Abstract
Het enterische zenuwstelsel (ENS) speelt een belangrijke rol bij het reguleren van gastro-intestinale (GI) motiliteit en onafhankelijk van het centrale zenuwstelsel werken. Veranderingen in ENS functie zijn een belangrijke oorzaak van GI symptomen en ziekten en kunnen bijdragen aan GI afwijkingen die bij neuropsychiatrische aandoeningen waaronder autisme. Het staat vast dat geïsoleerde colon segmenten genereren spontaan, ritmische samentrekkingen bekend als de dikke darm migreren Motor Complexen (CMMCs). Een procedure om de enterische neurale regulering van CMMCs in ex vivo de voorbereidingen van de muis colon wordt beschreven te analyseren. De dikke darm is losgesneden van het dier en gespoeld fecale inhoud voorafgaand aan de canule in een orgaanbad verwijderen. De gegevens worden verkregen via een videocamera boven het orgaanbad geplaatst en omgezet in hoge resolutie spatiotemporele kaarten via een in-house software. Met deze techniek basislijn contractiele patronen en farmacologische effecten ENS functie colon segments vergelijkbaar gedurende 3-4 uur. Bovendien kunnen voortplantinglengte en snelheid van CMMCs ook worden die als veranderingen in de darm diameter en contractiefrequentie. Deze techniek is nuttig voor het karakteriseren maagdarmmotiliteit patronen in transgene muismodellen (en andere soorten, waaronder ratten en cavia). Zo zijn farmacologisch geïnduceerde veranderingen in CMMCs opgenomen in wild type muizen en in de neuroligin-3 R451C muismodel van autisme. Daarnaast kan deze techniek worden toegepast op andere gebieden van het maagdarmkanaal waaronder het duodenum, jejunum en ileum en in verschillende ontwikkelingsstadia leeftijden in muizen.
Introduction
Het enterische zenuwstelsel (ENS) is de intrinsieke neuronale netwerk van het maagdarmkanaal en moduleert diverse functies zoals vertering van darminhoud, opname van voedingsstoffen en de secretie en reabsorptie van vocht. Neuronen van de ENS bevinden zich in de myenterische en submucosale plexus. De myenterische plexus speelt een belangrijke rol bij het reguleren van gastro-intestinale motiliteit 1 dat de submucosale plexus zich voornamelijk bezig met de controle secretie 2,3. De myenterische plexus ligt tussen de longitudinale en circulaire spierlagen van de darmwandcomponenten. De contractiele activiteit van de gladde spierlagen van de darmwand vergemakkelijkt de primaire functies van het maagdarmkanaal door mengen en darminhoud voortbewegen over de lengte van de darm 3. Hoewel de extrinsieke innervatie naar het maagdarmkanaal van de CNS bijdraagt aan gastro-intestinale functie in vivoDe ENS kan reguleren gastro-intestinale functie onafhankelijk. Deze unieke eigenschap maakt het functionele onderzoek van enterische neuronale circuits en hun bijdrage aan maagdarmmotiliteit ex vivo.
Colon migreren motor complexen (CMMCs) zijn spontane, neurogene gebeurtenissen die zijn de belangrijkste motor patroon waargenomen in geïsoleerde muis colon in de afwezigheid van fecale pellets 4-9. CMMCs worden gedefinieerd als ritmische samentrekkingen die zich voortplanten langs een horizontale afstand die ten minste de helft van de totale lengte van het colon (dwz van de blindedarm naar de endeldarm) 10. De relatie tussen CMMCs en de contractiele patronen die fecale pellets voortbewegen moet nog duidelijk worden aangetoond, maar sommige farmacologische verschillen zijn gemeld 11. Desondanks moet het vermogen van de ENS onafhankelijk functioneren van het CZS en het bestaan van neurale gemedieerde motorische patronen in de IMolated colon biedt een ideale test systeem om verstoringen in de beweeglijkheid als gevolg van onderliggende ENS dysfunctie te onderzoeken. De spontaniteit van gastrointestinale motorische patronen maakt de functionele veranderingen in reactie op farmacologische stimuli worden beoordeeld.
Het gebruik van video-imaging en spatiotemporele mapping werd voor het eerst ontwikkeld om kwantitatief te onderzoeken dunne darm peristaltiek in cavia's 12. Hier wordt een ex vivo werkwijze beschreven dat de studie van muis motiliteitspatronen maakt gebruik van videobeelden en analyse van deze opnames met hoge resolutie weer (~ 100 urn, 33 msec) kaarten van dikke diameter als functie van positie langs de colon en tijd (tijdruimtelijk maps). Met behulp van in-house edge detectie software (Analyse2; beschikbaar op aanvraag), de gegevens van de volledige lengte colon segmenten aanbestedende in real-time worden verwerkt tot spatiotemporele kaarten voor elk experiment te genereren. In deze stap, video (AVI) bestanden zijn summarized en omgezet in spatiotemporele kaarten met behulp van Analyse2. Tijdruimtelijk kaarten (figuur 2) tonen contractiliteit tijd en maken de meting van meerdere parameters zoals voortplantingssnelheid, omvang, lengte en duur. Gut diameter ook geregistreerd gedurende de duur van het experiment als een maat voor de globale contractiliteit van het weefselsegment. Deze methode kan worden toegepast om verschillen in de plaats van opening van contractiele complexen die veranderde enterische neurale verbindingen kunnen duiden.
Eenzelfde videobeelden model zodat pellet aandrijving beoordelen cavia's is gerapporteerd 13 maar hier beschrijven we de toepassing van de videobeelden benadering voor het kwantificeren van spontane motiliteit (dat wil zeggen in afwezigheid van pellets). Wij ook informatie om te helpen bij de dissectie en voorbereiding van maag-darmweefsel voor videobeelden benadering. Dezeprotocol voorziet onderzoekers een toegankelijke en eenvoudig herhaald voor de analyse van enterische neuronale controle van gastrointestinale functie in diermodellen van ziekten met inbegrip van genetische muismodellen.
De videobeelden techniek maakt de analyse van motiliteit in reactie op verschillende farmacologische middelen. Medicijnen kunnen worden toegediend via het darmlumen of orgaanbad buiten de colon preparaat. Verschillende gebieden van de muis maagdarmkanaal vertonen specifieke motiliteitspatronen zoals kleine darm segmentatie en CMMCs in de dikke darm.
Deze techniek is gebruikt om stamverschillen in kleine darmfunctie identificeren; differentiële gevoeligheid voor 5-HT3 en 5-HT4-antagonisten werden waargenomen in het jejunum van Balb / c en C57 / Bl6 muizen als gevolg van de polymorfe aard van de TPH2 gen expressie in de twee stammen 6. Het effect van 5-HT-remming op beweeglijkheid blijft concontroversiële, zoals tegenstrijdige gegevens gerapporteerd over het belang van endogene 5-HT op colon peristaltiek en CMMCs 14,15. Veranderingen in motiliteit pre- en postnataal 7 tijdens de ontwikkeling en de effecten van genmutaties op gastro-intestinale motiliteit in diermodellen van de ziekte kan 10 worden onderzocht door gebruik videobeelden. Hier tonen we gebruik van de werkwijze voor de studie van motiliteit in het NL3 R451C muismodel van autisme, dat een missense mutatie in het gen dat voor het Nlgn3 synaptische adhesieproteïne neuroligin 3-16 tot expressie brengt. Deze mutatie werd het eerst geïdentificeerd in patiënten met autisme spectrum stoornis (ASS) 17, die sterk wordt geassocieerd met GI dysfunctie 18-22. We hebben onderzocht of de NL3 R451C synaptische mutatie invloed neurale uitgangen in de ENS met behulp van de video-beeldvormende techniek. We presenteren kenmerkende gegevens CMMCs op baseline en in reactie op het serotonerge 5HT 3/4 receptorantagonist tropisetron in het NL3 R451C muismodel van autisme.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Animal handling en cervicale dislocatie van de dieren voorafgaand aan alle experimenten werden uitgevoerd strikt volgens de protocollen van de Animal Experimentation Comité voor de Universiteit van Melbourne goedgekeurd (Ethics ID: 1.212.494,7)
1. Tissue Collection en Dissection
- Euthanaseren volwassen muizen door cervicale dislocatie. Indien mogelijk vermijden anesthesie invloeden op darmwerking via receptoren op neuronale populaties voorkomen dat belangenconflicten.
- Noteer het totale lichaamsgewicht van het dier, pin het lichaam (via de vier poten, buikzijde blootgesteld aan experimentator) stevig tegen een dissectie board via injectienaalden (Grootte: 20 G).
- Met behulp van ontleden pincet en een schaar; maak een incisie door de epidermis overlappen de onderste buikspier lagen. Blijf de pincet en schaar de buikholte geopend langs de middellijn van het abdomen naar het borstbeen.
- Om het weefsel uitdrogende voorkomen, giet physiologisch zoutoplossing (Krebs oplossing: 118 NaCl, 4,6 KCI, 2,5 CaCl2, 1,2 MgSO4, 1 NaH 2PO 4, 25 NaHCO 3, 11 D-glucose in mM - geborreld bij kamertemperatuur met carbogeen gas; 95% O2 en 5 % CO2 gedurende ten minste 20 min) op buikinhoud regelmatig (bijvoorbeeld elke 30-60 sec) tijdens de dissectie proces.
- Om de dikke darm te isoleren terwijl aan de blindedarm en endeldarm, houdt de blindedarm (aangrenzend aan het proximale uiteinde van de colon) zachtjes met ontleden tang ongeveer 4-5 cm boven het lichaam van het dier tijdens het bijsnijden mesenterium behulp fijne dissectie schaar.
- Zorg ervoor dat u te behandelen, rekken of snijd de gastro-intestinale weefsel terwijl het verwijderen van de aangrenzende mesenterium.
- Verwijder overtollig weefsel (dat wil zeggen, urineblaas en teelballen). Met behulp van grof ontleden schaar, maken twee verticale incisies (dat wil zeggen, ongeveer 0,5 cm van de middellijn) naar het bekken bezuinigen op each zijde van de dikke darm.
- Gebruik fijne schaar om het rectum te scheiden van aangrenzende bekken weefsel en trim rondom de spieren van de dikke darm.
- Plaats de full-length colon (van caecum tot anus) in een bekerglas met fysiologische zoutoplossing (voorheen zuurstof met carbogeen) en blijven zuurstof bij kamertemperatuur. Verwijder de blindedarm en het rectum met behulp van fijne ontleden schaar en vervangen in beker.
- Lege fecale pellets / darminhoud van colon voorbereidingen door het toepassen van lichte positieve druk bij de mondelinge einde met behulp van een 5 ml injectiespuit bevestigd aan een 200 ul pipet tip gevuld met fysiologische zoutoplossing. Om het weefsel te oriënteren in de toekomst gebruikt een insect pin aan het proximale uiteinde van het colon, waarbij strepen in de mucosa zichtbaar markeren.
- Wijzig de plastic pipet tip om de spuit 5 ml passen door het verwijderen van ongeveer 1 cm van de breedste / proximale uiteinde met behulp van een scheermesje. Om het debiet te verhogen, verbreden van de distale / kleinere einde door te snijden op een angle (ongeveer 45 ° C) met een scheermesje.
- Pak de colon weefsel voorzichtig aan het proximale uiteinde met ontleden tang, plaatst de pipetpunt in het lumen van het colon en spoel fysiologische zoutoplossing door het lumen.
2. Voorbereiding van de dikke darm weefsel en experimentele set-up voor Video Imaging
- Flush fysiologische zoutoplossing door alle buizen bevestigd aan twee kamers verdeelde orgaanbad ingesteld (Figuur 1 en Figuur 3), met een injectiespuit bevestigd aan een 200 ul pipetpunt. Deze stap verwijdert alle vuil in de buis die de stroom van oplossing kunnen blokkeren. Voor slangen voorschriften hebben betrekking op materialen tafel.
- Zorg ervoor dat de kamers van het orgel bad voortdurend superfused met een fysiologische zoutoplossing borrelen met carbogen (95% O 2 en 5% CO 2, stroomsnelheid van 5 ml min -1). Met behulp van een temperatuursensor op regelmatige tijdstippen, ervoor te zorgen dat de temperature van het bad wordt gehouden tussen 33 ° C -37 ° C.
- Vul de toevoer reservoir via een 3-weg kraan aan de inlaatbuis met ongeveer 20-30 ml fysiologische zoutoplossing met behulp van een 50 ml spuit.
- Tijdens het experiment te handhaven de druk in de toevoer reservoir via arubber stop met een glazen buis (5 mm binnendiameter) ingebracht door het midden. Zorg ervoor dat de bovenste opening van de instroom reservoir goed is afgesloten (met de binnenste glazen buis resterende onverharde).
- Plaats de dikke darm (lengte 5-7 cm) in het orgel bad kamer, zorg ervoor dat deze volledig is ondergedompeld in fysiologische zoutoplossing.
- Canule elk uiteinde van de colon segment beide ondergedompelde inlaat- / uitlaatbuizen (inlaat / uitlaat buizen van verschillende diameter kan worden aangepast aan de grootte van het weefsel lumen bv. Postnatale weefsels, volwassen muizen en cavia) in het bad met behulp van standaard katoenen naaigaren. Bevestig het proximale uiteinde van het colon aan de inlaatbuis en dedistale einde van de darm naar de uitlaatbuis (verbonden via een 3-weg kraan een verticale uitlaatbuis; 6 cm hoog). Zorg ervoor dat het weefsel is niet overbelast of te ontspannen na een canule om interferentie met toekomstige metingen en analyses te vermijden.
- Noteer de lengte van het colon door de afstand tussen de proximale en distale canuleringen met een 15 cm liniaal. Dit is belangrijk voor het interpreteren van veranderingen in contractie lengte voortplantingssnelheid en contractie initiatiepunten.
- Zorg voor een stabiele basislijn luminale druk (cm H 2 O) is vastgesteld voor het begin van het experiment. Bereken luminale druk door het meten van de verticale afstand van het weefsel de meniscus fysiologische zoutoplossing in de glazen buis instroom reservoir (oraal) en de verticale uitstroombuis (anaal).
- Handhaaf weefselpreparaten bij een constante intraluminale druk (bijvoorbeeld 1-2 cm H2O) door ervoor te zorgen dat de instroom stop afdichting pressure constant wordt gehouden en dat er geen blokkades in de set-up zijn.
- Laat de dikke darm in evenwicht in fysiologische zoutoplossing gedurende 30 minuten voordat de opname darmbewegingen. Controleer of er geen blokkades ontstaan in de in- en uitstroom buizen en verwijder ze door het toepassen van druk door de instroom reservoir of door het opnieuw cannuleren de orale en anale uiteinden van de dikke darm.
3. Fotolader en Experimentele Protocol
- Record darmbewegingen als video-bestanden met behulp van een videocamera (30 frames / sec, 640 x 840 pixels) gepositioneerd 10-15 cm boven het orgel bad op een standaard laboratorium retort stand (figuur 1).
- Open Virtual Dub (video capture software) via het pictogram op het bureaublad. Op het tabblad 'Bestand' de optie 'capture AVI' om het beeld van de camera te bekijken. Op de 'Audio' tab Wis 'in te schakelen audio-opname' om het geluid uit te schakelen.
- In het tabblad video te selecteren 'compressie' en 'DivX6.9.2. Codec & #39; om video bestanden te comprimeren om het gebruik van opslagruimte te minimaliseren. Deze functie komt beschikbaar bij de installatie van de compressie software 'DivX'.
- De cameralocatie handmatig aanpassen zodat de gehele canule colon segment zichtbaar (met een canule gebieden direct nabij de verticale randen van het videoframe) via de video-opname softwarevenster (zie figuur 1). Om de beeldkwaliteit te verbeteren en reflecties te minimaliseren, bevestig een papieren / kartonnen schild om de steun camera om vreemde licht te blokkeren op het orgel bad. Optimaliseer videokwaliteit door het aanpassen van de helderheid, het contrast en de belichting met behulp van de camera software-interface.
- Voordat u gaat opnemen, stelt u een specifieke bestandsnaam; in het tabblad 'Bestand' de optie 'Set capture file' en geef een unieke naam voor de video.
- Begin met het vastleggen van video door op 'Capture file' van het 'Capture' werkbalk. Om recordin stoppeng Selecteer de 'Stop capture' knop of op de toets 'Esc' op het toetsenbord.
- Vervang de fysiologische zoutoplossing opgenomen in de toevoer reservoir met verse fysiologische zoutoplossing elke 30 minuten.
- Record luminale druk (zie 2.9) en met behulp van een temperatuursensor, kennis te nemen van het orgel badtemperatuur. Herhaal deze stappen gedurende het experiment (dat wil zeggen, elke 30 min) zodat deze variabelen constant.
- Record colon activiteit in totaal 3 uur (inclusief drug toepassing en uitwassen duur). Voor data-opslag doeleinden registreren gegevens in 15 min video segmenten. Een volledige experiment zal typisch bestaan uit 12 x 15 min video-opnames.
- Record activiteit 1 uur onder controle condities (fysiologische zoutoplossing).
- Breng het geneesmiddel (hetzij gesuperfuseerd in het bad of toegediend in het lumen via de toevoer reservoir) gedurende 30 minuten tot 1 uur.
Opmerking: Verschillende routes van toediening kan yield verschillende effecten 23. - Solliciteer verse fysiologische zoutoplossing aan het bad of lumen tijdens een 1 uur uitwasperiode.
4. Data Processing en het genereren van Spatiotemporal Maps
- Proces elke video-opname offline met behulp van in-house software geschreven in MATLAB (R2012a, versie 7.4, beschikbaar op aanvraag) met het oog op spatiotemporele kaarten illustreren colonbeweeglijkheid genereren.
- Open analyse software via het pictogram op het bureaublad.
- In het commando venster, voer "Analyse2" met het oog op de analyse controlepaneel te openen.
- Maak gebruik van de rand detectie functie om spatiotemporele kaarten te genereren door te klikken op "Edge detectie voor AVI-bestanden" in het Configuratiescherm. Deze functie zal de analyse software in staat te stellen het opnieuw gecodeerde video's in Audio Video Interleaved (AVI) formaat te lezen.
- Voer de volgende stappen achtereenvolgens naar spatiotemporele kaarten te genereren met behulp van een adaptive randdetectie-algoritme.
- Open opgenomen video-bestanden door het tabblad 'Bestanden toevoegen', selecteer 'Open video' en kies de locatie van de videobestanden.
- Vanaf het genoemd worden in de analyse software video-bestanden, selecteert u het bestand van belang.
- Selecteer een rechthoekig gebied van belang in het kader van de video, bijvoorbeeld de gehele lengte van de dikke darm, de plaats waar de darm oraal canule om de anale canule. Ervoor dat de proximale en distale canule punten zijn naast de verticale begrenzingen van het gebied van belang. Randdetectie lijnen (rood en groen) verschijnt automatisch bovenop imago van de real time op.
- Ervoor zorgen dat de detectiedrempel lijnen direct nabij de colon op zowel de bovenste en onderste grenzen van het colon weefsel (dit kan worden geoptimaliseerd voor elke video door het veranderen detectie drempelwaarden op het bedieningspaneel). Zorg ervoor dat de randdetectie lines zijn continu langs de lengte van het imago van de dikke darm van de door het aanpassen van het contrast en de helderheid via het bedieningspaneel.
- Voer de volledige lengte van het colon (mm) in de breedte dialoogvenster (zoals aangegeven in stap 2,7). Selecteer vervolgens "Genereer heat map".
- In het pop-up venster, selecteer een locatie voor het bestand worden opgeslagen en geef een bestandsnaam voor de spatiotemporele kaart.
- Selecteer de '.su2' format en selecteer 'Toevoegen aan wachtrij'.
Opmerking: .su2 formaat comprimeert de gegevens naar een kleinere bestandsgrootte en meerdere video-bestanden kunnen worden toegevoegd aan de wachtrij. - Kies 'Begin detectie' to spatiotemporele kaarten te genereren.
5. Analyse van Spatiotemporal Maps
- Gebruik spatiotemporele kaarten om parameters zoals de frequentie, voortplantingssnelheid, langere en langduriger CMMCs, darm diameter en het punt van opening en de richting van contracties schatten.
- Om te beginnen met het analyseren van spatiotemporelekaarten type "analyse2 in het commando venster zoals beschreven in de vorige paragraaf. In plaats van "Edge detectie", selecteer de "Heat kaartanalyse" knop.
- Open tijdruimtelijk kaartbestanden (.su2 bestanden) door het tabblad 'Bestanden toevoegen' en met vermelding van de locatie van de eerder verkregen .su2 bestanden.
- Zodra de spatiotemporele map is zichtbaar op het scherm, geeft u een kleurbereik op het bedieningspaneel, zodat het minimum is ingesteld op 1.
Merk op dat de maximum kan variëren 5-10 volgens de contractiliteit van het weefsel. - Kies 'Lock kleurbereik' om ervoor te zorgen alle kaarten van een enkel experiment worden geanalyseerd onder dezelfde omstandigheden.
- Zorg ervoor dat de tijd instellingen zijn constant voor alle tijdruimtelijk kaarten uit een bepaald experiment.
- Om CMMC frequentie bepalen handmatig contracties die meer dan 50% van de lengte van het colon doorkruisen tellen. Deze contracties kunnen Visuaseerd als rood / oranje strepen (standaard HSV kleur index) op de spatiotemporele kaart (zie figuur 2 voor een voorbeeld). Andere contracties die korter zijn of niet voortplanten kunnen ook worden geïdentificeerd en gekwantificeerd.
- Desgewenst moeten nadere analyse op een hogere resolutie van deze kaarten. Zo kunnen gedetailleerde eigenschappen, waaronder de snelheid en duur van elke contractie onderzocht.
- Met het oog op de snelheid en de duur te meten, selecteert u de "Annoteer samentrekking waves" knop op het vuur kaartanalyse bedieningspaneel.
- Vervolgens opnieuw in elk CMMC door te klikken op de knop "Zoom" en het interessegebied selecteren. Selecteer vervolgens de knop "handmatig annoteren" naar elke contractie annoteren met de muis om een lijn van de eerste positie naar het einde van elke contractie. Deze methode kan worden gebruikt om de schijnbare voortplantingssnelheid en de duur van dilataties die lijken te propageren meten (voor bijvoorbeeld verder zienal eind kaarten in figuur 2A, 2B).
Opmerking: De gegevens voor de snelheid en de duur zal onder het raam resultaten verschijnen. Deze waarden kunnen worden overgedragen aan een spreadsheet van belang door het tabblad "Gegevens exporteren". Ongewenste annotaties kunnen worden verwijderd door te klikken op de "Verwijder geselecteerde annotaties" knop.
- Indien gewenst, gebruik maken van de x- en y-coördinaten van de spatiotemporele kaarten (tijd en positie langs de colon, respectievelijk) naar de positie van opening van kleine contracties of CMMCs bepalen.
- Evenzo, teneinde intervallen tussen de weeën bepalen, gebruikt de functie "Annotate" naar de tijdsduur tussen de weeën te meten. Zoals eerder, deze resultaten kunnen worden naar een spreadsheet door het tabblad "Exporteer data" geëxporteerd.
- Om de rust darm breedte te meten, selecteert u de "Take dwarsdoorsnede" knop op de Heat kaartanalyse panel.
- Selecteer 'Add9; op het paneel temporele doorsneden. Dubbelklik op elke locatie binnen de kaart voor een horizontale lijn bovenop de warmte kaart te genereren. data Gut diameter worden nu weergegeven in een nieuw venster.
- Om gut diameter meten, plaatst u de cursor op een piek en de aangrenzende dal-tot-gemiddelde gut breedte te verkrijgen voor een bepaalde experimentele conditie. Veranderingen in diameter darm kan worden vergeleken tussen experimentele omstandigheden.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Tot 90% van de patiënten met ASS ervaren een array van maagdarmstoornissen, zoals diarree en constipatie 18,24,25. Echter, de onderliggende oorzaken van deze gastro-intestinale problemen zijn onbekend. Vele mutaties geïdentificeerd in patiënten met ASS geassocieerd met synaptische eiwitten bijdragen tot veranderingen en verstoringen in synaptische transmissie of functie. Een dergelijke mutatie in het gen dat codeert voor de celadhesie molecuul neuroligin-3 (NL3 R451C), werd geïdentificeerd in twee broers met ASS 17. Deze mutatie leidt tot een arginine residu op positie 451 van de neuroligin eiwit worden vervangen door een cysteïne. NL3 R451C muizen die deze mutatie vertonen verhoogde GABA gemedieerde overdracht in de somatosensorische cortex 16,26 naast verhoogde AMPA en NMDA-receptor-gemedieerde activiteit in de hippocampus 25,27.
28-30. Aangezien het enterische zenuwstelsel een belangrijke rol in het reguleren van gastro-intestinale functie speelt, we gepostuleerd dat de mutatie R451C motiliteit zou beïnvloeden. Teneinde eventuele veranderingen in gastrointestinale functie vanwege synaptische afwijkingen onderzoeken zochten we de effecten van de mutatie op R451C CMMC frequentie in deze muizen te onderzoeken.
Omdat serotonine (5-HT) werkt op de ENS gastrointestinale moduleren in muizen 6 analyseerden we motiliteitspatronen in reactie op de 5-HT 3/4 receptorantagonist tropisetron in colon preparaten van WT en NL3 R451C muizen.
Om te beoordelen of de synaptische mutatie verandert CMMCs als het enterisch zenuwstelsel farmacologisch wordt verstoord, de 5HT 3/4 receptor antagonist Tropisetron (Trop;10 pM, welke blokken zowel 5HT3 en 5HT receptoren 4) aan het bad met de colon preparaten (figuur 2) werd toegevoegd. Darmweefsel uit negentien dezelfde leeftijd mannelijke muizen (11 WT en 8 NL3 R451C) gebruikt. In aanwezigheid van tropisetron, NL3 R451C muizen een afname in frequentie CMMC vergelijking met WT nestgenoten. Representatieve voorbeelden van tijdruimtelijk kaarten die CMMCs en contractiele activiteit in WT- en NL3 R451C colon preparaten worden in figuren 2A tot en met 2E, respectievelijk. Hoewel er geen verschil tijdens controle omstandigheden tussen WT en NL3 R451C werd waargenomen, tropisetron aanzienlijk verminderd CMMC frequentie in zowel de WT en NL3 R451C muizen (figuur 2C, 2F). In WT muizen, de mediane aantal CMMCs was 23 in de controle omstandigheden in vergelijking met 15 in tropisetron (p = 0,023). In NL3 muizen, het mediane aantal CMMCs in controle omstandigheden was 19,5tegenover 2 in aanwezigheid van tropisetron (p = 0,022). Bovendien, tropisetron had een groter effect op de frequentie van CMMCs in NL3 R451C muizen in vergelijking met WT (p = 0,047).
Figuur 1. orgaanbad zetten en generatie tijdruimtelijke maps. (A) Een vers ontleed gastrointestinale segment wordt geplaatst in een orgaanbad (dwarsdoorsnede) met fysiologische zoutoplossing en een canule bij orale en anale uiteinden. De orale canule is verbonden met een toevoer reservoir gevuld met fysiologische zoutoplossing en de anale canule verbonden met een uitlaatbuis. Een videocamera boven het orgaanbad geplaatst om contractiele activiteit van de dikke darm nemen. (B) beweeglijkheid wordt omgezet naar spatiotemporele kaarten etikettering regio hoge resolutie van de dikke darm die worden uitgezet in blauw en vernauwde gebieden in rood. (C) Een kaart die tijdruimtelijk motiliteit (CMMCs) van een volwassen muis WT. Individuele CMMCs worden aangeduid als rode verticale regio's in de kaart. De X-as geeft de tijd toe (0-15 min). De Y-as geeft de ruimtelijke locatie langs de dikke darm segment (anale op de basis, orale bovenaan). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2. Spatiotemporele kaarten tonen verhoogde gevoeligheid voor Tropisetron in NL3 R451C muizen colon Spatiotemporal kaarten van CMMC frequentie colon segmenten van WT controles (A) en in aanwezigheid van Tropisetron. (Trop; B). Trop verminderd CMMC frequentie WT colon (C). Spatiote mporal kaarten van NL3 colon onder controle condities (D) en in aanwezigheid van Trop (E). Trop veroorzaakte een sterke vermindering CMMC frequentie NL3 colon (F). CMMC frequentie in reactie op Trop is in het NL3 significant verminderd in vergelijking met WT colon (p = 0,047, niet getoond). Gut breedte (pixelkleur) aangegeven op de Y-as (willekeurige eenheden, waaier 1-6). Schaal bar in E geldt voor alle kaarten. trop; Tropisetron. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 3. Schematische voorstelling van orgaanbad. (A) Bovenaanzicht, (B) Onderkant, (C) vooraanzicht, (D) Zijaanzicht van een twee chambered orgaanbad opgezet. Afmetingen in mm.ref = "https://www.jove.com/files/ftp_upload/53828/53828fig3large.jpg" target = "_ blank"> Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Met behulp van deze video beeldvormende techniek, werd CMMC frequentie gemeten als een indicatie van motiliteit in wild type en NL3 R451C muizen, een muismodel van autisme spectrum stoornis 17. Onze resultaten duiden op een vermindering van het aantal CMMCs in mutante NL3 R451C muizen in vergelijking met wildtype muizen in aanwezigheid van de 5HT 3/4 receptorantagonist Tropisetron suggereert dat NL3 R451C muizen een verhoogde gevoeligheid vertonen voor Tropisetron. Derhalve stellen wij voor dat de neuroligin-3 R451C mutatie verandert de serotonine route, mogelijk door modulatie of 5HT 3 of 4 5HT receptorfunctie in enterische neuronen, de slijmvliezen of beide. Dit toont de voordelen van de methode voor het identificeren van fenotypische verschillen tussen genotypen en dat specifieke doelwitten voor verdere studies.
Deze werkwijze kan worden gemodificeerd om ruimtelijke resolutie te verbeteren door het verwerven's viaeen stereo-microscoop voorzien van een camera te monteren. Deze benadering maakt opnamen al E12.5 31 worden gemaakt van kleine preparaten van het maagdarmkanaal op embryonale tijdstippen. Neuromodulators kunnen worden toegediend via het lumen of het orgaanbad buiten de colon preparaat. Bovendien is deze werkwijze nuttig voor het beoordelen van zowel grote als kleine gastrointestinale motiliteit in verschillende soorten, waaronder muizen, ratten en cavia.
Algemene stappen voor probleemoplossing voor deze werkwijze omvatten het verifiëren van de oplossing via de slang, levensvatbaarheid van het weefsel bereiding, handhaven van constante druk luminale en ervoor zorgen dat colon segmenten van de wanden van het orgaanbad gelegen. Verstoppingen in de slang kan luminale druk veranderen en voorkomen contracties optreedt; daarom alle buizen moeten grondig worden gereinigd om zoutkristallen of vuil / ontlasting te verwijderen voordat infusen. Air moet worden verwijderd uit een buis lijnen rechtstreeks verband houden met de canule voorafgaand aan experimenten (dat wil zeggen, door het vullen van de buizen met zoutoplossing). Bovendien moet weefselpreparaten voorzichtig worden behandeld om beschadiging als gevolg onbeweeglijkheid van de colon te voorkomen. Om weefselschade te voorkomen, opdat de colon vast (niet goed) bevestigd aan de canule tijdens het opnameproces en een constante temperatuur en een continue aanvoer van CO 2 + O 2 aan het bad. Ook voor zorgen dat de luminale druk constant wordt gehouden en dat er geen weeën handmatig worden geïnitieerd door het aanpassen van instroom reservoirs tijdens de opname periode. Controleer of de colon weefsel niet in contact komt met de weeën wand van het orgaanbad omdat dit randdetectie van de relevante spatiotemporele kaarten voorkomen. Dit kan vermeden worden door het volgen van de contracties gedurende de evenwichtsperiode en de positie van de dikke darm om dit te voorkomen tijdens het experiment.
_content "> Verschillende beperkingen waaraan deze techniek moeten worden genomen in op de behandeling bij het analyseren en interpreteren van de gegevens zoals de lage doorvoer deze oriëntatie. Hoewel de werkwijze effectief is bij het identificeren van veranderingen in migrerende motorische patronen kan niet bepalen of dilations die tijdens de voortgang van een CMMC zijn neuraal gemedieerde of eenvoudig passief reacties op de contractiele activiteit (dat wil zeggen, als gevolg van de beweging van vloeistof). de concentratie gradiënten voor diffusie over de dikke wand volstaat om de gevolgen van luminaal toegediende geneesmiddelen toe te schrijven aan acties in de mucosa, maar langdurige experimenten mucosale degeneratie kan optreden waardoor de plaatsen van werking van deze geneesmiddelen via opnameperiode veranderen. Daarnaast of drugs hebben verschillende effecten in de myenterische en submucosale plexus kan niet worden bepaald met deze methode. daarentegen als uitgangspunt kan een collectieve evaluatie van de effecten op de enterische nervous systeem door het meten van een algehele verandering in beweeglijkheid patronen. Verdere overwegingen zijn de noodzaak om rekening te houden met de aard van de data (bijv tellingsgegevens voor CMMC frequentie, die niet-parametrische analyse) en de lage frequentie van CMMCs, bij het ontwerpen van experimenten en passende gegevensanalyse strategieën.Onlangs, Barnes en collega's voorgesteld dat darmweefsel nodig stimulatie om te observeren CMMCs 32 echter gepubliceerde bevindingen uit ons lab tonen aan dat spontane CMMCs kan worden waargenomen door simpelweg het weefsel aan het orgel bad pinning via het mesenterium 7. De aanwezigheid van CMMCs onder deze omstandigheden blijkt niet alleen de spontaniteit van CMMCs, maar aanvult de bruikbaarheid van deze techniek om veranderingen in motiliteit stellen. Hoewel deze benadering geldt voor extra-colon gebieden van het maagdarmkanaal, de complexiteit van kleine intestinale motiliteit vereist meer detscheelde analysestrategieën dan die welke worden gebruikt voor het kwantificeren van CMMCs 33.
Deze experimentele benadering zeer hoge ruimtelijke en temporele resolutie en omvat de mogelijkheid van geneesmiddelafgifte zowel buiten als binnen het lumen voor het onderzoeken van de effecten van variërende concentratie gradiënten op het enterische zenuwstelsel. Bovendien is deze methode is geschikt voor het analyseren van de dunne darm segmentatie tijdens de gevoede toestand 6,23. De ex vivo aard van deze methode kan de rol van het enterische zenuwstelsel bij afwezigheid van centrale zenuwstelsel inputs worden beoordeeld en is daarom een ideale manier om gastrointestinale motiliteit onderzoeken in verschillende uitvoeringen, waaronder genetische modellen van de ziekte (zie figuur 2) 6,34.
Deze werkwijze kan ook worden gebruikt om fysiologische gegevens op computersimulaties van motorische activiteit 23,33,35 vergelijken. Dergelijke simulaties kunnen motor patronen voorspellende vorm van spatiotemporele kaarten voor directe vergelijkingen met fysiologische experimenten 33,35. Toepassing van snelle Fourier Transform and waveletanalyse 36, kan de bijdrage van gladde spieren pacemakers (gegenereerd door interstitiële cellen van Cajal) motiliteit worden geëxtraheerd. Bovendien kan deze video beeldvormende techniek worden gecombineerd met extracellulaire van elektrische activiteit in de spier 3 inbreng van neurale myogene patroongeneratoren te onderscheiden toestaan. Let op, de extracellulaire werkwijze lost remmende knooppunt potentialen bij gebrek aan gladde spiercontracties of relaxaties.
Hoewel deze techniek gevestigde voor de analyse van gastrointestinale motiliteit in een groot aantal preparaten en soorten, maar heeft ook het potentieel voor gebruik in andere systemen zoals het bestuderen van vasoconstrictie in het mesenterium (zijn geanalyseerd via een eenvoudiger diameter volgsysteem 37) enin de skeletspier.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
JCB en ELH-Y werden gesteund door het Amerikaanse ministerie van Defensie CDMRP Autism Research Program (AR11034). NHMRC (1047674) om ELH-Y.The May Stewart Beurs-University of Melbourne vertrouwen gefinancierde beurs voor MS. Wij danken Ali Taher, Fátima Ramalhosa en Gracia Seger voor technische bijdragen.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagents | |||
| NaCl (MW: 58.44) | Sigma-Aldrich | S7653-250G | |
| KCl (MW: 74.55) | Sigma-Aldrich | P9333-500G | |
| NaH2PO4.2H2O (MW: 156.01) | Chem Supply | 471-500G | |
| MgSO4.7H20 (MW: 246.48) | Chem Supply | MA048 | |
| CaCl2.2H2O (MW: 147.02) | Chem Supply | CA033 | |
| D-Glucose anhydrous (MW: 180.16) | Chem Supply | GA018-500G | |
| NaHCO3 (MW: 84.01) | Chem Supply | GA018-500G | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Materials | |||
| Two chambered organ bath Dimentions: 14 cm x 8 cm x 3 cm |
Custom Made | Contact Laboratory Directly | |
| 732 MULTI -PURPOSE SEALANT CLEAR | Dow Corning Australia Pty Ltd | 1890573 | |
| SYLGARD 184 SILICONE ELASTOMER KIT | Dow Corning Australia Pty Ltd | 1064291 | |
| STOPCOCK 3 WAY FEM-ML L/LOCK S | Terumo Medical Corporation | 0912-2006 | |
| SYRINGES with Luer Lock Tips 50 ml, 20 ml, 10 ml | Terumo Medical Corporation | N/A | |
| 1.57 mm (ID) x 3.16 mm (OD) - Silastic Tubing | Masterflex | 508-008 | |
| 1.02 mm (ID) x 2.16 mm (OD) - Silastic Tubing | Masterflex | 508-005 | |
| 1.50 mm (ID) x 2.50 mm (OD) - Silastic Tubing | Masterflex | 508-007 | |
| 1.60 mm (ID) - Platinum cured silicone tubing | Masterflex | 96410 - 14 | |
| 4.40 mm (ID) - Platinum cured silicone tubing | Masterflex | 96410 - 15 | |
| 3.10 mm (ID) - Platinum cured silicone tubing | Masterflex | 96410 -16 | |
| Graduated Laboratory Glass Bottles - 500 ml | Thermofisher Scientific | 100-400 | |
| CHEMICAL RUBBER STOPPER 57 x 65 mm | |||
| CHEMICAL RUBBER STOPPER 29 mm x 32 mm | |||
| Water heater (thermo regulator) | Ratek | TH7000 | |
| Logitech Webcam | Logitech | ||
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Software | |||
| Virtual Dub - 1.9 11 | virtualdub.org | ||
| MATLAB R2012a | Graph Pad | ||
| Logitech Webcam Software | Logitech |
References
- Powell, A. K., O'Brien, S. D., Fida, R., Bywater, R. A. Neural integrity is essential for the propagation of colonic migrating motor complexes in the mouse. Neurogastroenterol Motil. 14, 495-504 (2002).
- Furness, J. B. The enteric nervous system and neurogastroenterology. Nat Rev Gastroenterol Hepatol. 9, 286-294 (2012).
- Gwynne, R. M., Bornstein, J. C. Mechanisms underlying nutrient-induced segmentation in isolated guinea pig small intestine. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 292, G1162-G1172 (2007).
- Bush, T. G., Spencer, N. J., Watters, N., Sanders, K. M., Smith, T. K. Spontaneous migrating motor complexes occur in both the terminal ileum and colon of the C57BL/6 mouse in vitro. Auton Neurosci. 84, 162-168 (2000).
- Fida, R., Lyster, D. J., Bywater, R. A., Taylor, G. S. Colonic migrating motor complexes (CMMCs) in the isolated mouse colon. Neurogastroenterol Motil. 9, 99-107 (1997).
- Neal, K. B., Parry, L. J., Bornstein, J. C. Strain-specific genetics, anatomy and function of enteric neural serotonergic pathways in inbred mice. J Physiol. 587, 567-586 (2009).
- Roberts, R. R., Murphy, J. F., Young, H. M., Bornstein, J. C. Development of colonic motility in the neonatal mouse-studies using spatiotemporal maps. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 292, G930-G938 (2007).
- Spencer, N. J. Control of migrating motor activity in the colon. Curr Opin Pharmacol. 1, 604-610 (2001).
- Spencer, N. J., Bywater, R. A. Enteric nerve stimulation evokes a premature colonic migrating motor complex in mouse. Neurogastroenterol Motil. 14, 657-665 (2002).
- Roberts, R. R., Bornstein, J. C., Bergner, A. J., Young, H. M. Disturbances of colonic motility in mouse models of Hirschsprung's disease. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 294, G996-G1008 (2008).
- Tough, I. R., et al. Endogenous peptide YY and neuropeptide Y inhibit colonic ion transport, contractility and transit differentially via Y(1) and Y(2) receptors. Br J Pharmacol. 164, 471-484 (2011).
- Hennig, G. W., Costa, M., Chen, B. N., Brookes, S. J. Quantitative analysis of peristalsis in the guinea-pig small intestine using spatio-temporal maps. J Physiol. 517 (Pt 2), 575-590 (1999).
- Hoffman, J. M., Brooks, E. M., Mawe, G. M. Gastrointestinal Motility Monitor (GIMM). J Vis Exp. , (2010).
- Smith, T. K., Gershon, M. D. Rebuttal from Terence K. Smith and Michael D. Gershon. J Physiol. 593, 3233 (2015).
- Spencer, N. J., Sia, T. C., Brookes, S. J., Costa, M., Keating, D. J. CrossTalk opposing view: 5-HT is not necessary for peristalsis. J Physiol. 593, 3229-3231 (2015).
- Tabuchi, K., et al. A neuroligin-3 mutation implicated in autism increases inhibitory synaptic transmission in mice. Science. 318, 71-76 (2007).
- Jamain, S., et al. Mutations of the X-linked genes encoding neuroligins NLGN3 and NLGN4 are associated with autism. Nat Genet. 34, 27-29 (2003).
- Chaidez, V., Hansen, R. L., Hertz-Picciotto, I. Gastrointestinal problems in children with autism, developmental delays or typical development. J Autism Dev Disord. 44, 1117-1127 (2014).
- Ibrahim, S. H., Voigt, R. G., Katusic, S. K., Weaver, A. L., Barbaresi, W. J. Incidence of gastrointestinal symptoms in children with autism: a population-based study. Pediatrics. 124, 680-686 (2009).
- Kohane, I. S., et al. The co-morbidity burden of children and young adults with autism spectrum disorders. PloS One. 7, e33224 (2012).
- McElhanon, B. O., McCracken, C., Karpen, S., Sharp, W. G. Gastrointestinal symptoms in autism spectrum disorder: a meta-analysis. Pediatrics. 133, 872-883 (2014).
- Peters, B., et al. Rigid-compulsive behaviors are associated with mixed bowel symptoms in autism spectrum disorder. J Autism Dev Disord. 44, 1425-1432 (2014).
- Ellis, M., Chambers, J. D., Gwynne, R. M., Bornstein, J. C. Serotonin and cholecystokinin mediate nutrient-induced segmentation in guinea pig small intestine. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 304, G749-G761 (2013).
- Parracho, H. M., Bingham, M. O., Gibson, G. R., McCartney, A. L. Differences between the gut microflora of children with autistic spectrum disorders and that of healthy children. J Med Microbiol. 54, 987-991 (2005).
- Buie, T., et al. Evaluation, diagnosis, and treatment of gastrointestinal disorders in individuals with ASDs: a consensus report. Pediatrics. 125, Suppl 1. S1-S18 (2010).
- Etherton, M., et al. Autism-linked neuroligin-3 R451C mutation differentially alters hippocampal and cortical synaptic function. Proc Natl Acad Sci U S A. 108, 13764-13769 (2011).
- Etherton, M. R., Tabuchi, K., Sharma, M., Ko, J., Sudhof, T. C. An autism-associated point mutation in the neuroligin cytoplasmic tail selectively impairs AMPA receptor-mediated synaptic transmission in hippocampus. EMBO J. 30, 2908-2919 (2011).
- Zhang, Q., et al. Expression of neurexin and neuroligin in the enteric nervous system and their down-regulated expression levels in Hirschsprung disease. Mol Biol Rep. 40, 2969-2975 (2013).
- Wang, J., et al. Expression and significance of neuroligins in myenteric cells of Cajal in Hirschsprung's disease. PloS One. 8, e67205 (2013).
- Yang, H., et al. The down-regulation of neuroligin-2 and the correlative clinical significance of serum GABA over-expression in Hirschsprung's disease. Neurochem Res. 39, 1451-1457 (2014).
- Roberts, R. R., et al. The first intestinal motility patterns in fetal mice are not mediated by neurons or interstitial cells of Cajal. J Physiol. 588, 1153-1169 (2010).
- Barnes, K. J., Spencer, N. J. Can colonic migrating motor complexes occur in mice lacking the endothelin-3 gene? Clin Exp Pharmacol Physiol. 42, 485-495 (2015).
- Chambers, J. D., Bornstein, J. C., Thomas, E. A. Multiple neural oscillators and muscle feedback are required for the intestinal fed state motor program. PloS One. 6, e19597 (2011).
- Heredia, D. J., et al. Important role of mucosal serotonin in colonic propulsion and peristaltic reflexes: in vitro analyses in mice lacking tryptophan hydroxylase 1. J Physiol. 591, 5939-5957 (2013).
- Chambers, J. D., Bornstein, J. C., Thomas, E. A. Insights into mechanisms of intestinal segmentation in guinea pigs: a combined computational modeling and in vitro study. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 295, G534-G541 (2008).
- Huizinga, J. D., et al. The origin of segmentation motor activity in the intestine. Nat Commun. 5, 3326 (2014).
- Neild, T. O., Shen, K. Z., Surprenant, A. Vasodilatation of arterioles by acetylcholine released from single neurones in the guinea-pig submucosal plexus. J Physiol. 420, 247-265 (1990).
