Abstract
O sistema nervoso entérico (ENS) desempenha um papel importante na regulação da motilidade gastrintestinal (GI) e podem funcionar de forma independente do sistema nervoso central. As alterações na função ENS são uma causa importante de sintomas gastrointestinais e doença e pode contribuir para os sintomas gastrointestinais relatados em desordens neuropsiquiátricas incluindo autismo. Está bem estabelecido que os segmentos de cólon isolados gerar contrações espontâneas, rítmicos conhecido como Colônica Migração Motor Complexos (CMMCs). Um procedimento para analisar a regulação neural entérica de CMMCs em ex vivo preparações de cólon do rato é descrita. O cólon é dissecado a partir do animal e lavada para remover o conteúdo de fezes antes de ser canulada num banho de órgãos. Os dados são adquiridos por meio de uma câmara de vídeo posicionado acima do banho do órgão e convertidos em mapas de alta resolução espaço-temporais através de um pacote de software em casa. Usando esta técnica, os padrões contráteis linha de base e efeitos farmacológicos sobre a função ENS no cólon segments podem ser comparados ao longo de 3-4 h. Além disso, o comprimento de propagação e velocidade de CMMCs podem ser gravados, bem como alterações no diâmetro do intestino e frequência de contração. Esta técnica é útil para caracterizar os padrões de motilidade gastrointestinal em modelos de ratinho transgénicos (e em outras espécies, incluindo ratos e cobaia). Desta forma, as alterações induzidas farmacologicamente em CMMCs são registadas em ratinhos de tipo selvagem e no modelo de ratinho R451C neuroligin-3 de autismo. Além disso, esta técnica pode ser aplicada a outras regiões do tracto gastrointestinal, incluindo o duodeno, jejuno e íleo e em diferentes idades de desenvolvimento em ratinhos.
Introduction
O sistema nervoso entérico (ENS) representa a rede neuronal intrínseca do tracto gastrointestinal e modula várias funções, tais como a digestão do conteúdo intestinal, absorção de nutrientes e a secreção e reabsorção de fluido. Neurônios do ENS estão localizados nas mioentéricos e submucoso plexos. O plexo mientérico desempenha um papel importante na regulação da motilidade gastrointestinal 1 ao passo que o plexo submucosa é principalmente envolvida no controlo da secreção de 2,3. O plexo mientérico está situado entre as camadas de músculo circular e longitudinal da parede gastrointestinal. A actividade contráctil das camadas de músculo liso da parede intestinal facilita as funções primárias do tracto gastrointestinal através da mistura e impulsionando conteúdo intestinal ao longo do comprimento do intestino 3. Embora o fornecimento do nervo extrínseca ao tracto gastrointestinal do SNC contribui para a função gastrointestinal in vivo, O ENS é capaz de regular a função gastrointestinal de forma independente. Esta característica única permite a investigação funcional dos circuitos neuronais entéricas ea sua contribuição para a motilidade gastrointestinal ex vivo.
Colo complexos motor migrante (CMMCs) são espontâneos, eventos neurogénicos que são o padrão motor predominante observado no rato cólon isolado na ausência de partículas fecais 4-9. CMMCs são definidos como contracções rítmicas que se propagam ao longo de uma distância horizontal que é pelo menos metade do comprimento total do cólon (ou seja, a partir do ceco até ao recto) 10. A relação entre CMMCs e os padrões contráteis que impulsionam pelotas fecais está ainda a ser claramente estabelecida, no entanto, algumas diferenças farmacológicas foram relatados 11. No entanto, a capacidade do ENS a funcionar independentemente do SNC e a existência de padrões motores mediada por neurais na IScólon olated proporciona um sistema de ensaio ideal para examinar distúrbios na motilidade resultantes da disfunção subjacente ENS. A espontaneidade dos padrões motores gastrointestinais permite alterações funcionais em resposta a estímulos farmacológicos a ser avaliada.
O uso de imagens de vídeo e mapeamento espaço-temporal foi desenvolvido pela primeira vez para analisar quantitativamente pequena peristaltismo intestinal em cobaias 12. Aqui, uma técnica ex vivo é descrito que permite o estudo de rato padrões de motilidade do cólon usando imagens de vídeo e a análise destas gravações para a construção de alta resolução (~ 100 uM, 33 mseg) mapas de diâmetro do cólon em função da posição ao longo do cólon e de tempo (mapas espaço-temporais). Usando o software in-house detecção de flanco (Analyse2; disponível a pedido), os dados de todo o comprimento do cólon segmentos contratantes em tempo real são processados para gerar mapas espaço-temporais para cada experimento. Nesta etapa, arquivos de vídeo (AVI) são summazado e convertido em mapas espaço-temporais usando Analyse2. Mapas espaço-temporais (Figura 2) retratam a contratilidade ao longo do tempo e permitir a medição de vários parâmetros, incluindo velocidade de propagação, magnitude, extensão e duração. Gut diâmetro é também registado em toda a duração da experiência como uma medida da contractilidade global do segmento de tecido. Este método pode ser aplicado para identificar diferenças no ponto de início de complexos contrácteis que poderia indicar a conectividade neural entérico alterada.
Um protocolo de imagens de vídeo semelhante concebido para avaliar sedimento de propulsão em cobaias foi avaliado 13 no entanto aqui descrevemos a aplicação da abordagem de imagens de vídeo para a quantificação da motilidade do cólon espontânea (isto é, na ausência de peletes). Nós também fornecemos informações detalhadas para ajudar na dissecção e preparação do tecido gastrointestinal para a abordagem de imagem de vídeo. esteprotocolo fornece aos pesquisadores uma ferramenta acessível e facilmente replicado para análise de controle neural entérica da função gastrointestinal em modelos animais da doença, incluindo modelos genéticos do rato.
A técnica de imagiologia de vídeo permite a análise da motilidade do cólon em resposta a vários agentes farmacológicos. Os fármacos podem ser administrados através do lúmen do intestino ou ao banho de órgãos externos para a preparação do cólon. Diferentes regiões do tracto gastrointestinal de rato exibem padrões de motilidade específicas tais como pequena segmentação CMMCs intestinal e no cólon.
Esta técnica tem sido utilizada para identificar diferenças de estirpes em pequena função intestinal; sensibilidade diferencial de 5-HT3 e 5-HT4 antagonistas foram observados no jejuno de ratinhos Balb / c e C57 / BL6, devido à natureza polimórfico do gene TPH2 expressa nas duas estirpes 6. O efeito de inibição da 5-HT sobre a motilidade permanece concontroversa, como dados conflitantes tem sido relatado sobre a importância da endógena 5-HT sobre o peristaltismo do cólon e CMMCs 14,15. As alterações na motilidade e pré-pós-natal durante o desenvolvimento e 7, os efeitos de mutações genéticas na motilidade gastrointestinal em modelos animais de doenças 10 também pode ser examinado por utilização de imagem de vídeo. Aqui, ilustramos a utilização do método para um estudo da motilidade do cólon, no modelo de ratinho de NL3 R451C autismo, o qual expressa uma mutação sem sentido no gene que codifica a proteína NLGN3 adesão sináptica neuroligin-3 16. Esta mutação foi identificada pela primeira vez em pacientes diagnosticados com transtorno do espectro do autismo (ASD) 17, que está fortemente associada com disfunção GI 18-22. Nós investigamos se a mutação sináptica NL3 R451C afeta saídas neurais no ENS utilizando a técnica de imagem de vídeo. São apresentados dados que caracterizam CMMCs na linha de base e, em resposta ao 5H serotonérgicaT 3/4 receptor antagonista tropissetrom no modelo de ratinho de NL3 R451C de autismo.
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Protocol
manejo dos animais e deslocamento cervical de animais antes de todas as experiências foram realizadas estritamente de acordo com protocolos aprovados pelo Comitê Experimentação Animal da Universidade de Melbourne (Ética ID: 1.212.494,7)
1. Tissue Recolha e Dissection
- Euthanize camundongos adultos por deslocamento cervical. Se possível evitar a anestesia para evitar influências sobre a função intestinal através de receptores localizados em populações neuronais de interesse.
- Grave peso corporal total do animal, pino do corpo (através das quatro patas, lado ventral expostos ao experimentador) firmemente a uma placa de dissecção utilizando agulhas hipodérmicas (Tamanho: 20 G).
- Usando dissecando pinça e tesouras; fazer uma incisão através da epiderme sobrepondo as camadas musculares abdominais inferiores. Continuar a usar a pinça e tesouras para abrir a cavidade abdominal ao longo da linha média do abdome ao esterno.
- Para evitar que a desidratação dos tecidos, despeje physisalina ological (solução de Krebs: 118 NaCl, 4,6 KCl, 2,5 CaCl2, 1,2 MgSO4, 1 NaH 2 PO 4, 25 NaHCO3, 11 de D-glucose em mM - borbulhar à temperatura ambiente com gás carbogénio; 95% de O2 e 5 % de CO 2 durante um período mínimo de 20 min) para o conteúdo abdominal, em intervalos regulares (isto é, a cada 30-60 seg) durante o processo de dissecção.
- Para isolar o cólon quando estiver ligado ao ceco e do recto, segurar o ceco (localizado adjacente à extremidade proximal do cólon) suavemente, utilizando fórceps de dissecação de aproximadamente 4-5 cm acima do corpo do animal ao aparar o mesentério usando tesouras de dissecação fina.
- Tome cuidado para não segurar, esticar ou cortar o tecido gastrointestinal durante a remoção do mesentério adjacente.
- Remover o excesso de tecido (ou seja, bexiga urinária e testículos). Com uma tesoura de dissecação grosseira, fazer duas incisões verticais (ou seja, aproximadamente 0,5 cm da linha média) para cortar o osso pélvico na EACH lado do cólon.
- Use uma tesoura fina para separar o reto a partir adjacente tecido pélvico e aparar em torno músculos do cólon.
- Colocar os dois pontos de comprimento completo (a partir de ceco para reto) num copo contendo uma solução salina fisiológica (previamente oxigenada com carbogéneo) e continuar a oxigenar à TA. Remover o ceco e reto usando tesouras de dissecação finas e substituir em proveta.
- pastilhas fecais vazio / conteúdo intestinal a partir de preparações do cólon através da aplicação de pressão positiva suave no final oral, utilizando uma seringa de 5 ml ligado a uma ponta de pipeta 200 uL cheio com solução salina fisiológica. A fim de orientar o tecido, no futuro, utilizar um pino de insectos para marcar a extremidade mais proximal do cólon, em que as estrias na mucosa são visíveis.
- Modificar a ponta da pipeta de plástico para se ajustar à seringa de 5 ml por remoção de aproximadamente 1 cm da extremidade mais larga / proximal usando uma lâmina de barbear. Para aumentar a taxa de fluxo, alargar a extremidade distal / inferior em corte numa Angle (aproximadamente 45 ° C), utilizando uma lâmina de barbear.
- Segure o tecido do cólon suavemente na sua extremidade proximal com uma pinça de dissecação, insira a ponta da pipeta para o lúmen do cólon e soro fisiológico nivelado através do lúmen.
2. Preparação de cólon de tecidos e Experimental Set Up for Imaging Vídeo
- Solução salina fisiológica através de toda a tubagem nivelado ligado a um banho de órgão dois septadas configurar (Figura 1 e Figura 3), utilizando uma seringa ligada a uma ponta de pipeta de 200 uL. Este passo remove quaisquer detritos dentro da tubagem que poderia bloquear o fluxo da solução. Para tubos especificações referem-se a tabela de materiais.
- Assegure-se que as câmaras de banho de órgãos são continuamente superfusão com solução salina fisiológica borbulhada com carbogénio (95% O 2 e 5% de CO 2, a taxa de 5 mL min -1 Flow). Usando uma sonda de temperatura em intervalos regulares, garantir que o temperature do banho é mantida entre 33 ° C -37 ° C.
- Encher o reservatório de entrada ligado através de uma torneira de passagem de 3 vias para o tubo de entrada com cerca de 20-30 ml de soro fisiológico usando uma seringa de 50 ml.
- Durante a experiência, mantém a pressão no reservatório de fluxo utilizando arubber rolha com um tubo de vidro (5 mm de diâmetro interno) inserido através do seu centro. Certifique-se de que a abertura superior do reservatório entrada está firmemente selado (com o tubo de vidro interior restante não selada).
- Colocar o cólon (5-7 cm de comprimento) para a câmara de banho de órgãos, certificando-se de que ele é inteiramente submerso em solução salina fisiológica.
- Canular cada extremidade do segmento do cólon para os dois tubos de entrada / saída submersos (entrada / tubos de saída de diâmetro diferente podem ser alteradas de acordo com o tamanho do lúmen de tecido, por exemplo. Tecido pós-natal, ratos adultos e cobaia) no banho usando o padrão linhas de costura de algodão. Prendem a extremidade proximal do cólon para o tubo de entrada eoextremidade distai do cólon para o tubo de saída (ligado através de uma torneira de passagem de 3 vias para um tubo de saída vertical; de 6 cm de altura). Certifique-se de que o tecido não é sobrecarregado ou muito relaxado após punção para evitar a interferência com as medições e análises futuras.
- Grave o comprimento do cólon, medindo a distância entre as extremidades proximal e distal utilizando cânulas uma régua 15 centímetros. Isto é importante para a interpretação das variações de comprimento contracção, a velocidade de propagação e os pontos de iniciação contracção.
- Assegurar uma pressão de linha de base estável luminal (cm H2O) é estabelecida antes de começar a experiência. Calcular pressão luminal por medição da distância vertical entre o tecido do menisco de solução salina fisiológica dentro do tubo de vidro do reservatório de entrada (por via oral) e o tubo de saída vertical (anal).
- Manter preparações de tecido, a uma pressão constante intraluminal (por exemplo, 1-2 cm de H 2 O), assegurando que o fluxo de vedação pressu rolhare é mantido constante e que não há bloqueios estão presentes no set up.
- Deixar o cólon para equilíbrio em solução salina fisiológica durante 30 minutos antes de gravar os movimentos intestinais. Entrada para quaisquer bloqueios resultantes nos tubos de entradas ou saídas e removê-los por aplicação de pressão através do reservatório de entrada ou por re-canulação as extremidades oral e anal do cólon.
3. Captura de Imagem e Protocolo Experimental
- Movimentos intestinais recordes como arquivos de vídeo usando uma câmera de vídeo (30 quadros / segundo, 640 x 840 pixels) posicionado 10-15 cm acima do banho de órgãos em uma réplica de laboratório padrão ficar (Figura 1).
- Abra Dub virtual (software de captura de vídeo) a partir do ícone na área de trabalho. Na guia "Arquivo", selecione "AVI captura 'para visualizar a imagem da câmara. No 'Audio' não selecção separador «permitir a captura de áudio 'para desativar o som.
- Na guia vídeo, selecione "compressão" e "DivX6.9.2. Codec & #39; para comprimir arquivos de vídeo para minimizar o uso de espaço de armazenamento. Esta função estará disponível após a instalação do software de compressão 'DivX'.
- Ajustar manualmente a localização da câmera para que todo o segmento de cólon cânula é visível (com regiões de cânula imediatamente adjacentes às bordas verticais do quadro de vídeo) através de janela do software de captura de vídeo (veja a Figura 1). A fim de melhorar a qualidade de imagem e minimizar as reflexões, anexar um escudo de papel / cartão para o apoio da câmara para bloquear a luz externa para o banho de órgãos. Otimizar a qualidade de vídeo, ajustando as definições de brilho, contraste e exposição utilizando a interface do software da câmera.
- Antes de gravar, defina um nome de arquivo específico; na guia "Arquivo", selecione 'Definir arquivo de captura' e especifique um nome exclusivo para o vídeo.
- Iniciar a captura de vídeo pressionando 'file Capture' do 'Capture' barra de ferramentas. Para parar recording selecione o botão "Parar captura 'ou a tecla" Esc "no teclado.
- Substituir o soro fisiológico contido no interior do reservatório de entrada com uma solução salina fisiológica fresca a cada 30 min.
- pressão registro luminal (ver 2.9) e utilizando uma sonda de temperatura, anote a temperatura do banho de órgãos. Repetir estes passos ao longo da experiência (isto é, a cada 30 minutos) para assegurar que estas variáveis são constantes.
- atividade colônica registro no total para 3 horas (incluindo a aplicação de drogas e duração washout). Para fins de armazenamento de dados, registro de dados em segmentos de vídeo 15 min. Uma experiência completa será tipicamente composto por gravações de vídeo 12 x 15 min.
- atividade recorde de 1 hora sob condições de controle (soro fisiológico).
- Aplicar a droga (ou superfusão para o banho ou administrados para o lúmen através do reservatório de fluxo) durante 30 min a 1 h.
Nota: Diferentes vias de administração podem yield efeitos diferentes 23. - Aplicar soro fisiológico fresca para o banho ou na luz durante um período de lavagem de 1 hora.
Processamento 4. Dados e Geração de espaço-temporais Mapas
- Processo de cada desligada gravação de vídeo usando o software in-house escrito em MATLAB (R2012a, Versão 7.4, disponível a pedido), a fim de gerar mapas espaço-temporais que ilustram a motilidade do cólon.
- software de análise aberta a partir do ícone na área de trabalho.
- Na janela de comando, digite "Analyse2" para abrir o painel de controle de análise.
- Utilize a função de detecção de bordas para gerar mapas espaço-temporais, clicando em "A detecção de bordas para arquivos .avi" na janela do painel de controle. Esta função irá permitir que o software de análise para ler os vídeos recodificadas em formato Audio Video Interleaved (AVI).
- Realizar os seguintes passos sequencialmente para gerar mapas espaço-temporais usando um adaalgoritmo de detecção de borda ptive.
- Abrir arquivos de vídeo gravados por selecionar a guia "Adicionar arquivos", selecione "Abrir vídeo 'e selecione o local dos arquivos de vídeo.
- A partir dos arquivos de vídeo listados dentro do software de análise, selecione o arquivo de interesse.
- Seleccionar uma região rectangular de interesse dentro do quadro do vídeo, por exemplo, todo o comprimento do cólon, desde o ponto em que o cólon é canulada por via oral para a canulação Anal. Assegurar que os pontos de canulação proximal e distal são adjacentes aos limites verticais da região de interesse. linhas de detecção de flanco (vermelho e verde) será automaticamente aparecem sobrepostos na imagem em tempo real.
- Certifique-se de que as linhas de limiar de detecção de borda são imediatamente adjacentes aos dois pontos em ambos os limites superior e inferior do tecido do cólon (isto pode ser optimizado para cada vídeo, alterando os valores de limiar de detecção do painel de controlo). Certifique-se de que a detecção l bordaines são contínuos ao longo do comprimento do cólon imagem, ajustando o contraste e o brilho utilizando o painel de controlo.
- Digite o comprimento total do cólon (mm) na caixa de diálogo largura (como registrado no passo 2.7). Em seguida, selecione "Gerar mapa de calor".
- Na janela pop-up, selecione um local para o arquivo a ser salvo e especifique um nome de arquivo para o mapa espaço-temporal.
- Selecione o formato de '.su2 "e selecione" Adicionar à fila'.
Nota: O formato .su2 comprime dados para um tamanho menor e vários arquivos de vídeo podem ser adicionados à fila. - Selecione 'Comece a detecção' para gerar mapas espaço-temporais.
5. Análise do espaço-temporais Mapas
- Utilize mapas espaço-temporais para estimar parâmetros como frequência, velocidade de propagação, comprimento e duração da CMMCs, diâmetro do intestino e do ponto de iniciação e direção de contrações.
- Para iniciar a análise espaço-temporalmapas, tipo 'analyse2' na janela de comando como descrito na seção anterior. Em vez de "detecção Edge", selecione o botão "análise do mapa de calor".
- Abra os arquivos do mapa espaço-temporais (arquivos .su2) seleccionando a opção "Adicionar arquivos 'e especificar a localização dos arquivos previamente obtidos .su2.
- Uma vez que o mapa espaço-temporal é visível no ecrã, especificar uma gama de cores do painel de controlo, assegurando que o mínimo é definido como 1.
Note-se que a máxima pode variar 5-10 de acordo com a contractilidade do tecido. - Selecione 'Lock gama de cores' para garantir que todos os mapas a partir de uma única experiência são analisados sob as mesmas condições.
- Certifique-se de que as definições de espaço de tempo são constantes para todos os mapas espaço-temporais de um determinado experimento.
- A fim de determinar a frequência CMMC, contar manualmente contracções em mais do que 50% do comprimento do cólon. Estas contracções podem ser visualized como riscas vermelho / laranja (padrão de índice de cor HSV) no mapa espaço-temporal (ver Figura 2 para um exemplo). Outros contracções que são mais curtos ou não se propagam também podem ser identificados e quantificados.
- Se desejar, realizar uma análise mais aprofundada em uma resolução maior a partir destes mapas. Por exemplo, pode ser examinado propriedades específicas, incluindo a velocidade e a duração de cada contracção.
- A fim de medir a velocidade e duração, selecione o botão "Anotar as ondas de contração" no painel de controle de análise do mapa de calor.
- Em seguida, ampliar para cada CMMC clicando no botão "Zoom" e selecionando a área de interesse. Em seguida, selecione o botão "anotar manualmente" para anotar cada contração, usando o mouse para desenhar uma linha a partir da posição mais inicial ao final de cada contração. Este método pode ser utilizado para medir a velocidade de propagação aparente e a duração de dilatações que parecem propagar (por exemplo, ver umaal final de mapas na Figura 2A, 2B).
Nota: Os dados para a velocidade ea duração será exibido na janela de resultados. Estes valores podem ser transferidos para uma planilha de interesse, selecionando a guia "Exportar dados". anotações indesejados podem ser removidos clicando no botão "Remover anotações selecionado".
- Se desejado, utilizar a coordenadas x e y de os mapas de espaço-temporais (tempo e posição ao longo do cólon, respectivamente) para determinar a posição de início de pequenas contracções ou CMMCs.
- Da mesma forma, a fim de determinar os intervalos entre as contrações, use a função "Anotar" para medir a duração entre as contrações. Tal como anteriormente, estes resultados podem ser exportados para uma planilha selecionando a guia "Exportar dados".
- A fim de medir a largura do intestino descansando, selecione o botão "Take seção transversal" no painel de análise do mapa de calor.
- Escolha 'Adicionar9; no painel secções transversais temporal. Dê um duplo clique em qualquer local dentro do mapa para gerar uma linha horizontal sobreposto ao mapa de calor. dados relativos ao diâmetro Gut agora será exibido em uma nova janela.
- Para medir o diâmetro do intestino, coloque o cursor em um pico e da calha adjacente para obter largura média intestino para uma condição experimental específico. A alteração do diâmetro do intestino pode ser comparada entre as condições experimentais.
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Representative Results
Até 90% dos pacientes com TEA experimentar uma variedade de desordens gastrintestinais, incluindo a diarreia e a constipação 18,24,25. No entanto, as causas subjacentes a estes problemas gastrointestinais são desconhecidos. Muitas mutações identificadas em pacientes com ASD estão associados a proteínas sinápticas contribuindo para alterações e perturbações na transmissão ou função sináptica. Uma tal mutação, no gene que codifica para a molécula de adesão celular neuroligin-3 (NL3 R451C), foi identificada em dois irmãos com ASD 17. Esta mutação resulta em um resíduo de arginina na posição 451 da proteína neuroligin ser substituído com um resíduo de cisteína. Camundongos NL3 R451C expressando esse show mutação aumentou GABA transmissão mediada no córtex somatossensorial 16,26 ao lado aumento da atividade mediada receptor AMPA e NMDA no hipocampo 25,27.
28-30. Como o sistema nervoso entérico desempenha um papel importante na regulação da função gastrointestinal, postulamos que a mutação R451C iria afectar a mobilidade. Por conseguinte, a fim de investigar possíveis alterações nas funções gastrointestinais devido a anormalidades sinápticas procurou-se examinar os efeitos da mutação R451C na frequência CMMC nestes ratinhos.
Como a serotonina (5-HT), actua sobre o ENS para modular a função gastrointestinal em ratos 6 foram analisados os padrões de motilidade em resposta ao 3/4 do receptor 5-HT em preparações tropisetron antagonista do cólon de ratinhos WT e NL3 R451C.
Para avaliar se a mutação altera CMMCs sináptica quando o sistema nervoso entérico é farmacologicamente perturbado, o antagonista do receptor 5HT 3/4 Tropissetrom (Trop;10? M, o que bloqueia tanto 5HT3 e 5HT 4 receptores) foi adicionado ao banho contendo a preparação do cólon (Figura 2). Foi utilizado tecido do cólon de dezenove anos ratos combinado do sexo masculino (11 WT e 8 NL3 R451C). Na presença de tropisetrona, ratinhos NL3 R451C mostrou uma diminuição na frequência CMMC em comparação com WT da mesma ninhada. Exemplos representativos de mapas de espaço-temporais que mostram CMMCs e actividade contráctil em preparações cólon WT e R451C NL3 são mostradas nas Figuras 2A a 2E, respectivamente. Embora não se observou nenhuma diferença entre WT e NL3 R451C durante condições de controlo, tropissetrom reduziu significativamente a frequência CMMC em ambos os ratinhos WT e NL3 R451C (Figura 2C, 2F). Em ratinhos WT, o número médio de CMMCs foi 23 em condições de controlo em comparação com 15 em tropisetron (p = 0,023). Em ratinhos NL3, o número médio de CMMCs em condições de controlo foi de 19,5em comparação com 2 na presença de tropisetrona (p = 0,022). Além disso, tropissetrom teve um efeito maior sobre a frequência de CMMCs em camundongos NL3 R451C em comparação com WT (p = 0,047).
Figura 1. banho de órgãos configurar e geração de mapas de espaço-temporais. (A) um segmento gastrointestinal recém-dissecados é colocado num banho de órgãos (vista em corte transversal) contendo solução salina fisiológica e canulada em extremidades orais e anais. A cânula oral é ligado a um reservatório de entrada cheia com solução salina fisiológica e a cânula Anal ligado a um tubo de saída. Uma câmara de vídeo está colocado por cima do banho de órgãos, a fim de registar a actividade contráctil do cólon. (B) a motilidade é convertida em alta resolução regiões de rotulagem mapas espaço-temporais do cólon que são dilatados em regiões azuis e constrição iN vermelho. (C) Um mapa espaço-temporal mostrando motilidade do cólon (CMMCs) de um rato WT adulto. CMMCs individuais são indicados como regiões verticais vermelhas dentro do mapa. O eixo X mostra o aumento do tempo (0-15 min). O eixo Y representa a localização espacial ao longo do segmento de cólon (anal na base, oral na parte superior). Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2. Os mapas espaço-temporal mostram aumento da sensibilidade à Tropisetron em NL3 R451C cólon do rato mapas espaço-temporal mostrando frequência CMMC em segmentos de cólon de controles WT (a) e na presença de Tropisetron. (Trop; B). Trop reduzida frequência CMMC no WT dois pontos (C). Spatiote mapas mporal de NL3 cólon sob condições de controlo (D) e na presença de Trop (E). Trop causou uma forte redução na frequência CMMC em NL3 cólon (F). CMMC frequência em resposta a Trop foi significativamente reduzida em comparação com NL3 cólon WT (p = 0,047, não mostrado). Gut largura (a cor do pixel) é indicada no eixo Y (unidades arbitrárias, escala 1-6). barra de escala em E aplica-se a todos os mapas. trop; Tropissetrom. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3. Esquema de banho de órgãos. (A) Vista de cima, (B) do lado de baixo, (C) vista frontal, (D) Vista lateral, de um banho de órgãos duas câmaras configurar. Dimensões em mm.ref = "https://www.jove.com/files/ftp_upload/53828/53828fig3large.jpg" target = "_ blank"> Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Discussion
Usando esta técnica de imagem de vídeo, a frequência CMMC foi medida como uma indicação da motilidade do cólon em ratos de tipo selvagem e NL3 R451C, um mouse modelo de transtorno do espectro do autismo 17. Os nossos resultados indicam uma redução no número de CMMCs em ratinhos mutantes NL3 R451C, em comparação com ratinhos de tipo selvagem na presença do antagonista selectivo do receptor 5HT 3/4 Tropisetron sugerindo que os ratinhos NL3 R451C exibem uma sensibilidade aumentada a tropisetron. Assim, propõe-se que a mutação R451C neuroligin-3 altera a via de serotonina, potencialmente quer por modulação da função do receptor 5HT 3 ou 4 5HT em neurónios entéricos, a mucosa, ou ambos. Isso destaca o valor do método para a identificação de diferenças fenotípicas entre genótipos e para identificação de alvos específicos para estudos posteriores.
Este método pode ser modificado para melhorar a resolução espacial através da aquisição de vídeo atravésum estereomicroscópio equipado com uma câmara de montagem. Esta abordagem permite gravações para ser feita a partir de pequenas preparações do tracto gastrointestinal em pontos de tempo embrionárias tão cedo quanto 31 E12.5. Neuromoduladores pode ser aplicada através do lúmen ou no banho de órgão externo para a preparação do cólon. Além disso, este método é útil para avaliar as grandes e pequenas da motilidade gastrointestinal num intervalo de espécies, incluindo ratos, ratazanas e cobaias.
passos de resolução de problemas comuns para este método incluem a verificação do fluxo de solução através do tubo, a viabilidade da preparação de tecido, a manutenção da pressão constante luminal e assegurar que os segmentos de cólon estão localizados longe das paredes do banho de órgãos. Bloqueios dentro do tubo pode alterar a pressão luminal e evitar contrações ocorra; portanto, todos os tubos devem ser cuidadosamente limpas para remover cristais de sal ou restos de matéria / fecal antes da canulação. O ar deve ser removido a partir de linhas de tubagem directamente associada com a cânula antes das experiências (isto é, por iniciação dos tubos com solução salina). Além disso, as preparações de tecido devem ser manuseados com cuidado, a fim de evitar danos, resultando em imobilidade do cólon. Para evitar danos nos tecidos, assegurar que o cólon é firmemente (mas não firmemente) ligado à cânula durante o processo de gravação e manter uma temperatura constante e um fornecimento contínuo de CO 2 + O 2 ao banho. Também assegurar que a pressão é mantida constante luminal e que não há contracções são iniciadas manualmente ajustando reservatórios de influxo durante o período de gravação. Certifique-se de que o tecido do cólon não contacta com a parede do banho de órgãos durante as contracções como isso vai impedir análise de detecção de borda dos mapas temporais e espaciais relevantes. Isto pode ser evitado através da monitorização das contracções durante o período de equilíbrio e ajustando a posição do cólon para impedir que isto ocorra durante a experiência.
_content "> Vários limitações associadas a esta técnica deve ser levado em consideração na análise e interpretação dos dados, incluindo a baixa natureza rendimento desta abordagem. Enquanto o método é eficaz na identificação de alterações na migração de padrões motores, não pode determinar se dilatações ocorrendo durante a progressão de um CMMC são neuralmente mediada ou simplesmente respostas passivas para a actividade contráctil (isto é, resultante da circulação de fluidos). os gradientes de concentração para a difusão através da parede do cólon permitir que os efeitos de drogas luminally aplicadas a ser atribuída a acções dentro do mucosa, mas em experiências prolongadas degeneração da mucosa pode ocorrer alterando assim os sítios de acção destas drogas sobre o período de gravação. Além disso, se as drogas têm efeitos distintos nas mioentérico e submucoso plexos não pode ser determinado utilizando este método. em contraste, esta abordagem permite uma avaliação colectiva de efeitos sobre a ne entéricasistema rvous medindo uma mudança global nos padrões de motilidade. Outras considerações incluem a necessidade de ter em conta a natureza dos dados (ou seja, dados de contagem para a freqüência CMMC, exigindo análise não paramétrica) e a baixa frequência de CMMCs, ao projetar experimentos e estratégias de análise de dados apropriados.Recentemente, Barnes e colegas propuseram que o tecido do cólon requer estimulação, a fim de observar CMMCs 32, no entanto, publicaram os resultados do nosso laboratório demonstram que CMMCs espontâneos pode ser observado por simplesmente prendendo o tecido ao banho de órgãos através do mesentério 7. A presença de CMMCs nessas condições demonstra não só a espontaneidade da CMMCs, mas reforça a utilidade desta técnica para estabelecer as alterações da motilidade do cólon. Embora esta abordagem é aplicável às regiões extra-do cólon do tracto gastrointestinal, a complexidade da motilidade intestinal pequena requer mais detafligia estratégias de análise do que os utilizados para quantificar CMMCs 33.
Esta abordagem experimental tem muito alta resolução espacial e temporal e inclui a opção de entrega da droga, tanto externa para e no interior do lúmen para investigar os efeitos de diferentes gradientes de concentração no sistema nervoso entérico. Além disso, este método é adequado para a análise de pequena segmentação intestinal durante o estado alimentado 6,23. A natureza ex vivo do presente método permite que o papel do sistema nervoso entérico a ser avaliada na ausência de alimentação do sistema nervoso central e é, por conseguinte, uma forma ideal para investigar a motilidade gastrointestinal em uma variedade de modelos, incluindo modelos genéticos de doença (ver figura 2) 6,34.
Este método também pode ser utilizado para comparar dados fisiológicos para simulações de computador da actividade motora 23,33,35. Tais simulações podem prever padrões motores ema forma de mapas espaço-temporais para comparações directas com experimentos fisiológicos 33,35. Usando Transformada Rápida de Fourier e análise wavelet 36, a contribuição de estimuladores de músculo liso (gerado pelas células intersticiais de Cajal) a motilidade pode também ser extraído. Além disso, esta técnica de imagem de vídeo podem ser combinados com a gravação extracelular de actividade eléctrica no músculo 3 para permitir que as contribuições de neural e geradores de padrão miog�icas ser distinguidos. Note-se, o método de gravação extracelular resolve inibidores potenciais de junção, na ausência das contracções do músculo liso ou relaxamentos.
Embora esta técnica é bem estabelecido para a análise da motilidade gastrointestinal em uma vasta gama de preparações e espécies, que também tem o potencial de ser utilizado em outros sistemas, tais como o estudo de vasoconstrição no mesentério (anteriormente analisados por meio de um sistema de acompanhamento de diâmetro mais simples 37) eno músculo esquelético.
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Acknowledgments
JCB e ELH-Y foram apoiadas pelo Departamento de Defesa dos EUA CDMRP Programa de Pesquisa em Autismo (AR11034). NHMRC (1047674) para ELH-Y.The Maio Stewart Bursary-University of Melbourne confiança financiado bolsa para MS. Agradecemos Ali Taher, Fátima Ramalhosa e Gracia Seger para as contribuições técnicas.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagents | |||
| NaCl (MW: 58.44) | Sigma-Aldrich | S7653-250G | |
| KCl (MW: 74.55) | Sigma-Aldrich | P9333-500G | |
| NaH2PO4.2H2O (MW: 156.01) | Chem Supply | 471-500G | |
| MgSO4.7H20 (MW: 246.48) | Chem Supply | MA048 | |
| CaCl2.2H2O (MW: 147.02) | Chem Supply | CA033 | |
| D-Glucose anhydrous (MW: 180.16) | Chem Supply | GA018-500G | |
| NaHCO3 (MW: 84.01) | Chem Supply | GA018-500G | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Materials | |||
| Two chambered organ bath Dimentions: 14 cm x 8 cm x 3 cm |
Custom Made | Contact Laboratory Directly | |
| 732 MULTI -PURPOSE SEALANT CLEAR | Dow Corning Australia Pty Ltd | 1890573 | |
| SYLGARD 184 SILICONE ELASTOMER KIT | Dow Corning Australia Pty Ltd | 1064291 | |
| STOPCOCK 3 WAY FEM-ML L/LOCK S | Terumo Medical Corporation | 0912-2006 | |
| SYRINGES with Luer Lock Tips 50 ml, 20 ml, 10 ml | Terumo Medical Corporation | N/A | |
| 1.57 mm (ID) x 3.16 mm (OD) - Silastic Tubing | Masterflex | 508-008 | |
| 1.02 mm (ID) x 2.16 mm (OD) - Silastic Tubing | Masterflex | 508-005 | |
| 1.50 mm (ID) x 2.50 mm (OD) - Silastic Tubing | Masterflex | 508-007 | |
| 1.60 mm (ID) - Platinum cured silicone tubing | Masterflex | 96410 - 14 | |
| 4.40 mm (ID) - Platinum cured silicone tubing | Masterflex | 96410 - 15 | |
| 3.10 mm (ID) - Platinum cured silicone tubing | Masterflex | 96410 -16 | |
| Graduated Laboratory Glass Bottles - 500 ml | Thermofisher Scientific | 100-400 | |
| CHEMICAL RUBBER STOPPER 57 x 65 mm | |||
| CHEMICAL RUBBER STOPPER 29 mm x 32 mm | |||
| Water heater (thermo regulator) | Ratek | TH7000 | |
| Logitech Webcam | Logitech | ||
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Software | |||
| Virtual Dub - 1.9 11 | virtualdub.org | ||
| MATLAB R2012a | Graph Pad | ||
| Logitech Webcam Software | Logitech |
References
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