Abstract
Энтеросолюбильное нервной системы (ENS) играет важную роль в регуляции желудочно (ГИ) подвижность и может функционировать независимо от центральной нервной системы. Изменения функции ENS являются основной причиной симптомов GI и болезни и может способствовать желудочно-кишечные симптомы, зарегистрированных в нервно-психических расстройств, включая аутизм. Хорошо известно, что изолированные сегменты кишки генерировать спонтанные, ритмические сокращения, известные как ободочной мигрирующий моторный комплекс (CMMCs). Процедура для анализа кишечно нервной регуляции CMMCs в Экс Vivo препараты толстой кишки мыши описана. Толстой кишки рассекают от животного и промыть, чтобы удалить фекальные содержание до того, как канюлю в ванночку. Данные приобрела с помощью видеокамеры, расположенной над ванночку и преобразуется в высоком разрешении пространственно-временных карт с помощью пакета программного обеспечения в доме. Используя эту технику, базовые модели сократительные и фармакологическое действие на функции ENS в толстой кишки сegments можно сопоставить по 3-4 ч. Кроме того, длина распространения и скорость CMMCs могут быть записаны, а также изменения в диаметре кишки и частоты сокращений. Этот метод полезен для характеристики желудочно-кишечной активности узоры в трансгенных мышах (и в других видов, включая крыс и морских свинок). Таким образом, фармакологически индуцированные изменения в CMMCs записываются в мышей дикого типа и в мышиной модели R451C нейролигины-3 аутизма. Кроме того, этот метод может быть применен и в других регионах желудочно-кишечного тракта, включая двенадцатиперстной кишки, тощей и подвздошной кишки и в различном возрасте развития у мышей.
Introduction
Энтеросолюбильное нервной системы (ENS) представляет собой характеристическую нейронной сети из желудочно-кишечного тракта и модулирует различные функции, такие как переваривание содержимого кишечника, всасывание питательных веществ и секреции и реабсорбции жидкости. Нейроны ENS находятся в мышечной оболочки кишечника и подслизистой сплетения. Мышечной оболочки кишечника сплетения играет важную роль в регуляции желудочно-кишечного 1 тогда подслизистой сплетения в основном занимается контролем секреции 2,3. Мышечной оболочки кишечника сплетения расположен между продольными и круговыми слоями мышечных желудочно-стены. Сократительной активности слоев гладких мышечных кишечной стенки облегчает первичные функции желудочно-кишечного тракта путем смешивания и метательные кишечного содержимого по длине кишечника 3. Хотя внешняя иннервация желудочно-кишечного тракта из ЦНС способствует функции желудочно-кишечного в естественных, То ЭНС способен регулировать функции желудочно-кишечного независимо. Это уникальное свойство позволяет функциональную расследование кишечных нервных цепей и их вклад в желудочно-кишечного экс естественных.
Толстокишечные мигрирующий моторный комплекс (CMMCs) спонтанные, нейрогенные события, которые являются преобладающими узор двигателя наблюдается в изолированной толстой кишке мышей в отсутствие фекальных шариков 4-9. CMMCs определяются как ритмических сокращений, которые распространяются вдоль горизонтального расстояния, что, по меньшей мере половина общей длины толстой кишки (т.е., от слепой кишки до прямой кишки) 10. Отношения между CMMCs и узоров сократительных которые продвигают фекальные шарики еще четко установлено, однако некоторые фармакологические различия были зарегистрированы 11. Тем не менее, способность ENS функционировать независимо от ЦНС и существование нейронных опосредованного моделей моторных в ISolated толстой кишки представляет собой идеальную аналитическую систему для изучения нарушений в подвижности в результате основной дисфункции ENS. Спонтанность желудочно-кишечных моделей моторных позволяет функциональные изменения в ответ на фармакологические раздражители должны быть оценены.
Использование видео изображений и пространственно-временной картографии была впервые разработана количественно изучить небольшой перистальтику кишечника у морских свинок 12. Здесь, экс виво методика описана, что позволяет исследовать мыши ободочной узоров моторики с использованием видео изображений и анализ этих записей, чтобы построить с высоким разрешением (~ 100 мкм, 33 мсек) карты толстокишечной диаметром как функция положения вдоль толстой кишки и времени (пространственно-временных карт). Использование ПО в доме детектирования кромки (Analyse2; предоставляется по запросу), данные из полноразмерных ободочной сегментов сжимается в реальном времени обрабатываются для генерации пространственно-временных карт для каждого эксперимента. На этом этапе, видеофайлы (AVI) являются отличиемавторизованном и преобразуется в пространственно-временных карт с использованием Analyse2. Пространственно-временные карты (Рисунок 2) изображают сократимость течением времени и позволяет измерять нескольких параметров, включая скорость распространения, величине длины и продолжительности. Диаметр Gut также записывается в течение всего срока эксперимента в качестве меры общей сократимости сегмента ткани. Этот метод может быть применен для идентификации различий в точки инициации сократительных комплексов, которые могут указывать измененное кишечно нейронную связь.
Аналогичный протокол видеоизображения предназначен для оценки гранул тягу у морских свинок было сообщено 13 однако здесь мы приводим применение подхода визуализации видео для количественного определения спонтанной моторику толстого кишечника (т.е. при отсутствии гранул). Мы также предоставить подробную информацию для содействия в вскрытия и подготовки желудочно-кишечной ткани для подхода видео изображения. ЭтаПротокол предоставляет исследователям доступной и легко тиражироваться инструмента для анализа кишечно нейронной контроль функции желудочно-кишечного в животных моделях болезни включая генетические мышиных моделях.
Методика видеоизображения позволяет анализировать моторику толстого кишечника в ответ на различные фармакологические препараты. Препараты могут быть введены с помощью просвета кишечника или ванночку внешними по отношению к ободочной подготовки. В разных регионах мыши желудочно-кишечного тракта проявляют определенные шаблоны моторики, такие как тонкого кишечника сегментации и CMMCs в толстой кишке.
Этот метод был использован для идентификации штамма различия в небольшом функции кишечника; дифференциальная чувствительность к 5-НТ 3 и 5-HT 4 антагонистов наблюдались в тощей кишке BALB / C и C57 / BL6 мышей вследствие полиморфной природы гена tph2 выраженной в двух штаммов 6. Эффект 5-НТ ингибированием моторики остается конспорными, так как противоречивые данные Сообщалось о важности эндогенного 5-НТ на толстой перистальтики и CMMCs 14,15. Изменения в подвижности до- и послеродовом периоде при развитии 7, и последствия генных мутаций на желудочно-кишечного в животных моделях болезни 10 также могут быть рассмотрены с использованием видеоизображения. Здесь мы проиллюстрируем применение метода для исследования толстой моторики в мышиной модели NL3 R451C аутизма, который выражает миссенс-мутации в гене Nlgn3 кодирующий синаптическую адгезии белка нейролигины-3 16. Эта мутация была впервые идентифицирована в пациентах с диагнозом расстройства аутистического спектра (ASD) 17, который прочно ассоциируется с GI дисфункции 18-22. Мы исследовали, влияет ли синаптической мутация NL3 R451C нейронных выходов в ENS, используя технику видео изображений. Мы представляем данные, характеризующие CMMCs исходно и в ответ на серотонинергической 5НТ антагонист трописетрон 3/4 рецептора в мышиной модели NL3 R451C аутизма.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Обработка животных и цервикальной дислокации животных до Все эксперименты проводились в строгом соответствии с процедурами, утвержденными экспериментирование комитета животных в Университете Мельбурна по (по этике ID: 1212494,7)
1. Ткань Сбор и Препарирование
- Эвтаназии взрослых мышей путем смещени шейных позвонков. Если возможно избежать анестезии, чтобы предотвратить влияние на функции кишечника с помощью рецепторов, расположенных на нейронных популяций, представляющих интерес.
- Запишите общую массу тела животного, контактный корпус (с помощью четырех лапах, брюшная сторона подвергается экспериментатор) твердо рассечение борту использованием иглы для подкожных инъекций (размер 20 г).
- Использование рассекает щипцов и ножниц; сделать надрез через эпидермис наложения нижней части живота мышечные слои. Продолжать использовать щипцы и ножницы, чтобы открыть брюшную полость вдоль средней линии живота к грудине.
- Чтобы предотвратить обезвоживание тканей, залить physiтодические физиологический раствор (Кребс решение: 118 NaCl, 4,6 KCl, 2,5 CaCl 2, 1,2 MgSO 4, 1 NaH 2 PO 4, 25 NaHCO 3, 11 D-глюкозы в мм - ыми при КТ карбогена газа; 95% O 2 и 5 % СО 2 в течение как минимум 20 мин) на брюшной содержание через равные промежутки времени (например, каждые 30-60 секунд) в течение процесса рассечение.
- Чтобы изолировать двоеточие, будучи прикрепленными к слепой кишке и прямой кишки, провести слепой кишки (расположенной рядом с проксимальным концом толстой кишки) осторожно, используя рассекает щипцов примерно 4-5 см выше тела животного в то время обрезки брыжейки с использованием тонких рассечение ножницами.
- Заботьтесь, чтобы не справиться, растянуть или сократить желудочно-кишечной ткани при удалении прилегающий брыжейки.
- Удалите излишки ткани (т.е., мочевого пузыря и яичек). Используя грубые анатомические ножницы, сделать две вертикальные разрезы (т.е. примерно 0,5 см от средней линии), чтобы сократить тазовой кости на еач сторона толстой кишки.
- Используйте тонких ножниц отделить кишку от прилегающих тазовой ткани и отделки окружающие мышцы из толстой кишки.
- Поместите полноразмерную двоеточие (от слепой кишки до прямой кишки) в стакан, содержащий физиологический раствор (ранее кислородом с карбогена) и продолжают насыщать кислородом при комнатной температуре. Удалить слепой кишки и прямой кишки с использованием тонких рассекает ножницы и замены в стакане.
- Пустые каловые шарики / кишечного содержимого из толстой препаратов путем легкого положительное давление в ротовой конце, используя 5 мл шприц, присоединенный к 200 мкл кончика пипетки, заполненной физиологическим раствором. Для того чтобы ориентироваться в ткани и в будущем, использовать штифт насекомых, чтобы отметить наиболее проксимального конца толстой кишки, где страты в слизистой оболочке видны.
- Изменение пластмассовый наконечник пипетки, чтобы соответствовать 5 мл шприц, удаляя примерно 1 см самой широкой / проксимального конца, используя лезвие бритвы. Для увеличения скорости потока, расширить дистального / меньший конец путем разрезания на англе (примерно 45 ° С), используя лезвие бритвы.
- Ручка чего ткань толстой кишки осторожно на ее проксимальном конце с рассекающих щипцов, вставить наконечник в просвет толстой кишки и флеш физиологическом растворе через просвет.
2. Подготовка толстой ткани и Экспериментальная установка для видеоизображения
- Флеш физиологический через все трубки, присоединенные к бане двухкамерный органов созданной (рисунок 1 и рисунок 3), с помощью шприца, прикрепленный к 200 мкл кончика пипетки. Этот шаг удаляет любой мусор внутри трубки, которые могут блокировать поток раствора. Для труб характеристики, обратитесь к таблице материалов.
- Убедитесь, что в палатах ванночку непрерывно орошали физиологическим раствором продувают карбогена (95% O 2 и 5% CO 2, скорость 5 мл мин -1 течь). Используя датчик температуры через регулярные промежутки времени, убедитесь, что в TEMPERATЮр ванны поддерживают в пределах 33 ° C -37 ° C.
- Заполните притока резервуар, соединенный через 3-ходовым запорным краном, чтобы впускной трубы с примерно 20-30 мл физиологического раствора с использованием 50 мл шприц.
- В ходе эксперимента, поддержания давления в резервуаре для впуска использованием arubber пробку со стеклянной трубкой (внутренним диаметром 5 мм), вставленной через его центр. Убедитесь, что верхнее отверстие впускного коллектора надежно запечатан (с внутренняя труба стекла остальные вскрыты).
- Поместите двоеточие (длина 5-7 см) в ванну камеры органов, убедившись, что он полностью погружен в физиологическом растворе.
- Иглу каждый конец толстой сегмента до двух подводных впускных / выпускных труб (на входе / выходе трубы разного диаметра могут быть изменены в зависимости от размера ткани просвет например. Послеродовую ткани, взрослых мышей и морскую свинку) в используя стандарт ванны нитки хлопчатобумажные швейные. Приложить проксимальный конец толстой кишки, чтобы впускной трубы и томуДистальный конец толстой кишки к выпускной трубе (подключенного через 3-ходовым запорным краном к вертикальной выпускной трубы; 6 см высотой). Убедитесь, что ткань не перегружены или слишком расслаблены после катетеризации, чтобы избежать помех с будущими измерений и анализа.
- Записывают длину толстой кишки путем измерения расстояния между проксимальным и дистальным cannulations использованием 15 см линейку. Это важно для интерпретации изменений в сокращении длины, скорости распространения и точек инициации сокращения.
- Обеспечить стабильную исходную давление просвета (см H 2 O) устанавливается перед началом эксперимента. Рассчитать просвета давление путем измерения вертикального расстояния от ткани мениска физиологического раствора внутри стеклянной трубке впускного коллектора (орального) и вертикальной выпускной трубы (анального).
- Поддержание тканевых препаратов при постоянном давлении в просвете (например, 1-2 см H 2 O), гарантируя, что приток пробка уплотнение pressuRe поддерживается постоянным и что никакие блокировки не присутствуют в настроить.
- Оставьте двоеточие, чтобы уравновесить в физиологическом растворе в течение 30 мин перед записью кишечных движений. Проверьте наличие засоров, возникающих во входных или выводных труб и удалить их, применяя давление через впускное резервуара или путем повторного cannulating устные и анальные концы толстой кишки.
3. Захват изображения и Протокол эксперимента
- Запись кишечные движения, как видео файлов, используя видеокамеру (30 кадров / сек, 640 х 840 пикселей), расположенный в 10-15 см выше ванночку на стандартной лабораторной реторты стоять (рисунок 1).
- Открыть Virtual Dub (видео программное обеспечение захвата) с помощью значка на рабочем столе. На вкладке "Файл" выберите "захвата AVI", чтобы просмотреть изображение с камеры. На "Audio" вкладки снимите флажок "включить аудио захват", чтобы отключить звук.
- На вкладке видео выберите 'сжатие' и 'DivX6.9.2. Кодек & #39; сжимать видео файлы, чтобы минимизировать использование дискового пространства. Эта функция станет известна после установки программного обеспечения сжатия 'DivX'.
- Вручную настроить расположение камеры таким образом, что вся канюлю сегмент толстой кишки видна (канюлированными регионах, непосредственно примыкающих к вертикальным краям видеокадра) через окна программы захвата видео (рисунок 1). Для того чтобы улучшить качество изображения и минимизировать отражения, прикрепить бумага / картон щит к опоре камеры, чтобы блокировать посторонний свет на ванночку. Оптимизация качества видео, регулируя яркость, контраст и экспозиция параметров с помощью программного интерфейса камеры.
- Перед записью установить определенный имя файла; на вкладке "Файл" выберите "Установить файл захвата" и указать уникальное имя для видео.
- Начать видеозапись нажатием 'файла регистрации' на панели инструментов 'Capture'. Чтобы остановить recordinг выбрать кнопку "Остановить захват" или клавишу 'Esc' на клавиатуре.
- Заменить физиологический раствор, содержащийся внутри впускного коллектора со свежим физиологическим раствором через каждые 30 мин.
- Запись просвета под давлением (см 2.9) и с помощью датчика температуры, принять к сведению температуре орган ванны. Повторите эти шаги в течение всего эксперимента (т.е. каждые 30 мин), чтобы гарантировать, что эти переменные являются постоянными.
- Запись ободочной деятельность в общей сложности в течение 3 часов (в том числе применения препарата и продолжительности вымывания). Для целей хранения данных, запись данных в 15 мин сегментов видео. Полный эксперимент, как правило, состоит из 12 х 15 мин видеозаписей.
- Запись активности в течение 1 ч в условиях контроля (физиологический раствор).
- Нанести препарат (либо орошали в ванну или в ведении в просвет через впускной резервуар) в течение 30 мин до 1 ч.
Примечание: Различные способы введения могут уIELD различные эффекты 23. - Применяют свежий физиологический раствор в ванну или просвета в течение периода вымывания 1 ч.
Обработка 4. Данные и генерация пространственно-временных Maps
- Обработать каждый видеозапись форума, используя программное обеспечение в доме, написанный на MATLAB (R2012a, версия 7.4; предоставляется по запросу), чтобы сгенерировать пространственно-временных карт, иллюстрирующих моторику толстого кишечника.
- Открытое программное обеспечение для анализа с помощью значка на рабочем столе.
- В окне командной введите "Analyse2", чтобы открыть панель управления анализ.
- Использование функции обнаружения края для создания пространственно-временных карт, нажав кнопку "обнаружение края для файлов .avi» в окне панели управления. Эта функция позволит программного обеспечения для анализа, чтобы прочитать перекодировано видео в формате Audio Video Interleaved (AVI).
- Выполните следующие шаги последовательно генерировать пространственно-временных карт с использованием Adaptive алгоритм обнаружения края.
- Открытые видеофайлов, выбрав вкладку "Добавить файлы", выберите "Открыть видео" и выберите местоположение видеофайлов.
- Из видео файлов, перечисленных в рамках программного обеспечения анализа, выберите интересующий файл.
- Выберите прямоугольную область интереса в рамках видео, например, по всей длине толстой кишки, от точки, в которой двоеточие канюлированного перорально анального катетеризации. Убедитесь, что проксимальные и дистальные точки катетеризации примыкают к вертикальным границам области, представляющей интерес. Линии обнаружение края (красный и зеленый) будут автоматически отображаться накладывается на изображение в реальном времени.
- Убедитесь, что пороговые линии обнаружения края в непосредственной близости к толстой кишке на обоих верхних и нижних границах ткани толстой кишки (это может быть оптимизирована для каждого видео, изменяя пороговые значения обнаружения на панели управления). Убедитесь, что кромки обнаружения лИнес непрерывны по длине изображения толстой кишки путем настройки контраста и яркости с помощью панели управления.
- Введите полную длину толстой кишки (мм) в ширину диалоговом окне (как записанный в шаге 2.7). Затем выберите "Создать тепловую карту".
- В появившемся окне выберите папку для сохранения файла, чтобы быть сохранены и указать имя файла для пространственно-временной карте.
- Выберите формат ".su2" и выберите "Добавить в очередь".
Примечание: Формат .su2 сжимает данные, чтобы меньший размер файла и несколько видео файлы могут быть добавлены в очередь. - Выберите 'Begin обнаружение' для создания пространственно-временных карт.
5. Анализ пространственно-временной Maps
- Использование пространственно-временных карт для оценки параметров, таких как частота, скорость распространения, длина и продолжительность CMMCs, диаметром кишки и точки инициации и направление сокращений.
- Чтобы начать анализировать пространственно-временнойкарты, тип 'analyse2' в окне командной, как описано в предыдущем разделе. Вместо того, чтобы "обнаружение края", нажмите кнопку "Тепловая карта анализа".
- Открытые пространственно-временные файлы карт (.su2 файлы), выбрав вкладку "Добавить файлы" и указав расположение ранее полученных .su2 файлов.
- После того, как пространственно-временной карте видна на экране, указать диапазон цвета на панели управления, чтобы обеспечить минимальное устанавливается в 1.
Заметим, что максимальное может варьироваться от 5-10 в соответствии с сократительной способности ткани. - Выбрать 'Блокировка цветовую гамму ", чтобы удостовериться, что все карты из одного эксперимента анализируются в тех же условиях.
- Убедитесь, что параметры сроки постоянны для всех пространственно-временных карт из данного эксперимента.
- Для того чтобы определить частоту CMMC, вручную рассчитывать сокращения, которые пересекают более чем 50% от длины ободочной кишки. Эти сокращения могут быть visuaванный как красный / оранжевый полосы (стандартный индекс цвета HSV) на пространственно-временной карте (рисунок 2 для примера). Другие сокращения, которые короче или не распространяются также могут быть идентифицированы и количественно.
- При желании, провести дальнейший анализ с более высоким разрешением из этих карт. Например, подробные свойства, включая скорость и продолжительность каждого сокращения могут быть рассмотрены.
- Для того чтобы измерить скорость и продолжительность, нажмите кнопку "аннотирования волны сокращений" на тепловой карте ПКП анализ.
- Затем увеличить каждому CMMC нажав на кнопку "Zoom" и выбрав область интереса. Затем нажмите кнопку "Вручную аннотировать" для аннотирования каждого сокращения с помощью мыши, чтобы нарисовать линию от самой начальной позиции до конца каждого сокращения. Этот метод может быть использован для измерения кажущейся скорости распространения и продолжительность растяжений, которые появляются распространяться (например, в силу видитеаль конец карты, показанные на рис 2а, 2b).
Примечание: Данные по скорости и продолжительности появится под окном результатов. Эти значения могут быть переданы в электронную таблицу интереса, выбрав вкладку "Экспорт данных". Нежелательные аннотации могут быть удалены с помощью нажатия на кнопку "Удалить выбранное аннотации".
- При желании, использовать координаты х и у пространственно-временной карты (о времени и местоположении вдоль толстой кишки, соответственно), чтобы определить положение начала небольших сокращений или CMMCs.
- Аналогичным образом, с тем чтобы определить интервалы между сокращениями, использовать функцию "переименование", чтобы измерить продолжительность между сокращений. Как и ранее, эти результаты могут быть экспортированы в таблицу, выбрав вкладку "Экспорт данных".
- Для того чтобы измерить ширину отдыхает кишечника, нажмите кнопку "Take сечение" на тепловой карте анализа панели.
- Выберите "Добавить9; на временной панели сечений. Двойной щелчок в любом месте внутри карты для создания горизонтальной линии накладывается на карту тепла. Данные диаметр Gut теперь будут отображаться в новом окне.
- Для измерения диаметра кишки, поместите курсор на пике и прилегающей корыта, чтобы получить среднюю ширину кишечника в течение определенного экспериментальных условиях. Изменения в диаметре кишки можно сравнить между экспериментальных условиях.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
До 90% пациентов с РАС испытать массив желудочно-кишечных расстройств, в том числе диареи и запора 18,24,25. Тем не менее, основные причины этих желудочно-кишечных проблем неизвестны. Многие мутации, выявленные у пациентов с расстройствами аутистического спектра связаны с синаптические белки способствуют изменений и нарушений в синаптической передаче или функции. Одним из таких мутаций, в гене, кодирующем клеточной адгезии молекулы нейролигины-3 (NL3 R451C), был идентифицирован у двух братьев с ASD 17. Эта мутация приводит к остатка аргинина в положении 451 белка нейролигины заменяется с цистеином. NL3 R451C мышей, выражающие эту мутацию шоу увеличился ГАМК опосредованной передачи в соматосенсорной коре 16,26 наряду повышенной опосредованной активности АМФК и NMDA-рецепторов в гиппокампе 25,27.
28-30. Как кишечной нервной системы играет важную роль в регуляции функции желудочно-кишечного, мы предположили, что мутация R451C повлияет моторику. Поэтому, для того, чтобы изучить возможные изменения в желудочно-кишечных функций вследствие синаптических аномалий мы стремились изучить влияние мутации R451C на частоте CMMC у этих мышей.
Поскольку серотонин (5-НТ), действует на ENS модулировать функции желудочно-кишечного у мышей 6 мы проанализировали образцы моторики в ответ на 5-HT-рецепторов 3/4 антагониста трописетрон в ободочной препаратов из WT и NL3 R451C мышей.
Для оценки изменяет ли синаптический мутация CMMCs когда энтеросолюбильное нервная система фармакологически возмущенные, антагонист рецептора 5HT 3/4 Трописетрон (Trop;10 мкм, который блокирует как 5HT3 и 5НТ 4 рецепторы) был добавлен в ванну, содержащую препараты двоеточие (рисунок 2). Был использован Толстокишечная ткани из девятнадцати соответствующей возрастной самцов мышей (11 WT и 8 NL3 R451C). В присутствии трописетрон, мышей NL3 R451C показали снижение частоты CMMC сравнению с WT помета. Типичные примеры пространственно-временных карт, показывающих CMMCs и сократительную активность в мас и NL3 R451C препаратов толстой кишки показаны на рис 2А-2Е соответственно. Хотя никакой разницы не наблюдалось между WT и NL3 R451C во контрольных условиях, трописетрон значительно снижается частота CMMC у мышей WT и NL3 R451C (рис 2С, 2F). У мышей дикого типа, среднее количество CMMCs был в контрольных условиях 23 по сравнению с 15 в трописетрон (р = 0,023). У мышей n¯l3, среднее количество CMMCs в контрольных условиях составил 19,5по сравнению с 2 в присутствии трописетрон (р = 0,022). Кроме того, трописетрон имел больший эффект на частоте CMMCs у мышей NL3 R451C сравнению с WT (р = 0,047).
Рисунок ванны 1. Орган создан и генерация пространственно-временных карт. (A) свеже рассекали желудочно сегмент помещают в баню дл органов (поперечный разрез), содержащий физиологический раствор и через канюлю при оральной и анальной концах. Оральный канюли соединен с впускным резервуара, заполненного физиологическим раствором и анального канюли, соединенной с выпускным трубки. Видеокамера расположена над ванночку с целью записи сократительную активность толстой кишки. (B) подвижность превращают в высоком разрешении пространственно-временных областей карты маркировки толстой кишки, которые расширенных в синих и суженных регионов яп красный. (C) пространственно-временное карта, показывающая моторику толстого кишечника (CMMCs) от взрослого WT мыши. Индивидуальные CMMCs обозначены как красными вертикальными регионов в карте. Ось Х показывает время возрастает (0-15 мин). Оси ординат пространственного положения вдоль сегмента толстой кишки (анальный у основания, за полостью рта в верхней). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуре.
Рисунок 2. Пространственно-временные карты показывают повышенную чувствительность к трописетрон в NL3 R451C толстой кишки мыши Пространственно-временные карты, показывающие частоту CMMC в сегментах толстой кишки от управления WT (а) и в присутствии трописетрон. (Trop; Б). Trop уменьшение частоты CMMC в WT толстой кишки (C). Spatiote mporal карты из NL3 толстой кишки в контрольных условиях (D) и в присутствии Trop (E). Trop вызвало сильное снижение частоты CMMC в NL3 толстой кишки (F). Частота CMMC в ответ на Trop был значительно снижен в n¯l3 сравнению с WT толстой кишки (р = 0,047, не показаны). Ширина Gut (цвет пикселя) указывается на оси Y (произвольные единицы, диапазон 1-6). Масштабная линейка в Е относится ко всем картам. Trop; Трописетрон. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуре.
Рисунок 3. Схема ванне для органов. (А) Вид сверху, (B) Нижняя (С) Вид спереди, (D) Вид сбоку, из двух патрон ванночку создана. Размеры в мм.исх = "https://www.jove.com/files/ftp_upload/53828/53828fig3large.jpg" целевых = "_blank"> Нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуре.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Используя эту технику визуализации видео, частота CMMC измеряли как показатель моторику толстого кишечника в дикого типа и мышей NL3 R451C, мышиной модели расстройства аутистического спектра 17. Наши результаты свидетельствуют о снижении числа CMMCs в мутантных мышей NL3 R451C по сравнению с мышами дикого типа в присутствии антагониста рецептора 5HT 3/4 трописетрон предполагая, что у мышей NL3 R451C проявляют повышенную чувствительность к трописетрон. Соответственно, мы полагаем, что R451C мутации нейролигины-3 изменяет серотонина путь, потенциально путем модулирования либо функции рецептора 5НТ 3 или 5НТ 4 в кишечных нейронов, слизистой или обоих. Это подчеркивает значение его применения для идентификации фенотипических различий между генотипами и выявления конкретных задач для последующих исследований.
Этот метод может быть модифицирована таким образом пространственное разрешение, приобретая видео с помощьюстерео-микроскопа оснащен фотокамерой крепление. Такой подход позволяет записи быть сделаны из маленьких препаратов желудочно-кишечного тракта при эмбриональных временных точках в начале E12.5 31. Нейромодуляторов могут быть применены с помощью просвета или в баню дл органов внешнего по отношению к ободочной подготовки. Кроме того, этот метод полезен для оценки больших и малых моторику желудочно в диапазоне видов, включая мышей, крыс и морских свинок.
Общие шаги по устранению неисправностей для данного метода включает в себя проверку потока раствора через трубки, жизнеспособность препарата ткани, поддержания постоянного давления в просвете и обеспечение двоеточие сегменты расположены вдали от стенок ванны органа. Закупорка внутрь трубы может изменить просвета давление и предотвратить сокращения от происходящих; Поэтому все трубы должны быть тщательно очищены, чтобы удалить кристаллы соли или мусор / фекалии, прежде катетеризации. Воздух должен быть удален из труб линий непосредственно связанные с канюлей до экспериментов (т.е. по грунтовки труб с физиологическим раствором). Кроме того, тканевые препараты должны быть обработаны с осторожностью, чтобы не допустить повреждения в результате неподвижности толстой кишки. Чтобы избежать повреждения тканей, убедитесь, что двоеточие твердо (но не сильно) прикреплен к канюли в процессе записи и поддерживать постоянную температуру и непрерывную подачу СО 2 + O 2 в ванну. Кроме того, чтобы давление просвета остается постоянным, и что никакие сокращения не инициирован вручную путем регулировки притока резервуары в течение периода записи. Убедитесь, что ткань толстой кишки не контактирует со стенкой ванночку во время схваток, так как это будет препятствовать анализ детектирования кромки соответствующих пространственно-временных карт. Этого можно избежать с помощью мониторинга сокращений в течение периода уравновешивания и регулируя положение толстой кишки, чтобы предотвратить это в ходе эксперимента.
_content "> Несколько ограничения, связанные с этой техникой должны быть приняты к рассмотрению при анализе и интерпретации данных, включая низкую пропускную природы этого подхода. В то время как метод эффективен в выявлении изменений в миграции узоры моторные, он не может определить, является ли происходящие дилатации во прогрессирование в CMMC которые neurally опосредованной или просто пассивные ответы на сократительную активность (т.е., в результате чего от движения жидкости). концентрационные градиенты для диффузии через стенки кишки позволяют эффекты люминально применяемых препаратов следует приписать действий в рамках слизистая, но в длительных экспериментах слизистой дегенерации может происходить таким образом изменяя сайты действия этих препаратов в течение периода записи. Кроме того, является ли препараты имеют различные эффекты в мышечной оболочки кишечника и подслизистой сплетения не может быть определена с помощью этого метода. в отличие от этого, этот подход дает совокупной оценки эффектов на кишечно-пеrvous система путем измерения общего изменения шаблонов моторики. Дальнейшие соображения включают необходимость принимать во внимание характер данных (т.е. рассчитывать данные для частоты CMMC, требуя непараметрического анализа) и низкую частоту CMMCs, при проектировании экспериментов и соответствующие стратегии анализа данных.Недавно Барнс и его коллеги предложили, чтобы ободочной ткани требует стимуляции с целью наблюдения CMMCs 32, однако опубликованные результаты от нашей лаборатории показали, что спонтанные CMMCs можно наблюдать просто прижав ткань в ванну органов с помощью брыжейки 7. Наличие CMMCs в этих условиях демонстрирует не только спонтанность CMMCs, но более подробно рассматривается полезности этой методики для определения изменений в толстой моторики. Хотя этот подход применим к экстра-ободочной отделы желудочно-кишечного тракта, сложность небольшой моторики кишечника требует больше DETбеспокоило стратегии анализа, чем те, которые используются для количественного CMMCs 33.
Этот экспериментальный подход имеет очень высокую пространственное и временное разрешение и включает в себя возможность доставки лекарств и внешние по отношению к и внутри просвета для изучения влияния изменения градиентов концентрации на брюшной нервной системы. Кроме того, этот способ пригоден для анализа тонкого кишечника сегментацию во сытом состоянии 6,23. Экс естественных природа этого метода позволяет роль кишечной нервной системы должны быть оценены в отсутствие входов центральной нервной системы и, следовательно, идеальный способ исследовать желудочно-кишечного в различных моделях, в том числе генетических моделей болезни (рис 2) 6,34.
Этот метод также может быть использован для сравнения физиологических данных для компьютерного моделирования двигательной активности 23,33,35. Такое моделирование может предсказать паттерны двигателя вформа пространственно-временных карт для прямых сравнений с физиологических экспериментов 33,35. Использование быстрого преобразования Фурье и анализ 36 вейвлет, вклад электрокардиостимуляторами гладких мышц (порожденный интерстициальных клеток Кахалем), чтобы моторики также могут быть извлечены. Кроме того, этот метод визуализации видео могут быть объединены с внеклеточной записи электрической активности в мышцах 3, чтобы позволить вклады нервной и миогенных генераторов шаблонов следует отличать. Примечание внеклеточный Способ записи решает ингибирующие соединительных потенциалы в отсутствие сокращений гладких мышц или расслаблений.
Хотя эта методика хорошо известна для анализа моторики ЖКТ в широком диапазоне препаратов и видов, он также имеет потенциал, чтобы быть использован в других системах, таких как исследование вазоконстрикции в брыжейку (ранее анализируемого с помощью более простую систему слежения диаметра 37) ив скелетных мышцах.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
JCB и ELH-Y были поддержаны Департаментом США программы обороны CDMRP аутизма исследований (AR11034). NHMRC (1047674), чтобы ELH-ности У. мая Stewart Стипендии-Университета Мельбурна доверия финансируется стипендию РС. Мы благодарим Али Тахер, Фатима Ramalhosa и Gracia Seger по техническим взносов.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagents | |||
| NaCl (MW: 58.44) | Sigma-Aldrich | S7653-250G | |
| KCl (MW: 74.55) | Sigma-Aldrich | P9333-500G | |
| NaH2PO4.2H2O (MW: 156.01) | Chem Supply | 471-500G | |
| MgSO4.7H20 (MW: 246.48) | Chem Supply | MA048 | |
| CaCl2.2H2O (MW: 147.02) | Chem Supply | CA033 | |
| D-Glucose anhydrous (MW: 180.16) | Chem Supply | GA018-500G | |
| NaHCO3 (MW: 84.01) | Chem Supply | GA018-500G | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Materials | |||
| Two chambered organ bath Dimentions: 14 cm x 8 cm x 3 cm |
Custom Made | Contact Laboratory Directly | |
| 732 MULTI -PURPOSE SEALANT CLEAR | Dow Corning Australia Pty Ltd | 1890573 | |
| SYLGARD 184 SILICONE ELASTOMER KIT | Dow Corning Australia Pty Ltd | 1064291 | |
| STOPCOCK 3 WAY FEM-ML L/LOCK S | Terumo Medical Corporation | 0912-2006 | |
| SYRINGES with Luer Lock Tips 50 ml, 20 ml, 10 ml | Terumo Medical Corporation | N/A | |
| 1.57 mm (ID) x 3.16 mm (OD) - Silastic Tubing | Masterflex | 508-008 | |
| 1.02 mm (ID) x 2.16 mm (OD) - Silastic Tubing | Masterflex | 508-005 | |
| 1.50 mm (ID) x 2.50 mm (OD) - Silastic Tubing | Masterflex | 508-007 | |
| 1.60 mm (ID) - Platinum cured silicone tubing | Masterflex | 96410 - 14 | |
| 4.40 mm (ID) - Platinum cured silicone tubing | Masterflex | 96410 - 15 | |
| 3.10 mm (ID) - Platinum cured silicone tubing | Masterflex | 96410 -16 | |
| Graduated Laboratory Glass Bottles - 500 ml | Thermofisher Scientific | 100-400 | |
| CHEMICAL RUBBER STOPPER 57 x 65 mm | |||
| CHEMICAL RUBBER STOPPER 29 mm x 32 mm | |||
| Water heater (thermo regulator) | Ratek | TH7000 | |
| Logitech Webcam | Logitech | ||
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Software | |||
| Virtual Dub - 1.9 11 | virtualdub.org | ||
| MATLAB R2012a | Graph Pad | ||
| Logitech Webcam Software | Logitech |
References
- Powell, A. K., O'Brien, S. D., Fida, R., Bywater, R. A. Neural integrity is essential for the propagation of colonic migrating motor complexes in the mouse. Neurogastroenterol Motil. 14, 495-504 (2002).
- Furness, J. B. The enteric nervous system and neurogastroenterology. Nat Rev Gastroenterol Hepatol. 9, 286-294 (2012).
- Gwynne, R. M., Bornstein, J. C. Mechanisms underlying nutrient-induced segmentation in isolated guinea pig small intestine. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 292, G1162-G1172 (2007).
- Bush, T. G., Spencer, N. J., Watters, N., Sanders, K. M., Smith, T. K. Spontaneous migrating motor complexes occur in both the terminal ileum and colon of the C57BL/6 mouse in vitro. Auton Neurosci. 84, 162-168 (2000).
- Fida, R., Lyster, D. J., Bywater, R. A., Taylor, G. S. Colonic migrating motor complexes (CMMCs) in the isolated mouse colon. Neurogastroenterol Motil. 9, 99-107 (1997).
- Neal, K. B., Parry, L. J., Bornstein, J. C. Strain-specific genetics, anatomy and function of enteric neural serotonergic pathways in inbred mice. J Physiol. 587, 567-586 (2009).
- Roberts, R. R., Murphy, J. F., Young, H. M., Bornstein, J. C. Development of colonic motility in the neonatal mouse-studies using spatiotemporal maps. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 292, G930-G938 (2007).
- Spencer, N. J. Control of migrating motor activity in the colon. Curr Opin Pharmacol. 1, 604-610 (2001).
- Spencer, N. J., Bywater, R. A. Enteric nerve stimulation evokes a premature colonic migrating motor complex in mouse. Neurogastroenterol Motil. 14, 657-665 (2002).
- Roberts, R. R., Bornstein, J. C., Bergner, A. J., Young, H. M. Disturbances of colonic motility in mouse models of Hirschsprung's disease. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 294, G996-G1008 (2008).
- Tough, I. R., et al. Endogenous peptide YY and neuropeptide Y inhibit colonic ion transport, contractility and transit differentially via Y(1) and Y(2) receptors. Br J Pharmacol. 164, 471-484 (2011).
- Hennig, G. W., Costa, M., Chen, B. N., Brookes, S. J. Quantitative analysis of peristalsis in the guinea-pig small intestine using spatio-temporal maps. J Physiol. 517 (Pt 2), 575-590 (1999).
- Hoffman, J. M., Brooks, E. M., Mawe, G. M. Gastrointestinal Motility Monitor (GIMM). J Vis Exp. , (2010).
- Smith, T. K., Gershon, M. D. Rebuttal from Terence K. Smith and Michael D. Gershon. J Physiol. 593, 3233 (2015).
- Spencer, N. J., Sia, T. C., Brookes, S. J., Costa, M., Keating, D. J. CrossTalk opposing view: 5-HT is not necessary for peristalsis. J Physiol. 593, 3229-3231 (2015).
- Tabuchi, K., et al. A neuroligin-3 mutation implicated in autism increases inhibitory synaptic transmission in mice. Science. 318, 71-76 (2007).
- Jamain, S., et al. Mutations of the X-linked genes encoding neuroligins NLGN3 and NLGN4 are associated with autism. Nat Genet. 34, 27-29 (2003).
- Chaidez, V., Hansen, R. L., Hertz-Picciotto, I. Gastrointestinal problems in children with autism, developmental delays or typical development. J Autism Dev Disord. 44, 1117-1127 (2014).
- Ibrahim, S. H., Voigt, R. G., Katusic, S. K., Weaver, A. L., Barbaresi, W. J. Incidence of gastrointestinal symptoms in children with autism: a population-based study. Pediatrics. 124, 680-686 (2009).
- Kohane, I. S., et al. The co-morbidity burden of children and young adults with autism spectrum disorders. PloS One. 7, e33224 (2012).
- McElhanon, B. O., McCracken, C., Karpen, S., Sharp, W. G. Gastrointestinal symptoms in autism spectrum disorder: a meta-analysis. Pediatrics. 133, 872-883 (2014).
- Peters, B., et al. Rigid-compulsive behaviors are associated with mixed bowel symptoms in autism spectrum disorder. J Autism Dev Disord. 44, 1425-1432 (2014).
- Ellis, M., Chambers, J. D., Gwynne, R. M., Bornstein, J. C. Serotonin and cholecystokinin mediate nutrient-induced segmentation in guinea pig small intestine. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 304, G749-G761 (2013).
- Parracho, H. M., Bingham, M. O., Gibson, G. R., McCartney, A. L. Differences between the gut microflora of children with autistic spectrum disorders and that of healthy children. J Med Microbiol. 54, 987-991 (2005).
- Buie, T., et al. Evaluation, diagnosis, and treatment of gastrointestinal disorders in individuals with ASDs: a consensus report. Pediatrics. 125, Suppl 1. S1-S18 (2010).
- Etherton, M., et al. Autism-linked neuroligin-3 R451C mutation differentially alters hippocampal and cortical synaptic function. Proc Natl Acad Sci U S A. 108, 13764-13769 (2011).
- Etherton, M. R., Tabuchi, K., Sharma, M., Ko, J., Sudhof, T. C. An autism-associated point mutation in the neuroligin cytoplasmic tail selectively impairs AMPA receptor-mediated synaptic transmission in hippocampus. EMBO J. 30, 2908-2919 (2011).
- Zhang, Q., et al. Expression of neurexin and neuroligin in the enteric nervous system and their down-regulated expression levels in Hirschsprung disease. Mol Biol Rep. 40, 2969-2975 (2013).
- Wang, J., et al. Expression and significance of neuroligins in myenteric cells of Cajal in Hirschsprung's disease. PloS One. 8, e67205 (2013).
- Yang, H., et al. The down-regulation of neuroligin-2 and the correlative clinical significance of serum GABA over-expression in Hirschsprung's disease. Neurochem Res. 39, 1451-1457 (2014).
- Roberts, R. R., et al. The first intestinal motility patterns in fetal mice are not mediated by neurons or interstitial cells of Cajal. J Physiol. 588, 1153-1169 (2010).
- Barnes, K. J., Spencer, N. J. Can colonic migrating motor complexes occur in mice lacking the endothelin-3 gene? Clin Exp Pharmacol Physiol. 42, 485-495 (2015).
- Chambers, J. D., Bornstein, J. C., Thomas, E. A. Multiple neural oscillators and muscle feedback are required for the intestinal fed state motor program. PloS One. 6, e19597 (2011).
- Heredia, D. J., et al. Important role of mucosal serotonin in colonic propulsion and peristaltic reflexes: in vitro analyses in mice lacking tryptophan hydroxylase 1. J Physiol. 591, 5939-5957 (2013).
- Chambers, J. D., Bornstein, J. C., Thomas, E. A. Insights into mechanisms of intestinal segmentation in guinea pigs: a combined computational modeling and in vitro study. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 295, G534-G541 (2008).
- Huizinga, J. D., et al. The origin of segmentation motor activity in the intestine. Nat Commun. 5, 3326 (2014).
- Neild, T. O., Shen, K. Z., Surprenant, A. Vasodilatation of arterioles by acetylcholine released from single neurones in the guinea-pig submucosal plexus. J Physiol. 420, 247-265 (1990).
