Introduction
Согласно отчету 2014 года от Всемирной организации здравоохранения, 39% взрослого населения мира имеет избыточный вес, а 13% страдают ожирением 1. В ближайшее время, люди с избыточным весом будет включать в себя значительную часть населения пожилого возраста. Важной особенностью ожирения и старения является нарушение регуляции жира по отношению к заболеваемости и смертности 2. Адипокины, белки , секретируемые жировой ткани (АТ), может вызвать метаболические синдромы , такие как ожирение и диабет типа 2 3. Болезни обмена веществ , в основном вызвано чрезмерным накоплением энергии в липидной капли адипоцитов, что приводит при расширении 4. Поэтому представляет интерес для определения причин и молекулярных механизмов расширения АТ для того, чтобы найти возможности для борьбы с ней.
Избыточное питание приводит к расширению AT, который регулируется двумя событиями: чрезмерное накопление энергии в липидные капли адипоцитов, процессчто приводит к гипертрофии (увеличение размера адипоцитов), и увеличение липогенез, также известный как адипоцитов гиперплазии 5. Адипогенезом представляет собой процесс дифференциации мезенхимальных стволовых клеток (МСК) в адипоциты. Во-первых, MSCs перерасти в преадипоциты во время фазы действия обязательств. Во- вторых, преадипоциты дальнейшей дифференциации приобретать черты зрелых и функциональных адипоцитов 6. Несколько факторов транскрипции были определены в качестве основных регуляторов для определения преадипоцитов, таких как цинк палец белка 423 (Zfp423) и фактор клеток раннего B 1 (Ebf1). В то время как Zfp423 вызывает раннее принятие окончательного решения , Ebf1 требуется для генерации адипоцитов клетки - предшественники 6. Терминальная дифференцировка жестко контролируется транскрипционный каскад, в результате чего пероксисом γ рецептора активатора пролиферации (PPAR & gamma) является существенным фактором транскрипции 7. Другие ключевые транскрипционные факторы являются CCAAT / энхансер-связывающий белок (CЧлены семьи / EBP) (т.е., C / EBPα, C / EBPβ и C / EBPδ), Kruppel подобные факторы (KLFs), цАМФ реагировать элемент - связывающий белок (CREB) и раннего реагирования на рост 20 (Krox20) 6.
В последнее время было показано , что семейство активатором протеин-1 (AP-1) участвует в адипоциты процесса дифференцировки 8,9. Семейство АР-1 образована димерных белкового комплекса, состоящего из Fos, Jun и / или активации фактора транскрипции (ATF) членов. Фос связанных с антигеном 1 и 2 (Фра-1 и Фра-2) способны регулировать дифференциацию адипоцитов. Fra-1 снижает дифференциацию адипоцитов путем ингибирования C / EBPα 8, в то время как Fra-2 управляет адипоцитов оборота 9. Fra-2, таким образом, не только уменьшает количество адипоцитов, подавляя экспрессию PPARγ2 во время дифференцировки адипоцитов, но и уменьшает адипоцитов апоптоз посредством прямой репрессии гипоксия-индуцируемый факторов экспрессии (HIFs). Семейство HIF является НЕТЕrodimeric фактор транскрипции комплекс, состоящий из HIF-1, HIF-2Л и HIF-1. Гетеродимеры состоят из чувствительных к кислороду HIF-альфа белок (HIF-1 или HIF-2 & alpha ; ) и кислород нечувствительны HIF-1β субъединицей 10. Во время нормоксии, HIF-α белки являются поли-ubiquitinylated и окончательно деградирует протеасомами 11. не в условиях гипоксии, происходящих в AT во время расширения, HIF-α белки больше не гидроксилированного. Таким образом, они становятся стабилизированные и образуют димеры с конститутивно выраженной HIF-1. Транскрипционной активации генов , контролируемых элементов отклика HIF участвует в регуляции ангиогенеза, обмена веществ и воспаления 12. В самом деле, HIF-1α способствует при дисфункции путем индукции толерантности к глюкозе, ингибируя расходование энергии и периферическое использование липидов, а также за счет увеличения уровня лептина и ВЧУ индуцированную жировая дистрофия печени 13. Кроме того, HIF-1α регулирует adipocyт.е апоптоз в естественных условиях и в пробирке 9.
Настоящий протокол описывает методы для изучения состояния AT распутывать молекулярные характеристики адипоцитов гомеостаза у взрослых мышей. Он показывает , как апоптоз, пролиферацию и дифференцировку адипоцитов в естественных условиях и в пробирке можно регулировать с помощью гипоксии. Для этого мы используем мышей с адипоцитов конкретным удалением Fra-2 генерируемой путем скрещивания мышей , несущих Fra-2 floxed аллели с Fabp4-CreERT мышей 9. При использовании Fabp4-CRE мышей ERT, удаление является адипоцитов конкретным и индуцируется тамоксифена инъекции 14. Для модели взрослого, внутрибрюшинной инъекции тамоксифен выполняются в течение 5 последовательных дней, начиная с возраста 6 недель. Таким образом, мыши подвергаются нормальной диеты или с высоким содержанием жиров в течение 6 недель до того, как анализ завершен. Мыши, используемые в данном исследовании, были мужского пола на основе на фоне C57BL6, чтобы избежать женских гормонов, таких как эстрогены, Показано, регулирует распределение жира в организме 15. Использование другого генетического фона может также изменить метаболический фенотип, из - за деформации , связанные с различиями в управлении липида 16.
Этот протокол показывает , как анализировать AT в условиях гипоксии с использованием гистологии и как количественно адипоцитов апоптоз, пролиферацию и дифференцировку в естественных условиях с использованием иммуногистохимии и ген анализирует профилирование. Исследование завершается экспериментами в пробирке, показывая , как анализировать первичную дифференцировку адипоцитов и апоптоз измененную под воздействием гипоксии.
Protocol
ЭТИКА ЗАЯВЛЕНИЕ: Животные размещаются в стандартных условиях следующих руководящих принципов Закона об охране животных немецком. Животных кормили стандартной диете и воды вволю и выдерживают с 12 ч день / ночь цикла. Все эксперименты с животными разрешено местным комитетом по этике.
1. В Vivo анализа адипоцитов гомеостаза у взрослых мужчин
- Для количественной оценки гипоксию в естественных условиях, в первую очередь определить массу тела мышей, а затем вводят 60 мг / кг массы тела твердого pimonidazole гидрохлорида внутрибрюшинно (например: вводят 1,5 мг в 25 г мыши). Pimonidazole является эффективным гипоксическая маркер, который образует аддукты с тиоловыми группами белков, пептидов и аминокислот и обнаруживается с помощью специфического антитела.
- Жертвоприношение мышей и удалить perigonadal жира колодки (Рисунок 1).
- 45 мин после инъекции, принести в жертву мышей CO 2 удушья и последующее цервикальной дислокации. </ Li>
- Придавить конечности мышей (как показано на рисунке 1) и откройте брюшную полость. Снимите левую и правую perigonadal (придатка) жировой ткани внутри брюшной полости.
Примечание: жировое связаны с придатке по перитонеальных листочков , как показано на рисунке 1 (perigonadal жира колодки обозначены стрелками). - Позаботьтесь, чтобы удалить гонадных ткани из жировой ткани. Определение веса жира площадку для расчета соотношения: жира веса колодки (г) на массу тела (г).
Рисунок 1: Местонахождение perigonadal жировым в брюшной полости мышей. Изображение локализации perigonadal жира у взрослых мышей после жертвоприношения. Perigonadal жира колодки обозначены стрелками. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы VIEW большую версию этой фигуры.
- Для того, чтобы составить количественный профиль экспрессии генов, использовать один perigonadal жировой ткани для выделения РНК. Примечание: пока ткань не будет обработан, хранить образцы ткани в РНК растворе стабилизации при -80 & deg; C или в жидком азоте.
- Для гомогенизации жировой ткани, добавить жировой ткани к 1 мл однофазного раствора гуанидинизотиоцианата и фенола. Используйте пробирки, содержащие керамические шарики (1,4 мм), чтобы сокрушить ткани в гомогенизаторе при 6500 оборотах в минуту (2 раза 20 сек, 30 сек паузы).
- Изолировать РНК следующим образом (метод одноступенчатый по Chomczynski и Sacchi 17).
- Для разделения фаз, передавать гомогенизированный жир колодки для микроцентрифужных трубки, добавляют 0,2 мл объема хлороформа, встряхивают в течение 15 секунд, инкубировать в течение 5 мин при комнатной температуре и центрифугировать 12000 х г в течение 5 мин. Перенести верхнюю водную фазу (около 400 мкл), который содержит РНК, в новую пробирку микроцентрифужных. Не включайте ДНК-содержатИНГ интерфазная или фазы фенолом белоксодержащий.
- Для осаждения РНК, добавляют 1 объем изопропилового спирта, перемешивают и инкубируют в течение 15 мин при 4 ° С (это также можно инкубировать при температуре -20 ° С в течение ночи). Центрифуга при 12000 х г в течение 10 мин. Удалить изопропиловым супернатант тщательно. Промыть дважды с 75% -ным этанолом с центрифугами шагом 12000 мкг в течение 10 мин.
- После высушивания осажденную РНК в течение приблизительно 10 мин при комнатной температуре, растворяют его в 50 мкл H 2 O (РНКазы). Чтобы облегчить это, инкубировать в течение 2 мин при 65 ° С.
Примечание: Хранить РНК в 75% -ном этаноле при температуре -80 & deg; C или в жидком азоте в течение длительного хранения. - Количественно препараты РНК A 260/280 (оптимальное частное от 1,8 до 2,2) и вычислить концентрацию по 260:
- Для того, чтобы избежать загрязнения ДНК, переваривают 1 мкг препарата РНКс 1 U ДНКазы I в течение 30 мин при 37 ° С в объеме 10 мкл. Деактивировать при 65 ° С в течение 10 мин.
Примечание: Этот шаг не является обязательным. - Используйте 10 мкл препарата РНК, содержащей 1 мкг РНК для реакции обратной транскриптазы, чтобы генерировать одноцепочечную кДНК, пригодный для применения количественного ПЦР. Компоненты и их количества приведены в таблице 1.
- Используйте PCR Master Mix для количественного реального времени реакции ПЦР. Для того, чтобы определить , метаболические изменения во всей жировой ткани, используют специфические праймеры для генов , участвующих в AT гомеостаза (таблица 2) и условия ПЦР , перечисленных в таблице 3.
- В режиме реального времени для анализа данных ПЦР.
- Определение базовой линии (рисунок 2), нормально цикл от 1 до 15, где нет никаких изменений в флуоресцентных сигналов. В режиме реального времени программное обеспечение ПЦР нормализует специфические сигналы флуоресценции к исходной флуоресценции и к внутреннему опорному красителя, ROX, в результате чеговеличина конкретных сигналов с помощью праймеров, дельта Rn (ΔRn).
- Установите порог в экспоненциальной фазе кривой амплификации. Пересечение определяет пороговый цикл (Ct). На основе значения КТ, вычислить относительное выражение (& Delta; CТ) и изменение раза (ΔΔCt):
| Компонент | Объем мкл / реакция |
| 10x RT буфера | 2,0 |
| 25x дНТФ Mix (100 мМ) | 0,8 |
| 10x RT Случайные Грунтовки | 2,0 |
| MultiScribe обратной транскриптазы | 1,0 |
| Нуклеазы без H 2 O | 4.2 |
| 1 мкгРНК | 10 |
| Общая реакция на | 20 |
Таблица 1: Компоненты с соответствующим объемом для обратной реакции транскриптазы , чтобы генерировать одноцепочечную кДНК.
| Официальное полное название | Символ | Последовательность 3'-> 5' | ||
| Вперед | Задний ход | |||
| липогенез | Дельта-как 1 гомолог (прив-1) | Dlk1 | GACACTCGAAGCTCA CCTGG | GGAAGGCTGGGACGG GAAAT |
| фактор раннего В-клеток 1 | Ebf1 | CCACCATCGACTACGG CTTC | TCCTGGTTGTTGTGGGG CATC | |
| цинковый палец белка 423 | Zfp423 | GTGCCCAGGAAGAAGA CGTA | GGCGACGTGGATCTGA ATCT | |
| Жирная кислота связывающий белок 4 (Ap2) | Fabp4 | TCACCTGGAAGACAGCT CCTC | AAGCCCACTCCCACTTC TTTC | |
| CCAAT / энхансер-связывающий белок (С / ЕВР), альфа | Cebpa | AAGAGCCGCGACA AGGC | GTCAGCTCCAGCACCT TGTG | |
| CCAAT / энхансер-связывающий белок (С / ЕВР), бета | Cebpb | TTTCGGGACTTGATGC AATC | CCGCAGGAACATCTTT AAGG | |
| цАМФ реагировать элемент-связывающий белок 1 | Creb1 | ACTCAGCCGGGTACT ACCAT | TTGCTGCCTCCCTGTT CTTC | |
| CCAAT / энхансер-связывающий белок (C / EBP), дельта | Cebpd | CAGCGCCTACATTGAC TCCA | GTTGAAGAGGTCGGCG AAGA | |
| Kruppel-подобный фактор 4 | Klf4 | GCAGTCACAAGTCCCC TCTC TAGTCACAAGTGTGGG TGGC | ||
| Ранний ответ роста 2 (Krox20) | Egr2 | AGGCGGTAGACAAAATC CCAG | GATACGGGAGATCCAG GGGT | |
| Пероксисом распространителем активированного гамма-рецептора | PPARG | AGAGGTCCACAGAGCTG ИАТТК | GATGCACTGCCTATGAGC ACTT | |
| Липогенез | Ацетил-Коэнзим карбоксилазы альфа | Acaca | TGGGGACCTTGTCTTCA TCAT | ATGGGCGGAATGGTCTC TTTC |
| Жирные кислоты синтазы | FASN | ACATCCTAGGCATCC GAGA | CCGAGTTGAGCTGGGT TAGG | |
| Стеароил-Коэнзим-десатуразы 1 | scd1 | CGGGATTGAATGTTCTTG TCGT | TTCTTGCGATACACTCTG GTGC | |
| расщепление жира | Пататина-подобный домен containi фосфолипазы2 нг | Pnpla2 | AAGGACCTGATGACCA CCCT | CCAACAAGCGGATGGT Гааг |
| Жирная кислота поглощение | липопротеинлипазу | Лпл | GTATCGGGCCCAGCAA CATTATCC | GCCTTGCTGGGGTTTTC TTCATTC |
| CD36 антиген | CD36 | GTCTTCCCAATAAGCATGT CTCC | ATGGGCTGTGATCGGA АКТГ | |
| гипоксия | Индуцируемого гипоксией фактор 1, альфа-субъединицы | Hif1a | CCTGCACTGAATCAAGAG GTGC | CCATCAGAAGGACTTGCT GGCT |
| домен белка эндотелиальной ПАС 1 (также известный как: HIF-2альфа) | Epas1 | CAAGCTGAAGCTAAAG CGGC | TTGGGTGAATTCATCG GGGG | |
| супрессоров опухоли Гиппеля-Линдау | ВХЛ | ACCGAGGTCATCTTTG ЦПК | TTCCGCACACTTGGGT AGTC | |
| Арилуглеводородному рецептора ядерного транслокатор (также известный как: HIF-1бета) | Арнт | TGGGTCATCTTCTCGC GGTT | TGTCCTATCTGAGCAT CGTG | |
Таблица 2: Список генов с последовательностью соответствующих праймеров , используемых для анализа адипоцитов гомеостаза.
| шаг | Температура (° C) | Время (мин: сек) | ||
| активация полимеразной | Держать | 95 | 10:00 | |
| ПЦР | 40 циклов | Denaturize | 95 | 0:15 |
| Отжиг / Extension | 60 | 1:00 | ||
| кривая плавления | От 60 до 95 | 0,5 ° С / сек | ||
Таблица 3: ПЦР в реальном времени условия.
Рис . 2: Характеристики реального времени кривой ПЦР - амплификации Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
- Для выполнения гистологического анализа адипоцитов гомеостаза, используйте второй perigonadal жировой ткани. Не пересушивает ткани!
- Закрепить жировой ткани в 3,7% PBS-буферном растворе формальдегида в течение ночи, встраивать в парафин (следуйте инструкциям , как описано в другом месте 18) и разрезают внедренный ткани в 2-5 мкм толщиной секций (максимум 5 мкм).
- Определить количество адипоцитов в поле и размер адипоцитов в ярко-поле микроскопа после гематоксилином и эозином (H & E) окрашиванием: <ол>
- Deparaffinize секции промыванием 3 раза в течение 5 мин в ксилоле и повторно гидратировать секция 2 раза в течение 2 мин в 100% этаноле и 2 раза в течение 2 мин в 96% -ном этаноле. Наконец, промойте участок в дистиллированной H 2 O в течение 5 мин.
- Пятно гематоксилином, разводили 1: 5 дистиллированной H 2 O, в течение 10 мин при комнатной температуре и моют в H 2 O в течение 5 мин. Пятно с раствором эозина (20 мл 5% -ного эозина Y / 210 мл дистиллированной H 2 O / 25 мкл лед ной уксусной кислоты) в течение 30 секунд и снова промывали H 2 O в течение 5 мин.
- Высушить частей с помощью 96% -ного этилового спирта и 100% этанола в 2 раза каждый в течение 2 мин и ксилол 3 раза в течение 5 мин. Установите секции с безводным монтажном агентом.
- Оценка секций под светлого поля микроскопа. Показательным примером того , как анализировать адипоцитов с ImageJ 1.48v 19 показан на рис. 3: число клеток на квадратный метр (мкм 2), площадь клеток (× 10 3 мкм 2
- Откройте изображение секции с ImageJ 1.48v. Если параметры изображения указываются в пикселях вместо единицы длины, изменить масштаб.
- Выберите * прямая линия * в панели инструментов и настроить линию на известном расстоянии ссылкой на масштабной линейки. Перейти к Анализировать -> Set Scale Расстояние от линии отображается в пикселях;. добавить известное расстояние и единицу длины, например, мкм. Подтвердите с помощью OK. Размер картины и анализ параметров указаны в единицах длины заданной.
- Для определения параметров адипоцитов, отрегулируйте порог. Перейти к Image -> Adjust -> Threshold , чтобы открыть окно Threshold. Выберите следующие параметры: способ сегментации: по умолчанию; Threshold цвет: B & W; Цветовое пространство: HSB. Картина теперь отображается в черно-белом. НастроитьЯркость , чтобы очистить белые адипоциты и закрыть черные межклеточные пространства, как показано на рис. 3b.
- Подсчитайте количество адипоцитов на 2 мкм (рис 3e) с * многоточечной * выбор в панели инструментов и отметьте каждую ячейку для подсчета.
- Для определения размера адипоцитов, выберите * прямая линия * снова на панели инструментов и нарисуйте диаметр адипоцитов (рис 3в). Перейти к Анализировать -> Measure и появится новое окно, с длиной диаметра в мкм.
- Для определения площади адипоцитов, выберите * Wand (трассировка) инструмент * и щелкните внутри адипоцитов. Внутренняя стенка адипоците выбран красным цветом (Рис 3). Перейти к Анализировать -> Измерение и появится новое окно, с областью этого адипоцитов в мкм 2.
- Deparaffinize секции промыванием 3 раза в течение 5 мин в ксилоле и повторно гидратировать секция 2 раза в течение 2 мин в 100% этаноле и 2 раза в течение 2 мин в 96% -ном этаноле. Наконец, промойте участок в дистиллированной H 2 O.
- Для поиска антигена, переваривают срезы ткани в течение 30 мин при 37 ° С с протеиназы К рабочего раствора (20 мкг / мл в 10 мМ Трис / HCl, рН 7.4-8) и промыть PBS.
- Для того, чтобы блокировать эндогенной пероксидазы, используют 3% перекиси водорода в PBS в течение 10 мин, при последующем мытье 2 раза в течение 5 мин в PBS. Для того, чтобы блокировать неспецифическое связывание антител, используют 10% сыворотки в PBS. Используйте сыворотку хозяина вторичного антитела, в данном случае козла.
- Для окрашивания используют антитела для апоптоза, пролиферации и обнаружения (гипоксия
- Для усиления сигнала используют биотинилированные вторичные антитела, с разбавлением , как указано в таблице 5. Для обнаружения гипоксией используют HRP конъюгированный кроличий анти-FITC в качестве вторичного антитела. Инкубировать в течение 1 часа при комнатной температуре. Вымойте секций 2 раза 5 мин с PBS.
Примечание: Для окрашивания гипоксия с FITC-mAb1, пропустите шаг 1.4.4.4) и переходите к шагу 1.4.4.5).- Для каждого слайда, предварительно инкубировать 50 мкл авидин раствора с 50 мкл биотинилированных пероксидаза Н в течение 30 мин при комнатной температуре (этот метод также упоминается как авидин / биотин ABC сложного состава), а затем добавить к разделам еще 45 мин. Промыть 2 раза в течение 5 минут с PBS.
- Инкубируйте разделы в растворе субстрата пероксидазы, пока окрашивание не станет более интенсивным (от 5 до 10 мин). Промыть в течение 5 мин с дистиллированнойH 2 O.
- Для counterstaining, пятно с гематоксилином разводили 1: 5 дистиллированной H 2 O в течение 10 мин при комнатной температуре и мыть в H 2 O в течение 5 мин.
- Высушить секций в 96% этанола и 100% этанола, 2 раза каждый в течение 2 мин и ксилол 3 раза в течение 5 мин. Уплотнение секций с покровных и безводной монтажного агента. Оценка секций под светлого поля микроскопа.
- Для усиления сигнала используют биотинилированные вторичные антитела, с разбавлением , как указано в таблице 5. Для обнаружения гипоксией используют HRP конъюгированный кроличий анти-FITC в качестве вторичного антитела. Инкубировать в течение 1 часа при комнатной температуре. Вымойте секций 2 раза 5 мин с PBS.
- Добавить раствор фермента 50 мкл в 450 мкл раствора метки. Затем нанесите 50 мкл реакционной смеси TUNEL на гистологические и инкубировать в течение 60 мин при + 37 ° С в увлажненной атмосфере, в темноте. Вымойте секций 3 раза PBS в течение 5 мин и смонтировать с флуоресцентной монтажной среды, включая DAPI (4 ', 6-диамидино-2-фенилиндол) для counterstaining.
- Оценка секции под флуоресцентным микроскопом с 100-кратным Магнификата иона. Для измерения флуоресцеина использовать длину волны возбуждения 488 нм и обнаружить между 515-565 нм (зеленый лазер); DAPI возбуждает около 360 нм и излучает при температуре около 460 нм при связывании с ДНК (синий лазер).
- Количественно оверлеи из DAPI и флуоресцеина:
Рис . 3: Анализ адипоцитов характеристик в жировых секциях колодки Раздел картины perigonadal жировое самцов мышей , получавших с высоким содержанием жиров (HFD) или нормальной диеты (ND) с ярко-поле микроскопа (а); порог устанавливается в черно-белый (б) и размер адипоцитов (длина, в) количественно с ImageJ 1.48v, область (D) и адипоцитов количество клеток на мм 2 (е).F = "https://www.jove.com/files/ftp_upload/53822/53822fig3large.jpg" целевых = "_blank"> Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
| концентрация Фото | разведение | |
| апоптоз | Расколотая каспазы-3 (Asp175) (5A1E) Кролик мАт | 1: 2000 |
| пролиферация | Очищенная мышиного антитела против человеческого Ki-67 Клон B56 (RuO) | 1:50 |
| гипоксия | HIF-1 альфа антитела | 1: 100 |
| FITC-mAb1 | 1: 100 |
Таблица 4: Антитела с соответствующим разбавлением используется для иммуногистохимического окрашивания срезов AT.
| антитело | разведение |
| биотинилированным антимышь IgG (H + L) | 1: 200 |
| биотинилированные анти IgG мыши (H + L) | 1: 200 |
| ПХ конъюгаты кроличьей анти-FITC | 1: 100 |
Таблица 5: Вторичные антитела с разбавлением , используемые для иммуногистохимического окрашивания.
2. Экстракорпоральное Анализ адипоцитов гомеостаза под влиянием гипоксией
- Жертвоприношение мышей и удаления подкожной жировой ткани.
- Жертвоприношение мышей СО 2 удушья и последующим смещением шейных позвонков.
- Придавить конечности мышей , как показано на рисунке 4. Отделить кожу от верхней части ноги, поясницы и фланг и придавить это с иглами , как на рисунке 4. Затем удалите подкожной жировой ткани, которая расположена кзади у основания задние ноги, окружающие паховые лимфатические узлы (как показано на рисунке 4, слева: подкожный жировой тканиы показано стрелками; справа: паховых лимфатических узлов показано стрелкой).
Рисунок 4: Расположение подкожных жировых отложений. Изображение подкожной жировой ткани; левые стрелки указывают на подкожный жировой ткани и правая стрелка указывает на паховых лимфатических узлов. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
- Isolate полученные из жировой ткани стволовые клетки (ADSC) , как описано ранее 20.
- Семенной ADSC 4000 клеток / см 2 в Дульбекко, модифицированной Игла среднего Хэма F-12 с добавлением 10% нормальной сыворотки теленка, 1% пенициллина / стрептомицина, 0,5% амфотерицина В, 16 мкМ биотина, 18 мкМ пантотеновой кислоты и 100 мкМ аскорбиновой кислоты и растут культуры до слияния около 70 до 80%, Которая достигается после 4-х до 6 дней культивирования.
- Побудить Adipogenic дифференциацию.
- Удалите прилипший ADSC с поверхности путем обработки трипсином.
- Удалить среду, промывают PBS и добавляют 0,025% раствора трипсина (предварительно нагретый до 37 ° С) в течение 2 мин (до тех пор, пока клетки не отделяются от поверхности). Немедленно добавьте средних и мыть клетки.
- Граф клеток с помощью камеры Нейбауера.
- Поместите стеклянную крышку на центральной площади камеры Neubauer. Развести клеточной суспензии в соотношении 1:10 и загружают в камеру с 10 мкл разбавленных клеточной суспензии. Граф клеток в 4-х квадратов, расположенных в углах, каждый из которых состоит из 16 маленьких квадратов. Подсчитать количество клеток на мл:
- Поместите стеклянную крышку на центральной площади камеры Neubauer. Развести клеточной суспензии в соотношении 1:10 и загружают в камеру с 10 мкл разбавленных клеточной суспензии. Граф клеток в 4-х квадратов, расположенных в углах, каждый из которых состоит из 16 маленьких квадратов. Подсчитать количество клеток на мл:
- Семенной ADSC (как это описано в пункте 2.2) в 12-луночные культуральные планшеты и выращивать культуру до слияния около 70 до 80% (достигается после 4-х до 6-ти дней).
- Побудить adipogeНИК дифференцировки путем добавления 5 мкг / мл инсулина, 1 мкМ дексаметазон и 5 мкМ 3-изобутил-1-метилксантина (ИБМК) к культурам. Заменить среду каждые 2 дня. Клетки будут полностью дифференцированы через 7 дней.
- Удалите прилипший ADSC с поверхности путем обработки трипсином.
- Для анализа Adipogenic дифференциации, пятно с масляным красным O, который окрашивает триглицериды зрелых адипоцитов.
Примечание: Работа должна выполняться под вытяжкой!- Удалите среду, вымыть адипоциты осторожно PBS и фиксации клеток в течение 60 мин с 2 мл 10% -ного формалина.
- Для того, чтобы приготовить раствор масла окрашивания Красный O, смешайте 3 части исходного раствора O - красного масла (300 мг масла красного цвета O порошка , растворенного в 100 мл 99% -ного раствора изопропанола) с 2 -х частей дистиллированной Н 2 O и инкубировать в течение 10 мин при комнатной температуре. Фильтр рабочего раствора масла Красный O через нагнетательные фильтр 0,2 мкм.
Примечание: Рабочий раствор стабилен в течение 2 часов. - Для окрашивания масла Red O, удалите формалина, моют адипоцитов с H 2
- Оценка пластины под фазового контрастного микроскопа с 100-кратным увеличением. Липиды адипоцитов будет выглядеть красным, а ядра будут появляться синий.
- Необязательный шаг: Silence интересующего гена путем трансфекции с shRNA.
- Изменение среды и добавьте бессывороточной среды.
- Для трансфекции адипоцитов, используют липофекцию. Следуйте инструкциям производителя и использовать 1 мкг shRNA на пластинах ткани 12-а. После добавления липидной-ДНК-комплекса, инкубировать адипоциты в течение 48 ч при 37 ° С.
- Для анализа адипоциты, подвергнутых гипоксии, использовать гипоксического рабочую станцию или гипоксического инкубатор для поддержания клеток в условиях гипоксии. В зависимости от исследования, гипоксия сульд быть 0,5, 1 или 2% кислорода.
- Анализировать апоптоз FITC-меченого аннексина V и последующей проточной цитометрии анализов.
- Соберите адипоцитов с дополнительным мягким клеточным скребком, промывают PBS и добавляют 1 × 10 6 клеток в 100 мкл аннексина V-связывающего буфера (10 мМ Hepes / NaOH, рН 7,4, 140 мМ NaCl, 2,5 мМ CaCl 2). Добавьте количество аннексина V-FITC, рекомендованные производителем и инкубировать при комнатной температуре в течение 15 мин.
- Для проточной цитометрии измерения, добавьте 200 мкл буфера аннексина V-связывания и 1 мкМ ядерной контрастирующая. Определить флуоресценцию в зеленом и фиолетовом канале. Аннексина V + / ядерный контрастное + клетки определяются как вторичные некротические и аннексина V + / ядерный контрастное - клетки определяются как апоптотических клеток (рисунок 5).
- Количественно анализ уровня РНК адипоцитов для определения гомеостаза в условиях гипоксии.
- Добавить1 мл однофазный раствор гуанидинизотиоцианата и фенола в каждую лунку и изолируют РНК [ с использованием метода пошагового по Chomczynski и Sacchi 17 (этап 1.3.2)] и продолжить , как на этапах 1.3.2.1) до 1.3.5.2) ,
- Анализировать апоптоз FITC-меченого аннексина V и последующей проточной цитометрии анализов.
Рисунок 5: Adipocyte анализ апоптоза методом проточной цитометрии. Dot сюжет презентации FACS для аннексина V-FITC и TO-PRO-3 окрашивание адипоцитов. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Representative Results
Мы покажем , как определить адипоцитов гомеостаза в естественных условиях и в пробирке , используя пример Fra-2 эт / фл Fabp4-CreERT мышей по сравнению с однопометные дикого типа. Наш протокол определяет, как повышенная экспрессия HIF гипоксией коррелирует с адипоцитов дисфункции, как показано увеличением адипоцитов апоптоза.
Увеличение размера адипоцитов и области в высоким содержанием жиров (HFD) обработанных мышей
Избыточное питание, наряду с другими факторами, приводит к гипертрофии адипоцитов, вызванное чрезмерным накоплением энергии в липидных капель. Размер адипоцитов и область является показателем гипертрофии. Разделы жировой ткани от нормального (ND; Рисунок 6а) и с высоким содержанием жиров (HFD, рисунок 6б) мышей, а также количественными от размера адипоцитов и области ясно показывают адипоцитов гипертрофия после 6 неделье годы HFD, что указывает увеличенный размер адипоцитов в HFD обработанных мышей (рис 6с и г).
Увеличение гипоксия в жировой ткани (AT) взрослых Фра-2 фл / фл Fabp4-CreERT мышей приводит к повышению уровня HIF-1 и адипоцитов апоптоза
Для определения состояния в естественных условиях гипоксии в AT, Fra-2 эт / фл мышей Fabp4-CreERT анализируются через 6 недель после того, как Фра-2 удаления в возрасте 12 недель и по сравнению с однопометные дикого типа. Pimonidazole вводят мышам внутрибрюшинно в качестве эффективного гипоксией маркера; он не токсичен и способен распределять в AT. Гипоксических адипоциты в AT в естественных условиях определяются иммуногистохимического окрашивания антителами (рис 7а). Кроме того, повышенный статус гипоксическая АТ у мышей сопровождается увеличением HIF-1 положительной ADIPocytes как обозначено иммуногистохимического окрашивания Рисунок 7b), что подтверждается количественной оценки уровней экспрессии HIF-1α и его цели генов 9. Кроме того, TUNEL , окрашивание срезов при температурах от Fra-2 эт / фл Fabp4-CreERT мышей и Однопометники управления (фиг.7С) показывает , что увеличение адипоцитов апоптоз коррелирует с наличием гипоксии и HIF-1α экспрессии.
Увеличение HIF-1α экспрессию в первичных адипоцитов через гипоксия индуцированных адипоцитов апоптоза
Для анализа адипоцитов апоптоз в лабораторных условиях , мы используем адипоциты , сгенерированные из подкожной жировой ткани , как описано в другом месте 20. Как и ожидалось, HIF-1α выражение в адипоцитах увеличивается после того, как 24 ч гипоксией (рис 8а). Для дальнейшего анализа HIF-1α деятельности, уровни РНК мишени HIFгены , такие как Inos (индуцибельной синтазы оксида азота) количественно КПЦР. Рисунок 8b показывает , что повышенная экспрессия HIF-1 в условиях гипоксии приводит к повышению уровня Inos мРНК. Так как мы уже показали в естественных условиях (рисунок 8) , что увеличение HIF-1α выражение в адипоциты коррелирует с повышенной адипоцитов апоптоза, апоптоза также количественно в культурах в пробирке путем аннексина V окрашивания в условиях гипоксии. В соответствии с данными в естественных условиях (рисунок 7), повышенный уровень HIF-1α сопровождается усилением адипоцитов апоптоза , индуцированный гипоксических условиях (рис 8b). Более того, чтобы доказать, что гипоксическая-индуцированный апоптоз является HIF-зависимой; HIF-1α или HIF-2α замолчать с помощью РНК-интерференции в адипоцитах, полученных из дикого типа или Fra-2 дефицитных мышей. Увеличение адипоцитов апоптоз восстанавливается глушителей HIF-1 или HIF-2Л, как показано аннексином V окрашивание на рисунке 8b, доказывая , что датчик гипоксия HIF-α регулирует адипоцитов апоптоз.
Рисунок 6: Увеличение размера адипоцитов и области в с высоким содержанием жиров (HFD) мышей (а, б) H & E окрашивание срезов от perigonadal жировой ткани самцов мышей дикого типа , которых кормили нормальной диеты (ND) (а) или высокий. -fat диета (HFD) (б) в течение 6 недель. Полосы представляют 500 мкм. (С, d) количественными размера адипоцитов (с) и области (d) от perigonadal жировой ткани мышей дикого типа , получавших ND (а) или HFD (б) в течение 6 недель. N = 10. Данные приведены в виде среднего значения ± SEM. Статистический анализ проводился с использованием Student's т -TEST. *** Р <0,0001.: //www.jove.com/files/ftp_upload/53822/53822fig6large.jpg "Целевых =" _blank "> Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Рисунок 7: Повышение уровня HIF-1α и апоптоз в адипоцитах взрослых от Fra-2 эт / эт мышей Fabp4-CreERT. Гипоксия (а) и HIF-1α (б) окрашивание в AT мужской Fra-2 фл / фл Fabp4-creERT мышей и Однопометники мужчина из контрольной группы через 6 недель после инъекции тамоксифена. Увеличение 20X, 40X вставки. Черные стрелки указывают на гипоксические области и HIF-1α положительных клеток. (С) TUNEL окрашивание в Fra-2 эт / фл Fabp4-CreERT мышей и Однопометники контроль через 6 недель после инъекции тамоксифена. Увеличение 20X, 40X вставки. Черные стрелки указывают на TUNEL-положительных клеток. Эта цифра была изменена от Лютера и дри др. 9. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Рисунок 8:. Увеличение HIF-1α экспрессии и адипоцитов апоптоз в первичных адипоцитов , индуцированных гипоксией (а) ПЦР в реальном времени анализ HIF-1 и целевых HIFs уровней Inos мРНК в первичных адипоцитов , помещенных в гипоксических камерах проанализированы в указанные моменты времени. (Б) Количественное апоптоза аннексина V FACS окрашивания в первичных адипоцитов , выделенных из Fra-2 эт / фл мышей Fabp4-CreERT или контрольных мышей дикого типа , трансфицированные с контролем ш или ш плазмиды против HIF-1 или HIF-2Л и помещенные в условиях гипоксии (1% O 2) в течение 24 ч. Эта цифра была изменена от Лютера и др.
Discussion
Адипоциты характеризуются фенотипически их размера, числа и площади, выявление адипоцитов гиперплазию и гипертрофию, вызванную чрезмерным накоплением энергии из - за избыточного питания 5. Эти события, приводящие к нарушению регуляции жирных кислот и последующих метаболических синдромов также говорится повышенной жировой массы с сохранившимися метаболизмом, который также называют "здоровой" расширения жира. Например, Kusminski и др. 21 показали , что у мышей с массовым расширением жира остаются метаболически здоровыми, предполагая , что расширение жира не обязательно связано с метаболическими синдромов и должна быть тщательно определены , чтобы оценить характеристики адипоцитов. Жировая ткань (ЖТ) играет ключевую роль в регуляции обмена веществ организма. AT является самым большим эндокринным органом , который может влиять на дислипидемию, атеросклероз, гиперинсулинемии и гипергликемии 3. Оценка АТ гомеостаза и молекулярном мechanisms, регулирующие это может позволить лучше понять метаболических нарушений системы. Таким образом, распутывая механизмы, регулирующие дифференциацию адипоцитов, размер адипоцитов и масса жировой ткани будет способствовать развитию нового терапевтического лечения расстройств, ожирения. Использование в естественных условиях и в пробирке методами, можно определить роль пищевых и экспрессии генов воздействия на дифференциации адипоцитов и деятельности. Для определения гомеостаз AT, определяющих баланс дифференциации адипоцитов, пролиферации и апоптоза как это было предложено наш протокол также важно , как анализировать реакцию глюкозы и инсулина метаболизма 22-24.
Экспрессия профилирование анализ генов, вовлеченных в адипогенеза, липогенеза, липолиза, поглощение жирных кислот, гипоксии, апоптоза и пролиферации в первичных адипоцитов и висцерального AT является высокая пропускная метод для получения обзора по адипоцитов гомеостаза и их возможной дисфункции.Интересные кандидаты должны быть дополнительно проанализированы на уровне белка с помощью Вестерн-блоттинга или иммуногистохимического окрашивания. Для получения оптимальных результатов в реальном времени от системы ПЦР с использованием несимметричных цианиновых красителей, концентрации кДНК в диапазоне от 1 до 10 нг и оптимальные концентрации праймеров в диапазоне от 50 до 900 нм должен быть проверен, чтобы минимизировать неспецифической амплификации. Критические компоненты праймеры; для каждого прогона, кривые плавления должны строго контролироваться, чтобы обеспечить специфичность и исключить образование димеров праймеров. Таким образом, при использовании отрицательного контроля с H 2 O вместо кДНК рекомендуется. Кроме того, коммерческие доступные несимметричные цианиновые красители предоставляются в качестве мастер-смесей, которые содержат пассивный эталонный краситель (например, ROX) для обеспечения внутреннего опорного сигнала. КДНК сигнала нормируется при анализе данных к ROX сигналов для коррекции хорошо в скважине флуктуации сигнала. Еще один момент, который следует учитывать для того, чтобы установить жижуd Система КПЦР является выбор гена домашнего хозяйства. Для каждого состояния, используются несколько генов домашнего хозяйства, например, HPRT, β-актина, GAPDH, β-2-MG или HSP90.
HIF белки , стабилизированные гипоксических условиях являются мастер - регуляторы , определяющие не только выживаемость адипоцитов, но и метаболические изменения, такие как глюкоза, толерантность к инсулину и липидного обмена 11,25,26. Для установления гипоксические области в жировой ткани, HIF-1α определяется в AT секциях с помощью иммуногистохимии. Поскольку HIF белки быстро деградируют в пределах от 5 до 10 мин при нормоксических условиях, порядок и фиксация жировой ткани для гистологического анализа должны строго контролироваться, чтобы избежать задержки времени. Поэтому, чтобы обеспечить гипоксию не только через HIF окрашивания, pimonidazole используется для определения гипоксические области в AT. Pimonidazole способен распространять в ткани, как это уже было показано в костях 27И эффективно маркировать гипоксические области , путем связывания с тиол-содержащих белков специфически в гипоксических клеток, которые дополнительно обнаружены в гистологических срезах с помощью специфических антител связывания 28. Тем не менее, другие маркеры и способы могут быть использованы для анализа гипоксия пути. Например, участие в пролилгидроксилазы (PHD) фермента, которые индуцируют гидроксилирование остатков пролина под нормоксии, а также белка фон Хиппель-Линдау (VHL), распознающие гидроксилированных пролины и индуцируют поли-убиквитинирование посредничать протеасомной HIF деградации, должны быть проанализированы для полного обзора пути 29,30. Кроме того, повсеместное обнаружение HIFs также определить стабильность белка и деградации , которые могут быть изменения 31,32.
Кроме того, распространение по Ki67 и апоптоз с помощью TUNEL окрашивания определяют в естественных условиях путем окрашивания AT гистологических срезов. Количественное пролиферации Ki67 и аpoptosis с помощью TUNEL или V окрашивания аннексина через проточной цитометрии анализа также осуществляется 33. Пролиферация, конечно, может быть измерена с помощью других методик, таких как анализ адипоцитов клеточного цикла, который не учтенные измерения Ki67 положительных клеток. Кроме того, апоптозом исследование TUNEL может быть завершена путем FACS анализа аннексина V и TOP-PR-3, который будет определять уровни некроза по сравнению с процессом гибели клеток апоптоза. Апоптоз является фундаментальным процессом для программы клеточной смерти, что является важным для AT гомеостаза. Действительно, нарушение регуляции апоптоза адипоцитов было вовлечено ранее в процессах , способствующих ожирению и липодистрофии 34. Кроме того, в 2011 году, кейпера и др. Связаны воспаление жировой ткани к адипоцитов апоптоза. Они показали, что макрофаги индуцированный апоптоз в преадипоциты и адипоциты, которые в свою очередь привлекают макрофаги. Вербовка макрофагов ускоряет воспаление, которое CONTRibutes метаболических синдромов , таких как глюкоза и инсулина толерантности 35. Однако адипоцитов апоптозом все еще слабо изученное явление, несмотря на то, что гипотеза индуцированного апоптоза адипоцитов может привести к снижению веса.
Настоящий протокол использует иммуногистохимических подходы к изучению другого явления, как пролиферации, апоптоза и гипоксии в естественных условиях. Таким образом, ткань фиксировали в 4% формальдегида, который является важным шагом. Длительное время фиксации ткани приводит к изменению эпитопов, которые становятся не доступными для антитела. В отличие от этого, короткое время фиксации повышает чувствительность эпитопов реагентов. Рекомендуемое оптимальное время фиксации составляет 24 часа в сутки. Кроме того, толщина секций также влияет на антитела, связывающиеся с их эпитопов; оптимальная толщина составляет от 2 до 5 мкм. Секции толщиной более 5 мкм будут давать ложные положительные результаты в связи с увеличением сайтов связывания. В отличие от этого, sections тоньше, чем 2 мкм, содержат меньше сайтов связывания и положительные области не определены. Далее решающими факторами являются само антитело, время инкубации, концентрации и даже температуры, которые влияют на качество специфического связывания с эпитопами. Таким образом, антитела проверки концентрации и инкубации необходимо время для каждого условия.
Для завершения исследования, мы обеспечиваем экстракорпорального протокол дифференцировки адипоцитов в, которая может быть расширена с помощью различных методов лечения, стимуляции или сопутствующих культур. При использовании в лабораторных культурах адипоцитов, целесообразно определить дефекты в дифференциации адипоцитов и функций. Для получения достоверных результатов, как и для всех первичных клеток, здоровое поведение и внешний вид ADSCs и адипоциты является весьма важным. Зернистость, цитоплазматические vacuolations и / или отслойка признаки ухудшения, указывающие на неадекватную среду, микробное загрязнение или старение первичнойклетки. Этот протокол использует изолированных адипоцитах из жировой ткани ткани, в то время как он является , а также возможно использование мезенхимальных стволовых клеток , выделенной из костного мозга , как описано другими протоколами 36. Последняя включает в себя клетки-предшественники стромы, которые могут отражать дополнительные проблемы дифференциации, происходящие на самой ранней стадии дифференцировки адипоцитов, это может быть пропущено в нашем текущем протоколе. Кроме того, ADSCs может быть быстро (более чем в 10 раз в течение одной недели) расширилась, и долгосрочные культивированный ADSCs после некоторых пассажей до сих пор сохраняют свою мезенхимальных плюрипотентности 37,38. Еще одно преимущество с помощью ADSCs является то, что можно легко переключиться на человека, так как ADSCs могут быть собраны из пациентов липосакцией, которая является простым и минимально инвазивным методом.
Как AT влияет на некоторые другие органы в эндокринный образом, протокол должен быть распространен на адипокинов. Адипокины, такие как лептин, адипонектина, фактор некроза опухолей-альфа (TNF), ай резистин, секретируется адипоцитами , как известно, влияют на метаболические заболевания, контролируя жировой обмен, энергетический гомеостаз и чувствительность к инсулину 39. Таким образом, в сыворотке крови и адипоцитов secretome анализы должны быть выполнены. В случае при дисфункции, адипокинов и провоспалительных цитокинов, таких как IL-6, может привести к нарушению регуляции органов , таких как печень и поджелудочную железу, и мышечной функции 4. Для того, чтобы исключить системную дисфункции органов, модели на животных или клеточные культуры могут быть протестированы на их ответ на стимуляцию глюкозы и поглощение.
Здесь мы приводим протокол для анализа основного состояния АТ и адипоциты в естественных условиях и в пробирке , чтобы выявить молекулярные механизмы адипоцитов гомеостаза и функциональности.
Disclosures
Авторы не имеют ничего раскрывать.
Acknowledgments
Авторы хотели бы любезно поблагодарить д-ра J. Лютера и К. Ubieta для подготовки данных и д-р Б. Grötsch за вычитку рукописи. Эта работа была поддержана Немецким Исследовательским (BO3811 / 1-1-Нётер).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| RNAlater solution | Ambion | AM7021 | RNA stabilization solution |
| High-Capacity cDNA Reverse Transcription Kit | Applied Biosystems | 4368813 | |
| SYBR Select Master Mix | 4472908 | ||
| Purified Mouse Anti-Human Ki-67 | BD Biosciences | 550609 | Clone B56 (RUO) |
| Purified Mouse Anti-Human Ki-67 Clone B56 (RUO) | 550609 | Proliferation marker | |
| FITC Annexin V | BioLegend | 640906 | |
| Cleaved Caspase-3 Rabbit mAb | Cell signalling | 9664S | Clone 5A1E |
| Cleaved Caspase-3 (Asp175) (5A1E) Rabbit mAb | 9664 | Apoptosis marker | |
| Lipofectamine2000 Reagent | Invitrogen | 11668-027 | |
| TO-PRO-3 Iodide | T3605 | Nuclear counterstain, Monomeric cyanine nucleic acid stain, Excitation⁄Emission: 642⁄661 nm | |
| Mayer’s hemalum | Merck | 109249 | hematoxylin |
| pegGOLD TriFast | Peqlab | 30-2030 | TRIzol, single-phase solution of guanidine isothiocyanate and phenol |
| Percellys Ceramic Kit 1.4 mm | 91-PCS-CK14 | tubes containing ceramic beads (1.4 mm) | |
| Precellys 24 | 91-PCS24 | homogenizer | |
| HIF-1 alpha Antibody | Pierce | PA1-16601 | |
| HIF-1 alpha Antibody, 16H4L13 | 700505 | Hypoxia marker | |
| In Situ Cell Death Detection Kit, Fluorescein | Roche | 11 684 795 001 | TdT-mediated dUTP-biotin nick end labeling (TUNEL) |
| Eosin | Sigma | 318906 | |
| DNase I Solution (1 unit/µl) | Thermo Scientific | EN0525 | |
| biotinylated anti mouse IgG (H+L) | Vector Laboratories | BA-9200 | |
| biotinylated anti mouse IgG (H+L) | BA-1000 | ||
| Vectastain ABC Kit | PK-4000 | ||
| VECTASHIELD Mounting Medium with DAPI | H-1200 |
References
- Obesity and Overweight. Fact Sheet °113. WHO. , (Jan 2014) (2014).
- Gong, Z., Muzumdar, R. H. Pancreatic function, type 2 diabetes, and metabolism in aging. Int J Endocrinol. , 320482 (2012).
- Deng, Y., Scherer, P. E. Adipokines as novel biomarkers and regulators of the metabolic syndrome. Ann N Y Acad Sci. 1212, 1-19 (2010).
- Rezaee, F., Dashty, M. Role of Adipose Tissue in Metabolic System Disorders Adipose Tissue is the Initiator of Metabolic Diseases. J Diabetes Metab. , 008 (2013).
- Rutkowski, J. M., Stern, J. H., Scherer, P. E. The cell biology of fat expansion. J Cell Biol. 208, 501-512 (2015).
- Ma, X., Lee, P., Chisholm, D. J., James, D. E. Control of adipocyte differentiation in different fat depots; implications for pathophysiology or therapy. Front Endocrinol (Lausanne). 6, 1 (2015).
- Farmer, S. R. Transcriptional control of adipocyte formation. Cell Metab. 4, 263-273 (2006).
- Luther, J., et al. Elevated Fra-1 expression causes severe lipodystrophy. J Cell Sci. 124, 1465-1476 (2011).
- Luther, J., et al. Fra-2/AP-1 controls adipocyte differentiation and survival by regulating PPARgamma and hypoxia. Cell Death Differ. , (2014).
- Semenza, G. L. Regulation of mammalian O2 homeostasis by hypoxia-inducible factor 1. Annu Rev Cell Dev Biol. 15, 551-578 (1999).
- Kim, W., Kaelin, W. G. The von Hippel-Lindau tumor suppressor protein: new insights into oxygen sensing and cancer. Curr Opin Genet Dev. 13, 55-60 (2003).
- Aragones, J., Fraisl, P., Baes, M., Carmeliet, P. Oxygen sensors at the crossroad of metabolism. Cell Metab. 9, 11-22 (2009).
- Sun, K., Halberg, N., Khan, M., Magalang, U. J., Scherer, P. E. Selective inhibition of hypoxia-inducible factor 1alpha ameliorates adipose tissue dysfunction. Mol Cell Biol. 33, 904-917 (2013).
- Imai, T., Jiang, M., Chambon, P., Metzger, D. Impaired adipogenesis and lipolysis in the mouse upon selective ablation of the retinoid X receptor alpha mediated by a tamoxifen-inducible chimeric Cre recombinase (Cre-ERT2) in adipocytes. Proc Natl Acad Sci U S A. 98, 224-228 (2001).
- Clegg, D. J., Brown, L. M., Woods, S. C., Benoit, S. C. Gonadal hormones determine sensitivity to central leptin and insulin. Diabetes. 55, 978-987 (2006).
- Haluzik, M., et al. Genetic background (C57BL/6J versus FVB/N) strongly influences the severity of diabetes and insulin resistance in ob/ob mice. Endocrinology. 145, 3258-3264 (2004).
- Chomczynski, P., Sacchi, N. Single-step method of RNA isolation by acid guanidinium thiocyanate-phenol-chloroform extraction. Analytical biochemistry. 162, 156-159 (1987).
- Paraffin Processing of Tissue. Protocolsonline. , Available from: http://protocolsonline.com/histology/sample-preparation/paraffin-processing-of-tissue/ (2012).
- Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis. Nat Methods. 9, 671-675 (2012).
- Planat-Benard, V., et al. Plasticity of human adipose lineage cells toward endothelial cells: physiological and therapeutic perspectives. Circulation. 109, 656-663 (2004).
- Kusminski, C. M., et al. MitoNEET-driven alterations in adipocyte mitochondrial activity reveal a crucial adaptive process that preserves insulin sensitivity in obesity. Nat Med. 18, 1539-1549 (2012).
- Trajcevski, K. E., et al. Enhanced lipid oxidation and maintenance of muscle insulin sensitivity despite glucose intolerance in a diet-induced obesity mouse model. PLoS One. 8, 71747 (2013).
- Montgomery, M. K., et al. Mouse strain-dependent variation in obesity and glucose homeostasis in response to high-fat feeding. Diabetologia. 56, 1129-1139 (2013).
- de Queiroz, K. B., et al. Molecular mechanism driving retroperitoneal adipocyte hypertrophy and hyperplasia in response to a high-sugar diet. Mol Nutr Food Res. 58, 2331-2341 (2014).
- Ye, J. Emerging role of adipose tissue hypoxia in obesity and insulin resistance. Int J Obes (Lond). 33, 54-66 (2009).
- Xiong, Y., et al. The local corticotropin-releasing hormone receptor 2 signalling pathway partly mediates hypoxia-induced increases in lipolysis via the cAMP-protein kinase A signalling pathway in white adipose tissue. Mol Cell Endocrinol. 392, 106-114 (2014).
- Bozec, A., et al. Osteoclast size is controlled by Fra-2 through LIF/LIF-receptor signalling and hypoxia. Nature. 454, 221-225 (2008).
- Varia, M. A., et al. Pimonidazole: a novel hypoxia marker for complementary study of tumor hypoxia and cell proliferation in cervical carcinoma. Gynecol Oncol. 71, 270-277 (1998).
- Park, M. H., Choi, K. Y., Jung, Y., Min do, S. Phospholipase D1 protein coordinates dynamic assembly of HIF-1alpha-PHD-VHL to regulate HIF-1alpha stability. Oncotarget. 5, 11857-11872 (2014).
- Tennant, D. A., et al. Reactivating HIF prolyl hydroxylases under hypoxia results in metabolic catastrophe and cell death. Oncogene. 28, 4009-4021 (2009).
- Kim, J., So, D., Shin, H. W., Chun, Y. S., Park, J. W. HIF-1alpha Upregulation due to Depletion of the Free Ubiquitin Pool. Journal of Korean medical science. 30, 1388-1395 (2015).
- Amelio, I., et al. TAp73 opposes tumor angiogenesis by promoting hypoxia-inducible factor 1alpha degradation. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112, 226-231 (2015).
- Suga, H., et al. Adipose tissue remodeling under ischemia: death of adipocytes and activation of stem/progenitor cells. Plast Reconstr Surg. 126, 1911-1923 (2010).
- Moreno-Indias, I., Tinahones, F. J. Impaired adipose tissue expandability and lipogenic capacities as ones of the main causes of metabolic disorders. J Diabetes Res. 2015, 970375 (2015).
- Keuper, M., et al. An inflammatory micro-environment promotes human adipocyte apoptosis. Mol Cell Endocrinol. 339, 105-113 (2011).
- Sera, Y., et al. Hematopoietic stem cell origin of adipocytes. Experimental hematology. 37, 1108-1120 (2009).
- Zuk, P. A., et al. Multilineage cells from human adipose tissue: implications for cell-based therapies. Tissue engineering. 7, 211-228 (2001).
- Zuk, P. A., et al. Human adipose tissue is a source of multipotent stem cells. Molecular biology of the cell. 13, 4279-4295 (2002).
- Scherer, P. E. Adipose tissue: from lipid storage compartment to endocrine organ. Diabetes. 55, 1537-1545 (2006).
