This article describes a video imaging technique and high-resolution spatiotemporal mapping to identify changes in the neural regulation of colonic motility in adult mice. Subtle effects on gastrointestinal (GI) function can be detected using this approach in isolated tissue preparations to advance our understanding of GI disease.
Det enteriska nervsystemet (ENS) spelar en viktig roll i regleringen av gastrointestinala (GI) motilitet och kan fungera oberoende av det centrala nervsystemet. Förändringar i ENS funktion är en viktig orsak till GI-symtom och sjukdomar och kan bidra till GI-symtom rapporterats i neuropsykiatriska störningar, inklusive autism. Det är väl etablerat att isolerade kolon segment genererar spontana, rytmiska sammandragningar kallas Colonic Migrera Motor Anläggningar (CMMCs). Ett förfarande för att analysera enter neurala regleringen av CMMCs i ex vivo preparat av mus kolon beskrivs. Kolon dissekeras från djuret och spolas för att avlägsna fekalt innehåll innan de kanyl i ett organbad. Data förvärvas via en videokamera placerad ovanför organbadet och omvandlas till högupplösta Spatiotemporal kartor via en intern programpaketet. Med hjälp av denna teknik, baslinjen sammandragande mönster och farmakologiska effekter på ENS funktion i tjocktarmen segments kan jämföras över 3-4 h. Dessutom kan spelas in utbrednings längd och hastighet CMMCs samt förändringar i tarmen diameter och kontraktion frekvens. Denna teknik är användbar för att karakterisera gastrointestinala motilitet mönster i transgena musmodeller (och i andra arter, inklusive råtta och marsvin). På detta sätt, är farmakologiskt inducerade förändringar i CMMCs registreras i möss av vildtyp och i Neuroligin-3 R451C musmodell av autism. Dessutom kan denna teknik kunna användas till andra regioner i mag-tarmkanalen, inklusive duodenum, jejunum och ileum och under de olika utvecklingsåldrar i möss.
Det enteriska nervsystemet (ENS) är det inneboende neuronala nätverk av mag-tarmkanalen och modulerar olika funktioner såsom spjälkning av tarminnehållet, upptag av näringsämnen och den sekretion och reabsorption av fluid. Neuroner i ENS är belägna i myentericus och submukosala plexus. Den myenteric plexus spelar en viktig roll i regleringen av gastrointestinal motilitet en medan submukosala plexus är primärt involverad i kontrollen av utsöndringen 2,3. Plexus myentericus är belägen mellan de längsgående och cirkulära muskelskikten i mag-tarmväggen. Den kontraktila aktiviteten av de glatta muskelskikten i tarmväggen underlättar de primära funktionerna hos mag-tarmkanalen genom att blanda och snurrtarminnehåll utmed längden av tarmen 3. Även om den yttre nervtillförseln till mag-tarmkanalen från CNS bidrar till gastrointestinal funktion in vivoÄr ENS förmåga att reglera gastrointestinal funktion oberoende av varandra. Denna unika egenskap gör den funktionella undersökning av enter neuronala kretsar och deras bidrag till gastrointestinal motilitet ex vivo.
Kolon migrerande motorkomplex (CMMCs) är spontana, neurogena händelser som är den dominerande motor mönster som observerats i isolerade mus kolon i frånvaro av fekal pellets 4-9. CMMCs definieras som rytmiska sammandragningar som propagerar längs en horisontellt avstånd som är åtminstone hälften av den totala längden av tjocktarmen (dvs., från blindtarmen till ändtarmen) 10. Förhållandet mellan CMMCs och kontraktila mönster som driver fecal pellets ännu inte klart fastställas, men vissa farmakologiska skillnader har rapporterats 11. Ändå förmåga ENS att fungera oberoende av CNS och förekomsten av neurala-medierad motormönster i ISolated kolon är en idealisk analyssystem för att undersöka störningar i motilitet till följd av underliggande ENS dysfunktion. Spontanitet gastrointestinala motoriska mönster tillåter funktionella förändringar som svar på farmakologiska stimuli som ska utvärderas.
Användningen av video imaging och Spatiotemporal kartläggning utvecklades först för att kvantitativt undersöka små tarmperistaltik hos marsvin 12. Här är ett ex vivo beskrivna tekniken som gör det möjligt att studera mus kolon motilitet mönster med hjälp av video avbildning och analys av dessa inspelningar för att konstruera hög upplösning (~ 100 | im, 33 ms) kartor av kolon diameter som en funktion av läget längs kolon och tid (Spatiotemporal kartor). Använda egen programvara flankdetektering (Analyse2, tillgänglig på begäran), är data från full längd kolon segment upphandlande i realtid bearbetas för att generera Spatiotemporal kartor för varje experiment. I detta steg, video (AVI) filer summatecknat och omvandlas till Spatiotemporal kartor med Analyse2. Spatiotemporal kartor (Figur 2) visar kontraktilitet över tiden och möjliggör mätning av flera parametrar inklusive utbredningshastigheten, magnitud, längd och varaktighet. Gut diameter är också registreras under hela varaktigheten av experimentet som ett mått på den totala kontraktilitet av vävnaden segmentet. Denna metod kan användas för att identifiera skillnader i tidpunkten för initiering av kontraktila komplex som kan tyda på förändrad enter neurala anslutning.
En liknande video imaging protokoll som syftar till att bedöma pellets framdrivning hos marsvin har rapporterats 13 men här vi redogöra för tillämpningen av videoavbildningsteknik för kvantifiering av spontan motilitet i kolon (dvs i frånvaro av pellets). Vi tillhandahåller också detaljerad information för att hjälpa dissekering och beredning av mag-tarmvävnad för videoavbildningsteknik. Dettaprotokollet förser forskare med en lättillgänglig och lätt kopieras verktyg för att analysera enter neurala kontrollen av gastrointestinal funktion i djurmodeller av sjukdomen, inklusive genetiska musmodeller.
Videoavbildningsteknik möjliggör analysen av motilitet i kolon som svar på olika farmakologiska medel. Läkemedel kan administreras via tarmlumen eller organbadet utanför tarmrengöringen. Olika regioner av mus magtarmkanalen uppvisar specifika motilitet mönster såsom små tarmsegmentering och CMMCs i kolon.
Denna teknik har använts för att identifiera stamskillnader i små tarmfunktion; differentiell känslighet för 5-HT 3 och 5-HT4-antagonister observerades i jejunum hos Balb / c och C57 / BL6-möss på grund av den polymorfa naturen hos TPH2-genen uttrycks i de två stammarna 6. Effekten av 5-HT hämning på motilitet förblir conkontroversiellt, eftersom motstridiga uppgifter har rapporterats om vikten av endogena 5-HT på kolon peristaltiken och CMMCs 14,15. Förändringar i motilitet pre- och postnatalt under utveckling 7, och effekterna av genmutationer på gastrointestinal motilitet i djurmodeller av sjukdom 10 kan också undersökas genom att använda video avbildning. Här visar vi användning av metoden för en studie av kolonrörlighet i musmodellen NL3 R451C av autism, som uttrycker en missense-mutation i Nlgn3 gen som kodar synaptiska adhesionsproteinet Neuroligin-3 16. Denna mutation identifierades först hos patienter med diagnosen autism (ASD) 17, som är starkt förknippad med GI dysfunktion 18-22. Vi undersökte huruvida NL3 R451C synaptiska mutation påverkar neurala utgångar i ENS använder videoavbildningsteknik. Vi presentera data som kännetecknar CMMCs vid baslinjen och som svar på det serotonerga 5HT 3/4 receptorantagonist tropisetron i musmodell av autism NL3 R451C.
Med hjälp av den här videon bildteknik, var CMMC uppmätta frekvensen som en indikation på kolonrörlighet i vild typ och NL3 R451C möss, en musmodell av autism 17. Våra resultat tyder på en minskning av antalet CMMCs i mutanta NL3 R451C-möss jämfört med möss av vildtyp i närvaro av 5HT 3/4 receptorantagonisten Tropisetron antyder att NL3 R451C möss uppvisar en ökad känslighet för Tropisetron. Följaktligen föreslår vi att den neuroligin-3 R451C mut…
The authors have nothing to disclose.
JCB och ELH-Y stöddes av US Department of Defense CDMRP Autism Research Program (AR11034). NHMRC (1047674) till ELH-Y.The May Stewart stipendie-University of Melbourne förtroende finansierade stipendium till MS. Vi tackar Ali Taher, Fátima Ramalhosa och Gracia Seger för tekniska insatser.
Reagents | |||
NaCl (MW: 58.44) | Sigma-Aldrich | S7653-250G | |
KCl (MW: 74.55) | Sigma-Aldrich | P9333-500G | |
NaH2PO4.2H2O (MW: 156.01) | Chem Supply | 471-500G | |
MgSO4.7H20 (MW: 246.48) | Chem Supply | MA048 | |
CaCl2.2H2O (MW: 147.02) | Chem Supply | CA033 | |
D-Glucose anhydrous (MW: 180.16) | Chem Supply | GA018-500G | |
NaHCO3 (MW: 84.01) | Chem Supply | GA018-500G | |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Materials | |||
Two chambered organ bath Dimentions: 14 cm x 8 cm x 3 cm |
Custom Made | Contact Laboratory Directly | |
732 MULTI -PURPOSE SEALANT CLEAR | Dow Corning Australia Pty Ltd | 1890573 | |
SYLGARD 184 SILICONE ELASTOMER KIT | Dow Corning Australia Pty Ltd | 1064291 | |
STOPCOCK 3 WAY FEM-ML L/LOCK S | Terumo Medical Corporation | 0912-2006 | |
SYRINGES with Luer Lock Tips 50mL, 20 mL, 10 mL | Terumo Medical Corporation | N/A | |
1.57 mm (ID) x 3.16 mm (OD) – Silastic Tubing | Masterflex | 508-008 | |
1.02 mm (ID) x 2.16 mm (OD) – Silastic Tubing | Masterflex | 508-005 | |
1.50 mm (ID) x 2.50 mm (OD) – Silastic Tubing | Masterflex | 508-007 | |
1.60 mm (ID) – Platinum cured silicone tubing | Masterflex | 96410 – 14 | |
4.40 mm (ID) – Platinum cured silicone tubing | Masterflex | 96410 – 15 | |
3.10 mm (ID) – Platinum cured silicone tubing | Masterflex | 96410 -16 | |
Graduated Laboratory Glass Bottles – 500 ml | Thermofisher Scientific | 100-400 | |
CHEMICAL RUBBER STOPPER 57 x 65mm | |||
CHEMICAL RUBBER STOPPER 29 x 32mm | |||
Water heater (thermo regulator) | Ratek | TH7000 | |
Logitech Webcam | Logitech | ||
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Software | |||
Virtual Dub – 1.9 11 | virtualdub.org | ||
MATLAB R2012a | Graph Pad | ||
Logitech Webcam Software | Logitech |