We describe a protocol for amplifying retroviral integration sites from the genomic DNA of infected cells, sequencing the amplified virus-host junctions, and then mapping these sequences to a reference genome. We also describe techniques to quantify the distribution of integration sites relative to various genomic annotations using BEDTools.
दोनों को स्थानीय और वैश्विक पैमाने पर रेट्रोवायरस प्रदर्शनी हस्ताक्षर एकीकरण वरीयताओं। यहाँ, हम (1) बंधाव की मध्यस्थता पीसीआर (एलएम पीसीआर) प्रवर्धन और अगली पीढ़ी के अनुक्रमण (NGS) का उपयोग रेट्रोवायरल एकीकरण साइटों की विभिन्न पुस्तकालयों की पीढ़ी के लिए एक विस्तृत प्रोटोकॉल, (2) प्रत्येक वायरस के जीनोमिक स्थान मानचित्रण पेश BEDTools का उपयोग कर जंक्शन, और (3) सांख्यिकीय प्रासंगिकता के लिए डेटा का विश्लेषण करने की मेजबानी। जीनोमिक डीएनए संक्रमित कोशिकाओं से निकाले गए प्रतिबंध एंजाइमों के साथ या sonication द्वारा पाचन द्वारा खंडित है। उपयुक्त डीएनए अंत मरम्मत के बाद, डबल असहाय linkers ligated हैं पर डीएनए समाप्त होता है, और अर्द्ध नेस्टेड पीसीआर वायरस के दोनों लंबे टर्मिनल दोहराने (लीटर) अंत और ligated लिंकर डीएनए के पूरक प्राइमरों का उपयोग किया जाता है। पीसीआर प्राइमरों NGS के दौरान डीएनए क्लस्टरिंग के लिए आवश्यक दृश्यों ले, अलग अनुकूलक बंधाव के लिए आवश्यकता को नकार। गुणवत्ता नियंत्रण (QC) में डीएनए टुकड़ा आकार के वितरण का आकलन और अनुकूल करने के लिए आयोजित किया जाता हैएर डीएनए समावेश NGS से पहले। अनुक्रम आउटपुट फाइल लीटर युक्त पढ़ता के लिए छान रहे हैं, और लीटर और लिंकर परिभाषित दृश्यों दूर उत्पन्न होते हैं। छंटनी की मेजबान सेल दृश्यों BLAT का उपयोग कर एक संदर्भ जीनोम मैप किए गए हैं और संदर्भ के जीनोम में एक अनूठी बात करने के लिए न्यूनतम 97% पहचान के लिए छान रहे हैं। अनोखा एकीकरण साइटों विभिन्न जीनोमिक सुविधाओं से सटे न्यूक्लियोटाइड (एनटी) अनुक्रम और वितरण रिश्तेदार के लिए छानबीन कर रहे हैं। इस प्रोटोकॉल का उपयोग, उच्च जटिलता के एकीकरण साइट पुस्तकालयों तीन दिनों में जीनोमिक डीएनए से निर्माण किया जा सकता है। पूरे प्रोटोकॉल है कि एकीकरण साइट विश्लेषण करने के लिए अतिसंवेदनशील टिशू कल्चर कोशिकाओं के बहिर्जात वायरल संक्रमण शामिल हैं इसलिए लगभग एक से दो सप्ताह में आयोजित किया जा सकता है। इस प्रौद्योगिकी के हाल के अनुप्रयोगों एचआईवी संक्रमित रोगियों से एकीकरण साइटों के अनुदैर्ध्य विश्लेषण से संबंधित हैं।
वायरल डीएनए (vDNA) मेजबान सेल जीनोम में की एकता रेट्रोवायरल जीवन चक्र में एक आवश्यक कदम है। एकता वायरल एंजाइम इंटिग्रेस (IN), दो अलग उत्प्रेरक प्रक्रियाओं है कि स्थिरतापूर्वक डाला provirus 1 की स्थापना करने के लिए नेतृत्व के बाहर किया जाता है जिसके द्वारा पूरा किया है। सब यूनिटों में रेखीय vDNA कि रिवर्स प्रतिलेखन के माध्यम से उत्पन्न होता है की छोर संलग्न, एक में multimer 2-4 से एक साथ आयोजित समाप्त होता है vDNA साथ उच्च आदेश intasome के गठन। Cleaves में के रूप में 3'-प्रसंस्करण में जाना प्रक्रिया में दृश्यों 3 'vDNA अपरिवर्तनीय 5'-CA-3 से नीचे की ओर की छोर', recessed 3 'प्रत्येक vDNA टर्मिनस 5-8 से प्रतिक्रियाशील हाइड्रॉक्सिल समूहों के साथ समाप्त होता है छोड़कर। Intasome बाद में मेजबान की एक बड़ी विधानसभा का हिस्सा है और वायरल preintegration जटिल (पीआईसी) 9-11 रूप में जाना जाता प्रोटीन के रूप में नाभिक में आयात किया जाता है। सेलुलर लक्ष्य डीएनए (tDNA) का सामना करने के बाद, में vDNA 3'-हाइड्रॉक्सिल gro का उपयोग करता हैउतार tDNA ऊपर और एक कंपित फैशन में नीचे किस्में फोड़ना और एक साथ कतरा हस्तांतरण 12,13 की प्रक्रिया के माध्यम tDNA 5 'फॉस्फेट समूहों को vDNA मिलती है।
स्थानीय और वैश्विक पैमाने पर रेट्रोवायरस प्रदर्शनी एकीकरण साइट प्राथमिकताएं। स्थानीय स्तर पर, आम सहमति के एकीकरण साइटों दुर्बलता से संरक्षित मुरजबंध संबंधी tDNA दृश्यों कि लगभग पांच से दस vDNA प्रविष्टि साइटों 14,15 से बीपी अपस्ट्रीम और डाउनस्ट्रीम करने से अवधि से मिलकर बनता है। विश्व स्तर पर, रेट्रोवायरस विशिष्ट क्रोमेटिन एनोटेशन 16 लक्ष्य। के माध्यम से एप्सिलॉन, Lenti, और spuma अल्फा – सात विभिन्न रेट्रोवायरल पीढ़ी रहे हैं। Lentiviruses है, जो एचआईवी -1 में शामिल हैं, जबकि gammaretroviruses preferentially ट्रांसक्रिप्शनल प्रारंभ साइटों (TSSs) और सक्रिय बढ़ाने क्षेत्रों 18-20 में एकीकृत, सक्रिय रूप से लिखित जीन 17 से शरीर के भीतर एकीकरण के पक्ष में। इसके विपरीत, spumavirus जोरदार heterochrom ओर झुका हुआ हैइस तरह के जीन-गरीब पटल जुड़े डोमेन के 21 के रूप में atic क्षेत्रों,। स्थानीय tDNA आधार वरीयताओं में और tDNA 13,22,23 के बीच nucleoprotein संपर्कों के विशिष्ट नेटवर्क से तय बड़े हिस्से में हैं। Lentiviruses और gammaretroviruses के लिए, जीनोमिक एनोटेशन के लिए एकीकरण के सापेक्ष में और आत्मीय सेलुलर कारकों 24-27 के बीच बातचीत द्वारा शासित बड़े हिस्से में है। IN-tDNA बातचीत नेटवर्क 13,22,23,28 की बारीकियों में फेरबदल और खलल न डालें या फिर इंजीनियरिंग में मेजबान कारक बातचीत 25-27,29-32 रणनीतियों साबित कर रहे हैं क्रमशः, स्थानीय और वैश्विक स्तर पर एकीकरण retarget करने के लिए।
डीएनए अनुक्रमण रेट्रोवायरल एकीकरण साइटों सूची को इस्तेमाल किया प्रक्रियाओं की शक्ति पिछले दशकों में काफी बढ़ गई है। एकता साइटों श्रमसाध्य शुद्धि और मैनुअल क्लोनिंग तकनीक का उपयोग कर अध्ययन 33,34 प्रति अद्वितीय साइटों का सिर्फ एक मुट्ठी उपज के लिए अग्रणी काम में बरामद किए गए।हजारों 17 के लिए कई सौ करने के लिए बढ़ रही है बहिर्जात टिशू कल्चर सेल संक्रमण से बरामद साइटों की संख्या के साथ मैदान में तब्दील मानव और माउस मसौदा जीनोम के लिए अलग-अलग एकीकरण साइटों नक्शा करने के लिए, की क्षमता के साथ लीटर मेजबान डीएनए जंक्शनों के एलएम पीसीआर प्रवर्धन का संयोजन 18। NGS पद्धति के साथ एलएम पीसीआर की और अधिक हाल के संयोजन पुस्तकालय गहराई आसमान छू भेजा है। विशेष रूप से, pyrosequencing, अद्वितीय एकीकरण साइटों 30,35-38 के हजारों के दसियों के आदेश पर सामने आए, जबकि पुस्तकालयों डीएनए क्लस्टरिंग के उपयोग के माध्यम अनुक्रम अद्वितीय दृश्यों 19-21,39 के लाखों लोगों की प्राप्ति कर सकते हैं। यहाँ हम amplifying और डीएनए क्लस्टरिंग NGS का उपयोग कर रेट्रोवायरल एकीकरण साइटों क्रमबद्ध करने के लिए एक अनुकूलित एलएम पीसीआर प्रोटोकॉल का वर्णन। विधि प्रवर्धित डीएनए अणु में पीसीआर प्राइमरों में एडाप्टर दृश्यों की आवश्यकता है और इसलिए सीधे को शामिल किया जिससे एक अतिरिक्त एडाप्टर बंधाव कदम sequen से पहले के लिए आवश्यकता precluding40 cing। bioinformatic विश्लेषण पाइपलाइन, अद्वितीय एकीकरण साइटों की मैपिंग जीनोमिक सुविधाओं उचित करने के लिए लीटर मेजबान डीएनए जंक्शनों के लिए कच्चे अनुक्रमण डेटा की पार्स करने से भी आम तौर पर वर्णित है। पूर्वता इस क्षेत्र 36,38,41-43 में पूर्व पद्धति प्रोटोकॉल से स्थापित के अनुसार, कस्टम स्क्रिप्ट जैव सूचना विज्ञान पाइप लाइन में विशेष कदम के पूरा होने सहायता करने के लिए विकसित किया जा सकता है। उपयोगिता और प्रोटोकॉल की संवेदनशीलता, amplifying अनुक्रमण, और मानचित्रण संक्रमण की अनुमानित बहुलता 1.0 (MOI), साथ ही यह डीएनए के एक अनुमापन श्रृंखला में संक्रमित ऊतक संस्कृति कोशिकाओं से एचआईवी -1 एकीकरण साइटों द्वारा प्रतिनिधि डेटा के साथ सचित्र है 1 के एक अधिकतम कमजोर पड़ने के लिए कदम गुना 5 में असंक्रमित सेलुलर डीएनए के माध्यम से पतला: 15,625 6.4 x 10 -5 की अनुमानित बराबर MOI उपज के लिए।
रेट्रोवायरल एकीकरण साइटों के विश्लेषण के लिए एक प्रोटोकॉल, जीनोमिक वितरण पैटर्न के मानचित्रण के माध्यम से प्रारंभिक वायरस के संक्रमण से कदम, वर्णित है। इस प्रोटोकॉल किसी भी रेट्रोवायरस और किसी भी infecta…
The authors have nothing to disclose.
हम अपने सहयोगियों स्टीफन ह्यूजेस और सलाह के लिए हेनरी लेविन कि Engelman प्रयोगशाला में रेट्रोवायरल एकीकरण साइट अनुक्रमण के लिए NGS प्रोटोकॉल स्थापित करने के लिए महत्वपूर्ण था के लिए आभारी हैं। इस काम अनुदान स्वास्थ्य के अमेरिकी राष्ट्रीय संस्थानों द्वारा समर्थित किया गया AI039394 और AI052014 (ANE) और AI060354 (एड्स अनुसंधान के लिए हार्वर्ड विश्वविद्यालय के सेंटर)।
DMEM | Gibco | 11965-084 | Standard cell culture medium, compatible with HEK293T cells |
Fetal Bovine Serum | Thermo Scientific | SH 30088.03 | Different lots of serum may need to be pre-screened for optimal viral production |
Penicillin/Streptomycin | Corning | 30-002-Cl | Antibiotics to be added to DMEM |
Phosphate-buffered saline | Mediatech | 21-040-CV | Used to wash cells |
Trypsin EDTA | Corning | 25-053-CI | Used to detach adherent cells from tissue culture plates |
PolyJet | SignaGen Laboratories | SL100688 | DNA transfection reagent |
0.45 µm Filters | Thermo Scientific | 09-740-35B | Used to filter virus particle-containing cell culture media |
Turbo DNase | Ambion | AM2239 | Used to degrade carryover plasmid DNA from virus stocks |
HIV-1 p24 Antigen Capture Assay | ABL Inc. | 5447 | Used to quantify yield of virus production |
DNeasy Blood & Tissue Kit | Qiagen | 69506 | Used to purify genomic DNA from cells |
Sonicator | Covaris | S2 | With this model of sonicator perform two rounds of duty cycle, 5%; intensity, 3; cycles per burst, 200; time, 80 sec |
Nuclease-Free Water | GeneMate | G-3250-125 | Commercially-available water is recommended to reduce the possibility of sample cross-contamination |
QIAQuick PCR Purification Kit | Qiagen | 28106 | Used to purify DNA during library construction |
End-It DNA End-Repair Kit | Epicentre | ER81050 | Used to repair DNA ends of sonicated DNA samples |
Klenow Fragment (3'-5' exo–) | New England Biolabs (NEB) | M0212S | Used with dATP to A-tail repaired DNA fragments |
dATP | Thermo Scientific | R0141 | Deoxyadenosine triphosphate |
MseI | NEB | R0525L | Restriction endonuclease for genomic DNA cleavage |
BglII | NEB | R0144L | Restriction endonuclease to suppress amplification of upstream HIV-1 U5 sequence |
T4 DNA Ligase | NEB | M0202L/6218 | Enzyme for covalent joining of compatible DNA ends |
DNA Oligonucleotides | Integrated DNA Technologies | custom | Have the company purify the oligos. HPLC purification suffices for DNAs <30 nucleotides; PAGE purify longer DNAs |
Advantage 2 Polymerase Mix | Clontech | 639202 | Commercial mix containing DNA polymerase for PCR |
dNTPs (100 mM solutions) | Thermo Scientific | R0181 | Dilute the four chemicals on ice with sterile water to reach the intermediate worrking concentrations of 2.5 mM each dNTP |
NanoDrop | Thermo Scientific | NanoDrop 2000 | Spectrophotometer for determination of DNA concentration |
Qubit Fluorimeter | Life Technologies | Qubit® 3.0 | Fluorometer used to confirm integration site library DNA concentration |
2200 TapeStation System | Agilent | G2964AA | Tape-based assay to confirm integration site library DNA size distribution |
MiSeq | Illumina | SY-410-1003 | Used for NGS |