bevattende eiwitten specifiek in hypoxische cellen, die verder in histologische secties wordt gedetecteerd door specifieke antilichaambinding 28. Maar ook andere markers en methoden worden toegepast om de hypoxie pad analyseren. Bijvoorbeeld, de betrokkenheid van de prolyl hydroxylase (PHD) enzym dat hydroxylatie van proline residuen onder normoxie induceren, alsook het Von Hippel-Lindau (VHL) eiwit, dat gehydroxyleerd prolinen herkennen en induceren de poly-ubiquitinering om proteasomale HIF bemiddelen degradatie, moeten worden geanalyseerd voor een volledig overzicht van de route 29,30. Bovendien zou overal detectie van HIFs ook de eiwitstabiliteit en afbraak welke veranderen 31,32 bepalen.
Bovendien proliferatie door Ki67 en apoptose door de TUNEL kleuring worden bepaald in vivo door middel van kleuring van AT histologische secties. Kwantificering van proliferatie door Ki67 enpoptosis door TUNEL of annexine V-kleuring door middel van flowcytometrie-analyse wordt ook uitgevoerd 33. Proliferatie kan uiteraard worden gemeten met andere technieken, zoals analyses van de celcyclus adipocyten, die niet bij de meting van Ki67-positieve cellen is gericht. Bovendien kan apoptose studie van TUNEL worden ingevuld door FACS analyses van annexine V en TOP-PR-3, die het niveau van necrose versus de apoptosis celdood proces zal bepalen. Apoptose is een fundamenteel proces voor het programma van celdood, die belangrijk is voor AT homeostase. Inderdaad, ontregeling van apoptosis adipocyten is eerder betrokken bij processen die bijdragen tot zwaarlijvigheid en lipodystrofie 34. Bovendien, in 2011, Keuper et al. Verbonden vetweefsel ontsteking adipocyten apoptose. Zij toonden aan dat macrofagen geïnduceerde apoptose in preadipocyten en adipocyten, waardoor macrofagen trekken. De werving van macrofagen versnelt ontsteking, die contributes om metabool syndroom, zoals glucose en insuline tolerantie 35. Echter, adipocyten apoptose is nog steeds een slecht bestudeerde fenomeen, ondanks de hypothese dat geïnduceerde apoptose adipocyten zou kunnen leiden tot een verminderde gewicht.
Het huidige protocol maakt gebruik van immunohistochemische benaderingen voor verschillende fenomeen te bestuderen, zoals proliferatie, apoptose en hypoxie in vivo. Daarom werd het weefsel gefixeerd met 4% formaldehyde, wat een kritische stap. Een uitgebreide weefsel fixatie tijd leidt tot verandering van de epitopen, die niet toegankelijk zijn voor het antilichaam worden. Daarentegen korte fixatietijd verhoogt de gevoeligheid van epitopen reagentia. De aanbevolen optimale tijd van fixatie is 24 uur. Bovendien is de dikte van de secties beïnvloedt ook de antilichamen binden aan hun epitopen; optimale dikte tussen 2 en 5 urn. Secties dikker dan 5 micrometer zal vals-positieve resultaten als gevolg van verhoogde binding sites. Daarentegen isitingen dunner dan 2 micrometer bevatten minder binding sites en positieve gebieden zijn niet goed gedefinieerd. Zijn kritische factoren zijn het antilichaam zelf, incubatietijd, concentratie en gelijkmatige temperatuur, waarbij de kwaliteit van de specifieke binding aan de epitopen te beïnvloeden. Daarom valideren antilichaam concentratie en incubatietijd nodig voor elke conditie.
Om het onderzoek te voltooien, geven we een in vitro adipocytdifferentiatie protocol, die kan worden verlengd met verschillende behandelingen, stimulatie of co-culturen. Gebruikmakend van in vitro kweken van adipocyten, is het mogelijk om defecten in adipocytdifferentiatie en functies bepalen. Om betrouwbare resultaten te verkrijgen, als voor alle primaire cellen, het gezond gedrag en het uiterlijk van de ADSCs en adipocyten is heel belangrijk. De granulariteit, cytoplasmatische vacuolations en / of loslaten zijn tekenen van achteruitgang, wijst op een onvoldoende medium, microbiële besmetting of veroudering van de primairecellen. Dit protocol wordt gebruikt geïsoleerde adipocyten van het vetkussentje weefsel, terwijl het ook mogelijk om mesenchymale stamcellen geïsoleerd uit beenmerg zoals beschreven door 36 andere protocollen gebruiken. De laatste omvat stromale voorlopercellen cellen, die extra differentiatie problemen die zich voordoen bij de zeer vroege stap van adipocytdifferentiatie afbreuk zouden kunnen doen, kan dit worden gemist in onze huidige protocol. Bovendien kan snel ADSCs (meer dan 10 keer binnen één week) uitgebreid en langdurig gekweekte ADSCs na passages steeds hun pluripotentie mesenchymale 37,38 behouden. Een ander voordeel van het gebruik ADSCs is dat men gemakkelijk kan overschakelen naar menselijke, aangezien ADSCs van patiënten door liposuctie die een eenvoudige en minimaal invasieve wijze kunnen worden geoogst.
Zoals AT beïnvloedt verschillende andere organen in een endocriene wijze, moet het protocol worden uitgebreid tot adipokines. Adipokines, zoals leptine, adiponectine, tumornecrosefactor-α (TNF) and resistine, afgescheiden door adipocyten is bekend dat metabole ziekten beïnvloeden door het regelen van de vetstofwisseling, energie homeostase en insulinegevoeligheid 39. Daarom moet serum en adipocyten secretoom analyses worden uitgevoerd. Bij AT dysfunctie, adipokines en pro-inflammatoire cytokines, zoals IL-6, kan leiden tot ontregeling van organen zoals de lever en de pancreas, en spierfunctie 4. Om systemische orgaanfalen uitgesloten, terwijl diermodellen of celculturen worden getest op hun reactie op stimulatie en glucose opname.
Hier hebben we een protocol voor de analyse de basistoestand van AT en adipocyten in vivo en in vitro moleculaire mechanismen van adipocyten homeostase en functionaliteit onthullen.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
De auteurs willen graag vriendelijk bedanken Dr. J. Luther en K. Ubieta voor het bereiden van de gegevens en Dr. B. Grötsch voor proeflezen het manuscript. Dit werk werd ondersteund door de Deutsche Forschungsgemeinschaft (BO3811 / 1-1-Emmy Noether).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| RNAlater solution | Ambion | AM7021 | RNA stabilization solution |
| High-Capacity cDNA Reverse Transcription Kit | Applied Biosystems | 4368813 | |
| SYBR Select Master Mix | 4472908 | ||
| Purified Mouse Anti-Human Ki-67 | BD Biosciences | 550609 | Clone B56 (RUO) |
| Purified Mouse Anti-Human Ki-67 Clone B56 (RUO) | 550609 | Proliferation marker | |
| FITC Annexin V | BioLegend | 640906 | |
| Cleaved Caspase-3 Rabbit mAb | Cell signalling | 9664S | Clone 5A1E |
| Cleaved Caspase-3 (Asp175) (5A1E) Rabbit mAb | 9664 | Apoptosis marker | |
| Lipofectamine2000 Reagent | Invitrogen | 11668-027 | |
| TO-PRO-3 Iodide | T3605 | Nuclear counterstain, Monomeric cyanine nucleic acid stain, Excitation⁄Emission: 642⁄661 nm | |
| Mayer’s hemalum | Merck | 109249 | hematoxylin |
| pegGOLD TriFast | Peqlab | 30-2030 | TRIzol, single-phase solution of guanidine isothiocyanate and phenol |
| Percellys Ceramic Kit 1.4 mm | 91-PCS-CK14 | tubes containing ceramic beads (1.4 mm) | |
| Precellys 24 | 91-PCS24 | homogenizer | |
| HIF-1 alpha Antibody | Pierce | PA1-16601 | |
| HIF-1 alpha Antibody, 16H4L13 | 700505 | Hypoxia marker | |
| In Situ Cell Death Detection Kit, Fluorescein | Roche | 11 684 795 001 | TdT-mediated dUTP-biotin nick end labeling (TUNEL) |
| Eosin | Sigma | 318906 | |
| DNase I Solution (1 unit/µl) | Thermo Scientific | EN0525 | |
| biotinylated anti mouse IgG (H+L) | Vector Laboratories | BA-9200 | |
| biotinylated anti mouse IgG (H+L) | BA-1000 | ||
| Vectastain ABC Kit | PK-4000 | ||
| VECTASHIELD Mounting Medium with DAPI | H-1200 |
References
- Obesity and Overweight. Fact Sheet °113. WHO. , (Jan 2014) (2014).
- Gong, Z., Muzumdar, R. H. Pancreatic function, type 2 diabetes, and metabolism in aging. Int J Endocrinol. , 320482 (2012).
- Deng, Y., Scherer, P. E. Adipokines as novel biomarkers and regulators of the metabolic syndrome. Ann N Y Acad Sci. 1212, 1-19 (2010).
- Rezaee, F., Dashty, M. Role of Adipose Tissue in Metabolic System Disorders Adipose Tissue is the Initiator of Metabolic Diseases. J Diabetes Metab. , 008 (2013).
- Rutkowski, J. M., Stern, J. H., Scherer, P. E. The cell biology of fat expansion. J Cell Biol. 208, 501-512 (2015).
- Ma, X., Lee, P., Chisholm, D. J., James, D. E. Control of adipocyte differentiation in different fat depots; implications for pathophysiology or therapy. Front Endocrinol (Lausanne). 6, 1 (2015).
- Farmer, S. R. Transcriptional control of adipocyte formation. Cell Metab. 4, 263-273 (2006).
- Luther, J., et al. Elevated Fra-1 expression causes severe lipodystrophy. J Cell Sci. 124, 1465-1476 (2011).
- Luther, J., et al. Fra-2/AP-1 controls adipocyte differentiation and survival by regulating PPARgamma and hypoxia. Cell Death Differ. , (2014).
- Semenza, G. L. Regulation of mammalian O2 homeostasis by hypoxia-inducible factor 1. Annu Rev Cell Dev Biol. 15, 551-578 (1999).
- Kim, W., Kaelin, W. G. The von Hippel-Lindau tumor suppressor protein: new insights into oxygen sensing and cancer. Curr Opin Genet Dev. 13, 55-60 (2003).
- Aragones, J., Fraisl, P., Baes, M., Carmeliet, P. Oxygen sensors at the crossroad of metabolism. Cell Metab. 9, 11-22 (2009).
- Sun, K., Halberg, N., Khan, M., Magalang, U. J., Scherer, P. E. Selective inhibition of hypoxia-inducible factor 1alpha ameliorates adipose tissue dysfunction. Mol Cell Biol. 33, 904-917 (2013).
- Imai, T., Jiang, M., Chambon, P., Metzger, D. Impaired adipogenesis and lipolysis in the mouse upon selective ablation of the retinoid X receptor alpha mediated by a tamoxifen-inducible chimeric Cre recombinase (Cre-ERT2) in adipocytes. Proc Natl Acad Sci U S A. 98, 224-228 (2001).
- Clegg, D. J., Brown, L. M., Woods, S. C., Benoit, S. C. Gonadal hormones determine sensitivity to central leptin and insulin. Diabetes. 55, 978-987 (2006).
- Haluzik, M., et al. Genetic background (C57BL/6J versus FVB/N) strongly influences the severity of diabetes and insulin resistance in ob/ob mice. Endocrinology. 145, 3258-3264 (2004).
- Chomczynski, P., Sacchi, N. Single-step method of RNA isolation by acid guanidinium thiocyanate-phenol-chloroform extraction. Analytical biochemistry. 162, 156-159 (1987).
- Paraffin Processing of Tissue. Protocolsonline. , Available from: http://protocolsonline.com/histology/sample-preparation/paraffin-processing-of-tissue/ (2012).
- Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis. Nat Methods. 9, 671-675 (2012).
- Planat-Benard, V., et al. Plasticity of human adipose lineage cells toward endothelial cells: physiological and therapeutic perspectives. Circulation. 109, 656-663 (2004).
- Kusminski, C. M., et al. MitoNEET-driven alterations in adipocyte mitochondrial activity reveal a crucial adaptive process that preserves insulin sensitivity in obesity. Nat Med. 18, 1539-1549 (2012).
- Trajcevski, K. E., et al. Enhanced lipid oxidation and maintenance of muscle insulin sensitivity despite glucose intolerance in a diet-induced obesity mouse model. PLoS One. 8, 71747 (2013).
- Montgomery, M. K., et al. Mouse strain-dependent variation in obesity and glucose homeostasis in response to high-fat feeding. Diabetologia. 56, 1129-1139 (2013).
- de Queiroz, K. B., et al. Molecular mechanism driving retroperitoneal adipocyte hypertrophy and hyperplasia in response to a high-sugar diet. Mol Nutr Food Res. 58, 2331-2341 (2014).
- Ye, J. Emerging role of adipose tissue hypoxia in obesity and insulin resistance. Int J Obes (Lond). 33, 54-66 (2009).
- Xiong, Y., et al. The local corticotropin-releasing hormone receptor 2 signalling pathway partly mediates hypoxia-induced increases in lipolysis via the cAMP-protein kinase A signalling pathway in white adipose tissue. Mol Cell Endocrinol. 392, 106-114 (2014).
- Bozec, A., et al. Osteoclast size is controlled by Fra-2 through LIF/LIF-receptor signalling and hypoxia. Nature. 454, 221-225 (2008).
- Varia, M. A., et al. Pimonidazole: a novel hypoxia marker for complementary study of tumor hypoxia and cell proliferation in cervical carcinoma. Gynecol Oncol. 71, 270-277 (1998).
- Park, M. H., Choi, K. Y., Jung, Y., Min do, S. Phospholipase D1 protein coordinates dynamic assembly of HIF-1alpha-PHD-VHL to regulate HIF-1alpha stability. Oncotarget. 5, 11857-11872 (2014).
- Tennant, D. A., et al. Reactivating HIF prolyl hydroxylases under hypoxia results in metabolic catastrophe and cell death. Oncogene. 28, 4009-4021 (2009).
- Kim, J., So, D., Shin, H. W., Chun, Y. S., Park, J. W. HIF-1alpha Upregulation due to Depletion of the Free Ubiquitin Pool. Journal of Korean medical science. 30, 1388-1395 (2015).
- Amelio, I., et al. TAp73 opposes tumor angiogenesis by promoting hypoxia-inducible factor 1alpha degradation. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112, 226-231 (2015).
- Suga, H., et al. Adipose tissue remodeling under ischemia: death of adipocytes and activation of stem/progenitor cells. Plast Reconstr Surg. 126, 1911-1923 (2010).
- Moreno-Indias, I., Tinahones, F. J. Impaired adipose tissue expandability and lipogenic capacities as ones of the main causes of metabolic disorders. J Diabetes Res. 2015, 970375 (2015).
- Keuper, M., et al. An inflammatory micro-environment promotes human adipocyte apoptosis. Mol Cell Endocrinol. 339, 105-113 (2011).
- Sera, Y., et al. Hematopoietic stem cell origin of adipocytes. Experimental hematology. 37, 1108-1120 (2009).
- Zuk, P. A., et al. Multilineage cells from human adipose tissue: implications for cell-based therapies. Tissue engineering. 7, 211-228 (2001).
- Zuk, P. A., et al. Human adipose tissue is a source of multipotent stem cells. Molecular biology of the cell. 13, 4279-4295 (2002).
- Scherer, P. E. Adipose tissue: from lipid storage compartment to endocrine organ. Diabetes. 55, 1537-1545 (2006).
