Abstract
Enterik sinir sistemi (ENS) mide-bağırsak (Gl) motilite düzenlenmesinde önemli bir rol oynar ve birbirinden bağımsız olarak, merkezi sinir sisteminin işlev görebilir. ENS fonksiyonundaki değişiklikler GI semptomları ve hastalığın başlıca nedenidir ve otizm dahil nöropsikiyatrik bozukluklarda bildirilen GI belirtileri katkıda bulunabilir. Iyi izole kolon segmentleri Kolon Geçiş Motor Külliyesi (CMMCs) olarak bilinen spontan, ritmik kasılmaları oluşturmak olduğunun tespit edilmesi. Bir prosedür, fare kolon in vivo preparasyonlar tarif edilmektedir Ex CMMCs enterik nöral düzenleme analiz etmek. Kolon hayvan disseke ve önce organ banyosuna kanül olmanın dışkı içeriği kaldırmak için temizlendi. Veri organ banyosuna üzerine yerleştirilmiş bir video kamera aracılığı ile edinilen ve bir in-house yazılım paketi ile yüksek çözünürlüklü Spatiotemporal haritalar dönüştürülür. Bu tekniği, temel kasılma desen ve kolon s ENS fonksiyonu üzerinde farmakolojik etkilere kullanmaegmentler 3-4 saat boyunca karşılaştırılabilir. Buna ek olarak, CMMCs yayılma süresi ve hız bağırsak çapı ve kasılma sıklığındaki değişiklikler gibi kaydedilebilir. Bu teknik, transgenik fare modellerinde (ve sıçan ve gine domuzu gibi diğer türlerde), mide bağırsak hareket kabiliyeti desenleri karakterize etmek için yararlıdır. Bu şekilde, farmakolojik olarak CMMCs uyarılan değişiklikler, vahşi tipli fare ve otizm neuroligin-3 R451C fare modelinde kaydedilir. Ayrıca, bu tekniğin duodenum, jejunum ve ileum içeren ve farelerde farklı gelişim yaşlarda GI sisteminin diğer bölgelerine tatbik edilebilir.
Introduction
Enterik sinir sistemi (ENS) mide-bağırsak sisteminin iç nöronal ağ ve bağırsak içeriğinin sindirim, besin emilmesi ve salgılama ve akışkan geri emmek gibi çeşitli fonksiyonları modüle eder. ENS nöronları myenterik ve submukozal pleksuslar yer almaktadır. Miyenteron pleksusu submukozal pleksus ise mide-bağırsak motilitesini 1 düzenlenmesinde önemli bir rol oynar salgılama 2,3 kontrolünde ilgilenmektedir. miyenteron pleksusu mide duvarında uzunlamasına ve dairesel kas tabakaları arasında yer almaktadır. Intestinal çeperin yumuşak kas tabakaları kasılma aktivitesi karıştırma ve bağırsak 3 uzunluğu boyunca bağırsak içeriği itilmesi ile mide-bağırsak sisteminin birincil işlevleri kolaylaştırmaktadır. CNS gelen sindirim yollarında dışsal sinir besleme in vivo gastrointestinal fonksiyon katkıda rağmen, ENS, bağımsız bir gastrointestinal fonksiyon düzenleme yeteneğine sahiptir. Bu eşsiz özellik fonksiyonel enterik nöronal devrelerin soruşturma ve ex vivo gastrointestinal motilite katkılarını sağlar.
Kolon göç motorlu kompleksleri (CMMCs) fekal pelet 4-9 yokluğunda izole fare kolon gözlenen baskın motorlu model olan spontane, nörojenik olaylardır. CMMCs 10 (rektum çekum örneğin,) en azından iki nokta üst üste yarısı toplam uzunluğu olan yatay mesafe boyunca ilerler ritmik kasılmalar olarak tanımlanır. CMMCs ve fekal pelet itmek kasılma desen arasındaki ilişki henüz açıkça kurulacak olan ancak bazı farmakolojik farklılıklar 11 bildirilmiştir. Bununla birlikte, MSS bağımsız çalışması için ENS yeteneği ve DİR nöral aracılı motorlu desen varlığıolated kolon altında yatan ENS disfonksiyonu kaynaklanan motilite bozuklukları incelemek için ideal bir tahlil sistemi sağlar. gastrointestinal motor desen kendiliğinden farmakolojik uyarıcıya tepki olarak fonksiyonel değişiklikler değerlendirilmesine olanak tanır.
Video görüntüleme ve uzaysal haritalama kullanımı ilk nicel kobay 12 ince bağırsak peristalsis incelemek için geliştirilmiştir. Burada, bir ex vivo tekniği yüksek çözünürlüklü oluşturmak için video görüntü ve bu kayıtların analizi kullanılarak, fare kolon hareket kabiliyeti desen çalışma sağlayan açıklanan (~ 100 um, 33 msn) kolon boyunca pozisyonun bir fonksiyonu olarak kolon çapı harita ve zaman (Spatiotemporal haritalar) evi. in-house kenar algılama yazılımını kullanarak (Analyse2; istek üzerine), gerçek zamanlı olarak daralan tam uzunlukta kolon segmentlere veriler, her bir deney için zamanmekansal haritaları oluşturmak için işlenir. Bu adımda, video (AVI) dosyaları toplamı olanyetkilendirilmiş ve Analyse2 kullanarak Spatiotemporal haritalara dönüştürülür. Zamanmekansal haritalar (Şekil 2) zamanla kasılma tasvir ve yayılma hızı, büyüklüğü, uzunluğu ve süresi de dahil olmak üzere çok sayıda parametrelerinin ölçümünü sağlar. Gut çapı doku bölümünün genel kasılma bir ölçüsü olarak deney süresi boyunca kaydedilmektedir. Bu yöntem, değiştirilmiş enterik nöral bağlantı gösterebilir kontraktil komplekslerinin başlatma alanına farklılıkları belirlemek için uygulanabilir.
Kobaylarda pelet tahrik değerlendirmek için tasarlanmış benzer bir video görüntüleme protokolü, ancak burada (pelet yokluğunda, örneğin), spontan bağırsak motilitesi ölçümü için bir video görüntüleme yaklaşımı uygulanmasını hatlarıyla 13 bildirilmiştir. Biz de, video görüntüleme yaklaşım diseksiyon ve gastrointestinal doku hazırlanmasında yardımcı olmak için ayrıntılı bilgi sağlar. Buprotokol genetik fare modelleri dahil olmak üzere hastalığın hayvan modellerinde gastrointestinal fonksiyon enterik sinir kontrolünü analiz etmek için erişilebilir ve kolayca çoğaltılır aracı ile araştırmacılar sağlar.
Video görüntüleme tekniği, çeşitli farmakolojik maddeler yanıt olarak bağırsak motilitesi analiz edilmesini sağlar. İlaçlar kolon hazırlanması dış bağırsak lümeni veya organ banyosu ile uygulanabilir. Fare gastrointestinal sistemin farklı bölgeleri gibi kolonda ince bağırsak segmentasyon ve CMMCs gibi belirli hareketlilik sergilerler.
Bu teknik, küçük bağırsak fonksiyonlarında zorlanma farklılıkları tanımlamak için kullanılır olmuştur; 5-HT3 ve 5-HT4 antagonistlerinin diferansiyel duyarlılığı nedeniyle iki suş 6 olarak ifade TPH2 genin polimorfık doğası, Balb / c ve C57 / BL6 farelerinde jejunumunda gözlenmiştir. motilitesi üzerine 5-HT inhibisyonu etkisi con kalırtartışmalıdır, çelişkili veriler kolon Peristaltizmin ve CMMCs 14,15 üzerinde endojen 5-HT önemine bildirilmiştir olarak. Motilite öncesi ve doğum sonrası gelişim 7 sırasında değişiklikler ve hastalığın 10 hayvan modellerinde gastrointestinal motilite üzerindeki gen mutasyonlarının etkileri aynı zamanda video görüntüleme kullanılarak incelenebilir. Burada sinaptik yapışma proteini neuroligin-3 16 kodlayan Nlgn3 geninde yanlış anlamlı bir mutasyon ifade otizm NL3 R451C fare modelinde, kolonik motilite bir çalışma yönteminin kullanımını göstermektedir. Bu mutasyon, ilk güçlü GI disfonksiyonu 18-22 ile ilişkili Otizm spektrum bozukluğu (ASD) 17, tanısı konan hastalarda tespit edilmiştir. Biz NL3 R451C sinaptik mutasyon, video görüntüleme tekniği kullanılarak ENS nöral çıkışları etkileyip etkilemediğini araştırdık. Biz başlangıçta ve serotonerjik 5H yanıt olarak CMMCs karakterize verileri sunmakT 3/4 reseptör antagonisti tropisetron otizm NL3 R451C fare modelinde.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Hayvan taşıma ve hayvanların servikal dislokasyon tüm deneylerde önce idi kesinlikle Melbourne Üniversitesi Hayvan Deneyleri Komitesi tarafından onaylanan protokollere göre gerçekleştirilmiştir (Etik ID: 1212494,7)
1. Doku Toplama ve Diseksiyon
- servikal dislokasyon ile yetişkin fareler Euthanize. Mümkünse ilgi nöronal nüfus üzerinde bulunan reseptörleri yoluyla barsak fonksiyonları üzerine etkileri önlemek için anestezi kaçının.
- vücudu pin, hayvanın toplam vücut ağırlığını kaydetmek derialtı iğneler (Boyut: 20 G) kullanarak sıkıca diseksiyon kurulu (dört pençeleri yoluyla, ventral tarafı deneyci maruz).
- diseksiyon forseps ve makas kullanılarak; alt karın kas katmanları kaplanacağı epidermis üzerinden bir kesi yapmak. sternum karın orta hat boyunca karın boşluğuna açmak için forseps ve makas kullanmaya devam edin.
- Doku dehidrasyon önlemek için, fiziksel erişiminiz dökmekological tuzlu su (Krebs çözeltisi: 118 NaCl, CaCl2, 1.2 MgSO 4, 1 NaH 2 PO 4, 25 NaHCO 3 4.6 KCI, 2.5, 11 D-glukoz mM - carbogen gaz oda sıcaklığında kabarmış,% 95 O 2 ve 5 diseksiyon işlemi sırasında düzenli aralıklarla (yani, her 30-60 sn) karın içerikleri üzerine 20 dakika en az) için% CO 2.
- çekum ve rektum bağlıyken kolon izole etmek, ince diseksiyon makas kullanılarak mezenter kırparak hafifçe yaklaşık 4-5 cm hayvanın vücut üzerinde diseksiyon forseps kullanarak (kolon yakın ucuna bitişik bulunan) çekum tutun.
- Işlemek vermemeye özen germek veya bitişik mezenter çıkarırken gastrointestinal doku kesti.
- Aşırı doku (yani, mesane ve testis) sökün. Kaba kesme makas kullanarak, iki dikey kesi (yani, orta hattan yaklaşık 0,5 cm) adet üzerinde pelvik kemik kesmek için yapmakkolonun ch tarafı.
- Pelvik doku bitişiğindeki rektum ayırmak ve kolondan kas çevreleyen trim ince makas kullanın.
- (Daha önce karbojen oksijenli), fizyolojik tuzlu su ihtiva eden bir beher içerisine (rektum çekum) tam uzunlukta bir kolon yerleştirin ve oda sıcaklığında oksijen devam etmektedir. ince diseksiyon makas kullanılarak caecum ve rektum çıkarın ve beher değiştirin.
- Boş dışkı peletler / fizyolojik tuzlu su ile dolu bir 200 ul pipet bağlı bir 5 ml şırıngaya kullanılarak ağız ucunda hafif pozitif basınç uygulayarak kolon preparasyonlar bağırsak içeriği. Gelecekte doku yönlendirmek amacıyla, mukoza çizgiler görebilir kolon, en yakın ucu işaretlemek için bir böcek iğne kullanın.
- Bir jilet kullanarak geniş / proksimal sonundan itibaren yaklaşık 1 cm kaldırarak 5 ml şırınga sığdırmak için plastik pipet değiştirin. Bir ang üzerinde keserek uzak / küçük ucunu genişletmek, akış hızını arttırmak içinBir jilet kullanarak le (yaklaşık 45 ° C).
- Tutma yeri yavaşça kesme forseps ile proksimal ucunda kolon dokusu, lümen boyunca kolon ve yıkama serum fizyolojik lümeni içine pipet yerleştirin.
Video Görüntüleme Kolon Doku ve Deney Seti Up 2. Hazırlık
- 200 ul pipet bağlanmış bir şırınga kullanarak, ayarlanmış bir, iki bölmeli bir organ banyosu (Şekil 1 ve Şekil 3) bağlı tüm boru ile yıkayın fizyolojik tuz. Bu adım çözeltisinin akışını engelleyebilir tüp içinde herhangi bir enkaz kaldırır. borular için teknik malzemeler tabloya bakınız.
- (5 mi dak-1 akış oranı,% 95 O2 ve% 5 CO2) organ banyosu odaları sürekli karbojen fokurdatıldı fizyolojik tuzlu su ile süperfuz emin olun. Düzenli aralıklarla, bir sıcaklık probu kullanılarak, temperat sağlamakbanyosunun ure 33 ° C -37 ° C arasında muhafaza edilir.
- Yaklaşık 20-30 ml fizyolojik tuzlu su 50 ml'lik bir şırınga kullanarak giriş borusunun bir 3-yollu bir kapama supabı yoluyla bağlı olan giriş doldurun.
- Deneme sırasında, kendi merkezi aracılığıyla yerleştirilen bir cam tüpe (iç çapı 5 mm) ile stoper arubber kullanarak giriş rezervuar basıncı korumak. giriş rezervuarın üst açılış güvenli (iç cam tüp mühürsüz kalan) ile kapatılmış olduğundan emin olun.
- tamamen fizyolojik tuzlu su içinde batık emin olarak, organ banyosu odasına kolon (uzunluk 5-7 cm) yerleştirin.
- iki batık giriş / çıkış tüplerine kolon segmentinin her iki ucunu cannulate (giriş / değişik çap çıkış tüpleri doku lümeni örneğin büyüklüğüne göre değiştirilebilir. Doğum sonrası doku, yetişkin fareler ve kobay) banyo kullanarak standart pamuk dikiş ipliği. giriş tüpü ve kolon proksimal ucunu takınçıkış tüpüne kolon uzak ucu (dikey çıkış borusu bir 3-yollu bir kapama supabı yoluyla bağlanmış, yüksekliği 6 cm). Doku kanülasyon gelecek ölçümler ve analizler ile bir girişimi engellemek için sonra değil overstretched ya da çok rahat olduğundan emin olun.
- proksimal ve 15 cm cetvel kullanarak uzak kanüllerinin arasındaki mesafeyi ölçerek kolonun uzunluğunu kaydedin. Bu kasılma uzunluğu, yayılma hızı ve kasılma başlatma noktalarında değişiklikleri yorumlamak için önemlidir.
- Deney başlamadan önce kurulmuş istikrarlı bir temel luminal basıncı (cm H2O) emin olun. (Sözlü) girişi rezervuar ve dikey çıkış borusu (anal) cam tüp içinde serum fizyolojik menisküsüne dokudan dikey mesafeyi ölçerek luminal basıncı hesaplayın.
- Sabit intraluminal basınç doku hazırlıklarını koruyun (örneğin, 1-2 cm H2O) sağlayarak bu girişi stoper mühür pressusabit tutulur yeniden ve hiçbir tıkanıklıkları set up mevcut olduğunu.
- Bağırsak hareketlerinin kaydı 30 dakika önce fizyolojik tuzlu su içinde denge sağlaması için kolon bırakın. içi veya çıkış tüplerindeki kaynaklanan herhangi tıkanıklıkları kontrol edin ve giriş rezervuar aracılığıyla baskı uygulayarak ya da kolon oral ve anal uçları yeniden kanüle bunları kaldırın.
3. Resim yakalama ve Deneysel Protokol
- Bir video kamera kullanarak video dosyaları gibi rekor bağırsak hareketleri (30 kare / sn, 640 x 840 piksel), standart bir laboratuvar imbik organ banyosu üzerinde 10-15 cm (Şekil 1) standı konumlandırılmış.
- Masaüstünde simgeden Sanal Dub (video yakalama yazılımı) açın. 'Dosya' sekmesinden, kamera görüntüsünü görüntülemek için 'yakalama AVI' seçeneğini seçin. 'Ses' sekmesi deselect sesi devre dışı bırakmak için 'ses yakalama etkinleştirin.'
- Video sekmesinde 'sıkıştırma' ve 'DivX6.9.2 seçin. Codec & #39; depolama alanı kullanımını en aza indirmek için video dosyalarını sıkıştırmak için. Bu işlev, sıkıştırma yazılımı 'DivX' kurulumu sırasında kullanılabilir hale gelecektir.
- Tüm kanüle kolon segmenti video yakalama yazılımı penceresi üzerinden (video karesinin dikey kenarlarına hemen bitişiğinde kanül bölgeler ile) görülebilecek şekilde elle kamera konumunu ayarlamak (Şekil 1). Görüntü kalitesini artırmak ve yansımaları en aza indirmek amacıyla, organ banyosuna üzerine yabancı ışığı engellemek için kamera desteği kağıt / karton kalkanı takın. kamera yazılımı arabirimini kullanarak parlaklık, kontrast ve pozlama ayarlarını ayarlayarak video kalitesini optimize edin.
- Kayıttan önce, belirli bir dosya adını ayarlayın; 'Dosya' sekmesinde, 'Set yakalama dosyasını' seçin ve video için benzersiz bir ad belirtin.
- 'Yakalama' araç çubuğundan 'Yakalama dosya' tuşuna basarak video yakalama başlayın. recordin durdurmak içing 'yakalama durdurun' düğmesini veya klavyedeki 'Esc' tuşuna basın.
- taze serum fizyolojik her 30 dk ile giriş rezervuar içinde bulunan serum fizyolojik değiştirin.
- Kayıt luminal basıncı (2.9) ve bir ısı probu kullanılarak, organ banyosu sıcaklığı not edin. Bu değişkenler sabit olduğundan emin olmak için deney (yani, her 30 dk) boyunca bu adımları yineleyin.
- (Ilaç uygulaması ve yıkama süresi dahil) 3 saat boyunca toplamda rekor kolon etkinliği. veri depolama amaçlı, 15 dk video bölümleri rekor verilerde. Tam bir deney genellikle 12 x 15 dk video kayıtları oluşacaktır.
- Kontrol koşulları altında 1 saat (fizyolojik tuzlu su) için telaffuz aktivitesi.
- 1 saat 30 dakika boyunca ilaç (her iki girişi rezervuar yoluyla banyosuna superfused veya lümeni içine verilen) uygulanır.
Not: uygulama farklı yolları olabilir yfarklı etkileri 23 ield. - 1 saatlik yıkama süresince banyo veya lümene taze serum fizyolojik uygulayın.
Spatiotemporal Maps 4. Veri İşleme ve Üretimi
- Süreç MATLAB yazılı içi yazılımını kullanarak her video kayıt çevrimdışı, sırayla (R2012a, Sürüm 7.4 istek üzerine) kolon motilitesini gösteren uzaysal haritaları oluşturmak için.
- Masaüstünde simgeden Açık analiz yazılımı.
- Komut penceresinde, analiz, kontrol panelini açmak için "Analyse2" girin.
- Kontrol paneli penceresinde "avi dosyaları için Kenar algılama" linkine tıklayarak zamanmekansal haritaları oluşturmak için kenar algılama fonksiyonu yararlanın. Bu işlev, Audio Video Interleaved (AVI) formatında Recoded videoları okumak için analiz yazılımı sağlayacaktır.
- Bir ada kullanarak Spatiotemporal haritaları oluşturmak için sırayla aşağıdaki adımları uygulayınptive kenar algılama algoritması.
- "Dosya ekle" sekmesini seçerek açın kaydedilen video dosyaları, 'Açık' video seçin ve video dosyalarının konumunu seçin.
- analiz yazılımı içinde listelenen video dosyalarından, ilgi dosyayı seçin.
- Kolon Anal kanülasyon oral kanüle noktadan, video, örneğin, kolonun tüm uzunluğu çerçevesinde ilgi konusu bir dikdörtgen bölge seçin. proksimal ve distal kanülasyon noktaları ilgi bölgenin dikey sınırları bitişik olduğundan emin olun. Kenar algılama hattı (kırmızı ve yeşil) otomatik olarak gerçek zamanlı görüntü üzerine bindirilmiş görünür.
- kenar algılama eşiği hatları kolon dokusunun üst ve alt sınırları hem de kolon (bu kontrol panelindeki algılama eşik değerlerini değiştirerek, her video için optimize edilebilir) hemen bitişiğinde olduğundan emin olun. Emin olun kenar algılama l oines kontrast ayarı ve parlaklık kontrol panelini kullanarak kolon görüntüsünün uzunluğu boyunca süreklidir.
- genişliği iletişim kutusuna kolon (mm) tam uzunlukta (adım 2.7 kaydedilen gibi) girin. Ardından "ısı haritası oluşturun" seçeneğini seçin.
- dosyasının kaydedileceği için açılır penceresinde, bir yer seçin ve uzaysal harita için bir dosya adı belirtin.
- '.su2' Biçimini seçin ve 'Sıraya ekle'.
Not: .su2 biçimi daha küçük dosya boyutu ve çoklu video dosyalarını kuyruğuna eklenebilir verilerini sıkıştırır. - Spatiotemporal haritaları oluşturmak için 'algılama başlayın' seçin.
Spatiotemporal Haritalar 5. Analiz
- frekans, yayılma hızı, uzunluğu ve CMMCs süresi, bağırsak çapı ve başlatılmasında ve kasılmaları yön noktası olarak parametrelerini tahmin etmek uzaysal haritalar yararlanın.
- uzaysal analiz başlamak içinharitalar, komut penceresinde yazın 'analyse2' önceki bölümde açıklandığı gibi. Bunun yerine "Kenar tespiti" nin, "Isı haritası analizi" düğmesini seçin.
- 'Ekle dosyaları' sekmesini seçip, daha önce .su2 elde edilen dosyaların konumunu belirterek Açık uzaysal harita dosyaları (.su2 dosyaları).
- zamanmekansal harita ekranında görünür sonra, en az 1 olarak ayarlanırsa sağlanması, kontrol panelinde bir renk aralığını belirlemek.
Maksimum doku kontraktilite göre 5-10 arasında olabilir unutmayın. - aynı koşullar altında analiz edilir tek bir deney tüm haritaları sağlamak için 'Kilit renk yelpazesi' seçeneğini seçin.
- zaman çerçevesi ayarları, belirli bir deneyde tüm uzaysal haritalar için sabit olduğundan emin olun.
- CMMC sıklığını belirlemek için, el kolon uzunluğunun% 50'den fazla hareket kasılmaları sayısı. Bu kasılmalar visua olabilirzamanmekansal harita üzerinde kırmızı / turuncu çizgiler (standart HSV renk indeksi) olarak lized (bir örnek için bakınız Şekil 2). kısa ya da yaymak değil Diğer kasılmalar da tespit edilip ölçülebilir.
- İstenirse, bu haritalardan daha yüksek çözünürlükte daha fazla analiz yapmak. Örneğin, hız ve her kasılma süresi de dahil olmak üzere ayrıntılı özellikleri incelenebilir.
- hız ve süresini ölçmek için, ısı haritası analizi kontrol panelindeki "kasılma dalgaları Annotate" düğmesini seçin.
- Sonra, "Zoom" butonuna tıklayarak ve ilgi alanı seçerek her CMMC yakınlaştırmak. Sonra her kasılma sonuna kadar en başlangıç konumundan bir çizgi çizmek için fareyi kullanarak her daralma açıklama "Elle açıklama" düğmesini seçin. Bu yöntem, yaymak için görünen dilatasyon belirgin yayılma hızını ve süresini ölçmek için kullanılabilir (örneğin, bir bakınızŞekil 2A, 2B) haritaların el sonu.
Not: hız ve süresi için veri sonuçları pencerenin altında görünecektir. Bu değerler "İhracat verileri" sekmesini seçerek ilgi e-tabloya transfer edilebilir. İstenmeyen açıklamalar "Seçilen açıklamaları Kaldır" düğmesine tıklayarak kaldırılabilir.
- İstenirse, küçük kasılmalar veya CMMCs başlama konumunu belirlemek için x ve uzaysal haritaların y koordinatlarını (kolon boyunca zaman ve konum, sırasıyla) kullanmaktadır.
- Benzer şekilde, kasılmalar arasında aralıklarını belirlemek amacıyla, kasılmalar arasında süresini ölçmek için "Annotate" işlevini kullanın. Daha önce olduğu gibi, bu sonuçlar "İhracat verileri" sekmesini seçerek bir elektronik tablo ihraç edilebilir.
- dinlenme bağırsak genişliğini ölçmek için, ısı haritası analizi panelde "kesiti al" düğmesini seçin.
- Seç 'Ekle9; Temporal kesitler panelde. haritası içinde herhangi bir yerde çift tıklama ısı harita üzerinde üst üste yatay bir çizgi oluşturmak için. Gut çapı verileri artık yeni bir pencerede görüntülenir.
- bağırsak çapını ölçmek için, belirli bir deneysel durum için ortalama bağırsak genişliğini elde etmek için bir zirve ve bitişik oluk üzerine imleci. bağırsak çapında değişiklik deneysel koşullar arasında karşılaştırılabilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
ASD hastalarının% 90'a varan ishal ve kabızlık 18,24,25 gibi gastrointestinal bozukluklar, bir dizi deneyim. Ancak, bu gastrointestinal sorunlar altında yatan nedenleri bilinmemektedir. ASD hastalarda tespit pek çok mutasyon, sinaptik proteinlerin sinaptik iletimi veya fonksiyon bozuklukların ve rahatsızlıkların katkı ile ilişkilidir. Bu tür bir mutasyon, hücre yapışma molekülü neuroligin-3 (NL3 R451C) gen kodlamasında, ASD 17, iki kardeş tespit edilmiştir. Neuroligin proteininin konumunu 451 bir arginin kalıntısında Bu mutasyon sonucu bir sisteine sahip değiştirilmektedir. Bu mutasyon göstermek ifade NL3 R451C farenin hipokampus 25,27 içinde artış AMPA ve NMDA reseptörü aracılığıyla olan etkinliği ile birlikte somatosensori korteks 16,26 GABA aracılı iletim artmıştır.
28-30 mevcuttur. enterik sinir sistemi, gastrointestinal fonksiyonlarının düzenlenmesinde önemli bir rol oynar gibi, biz R451C mutasyonu hareketliliğini etkileyeceğini öne sürdü. Dolayısıyla, sinaptik anormallikler gastrointestinal fonksiyonların olası değişiklikleri araştırmak amacıyla bu farelerde CMMC frekansta R451C mutasyonunun etkilerini incelemek için çalıştı.
Serotonin (5-HT), farelerde 6 gastrointestinal fonksiyonunu modüle ENS ilgili hareket ettikleri için VT ve NL3 R451C farelerden kolon preparasyonlarda, 5-HT reseptör antagonisti 3/4 tropisetron yanıt olarak motilite desenleri analiz edilmiştir.
Enterik sinir sistemi farmakolojik, 5HT 3/4 reseptör antagonisti tedirgin olduğunda sinaptik mutasyon CMMCs değiştirir olup olmadığını değerlendirmek için Tropisetron (Trop;Blok 5HT3 ve 5HT 4 reseptörleri hem de) kolon preparatları (Şekil 2) ihtiva eden banyoya ilave edildi, 10 uM. Ondokuz yaş eşleştirilmiş erkek farelerde (11 WT ve 8 NL3 R451C) kolonik doku kullanıldı. Tropisetron varlığında NL3 R451C farenin WT littermates göre CMMC frekansı bir azalma olduğunu gösterdi. VT ve NL3 R451C kolon preparatlarda CMMCs ve kasılma aktivitesi gösteren uzaysal haritaları temsili örnekleri, sırasıyla Şekiller 2A-2E'de gösterilmektedir. Fark kontrol koşullarında WT ve NL3 R451C arasında fark olsa da, tropisetron anlamlı olarak VT ve NL3 R451C farelerde (Şekil 2C, 2F) CMMC sıklığının azalması. WT farelerinde, CMMCs ortanca tropisetron, 15 (p = 0.023) göre kontrol koşullarında 23 idi. NL3 farelerde, kontrol koşullarında CMMCs orta değer sayısı 19.5 olantropisetron mevcudiyetinde (p = 0.022) içinde 2 ile karşılaştırıldığında. Buna ek olarak, tropisetron WT (p = 0.047) göre NL3 R451C farelerde CMMCs sıklığı daha büyük bir etkiye sahipti.
Şekil 1. Organ banyosu kurmak ve uzaysal haritaların üretimi. (A) taze disseke gastrointestinal segmenti bir organ banyosuna (kesit görünümü) serum fizyolojik içeren yerleştirilir ve oral ve anal uçlarında kanüle edilir. Oral kanül fizyolojik tuzlu su ve çıkış borusuna bağlı Anal kanül ile dolu bir akış haznesine bağlanır. Bir video kamera kolon kasılma aktivitesini kaydetmek için organ banyosuna üzerinde konumlandırılmıştır. (B) motilite mavi ve dar bölgelerde dilate olan kolonun yüksek çözünürlüklü uzaysal harita etiketleme bölgelere dönüştürülür in kırmızı. (C) bir yetişkin WT fare kolon motilitesini (CMMCs) gösteren bir uzaysal haritası. Bireysel CMMCs haritanın içinde kırmızı dikey bölgeler olarak belirtilmiştir. X ekseni süresini arttırmak (0-15 dk) gösterir. Y ekseni (baz üstündeki sözlü olarak anal) mekansal kolon segmenti boyunca konumunu temsil eder. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Şekil 2. uzaysal harita NL3 R451C fare kolonda TROPİSETRON karşı artan bir duyarlılık göstermektedir uzaysal harita WT kontrol (A) kolon bölümlerine ve Tropisetron mevcudiyetinde CMMC sıklığını gösteren. (Trop, B). Trop WT kolon (C) CMMC frekansı azalır. Spatiote NL3 kolondan mporal harita Kontrol koşulları (D) altında Trop (E) varlığında gerçekleştirilir. Trop NL3 kolon (F) CMMC frekans güçlü bir azalmaya neden olmuştur. Trop yanıt CMMC frekans anlamlı WT kolon ile karşılaştırıldığında NL3 azaldı (p = 0.047, gösterilmemiştir). Gut genişliği (piksel renk) Y ekseninde (keyfi birimleri, aralık 1-6) gösterilir. E Ölçek çubuğu tüm haritalar için de geçerlidir. trop; Tropisetron. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Organ banyosuna Şekil 3. Şematik. (A) Üstten görünüm, (B) alt tarafı kurmak iki odacıklı bir organ banyosuna (C) Önden görünüm, (D) Yandan görünüm. Ölçüler mm.ref = "https://www.jove.com/files/ftp_upload/53828/53828fig3large.jpg" target = "_ blank"> bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Bu video görüntüleme tekniği kullanarak, CMMC frekansı vahşi tip kolonik motilite endikasyona ve NL3 R451C fareler, otizm spektrum bozukluğu 17 olan bir fare modeli olarak ölçülmüştür. Sonuçlarımız NL3 R451C farenin TROPİSETRON artan bir duyarlılık sergiler öne 5HT 3/4 reseptör antagonisti Tropisetron varlığında yabani tip farelere kıyasla mutant NL3 R451C farelerde CMMCs sayısında bir azalma göstermektedir. Bu doğrultuda, neuroligin-3 R451C mutasyonu potansiyel enterik nöronların, mukoza ya da her ikisi de 5HT 3 veya 5HT 4 reseptör fonksiyonunu ya modüle ederek, serotonin yolunu değiştirir öneriyoruz. Bu genotipler arasında ve sonraki çalışmalar için özel hedeflerin belirlenmesi için fenotipik farklılıkların belirlenmesi için yöntemin değerini vurgulamaktadır.
Bu yöntem ile video alarak uzaysal çözünürlüğü artırmak için değiştirilebilirbir kamera ile donatılmış bir stereo-mikroskop monte edin. Bu yaklaşım, kayıtları gibi erken E12.5 31 embriyonik zaman noktalarında gastrointestinal küçük preparasyonlar yapılabilir sağlar. Nöromodülatör lümen üzerinden veya bağırsak hazırlanması dış organ banyosunda uygulanabilir. Ayrıca, bu yöntem, fare, sıçan ve Hint domuzu tür açısından bir dizi büyük ve küçük mide-bağırsak motilitesini değerlendirmek için yararlıdır.
Bu yöntem için ortak sorun giderme adımları tüp yoluyla çözümün akışını, doku hazırlık canlılığı, sabit lümen basıncı bakım doğrulanması ve segmentleri uzak organ banyosuna duvarlarından yer aldığını kolon sağlanması yer alıyor. Hortumun içinde tıkanma lümen basıncını değiştirebilir ve meydana gelen kasılmaları önleyebilir; Bu nedenle tüm tüpler kanülasyon önce tuz kristalleri ya da enkaz / dışkı çıkarmak için iyice temizlenmesi gerekir. Hava tüpü hatları çıkarılması gerekir doğrudan deneyler (yani tuzlu su ile tüplerin astar) tarafından önce kanül ile ilişkili. Buna ek olarak, doku preparatları kolonun hareketsizlik sonucu zarar görmesini önlemek için dikkatli bir şekilde ele alınmalıdır. Doku hasarı önlemek için, kolon sıkıca (ama sıkı değil) kayıt işlemi sırasında kanül takılı olduğundan emin ve sabit sıcaklık ve banyo CO 2 + O 2 sürekli bir kaynağı sağlamak. Ayrıca luminal basıncı sabit tutulmasını sağlamak ve hiçbir kasılmalar manuel kayıt döneminde girişi rezervuarları ayarlayarak tarafından başlatılan söyledi. Bu, ilgili uzaysal haritaların kenar algılama analizini önleyecek şekilde kolon doku kasılmalar sırasında organ banyosunun duvara temas etmemesine dikkat ediniz. Bu dengeleme süresi sırasında kasılmaları izleme ve deney sırasında meydana gelmesini önlemek için kolon konumunu ayarlayarak önlenebilir.
_content "> analiz etmek ve bu yaklaşımın düşük verimlilik yapısı dahil olmak üzere verileri yorumlarken bu tekniği ile ilişkili çeşitli sınırlamalar yöntemi motorlu modelleri göç değişiklikleri belirlemede etkili olsa da, dilatasyon sırasında meydana olmadığını belirleyemiyor. dikkate alınmalıdır bir CMMC ilerlemesi nöral. kolonik duvar boyunca difüzyon konsantrasyon gradyanları luminally uygulanan ilaçların etkileri olan işlemlerden atfedilen izin (yani, sıvının hareket kaynaklanan) kontraktil aktivite pasif yanıt aracılık ettiği veya sade mukoza, ancak uzun süreli deneylerde mukozal dejenerasyonu ve böylece kayıt süresi boyunca bu ilaçların etkisinin bölümlerinin değiştirerek meydana gelebilir. Ayrıca, ilaçların bu yöntem kullanılarak tespit edilemez myenterik ve submukozal pleksuslar belirgin bir etkisinin olup olmadığı. Buna karşılık, bu yaklaşım sağlar enterik on ne etkileri kolektif bir değerlendirmemotilite desen genel bir değişimi ölçerek rvous sistemi. Ayrıntılı hususlar dikkate verilerin niteliğini alınması gerektiğini içeren deneyler ve uygun veri analizi stratejilerini tasarlarken ve CMMCs düşük frekans (yani, parametrik olmayan analiz gerektiren, CMMC frekansı için veri saymak).Son zamanlarda, Barnes ve arkadaşları Ancak bizim laboratuvarda elde edilen bulgular kendiliğinden CMMCs sadece mezenterin 7 vasıtasıyla organ banyosuna dokuyu sabitleyerek görülebilir olduğunu göstermektedir yayınlanan, kolon doku CMMCs 32 gözlemlemek için uyarılması gerektirdiğini önerdi. Bu koşullar altında, CMMCs varlığı sadece CMMCs kendiliindenliine gösterir, ancak bu teknik kullanışlılığı konusunda daha fazla tertip kolon motilitesinde değişiklikleri oluşturmak. Bu yaklaşım, mide-bağırsak sisteminin dışı kolon bölgelere uygulanabilir olsa da, ince bağırsak motilitesi karmaşıklığı daha det gerektirirCMMCs 33 ölçülmesi için kullanılanlardan daha analizi stratejileri ailed.
Bu deneysel yaklaşım çok yüksek uzaysal ve zamansal çözünürlüğe sahip ve harici ve enterik sinir sistemi üzerinde konsantrasyon değişimlerini değişen etkilerini araştırmak için lümeni içinde hem de ilaç dağıtım seçeneği içerir. Ayrıca, bu yöntem, tok halde, 6,23 sırasında ince bağırsak bölümleme analiz için uygundur. Bu yöntemin eks vivo Doğa (bakınız Şekil hastalığın genetik modelleri dahil olmak üzere çeşitli modeller, mide-bağırsak motilitesini araştırılması için ideal bir şekilde, merkezi sinir sistemi girişlerinin yokluğunda değerlendirilir enterik sinir sisteminin rolü sağlar ve bu nedenle 2) 6,34.
Bu yöntem, aynı zamanda, motor aktivitesi 23,33,35 bilgisayar simülasyonları fizyolojik verileri karşılaştırmak için kullanılabilir. Bu tür simülasyonlar motor desenleri tahmin edebilirsinizfizyolojik deneyler 33,35 ile doğrudan karşılaştırmalar için Spatiotemporal haritaların formu. Transform ve dalgacık analizi 36 Hızlı Fourier kullanarak, motilite (Cajal interstisyel hücreleri tarafından üretilir) düz kas kalp pili katkısı da elde edilebilir. Ayrıca, bu video görüntüleme tekniği nöral içi ve kas desen jeneratörleri katılım ayırdedilmesine olanak sağlayan kas 3 elektriksel aktivitenin hücre dışı kayıt ile birleştirilebilir. Hücre dışı kayıt yöntemi düz kas kasılmalarının veya gevşemeleri yokluğunda inhibitör kavşak potansiyeli giderir, unutmayın.
Bu teknik iyi preparatlar ve türlerinin geniş bir mide-bağırsak motilitesinde analizi için kurulduğunda, aynı zamanda, daha önce daha basit bir çapı izleme sistemi ile analiz mezenterinde vazokonstriksiyon çalışmasında (diğer sistemlerde kullanılmak üzere bir potansiyele sahip 37) veiskelet kasında.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
JCB ve ELH-Y Savunma CDMRP Otizm Araştırma Programı US Department (AR11034) tarafından desteklendi. Melbourne güven ELH-Y.The Mayıs Stewart Burs-University NHMRC (1047674) MS burs finanse etti. Biz teknik katkılarından dolayı Ali Tahir, Fátima Ramalhosa ve Gracia Seger teşekkür ederiz.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagents | |||
| NaCl (MW: 58.44) | Sigma-Aldrich | S7653-250G | |
| KCl (MW: 74.55) | Sigma-Aldrich | P9333-500G | |
| NaH2PO4.2H2O (MW: 156.01) | Chem Supply | 471-500G | |
| MgSO4.7H20 (MW: 246.48) | Chem Supply | MA048 | |
| CaCl2.2H2O (MW: 147.02) | Chem Supply | CA033 | |
| D-Glucose anhydrous (MW: 180.16) | Chem Supply | GA018-500G | |
| NaHCO3 (MW: 84.01) | Chem Supply | GA018-500G | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Materials | |||
| Two chambered organ bath Dimentions: 14 cm x 8 cm x 3 cm |
Custom Made | Contact Laboratory Directly | |
| 732 MULTI -PURPOSE SEALANT CLEAR | Dow Corning Australia Pty Ltd | 1890573 | |
| SYLGARD 184 SILICONE ELASTOMER KIT | Dow Corning Australia Pty Ltd | 1064291 | |
| STOPCOCK 3 WAY FEM-ML L/LOCK S | Terumo Medical Corporation | 0912-2006 | |
| SYRINGES with Luer Lock Tips 50 ml, 20 ml, 10 ml | Terumo Medical Corporation | N/A | |
| 1.57 mm (ID) x 3.16 mm (OD) - Silastic Tubing | Masterflex | 508-008 | |
| 1.02 mm (ID) x 2.16 mm (OD) - Silastic Tubing | Masterflex | 508-005 | |
| 1.50 mm (ID) x 2.50 mm (OD) - Silastic Tubing | Masterflex | 508-007 | |
| 1.60 mm (ID) - Platinum cured silicone tubing | Masterflex | 96410 - 14 | |
| 4.40 mm (ID) - Platinum cured silicone tubing | Masterflex | 96410 - 15 | |
| 3.10 mm (ID) - Platinum cured silicone tubing | Masterflex | 96410 -16 | |
| Graduated Laboratory Glass Bottles - 500 ml | Thermofisher Scientific | 100-400 | |
| CHEMICAL RUBBER STOPPER 57 x 65 mm | |||
| CHEMICAL RUBBER STOPPER 29 mm x 32 mm | |||
| Water heater (thermo regulator) | Ratek | TH7000 | |
| Logitech Webcam | Logitech | ||
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Software | |||
| Virtual Dub - 1.9 11 | virtualdub.org | ||
| MATLAB R2012a | Graph Pad | ||
| Logitech Webcam Software | Logitech |
References
- Powell, A. K., O'Brien, S. D., Fida, R., Bywater, R. A. Neural integrity is essential for the propagation of colonic migrating motor complexes in the mouse. Neurogastroenterol Motil. 14, 495-504 (2002).
- Furness, J. B. The enteric nervous system and neurogastroenterology. Nat Rev Gastroenterol Hepatol. 9, 286-294 (2012).
- Gwynne, R. M., Bornstein, J. C. Mechanisms underlying nutrient-induced segmentation in isolated guinea pig small intestine. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 292, G1162-G1172 (2007).
- Bush, T. G., Spencer, N. J., Watters, N., Sanders, K. M., Smith, T. K. Spontaneous migrating motor complexes occur in both the terminal ileum and colon of the C57BL/6 mouse in vitro. Auton Neurosci. 84, 162-168 (2000).
- Fida, R., Lyster, D. J., Bywater, R. A., Taylor, G. S. Colonic migrating motor complexes (CMMCs) in the isolated mouse colon. Neurogastroenterol Motil. 9, 99-107 (1997).
- Neal, K. B., Parry, L. J., Bornstein, J. C. Strain-specific genetics, anatomy and function of enteric neural serotonergic pathways in inbred mice. J Physiol. 587, 567-586 (2009).
- Roberts, R. R., Murphy, J. F., Young, H. M., Bornstein, J. C. Development of colonic motility in the neonatal mouse-studies using spatiotemporal maps. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 292, G930-G938 (2007).
- Spencer, N. J. Control of migrating motor activity in the colon. Curr Opin Pharmacol. 1, 604-610 (2001).
- Spencer, N. J., Bywater, R. A. Enteric nerve stimulation evokes a premature colonic migrating motor complex in mouse. Neurogastroenterol Motil. 14, 657-665 (2002).
- Roberts, R. R., Bornstein, J. C., Bergner, A. J., Young, H. M. Disturbances of colonic motility in mouse models of Hirschsprung's disease. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 294, G996-G1008 (2008).
- Tough, I. R., et al. Endogenous peptide YY and neuropeptide Y inhibit colonic ion transport, contractility and transit differentially via Y(1) and Y(2) receptors. Br J Pharmacol. 164, 471-484 (2011).
- Hennig, G. W., Costa, M., Chen, B. N., Brookes, S. J. Quantitative analysis of peristalsis in the guinea-pig small intestine using spatio-temporal maps. J Physiol. 517 (Pt 2), 575-590 (1999).
- Hoffman, J. M., Brooks, E. M., Mawe, G. M. Gastrointestinal Motility Monitor (GIMM). J Vis Exp. , (2010).
- Smith, T. K., Gershon, M. D. Rebuttal from Terence K. Smith and Michael D. Gershon. J Physiol. 593, 3233 (2015).
- Spencer, N. J., Sia, T. C., Brookes, S. J., Costa, M., Keating, D. J. CrossTalk opposing view: 5-HT is not necessary for peristalsis. J Physiol. 593, 3229-3231 (2015).
- Tabuchi, K., et al. A neuroligin-3 mutation implicated in autism increases inhibitory synaptic transmission in mice. Science. 318, 71-76 (2007).
- Jamain, S., et al. Mutations of the X-linked genes encoding neuroligins NLGN3 and NLGN4 are associated with autism. Nat Genet. 34, 27-29 (2003).
- Chaidez, V., Hansen, R. L., Hertz-Picciotto, I. Gastrointestinal problems in children with autism, developmental delays or typical development. J Autism Dev Disord. 44, 1117-1127 (2014).
- Ibrahim, S. H., Voigt, R. G., Katusic, S. K., Weaver, A. L., Barbaresi, W. J. Incidence of gastrointestinal symptoms in children with autism: a population-based study. Pediatrics. 124, 680-686 (2009).
- Kohane, I. S., et al. The co-morbidity burden of children and young adults with autism spectrum disorders. PloS One. 7, e33224 (2012).
- McElhanon, B. O., McCracken, C., Karpen, S., Sharp, W. G. Gastrointestinal symptoms in autism spectrum disorder: a meta-analysis. Pediatrics. 133, 872-883 (2014).
- Peters, B., et al. Rigid-compulsive behaviors are associated with mixed bowel symptoms in autism spectrum disorder. J Autism Dev Disord. 44, 1425-1432 (2014).
- Ellis, M., Chambers, J. D., Gwynne, R. M., Bornstein, J. C. Serotonin and cholecystokinin mediate nutrient-induced segmentation in guinea pig small intestine. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 304, G749-G761 (2013).
- Parracho, H. M., Bingham, M. O., Gibson, G. R., McCartney, A. L. Differences between the gut microflora of children with autistic spectrum disorders and that of healthy children. J Med Microbiol. 54, 987-991 (2005).
- Buie, T., et al. Evaluation, diagnosis, and treatment of gastrointestinal disorders in individuals with ASDs: a consensus report. Pediatrics. 125, Suppl 1. S1-S18 (2010).
- Etherton, M., et al. Autism-linked neuroligin-3 R451C mutation differentially alters hippocampal and cortical synaptic function. Proc Natl Acad Sci U S A. 108, 13764-13769 (2011).
- Etherton, M. R., Tabuchi, K., Sharma, M., Ko, J., Sudhof, T. C. An autism-associated point mutation in the neuroligin cytoplasmic tail selectively impairs AMPA receptor-mediated synaptic transmission in hippocampus. EMBO J. 30, 2908-2919 (2011).
- Zhang, Q., et al. Expression of neurexin and neuroligin in the enteric nervous system and their down-regulated expression levels in Hirschsprung disease. Mol Biol Rep. 40, 2969-2975 (2013).
- Wang, J., et al. Expression and significance of neuroligins in myenteric cells of Cajal in Hirschsprung's disease. PloS One. 8, e67205 (2013).
- Yang, H., et al. The down-regulation of neuroligin-2 and the correlative clinical significance of serum GABA over-expression in Hirschsprung's disease. Neurochem Res. 39, 1451-1457 (2014).
- Roberts, R. R., et al. The first intestinal motility patterns in fetal mice are not mediated by neurons or interstitial cells of Cajal. J Physiol. 588, 1153-1169 (2010).
- Barnes, K. J., Spencer, N. J. Can colonic migrating motor complexes occur in mice lacking the endothelin-3 gene? Clin Exp Pharmacol Physiol. 42, 485-495 (2015).
- Chambers, J. D., Bornstein, J. C., Thomas, E. A. Multiple neural oscillators and muscle feedback are required for the intestinal fed state motor program. PloS One. 6, e19597 (2011).
- Heredia, D. J., et al. Important role of mucosal serotonin in colonic propulsion and peristaltic reflexes: in vitro analyses in mice lacking tryptophan hydroxylase 1. J Physiol. 591, 5939-5957 (2013).
- Chambers, J. D., Bornstein, J. C., Thomas, E. A. Insights into mechanisms of intestinal segmentation in guinea pigs: a combined computational modeling and in vitro study. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 295, G534-G541 (2008).
- Huizinga, J. D., et al. The origin of segmentation motor activity in the intestine. Nat Commun. 5, 3326 (2014).
- Neild, T. O., Shen, K. Z., Surprenant, A. Vasodilatation of arterioles by acetylcholine released from single neurones in the guinea-pig submucosal plexus. J Physiol. 420, 247-265 (1990).
