Abstract
腸管神経系（ENS）は、胃腸（GI）運動性の調節に重要な役割を果たしており、独立して、中枢神経系の機能することができます。 ENS機能の変化は、GI症状や病気の主な原因であると自閉症などの精神神経疾患で報告されたGI症状に寄与することができます。よく分離された大腸セグメントは結腸移行モーター複合体（CMMCs）として知られている自発的な、リズミカルな収縮を発生させることが確立されています。マウス大腸のex vivoでの製剤でCMMCsの腸内神経調節を分析するための手順が記載されています。コロンは、動物から切除し、前の器官槽にカニューレを挿入されることに糞便コンテンツを削除するためにフラッシュされます。データは、器官浴の上方に位置し、ビデオカメラを介して取得し、社内ソフトウェアパッケージを介して、高解像度時空間マップに変換されます。この技術では、ベースライン収縮パターンと大腸の内ENS機能の薬理効果を使用しましたegmentsは3-4時間かけて比較することができます。また、CMMCsの伝搬長さと速度は、腸の直径と収縮頻度の変化と同様に記録することができます。この技術は、トランスジェニックマウスモデルにおいて（およびラットとモルモットを含む他の種で）消化管運動パターンを特徴付けるために有用です。このように、CMMCsで薬理学的に誘導された変化は、野生型マウスおよび自閉症のニューロリギン-3 R451Cマウスモデルに記録されています。さらに、この技術は、十二指腸、空腸および回腸を含むマウスにおける異なる発育年齢でGI管の他の領域にも適用することができます。
Introduction
腸神経系（ENS）は、胃腸管の本質的な神経回路網であり、そのような腸の内容物の消化、栄養素の吸収および分泌および流体の再吸収など様々な機能を調節します。 ENSのニューロンは、腸管筋及び粘膜下神経叢に位置しています。筋層間神経叢は粘膜下神経叢が分泌2,3の制御に主に関与しているのに対し、消化管運動1の調節に重要な役割を果たしています。筋層間神経叢は、胃腸壁の長手方向および円形筋肉層との間に位置しています。腸壁の平滑筋層の収縮活性は、腸3の長さ方向に沿って腸内容物を混合し、推進することにより、消化管の主な機能を容易にします。 CNSから消化管への外因性の神経供給は 、インビボで胃腸機能に寄与しているが、ENSは、独立して、消化管機能を調節することが可能です。このユニークな特徴は、機能性腸内神経回路の調査および ex vivo消化管運動への貢献を可能にします。
結腸移行モーター複合体（CMMCs）糞粒4-9の不在下で単離したマウス結腸において観察された支配的な運動パターンであり、自発的、神経性のイベントです。 CMMCsは、コロン（ すなわち、盲腸から直腸まで）10の少なくとも半分の合計の長さである水平距離に沿って伝播リズミカルな収縮として定義されています。糞便ペレットを推進CMMCsと収縮パターンとの関係は明らかにいくつかの薬理学的な違いが11報告されており、確立されてまだあります。それにもかかわらず、CNSの独立して機能するENSの能力とISの神経媒介運動パターンの存在olatedコロンは、基礎となるENS機能不全に起因する運動性の障害を調べるのに理想的なアッセイ系を提供します。胃腸の運動パターンの自発性は、薬理学的刺激に応答して、機能の変更を評価することができます。
ビデオ画像と時空間のマッピングを使用すると、最初の定量的モルモット12に小腸の蠕動運動を調べるために開発されました。ここでは、 エクスビボ技術は、高解像度を構築するためにビデオ画像及びこれらの記録の分析を用いて、マウス結腸運動パターンの研究を可能にすることが記載されている（〜100ミクロン、33ミリ秒）大腸に沿った位置の関数として、結腸の直径のマップ時間の（時空間マップ）。社内のエッジ検出ソフトウェアの使用（Analyse2、リクエストに応じて利用可能）を、リアルタイムで収縮し、全長結腸セグメントからのデータは、各実験のための時空間マップを生成するために処理されます。このステップでは、動画（AVI）ファイルはスンマですrizedとAnalyse2を使用して時空間マップに変換します。時空間マップ（ 図2）は、時間をかけて収縮性を表しており、伝搬速度、大きさ、長さ及び持続時間を含む複数のパラメータの測定を可能にします。腸の直径はまた、組織セグメントの全体的な収縮の尺度として実験期間を通じて記録されています。この方法は、改変された腸内神経の接続性を示している可能性が収縮複合体の開始点の違いを識別するために適用することができます。
モルモットにおいてペレット推進力を評価するために設計された同様の映像イメージングプロトコルは、しかしここでは、（ペレットの不存在下で、すなわち ）自発結腸運動の定量化のためのビデオ画像アプローチの適用を概説13に報告されています。我々はまた、ビデオ画像のアプローチのための切開および胃腸組織の調製を補助するための詳細な情報を提供します。このプロトコルは、遺伝的マウスモデルを含む、疾患の動物モデルにおいて胃腸機能の腸内神経制御を分析するためのアクセス可能な、簡単に複製されたツールを使って研究者に提供します。
ビデオイメージング技術は、様々な薬理学的因子に応答して、結腸運動の解析を可能にします。薬物は、腸内腔または結腸の準備の外部器官浴を介して投与することができます。マウス胃腸管の異なる領域は、結腸における小腸区分およびCMMCsような特定の運動パターンを示します。
この技術は、小腸機能の歪みの違いを識別するために使用されています。 5-HT 3および5-HT 4アンタゴニストの差動感度は、2つの系統6で発現TPH2遺伝子の多型性のためのBalb / cおよびC57 / BL6マウスの空腸で観察されました。運動性の5-HT阻害の効果は、詐欺のままtroversial、相反するデータが結腸の蠕動とCMMCs 14,15上の内因性5-HTの重要性について報告されています。運動前および出生後発達7中の変化、および疾患10の動物モデルにおいて胃腸運動の遺伝子変異の効果は、ビデオ画像を利用して調べることができます。ここでは、シナプス接着タンパク質のニューロリギン-3 16をコードする Nlgn3遺伝子におけるミスセンス変異を表現する自閉症のNL3 R451Cマウスモデルにおける結腸運動の研究のための方法の使用を例示します。この変異は、最初に強くGI機能障害18-22に関連している自閉症スペクトラム障害（ASD）17、と診断された患者で同定されました。私たちは、NL3 R451Cシナプス変異がビデオイメージング技術を用いて、ENSにおける神経出力に影響を与えるかどうかを調べました。私たちは、ベースライン時およびセロトニン5Hに応じてCMMCsを特徴付けるデータを提示T 3/4受容体アンタゴニストトロピセトロン 自閉症のNL3 R451Cマウスモデルインチ
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Protocol
動物の取り扱いおよび動物の頸部脱臼、すべての実験の前にあったが、厳密にメルボルン大学のための動物実験委員会によって承認されたプロトコルに従って行う（倫理ID：1212494.7）
1.組織収集および解剖
- 頚椎脱臼により成体マウスを安楽死させます。可能であれば、興味のニューロン集団に位置する受容体を介して消化管機能への影響を防ぐために麻酔を避けます。
- 動物の全体重を記録し、皮下注射針（サイズ：20 G）を使用して、しっかりと解剖ボードに（4足を経由して、実験者にさらさ腹側）本体を固定。
- 解剖鉗子とハサミを使用しました。下腹部の筋肉層を重ねる表皮を通して切開を作ります。胸骨に腹部の正中線に沿って腹腔を開くには、鉗子とはさみを使用し続けます。
- 組織の脱水を防ぐために、physiを注ぎます学的食塩水（クレブス溶液：118のNaCl、CaCl 2を、1.2のMgSO 4、1のNaH 2 PO 4、25 NaHCO 3で4.6のKCl、2.5、11 D-グルコースmMの中-カルボゲンガスを室温でバブリング; 95％O 2および5 ％解剖プロセスの間に一定の間隔で腹腔内容物の上に20分の最低CO 2）（ すなわち、すべての30-60秒）。
- 盲腸と直腸に取り付けられている間にコロンを単離するために、微細な解剖ハサミを使用して、腸間膜をトリミングしながら、約4〜5センチメートル動物の体の上に解剖鉗子を使用して、静かに（コロンの近位端に隣接して位置する）盲腸を開催。
- 隣接する腸間膜を除去しながら胃腸組織を扱うストレッチまたはカットしないように注意してください。
- 過剰な組織（ すなわち 、膀胱と精巣）を削除します。粗解剖ハサミを使用して、EAの骨盤の骨を切断するために2つの垂直切開（正中線からすなわち、約0.5cmに）作りますコロンのchの側面。
- 骨盤組織に隣接するから直腸を分離し、コロンから周囲の筋肉をトリミングする微細なハサミを使用してください。
- 生理食塩水を入れたビーカーに（盲腸から直腸まで）完全長のコロンを置きます（以前にカルボゲンと酸素）、室温で酸素化し続けています。細かい解剖ハサミを使用して、盲腸と直腸を外し、ビーカーに交換してください。
- 空の糞粒/生理食塩水で満たし、200μlのピペットの先端に取り付けられた5ミリリットルの注射器を用いた経口投与終了時に緩やかな正圧を印加することにより結腸調製物からの腸内容。将来的に組織を配向させるためには、粘膜における条線が表示されているコロン、ほとんどの近位端をマークするために虫ピンを使用します。
- カミソリの刃を使用して、最も広い/近位端の約1cmを除去することにより、5ミリリットルの注射器に合うようにプラスチック製のピペットチップを変更します。流量を増加させるために、ANGに切断することにより、遠位/小さい方の端を広げますカミソリの刃を使用して、ル（約45℃）。
- グリップ優しく解剖ピンセットでその近位端に結腸組織は、内腔を通ってコロンとフラッシュ生理食塩水の内腔にピペットチップを挿入します。
結腸組織とビデオイメージングのための実験のセットアップの調製
- 200μlのピペット先端に取り付けられた注射器を用いて、（ 図1及び図3）設定2室の器官槽に接続されたすべてのチューブを通して洗浄生理食塩水。このステップは、溶液の流れを遮断することができ、チューブ内の任意の破片を除去します。チューブの仕様については材料の表を参照してください。
- （5ミリリットル分-1の流速、95％O 2および5％CO 2）臓器浴のチャンバーを連続的にカルボゲンでバブリング生理食塩水で灌流されていることを確認してください。定期的に温度プローブを使用して、temperatことを確認浴のUREは、33℃-37℃の間に維持されます。
- 約20-30生理食塩水100mlを50mlのシリンジを使用して入口管に3方コックを介して接続された流入リザーバを充填します。
- 実験中、その中心を通って挿入されたガラス管（内径5ミリメートル）でarubberストッパーを使用して、流入リザーバ内の圧力を維持します。流入容器の上部開口を確実に（内側ガラス管が密閉されていない残りで）密封されていることを確認します。
- それは完全に生理食塩水に沈めていることを確認して、器官槽室にコロン（長さ5〜7センチメートル）を配置します。
- 2浸漬入口/出口管の結腸セグメントのカニューレ挿入各端部（異なる直径の入口/出口管は内腔、例えば、組織の大きさに応じて変更することができる。生後組織、成体マウスおよびモルモット）浴中で標準を使用してコットンミシン糸。入口管に、結腸の近位端を取り付け、出口管へのコロンの先端部（縦流出管に3方活栓を介して接続され、高さ6センチ）。組織は、将来の測定と解析との干渉を避けるためにカニューレ挿入した後、過延伸またはあまりにもリラックスしていないことを確認してください。
- 15cmの定規を使用して、近位および遠位カニューレ挿入の間の距離を測定することによって、結腸の長さを記録します。これは、収縮長さ、伝播速度と収縮開始点の変化を解釈するために重要です。
- 実験を開始する前に確立され安定したベースライン管腔圧（センチH 2 O）を確認してください。 （経口）流入リザーバと垂直流出管（肛門）のガラス管内の生理食塩水のメニスカスに組織からの垂直距離を測定することにより、管腔の圧力を計算します。
- 一定の管腔内の圧力で組織標本を維持する（ 例えば、1〜2センチメートルH 2 O）を保証することにより、その流入ストッパーシールpressu再一定に保たれ、何の閉塞は、セットアップ中に存在しないことをされています。
- 腸の動きを記録する前に30分間、生理食塩水で平衡化するために、コロンを残します。 IN-または流出管に生じるいかなる閉塞を確認し、流入リザーバーを介して、または結腸の再カニューレ挿入口腔と肛門端部によって圧力を適用することによって、それらを削除します。
3.イメージキャプチャおよび実験プロトコール
- ビデオカメラを使用してビデオファイルとして記録し、腸の動き（30フレーム/秒、640×840ピクセル）（ 図1）スタンドの標準的な実験レトルト上の器官槽の上に10〜15センチメートルに位置。
- デスクトップ上のアイコンから、仮想ダブ（ビデオキャプチャソフトウェア）を開きます。 「ファイル」タブから、カメラ画像を確認するには、「キャプチャーAVI」を選択します。 「オーディオ」タブの選択解除に音を無効にするには、「オーディオキャプチャを有効にします」。
- ビデオ]タブでは「圧縮」と「DivX6.9.2を選択します。コーデック＆＃39;ストレージ・スペースの使用量を最小限にするために、ビデオファイルを圧縮します。この関数は、圧縮ソフト「DivXの」のインストール時に使用可能になります。
- 全体カニューレ結腸セグメントがビデオキャプチャソフトウェアのウィンドウを介して（ビデオ・フレームの垂直エッジに直接隣接カニューレ領域で）表示されるように手動でカメラの位置を調整する（ 図1参照 ）。画質を向上させ、反射を最小限にするために、器官浴に外光を遮断するために、カメラの支持体に紙/ボール紙のシールドを取り付けます。カメラ・ソフトウェア・インタフェースを使用して明るさ、コントラスト、露出設定を調整することによって、ビデオ品質を最適化します。
- 記録する前に、特定のファイル名を設定します。 「ファイル」タブで、「設定キャプチャファイル」を選択し、ビデオの固有の名前を指定します。
- 「キャプチャ」ツールバーから「キャプチャファイル」を押して、ビデオのキャプチャを開始します。 recordinを停止するにはg 'はキャプチャを停止」ボタンまたはキーボードのEscキー」キーを選択します。
- 新鮮な生理食塩水を30分毎と流入リザーバ内に含まれる生理食塩水を交換してください。
- レコード腔の圧力（2.9を参照）、温度プローブを使用して、臓器浴温度に注意してください。これらの変数が一定であることを確認するための実験（ すなわち 、30分ごと）を通して、これらの手順を繰り返します。
- （薬物適用と休薬期間を含む）3時間の合計のレコード結腸活動。データ記憶のために、15分のビデオセグメント内の記録データについて。完全な実験は、一般的に12×15分のビデオ録画で構成されます。
- 制御条件の下で1時間（生理食塩水）を録音する活動。
- 1時間に30分間（浴中に灌流または流入リザーバーを介して、内腔に投与のいずれか）の薬物を適用します。
注：異なる投与経路をすることができ、yを異なる効果23を ield。 - 1時間の休薬期間中にバスまたは内腔に新鮮な生理食塩水を適用します。
時空間マップの4.データ処理および作成
- 結腸運動を示す時空間マップを生成するために、プロセスMATLABで記述され、社内のソフトウェア使用して、各ビデオ録画をオフライン（要リクエストR2012a、バージョン7.4）。
- デスクトップ上のアイコンから開く解析ソフトウェア。
- コマンドウィンドウで、分析のコントロールパネルを開くために「Analyse2」と入力します。
- コントロールパネルウィンドウで「.aviファイル用のエッジ検出」をクリックすることで、時空間マップを生成するために、エッジ検出機能を活用します。この機能は、オーディオビデオインターリーブ（AVI）形式で録画ビデオを読み取るために分析ソフトウェアを有効にします。
- ADAを使用して時空間マップを生成するために、順次、次の手順を実行しますptiveエッジ検出アルゴリズム。
- 「ファイルの追加」タブを選択して開く記録されたビデオファイルは、「オープンビデオ」を選択し、ビデオファイルの場所を選択します。
- 解析ソフトウェア内で記載されているビデオファイルから、興味のあるファイルを選択します。
- コロンが肛門挿管に経口カニューレを挿入された時点から、ビデオ、 例えば、結腸の全長のフレーム内の関心の矩形領域を選択します。近位および遠位カニューレ挿入ポイントが関心領域の垂直方向の境界に隣接していることを確認してください。エッジ検出ライン（赤と緑）を自動的にリアルタイム画像上に重畳表示されます。
- エッジ検出閾値線は結腸組織（これは、コントロールパネル上の検出閾値を変更することにより、各ビデオに対して最適化することができる）の上限と下限の両方で結腸に直接隣接していることを確認してください。エッジ検出リットルいることを確認してくださいINESは、コントロールパネルを使用して、コントラストおよび明るさを調整することにより、大腸画像の長さに沿って連続しています。
- 幅ダイアログボックスにコロン（ミリメートル）の全長を入力します（ステップ2.7で記録されています）。そして、「ヒートマップを生成」を選択します。
- ポップアップウィンドウでは、保存され、時空間マップのファイル名を指定するファイルの場所を選択します。
- 「.su2 '形式を選択して、「キューに追加」を選択します。
注：.su2フォーマットは、小さいファイルサイズと複数のビデオファイルにデータをキューに追加することができる圧縮します。 - 時空間マップを生成するには、「検出を開始」を選択します。
時空間マップの5.分析
- このような周波数、伝播速度、CMMCsの長さおよび持続時間、腸の直径と開始及び収縮の方向の位置などのパラメータを推定する時空間マップを利用します。
- 時空間分析を開始するにはマップは、コマンドウィンドウにタイプ 'analyse2」前のセクションで説明したように。代わりに、「エッジ検出」の、「ヒートマップ分析」ボタンを選択します。
- [追加ファイル]タブを選択し、以前.su2取得したファイルの場所を指定して開く時空間マップファイル（.su2ファイル）。
- 時空間マップがスクリーン上に表示されると、最小値が1に設定されていることを確実にする、コントロールパネルの色の範囲を指定します。
最大値は組織の収縮に応じて5〜10の範囲であることができることに注意してください。 - 同じ条件で分析されている単一の実験からすべてのマップを確実にするために「ロック色の範囲」を選択します。
- 時間枠の設定が与えられた実験から、すべての時空間マップの一定であることを確認してください。
- CMMC周波数を決定するために、手動で、結腸の長さの50％以上を通過収縮をカウントします。これらの収縮はvisuaすることができます時空間マップ上の赤/オレンジ色の縞（標準HSVカラーインデックス）としてlized（例えば図2を参照）。短いまたは伝播しない他の収縮も識別し、定量化することができます。
- 必要であれば、これらのマップから、より高い解像度でさらに分析を行います。例えば、各収縮の速度および持続時間を含む詳細な特性を調べることができます。
- 速度と持続時間を測定するために、ヒートマップ分析のコントロールパネル上の「収縮波に注釈を付ける」ボタンを選択します。
- 次に、「ズーム」ボタンをクリックし、関心領域を選択することにより、各CMMCにズームイン。次に、各収縮の終わりに最も初期位置から線を描画するために、マウスを使用して、各収縮に注釈を付けるために「手動で注釈を付ける」ボタンを選択します。この方法は、（ 例えばため、参照伝搬するように見える拡張部分の見かけ伝播速度と持続時間を測定するために使用することができます図2A、2B）でのマップのAl終了。
注：スピードと持続時間のためのデータは、結果ウィンドウの下に表示されます。これらの値は、「エクスポートデータ」タブを選択することで、興味のあるスプレッドシートに転送することができます。不要な注釈は、「選択した注釈を削除」ボタンをクリックすることにより除去することができます。
- 所望であれば、小さな収縮またはCMMCsの開始位置を決定するための時空間マップ（大腸に沿った時間及び位置のそれぞれ）のx、y座標を利用します。
- 同様に、収縮の間の間隔を決定するために、収縮間の時間を測定するために、「注釈」機能を使用します。前述のように、これらの結果は、「エクスポートデータ」タブを選択することで、スプレッドシートにエクスポートすることができます。
- 安静時の腸の幅を測定するために、ヒートマップ分析パネルの「断面を取る」ボタンを選択します。
- 選択して「追加9;一時的断面パネル上。マップ内の任意の場所でダブルクリックして、ヒートマップ上に重ね合わせた水平線を生成します。腸径データは、新しいウィンドウに表示されます。
- 腸の直径を測定するために、具体的な実験条件の平均腸幅を得るために、ピークと隣接する谷の上にカーソルを置きます。腸の直径の変化は、実験条件の間で比較することができます。
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagents | |||
| NaCl (MW: 58.44) | Sigma-Aldrich | S7653-250G | |
| KCl (MW: 74.55) | Sigma-Aldrich | P9333-500G | |
| NaH2PO4.2H2O (MW: 156.01) | Chem Supply | 471-500G | |
| MgSO4.7H20 (MW: 246.48) | Chem Supply | MA048 | |
| CaCl2.2H2O (MW: 147.02) | Chem Supply | CA033 | |
| D-Glucose anhydrous (MW: 180.16) | Chem Supply | GA018-500G | |
| NaHCO3 (MW: 84.01) | Chem Supply | GA018-500G | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Materials | |||
| Two chambered organ bath Dimentions: 14 cm x 8 cm x 3 cm |
Custom Made | Contact Laboratory Directly | |
| 732 MULTI -PURPOSE SEALANT CLEAR | Dow Corning Australia Pty Ltd | 1890573 | |
| SYLGARD 184 SILICONE ELASTOMER KIT | Dow Corning Australia Pty Ltd | 1064291 | |
| STOPCOCK 3 WAY FEM-ML L/LOCK S | Terumo Medical Corporation | 0912-2006 | |
| SYRINGES with Luer Lock Tips 50 ml, 20 ml, 10 ml | Terumo Medical Corporation | N/A | |
| 1.57 mm (ID) x 3.16 mm (OD) - Silastic Tubing | Masterflex | 508-008 | |
| 1.02 mm (ID) x 2.16 mm (OD) - Silastic Tubing | Masterflex | 508-005 | |
| 1.50 mm (ID) x 2.50 mm (OD) - Silastic Tubing | Masterflex | 508-007 | |
| 1.60 mm (ID) - Platinum cured silicone tubing | Masterflex | 96410 - 14 | |
| 4.40 mm (ID) - Platinum cured silicone tubing | Masterflex | 96410 - 15 | |
| 3.10 mm (ID) - Platinum cured silicone tubing | Masterflex | 96410 -16 | |
| Graduated Laboratory Glass Bottles - 500 ml | Thermofisher Scientific | 100-400 | |
| CHEMICAL RUBBER STOPPER 57 x 65 mm | |||
| CHEMICAL RUBBER STOPPER 29 mm x 32 mm | |||
| Water heater (thermo regulator) | Ratek | TH7000 | |
| Logitech Webcam | Logitech | ||
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Software | |||
| Virtual Dub - 1.9 11 | virtualdub.org | ||
| MATLAB R2012a | Graph Pad | ||
| Logitech Webcam Software | Logitech |
References
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