We describe a protocol for amplifying retroviral integration sites from the genomic DNA of infected cells, sequencing the amplified virus-host junctions, and then mapping these sequences to a reference genome. We also describe techniques to quantify the distribution of integration sites relative to various genomic annotations using BEDTools.
Ретровирусы проявляют предпочтения интеграции подписи на местном и глобальном масштабах. Здесь мы представляем подробный протокол для (1) генерации различных библиотек ретровирусных сайтов интеграции с использованием лигирования-опосредованной PCR (LM-ПЦР) и следующего поколения секвенирования (NGS), (2), отображающую геномную расположение каждого вирусоподобные принимающей узел с использованием BEDTools, и (3) анализ данных для статистической значимости. Геномную ДНК, выделенную из инфицированных клеток, раздроблена перевариванием ферментами рестрикции или с помощью ультразвука. После того, как подходящий ДНК конечного ремонта двухцепочечную линкеры лигировали на концы ДНК, и полупрозрачные, гнездовую ПЦР проводят с использованием праймеров, комплементарных как длинный концевой повтор (LTR), конец вируса и сшита ДНК линкера. ПЦР-праймеры несут последовательности, необходимые для кластеризации ДНК во время NGS, отрицая требование для отдельного адаптера перевязки. Контроль качества (QC) проводится с целью оценки распределения размера фрагмента ДНК и адаптироватьэр включение ДНК до начала NGS. Выходные файлы последовательности фильтруются для LTR-содержащих читает, и последовательности, определяющие LTR и компоновщик обрезаются прочь. Обрезанные последовательности клеток-хозяев отображаются на референсный геном с использованием BLAT и фильтруются для минимально 97% идентичности к единственной точке, в эталонном геноме. Уникальные сайты интеграции тщательно изучаются для смежных нуклеотидов (нт) последовательности и распределения по отношению к различным геномных особенностей. Используя этот протокол, библиотеки интеграции сайтов высокой сложности могут быть построены из геномной ДНК в течение трех дней. Таким образом, весь протокол, который включает в себя экзогенный вирусная инфекция клеток восприимчивых тканевых культур к анализу интеграции сайта может быть проведена в приблизительно одной до двух недель. Последние применения этой технологии относятся к продольной анализу интеграционных участков от ВИЧ-инфицированных пациентов.
Интеграция вирусной ДНК (vDNA) в геном клетки-хозяина является важным шагом в жизненном цикле ретровирусов. Интеграция осуществляется с помощью вирусного фермента интегразы (IN), которая осуществляет два различных каталитических процессов , которые приводят к созданию стабильно вставленной провирусом 1. В субъединицы участвовать концы линейного vDNA , который генерируется с помощью обратной транскрипции, образуя intasome высшего порядка с vDNA концы скрепляются с помощью IN мультимеров 2-4. В расщепляет 'концы vDNA вниз по течению от инвариантных 5'-СА-3' 3 последовательностей в процессе , известном как 3'-обработки, в результате чего утоплена 3 'концы с реактивными гидроксильными группами на каждом vDNA концевой 5-8. Intasome затем импортируется в ядро как часть большого сборки хозяина и вирусных белков , известных как preintegration комплекс (ПОС) 9-11. Столкнувшись с клеточной ДНК-мишени (tDNA), IN использует vDNA 3'-гидроксил Groвзлетов расщеплять верхнюю и нижнюю tDNA пряди в шахматном порядке и одновременно соединяет vDNA к tDNA 5 'фосфатных групп в процессе передачи цепи 12,13.
Ретровирусы предпочтения выставляется интеграция сайтов на локальном и глобальном масштабах. Локально, сайты интеграции на основе консенсуса состоят из слабо консервативных последовательностей палиндромных tDNA , которые охватывают приблизительно от 9:55 б.п. вверх и вниз по течению от вставки сайтов vDNA 14,15. В глобальном масштабе, ретровирусы ориентированы на конкретные хроматина аннотаций 16. Есть семь различных ретровирусная родов – альфа через эпсилон, Ленти и spuma. В лентивирусов, в том числе ВИЧ-1, в пользу интеграции в рамках органов активно расшифрованных генов 17, в то время как gammaretroviruses преимущественно интегрироваться в транскрипционных сайтов начальной (ЦСС) и активных областей усиливающих 18-20. В резком контрасте, spumavirus сильно смещен в сторону heterochromАИКТ регионы, такие как ген бедных листовых пластинок ассоциированных доменов 21. Местные базовые предпочтения tDNA в значительной степени продиктованы конкретными сетями нуклеопротеидных контактов между IN и tDNA 13,22,23. Для лентивирусах и gammaretroviruses, интеграция по отношению к геномных аннотаций в значительной степени регулируется взаимодействием между IN и родственными клеточных факторов 24-27. Изменяя специфику взаимодействия сети IN-tDNA 13,22,23,28 и срыве или реинжиниринг IN-хозяина фактор взаимодействия 25-27,29-32 проверенные стратегии перенацелить интеграции на местном и глобальном уровнях, соответственно.
Мощность процедур секвенирования ДНК, используемых в каталог ретровирусных сайтов интеграции чрезвычайно возросло за последние десятилетия. Интеграционные сайты были восстановлены в пионерской работе , используя трудоемкую очистку и ручных методов клонирования для получения только несколько уникальных участков на исследование 33,34.Сочетание LM-ПЦР – амплификации переходов ДНК ДКП-хозяевах с возможностью отображения отдельных участков интеграции на человека и проекты мыши геномы трансформированных поле, с количеством сайтов , добытых инфекций экзогенный для тканевой культуры клеток увеличением до нескольких сотен до тысяч 17 , 18. Более поздние комбинация LM-PCR с методологией NGS послал глубины библиотеки стремительно растет. В частности, Пиросеквенирование дали порядка десятков тысяч уникальных сайтов интеграции 30,35-38, в то время как библиотеки секвенировали посредством использования кластеризацию ДНК может принести миллионы уникальных последовательностей 19-21,39. Здесь мы опишем оптимизированный протокол LM-PCR для амплификации и секвенирования ретровирусных сайтов интеграции с использованием ДНК кластеризации NGS. Способ включает в себя адаптер требуется последовательностей в ПЦР-праймеров и, следовательно, непосредственно в усиленных молекул ДНК, тем самым исключающие требование дополнительного шага адаптера лигирования до начала sequenCing 40. Трубопровод биоинформатики анализ, из синтаксического анализа исходных данных секвенирования для LTR-ДНК хозяина переходов к отображению уникальных сайтов интеграции на соответствующие геномные функции, как правило, также описаны. В соответствии с очередности , установленной из предыдущих методологических протоколов в этой области 36,38,41-43, пользовательские скрипты могут быть разработаны , чтобы помочь завершению конкретных шагов в трубопроводе биоинформатики. Полезность и чувствительность протокола иллюстрируется данными, приближенными путем амплификации, секвенирование и картирование ВИЧ-1 интеграционные сайты из клеток для культивирования тканей, инфицированных при приблизительной множественности инфекции (MOI) 1,0, а также ряд титрование этой ДНК разбавленный через неинфицированному клеточную ДНК в 5-кратно до максимального разведении 1: 15625 , чтобы получить приблизительный эквивалент MOI 6,4 х 10 -5.
Протокол для анализа ретровирусных сайтов интеграции, от начальной стадии вирусной инфекции с помощью картирования геномных схем распределения, описан. Этот протокол применим к любому ретровируса и любого заражае- типа клеток. Кроме того, трубопровод анализа весьма чувствителен, с по…
The authors have nothing to disclose.
Мы благодарны нашим коллегам Стивен Хьюз и Генри Левин за советом, что имеет решающее значение для установления протокола NGS для ретровирусов секвенирования интеграции сайта в лаборатории Энгельман. Эта работа была поддержана США Национальных институтов здравоохранения гранты AI039394 и AI052014 (к АНХ) и AI060354 (Harvard University Центр исследований в области СПИДа).
DMEM | Gibco | 11965-084 | Standard cell culture medium, compatible with HEK293T cells |
Fetal Bovine Serum | Thermo Scientific | SH 30088.03 | Different lots of serum may need to be pre-screened for optimal viral production |
Penicillin/Streptomycin | Corning | 30-002-Cl | Antibiotics to be added to DMEM |
Phosphate-buffered saline | Mediatech | 21-040-CV | Used to wash cells |
Trypsin EDTA | Corning | 25-053-CI | Used to detach adherent cells from tissue culture plates |
PolyJet | SignaGen Laboratories | SL100688 | DNA transfection reagent |
0.45 µm Filters | Thermo Scientific | 09-740-35B | Used to filter virus particle-containing cell culture media |
Turbo DNase | Ambion | AM2239 | Used to degrade carryover plasmid DNA from virus stocks |
HIV-1 p24 Antigen Capture Assay | ABL Inc. | 5447 | Used to quantify yield of virus production |
DNeasy Blood & Tissue Kit | Qiagen | 69506 | Used to purify genomic DNA from cells |
Sonicator | Covaris | S2 | With this model of sonicator perform two rounds of duty cycle, 5%; intensity, 3; cycles per burst, 200; time, 80 sec |
Nuclease-Free Water | GeneMate | G-3250-125 | Commercially-available water is recommended to reduce the possibility of sample cross-contamination |
QIAQuick PCR Purification Kit | Qiagen | 28106 | Used to purify DNA during library construction |
End-It DNA End-Repair Kit | Epicentre | ER81050 | Used to repair DNA ends of sonicated DNA samples |
Klenow Fragment (3'-5' exo–) | New England Biolabs (NEB) | M0212S | Used with dATP to A-tail repaired DNA fragments |
dATP | Thermo Scientific | R0141 | Deoxyadenosine triphosphate |
MseI | NEB | R0525L | Restriction endonuclease for genomic DNA cleavage |
BglII | NEB | R0144L | Restriction endonuclease to suppress amplification of upstream HIV-1 U5 sequence |
T4 DNA Ligase | NEB | M0202L/6218 | Enzyme for covalent joining of compatible DNA ends |
DNA Oligonucleotides | Integrated DNA Technologies | custom | Have the company purify the oligos. HPLC purification suffices for DNAs <30 nucleotides; PAGE purify longer DNAs |
Advantage 2 Polymerase Mix | Clontech | 639202 | Commercial mix containing DNA polymerase for PCR |
dNTPs (100 mM solutions) | Thermo Scientific | R0181 | Dilute the four chemicals on ice with sterile water to reach the intermediate worrking concentrations of 2.5 mM each dNTP |
NanoDrop | Thermo Scientific | NanoDrop 2000 | Spectrophotometer for determination of DNA concentration |
Qubit Fluorimeter | Life Technologies | Qubit® 3.0 | Fluorometer used to confirm integration site library DNA concentration |
2200 TapeStation System | Agilent | G2964AA | Tape-based assay to confirm integration site library DNA size distribution |
MiSeq | Illumina | SY-410-1003 | Used for NGS |