We describe a protocol for amplifying retroviral integration sites from the genomic DNA of infected cells, sequencing the amplified virus-host junctions, and then mapping these sequences to a reference genome. We also describe techniques to quantify the distribution of integration sites relative to various genomic annotations using BEDTools.
hem yerel hem de küresel ölçeklerde retrovirüsler sergi imza entegrasyonu tercihleri. Burada, ligasyon aracılı PCR (LM-PCR) amplifikasyonu ve yeni nesil dizileme (NGS) kullanılarak retroviral entegrasyon sitelerin çeşitli kütüphanelerin (1) nesil için ayrıntılı bir protokol, (2) Her virüs- genomik konumunu haritalama sunuyoruz kavşak BEDTools kullanarak ve (3) İstatistiksel alaka için verileri analiz ev sahipliği yapmaktadır. enfekte olmuş hücrelerden özütlendi genomik DNA sınırlama enzimleri ile ya da sonikasyon ile sindirme ile parçalanır. uygun bir DNA son tamir sonra çift şeritli bir DNA bağlayıcılar uçlarına bağlanır ve yarı iç içe PCR virüsü uzun terminal tekrar (LTR) sonu ile bağlanmış bağlayıcı DNA hem de tamamlayıcı primerler kullanılarak gerçekleştirilir. PCR primerleri ayrı adaptör ligasyonu ihtiyacını inkâr NGS sırasında DNA kümeleme için gereken dizileri taşırlar. Kalite kontrol (KK) DNA fragmanı boyutu dağılımına değerlendirmek ve uyum için yapılırNGS önce bir DNA dahil edilmesini er. Dizi çıkış dosyaları LTR içeren okur için filtre edilir ve LTR ve bağlayıcı tanımlayan diziler uzakta kırpılır. Ayıklanmış konakçı hücre dizileri blat kullanarak bir referans genom eşlenir ve referans genom içinde benzersiz bir noktaya minimum% 97 kimlik filtrelenir. Benzersiz entegrasyon siteleri çeşitli genomik özelliklere bitişik nükleotid (nt) sekansı ve dağıtım akrabası için irdelenmektedir. Bu protokol kullanılarak, yüksek bir karmaşıklık entegre edilen kütüphaneler üç günde genomik DNA'dan yapılabilir. entegre edilen analiz duyarlı doku kültürü hücreleri eksojen viral enfeksiyon kapsamına almaktadır, tüm protokol, bu nedenle, yaklaşık bir ila iki hafta içinde yapılabilir. Bu teknolojinin son uygulamalar, HIV ile enfekte olmuş hastalardan alınan entegrasyon sitelerinden uzunlamasına analizi ile ilgilidir.
konakçı hücre genomuna viral DNA (vDNA) Entegrasyon retroviral yaşam döngüsünde önemli bir adımdır. Entegrasyon stabil eklenen Provirüsün 1 kurulmasına yol açan iki ayrı katalitik işlemlerini yürütür viral enzim integraz (IN) tarafından gerçekleştirilir. Alt birimlerin bir in multimer 2-4 tarafından bir arada tutulan uçları vDNA ile üst düzey intasome oluşturan, ters transkripsiyon yoluyla üretilen doğrusal vDNA uçlarını meşgul. Yararak İÇİNDE 3'-işleme olarak bilinen bir süreçte dizilerin 3 'aşağı değişmez 5'-CA-3 den vDNA uçları', '3 girintili bırakarak her vDNA terminalinde 5-8 reaktif hidroksil grupları ile sona erer. Intasome sonradan ev sahibi büyük bir montaj parçası ve preintegration kompleksi (PIC) 9-11 olarak bilinen viral proteinler gibi çekirdek içine alınır. hücresel hedef DNA (T-DNA) rastladığında, 3'-hidroksil gro vDNA kullanırUPS zikzaklı bir şekilde T-DNA üst ve alt şeritlerin ayrılması ve eş zamanlı olarak şerit aktarma 12,13 sürecinde T-DNA 5 'fosfat gruplarına vDNA katılır için.
yerel ve küresel ölçeklerde retrovirüsler sergi entegrasyon sitesi tercihleri. Yerel olarak, uzlaşma entegrasyon siteleri yaklaşık beş vDNA ekleme sitelerinden 14,15 den yukarı bp ve aşağı on dan yayılan zayıf korunmuş palindromic T-DNA dizilerinin oluşmaktadır. Küresel olarak, retrovirüsler özel kromatin açıklamaları 16 hedef. epsilon, Lenti ve spuma yoluyla alfa – yedi farklı retroviral cins vardır. Gammaretroviruses tercihen transkripsiyon başlangıç siteleri (TSSler) ve aktif artırıcı bölgelerine 18-20 entegre ederken HIV-1 içeren lentiviruses, aktif transkripsiyonu genler 17 bünyelerinde entegrasyonu lehine. tam tersine, spumavirus kuvvetle heterochrom karşı önyargılı olduğunuBu tür gen kötü lamina-ilişkili alanlar 21 olarak problemlerle bölgeler. Yerel T-DNA baz tercihleri IN ve T-DNA 13,22,23 arasındaki nukleoprotein temasların özel ağlar tarafından dikte büyük ölçüde vardır. Lentiviruses ve gammaretroviruses için genomik ek açıklamalar entegrasyon göreli IN ve soydaş hücresel faktörlerin 24-27 arasındaki etkileşimler tarafından yönetilen büyük bir kısmı yer almaktadır. Faktör etkileşimleri 25-27,29-32, sırasıyla yerel ve küresel düzeylerde entegrasyonu yeniden hedefleme stratejileri kanıtlanmış IN-host IN-T-DNA etkileşimi ağının 13,22,23,28 özelliklerini değiştiren ve bozan veya yeniden mühendislik.
retroviral entegrasyon siteleri katalog için kullanılan DNA dizi prosedürlerinin gücü geçmiş yıllarda son derece artmıştır. Entegrasyon siteleri Çalışma 33,34 başına benzersiz sitelerin sadece bir avuç elde etmek zahmetli arınma ve manuel klonlama teknikleri kullanılarak öncü çalışmalar ele alındı.Binlerce 17 birkaç yüz artan eksojen doku kültürü hücre enfeksiyonları elde sitelerin sayısı ile, alan dönüştürülmüş insan ve fare taslak genomları bireysel entegrasyon siteleri harita yeteneği ile LTR-konakçı DNA kavşaklarından LM-PCR amplifikasyonu kombinasyonu 18. NGS metodolojisi ile LM-PCR daha yeni kombinasyon kütüphane derinlik fırlayan gönderdi. Kütüphaneler eşsiz dizilerin 19-21,39 milyonlarca verebilir DNA kümeleme kullanımı yoluyla sıralı ise Özellikle, piro, onlarca benzersiz entegrasyon sitelerinden 30,35-38 binlerce sırasına vermiştir. Burada yükselterek ve DNA kümeleme NGS kullanarak retroviral entegrasyon siteleri sıralanması için optimize edilmiş LM-PCR protokol açıklar. yöntem, ve böylece sequen önce ek bir bağdaştırıcı bağlama adımı ihtiyacını engelleyen, büyütülmüş DNA moleküllerine dolayısıyla doğrudan PCR primerleri içine adaptörü dizileri gerekli birleştirir40 dans ediyorum. biyoinformatik analizi boru hattı, genomik özellikleri formüller verilmiştir özgü entegrasyon sitelerinden eşleme LTR-konakçı DNA birleşme için ham dizileme veri çözümlenmesinden, ayrıca genel olarak tarif edilmektedir. Bu alanda 36,38,41-43 önceki metodolojik protokollerden kurulan öncelik doğrultusunda, özel komut biyoinformatik boru hattı belirli adımların tamamlanmasına yardımcı olmak amacıyla geliştirilebilir. yardımcı ve protokol duyarlılığı enfeksiyonun yaklaşık çokluğu 1.0 (İB), hem de bu DNA'nın bir titrasyon serisi enfekte doku kültürü hücreleri, HIV-1 entegrasyon sitesi, yükseltme dizilemesi ve eşleyerek Örnek verilerle gösterilmektedir 6.4 x 10 -5 yaklaşık eşdeğer İçişleri Bakanlığı vermek üzere 15.625: enfekte olmamış hücresel DNA ile seyreltilmiş 1 maksimum seyreltme adımları 5 kat.
Genomik dağılım örnekleri eşleme yoluyla başlangıç virüs enfeksiyonu aşama retroviral entegrasyonu sitelerinin analizi için bir protokol, tarif edilmektedir. Bu protokol, bir retrovirüs ve bir infectable hücre tipine uygulanabilir. Bundan başka, deney boru hattı 6.4 x 10 -5 MOI ile başlatılmış bir enfeksiyon edilene Genomik DNA, eşdeğer seri seyreltmeleri benzersiz entegrasyon sitelerinden tatmin edici bir dizi geri potansiyeline sahip, çok hassastır. hücrelerin sadece küçük b…
The authors have nothing to disclose.
Biz Engelman laboratuarında retroviral entegrasyon sitesi sıralama için NGS protokolünü kurmak için kritik meslektaşlarımızla Stephen Hughes ve tavsiye için Henry Levin minnettarız. Bu çalışma AI039394 ve (ANE kadar) AI052014 ve AI060354 (AIDS Araştırma Harvard Üniversitesi Merkezi) ABD Ulusal Sağlık Enstitüleri tarafından hibe desteklenmiştir.
DMEM | Gibco | 11965-084 | Standard cell culture medium, compatible with HEK293T cells |
Fetal Bovine Serum | Thermo Scientific | SH 30088.03 | Different lots of serum may need to be pre-screened for optimal viral production |
Penicillin/Streptomycin | Corning | 30-002-Cl | Antibiotics to be added to DMEM |
Phosphate-buffered saline | Mediatech | 21-040-CV | Used to wash cells |
Trypsin EDTA | Corning | 25-053-CI | Used to detach adherent cells from tissue culture plates |
PolyJet | SignaGen Laboratories | SL100688 | DNA transfection reagent |
0.45 µm Filters | Thermo Scientific | 09-740-35B | Used to filter virus particle-containing cell culture media |
Turbo DNase | Ambion | AM2239 | Used to degrade carryover plasmid DNA from virus stocks |
HIV-1 p24 Antigen Capture Assay | ABL Inc. | 5447 | Used to quantify yield of virus production |
DNeasy Blood & Tissue Kit | Qiagen | 69506 | Used to purify genomic DNA from cells |
Sonicator | Covaris | S2 | With this model of sonicator perform two rounds of duty cycle, 5%; intensity, 3; cycles per burst, 200; time, 80 sec |
Nuclease-Free Water | GeneMate | G-3250-125 | Commercially-available water is recommended to reduce the possibility of sample cross-contamination |
QIAQuick PCR Purification Kit | Qiagen | 28106 | Used to purify DNA during library construction |
End-It DNA End-Repair Kit | Epicentre | ER81050 | Used to repair DNA ends of sonicated DNA samples |
Klenow Fragment (3'-5' exo–) | New England Biolabs (NEB) | M0212S | Used with dATP to A-tail repaired DNA fragments |
dATP | Thermo Scientific | R0141 | Deoxyadenosine triphosphate |
MseI | NEB | R0525L | Restriction endonuclease for genomic DNA cleavage |
BglII | NEB | R0144L | Restriction endonuclease to suppress amplification of upstream HIV-1 U5 sequence |
T4 DNA Ligase | NEB | M0202L/6218 | Enzyme for covalent joining of compatible DNA ends |
DNA Oligonucleotides | Integrated DNA Technologies | custom | Have the company purify the oligos. HPLC purification suffices for DNAs <30 nucleotides; PAGE purify longer DNAs |
Advantage 2 Polymerase Mix | Clontech | 639202 | Commercial mix containing DNA polymerase for PCR |
dNTPs (100 mM solutions) | Thermo Scientific | R0181 | Dilute the four chemicals on ice with sterile water to reach the intermediate worrking concentrations of 2.5 mM each dNTP |
NanoDrop | Thermo Scientific | NanoDrop 2000 | Spectrophotometer for determination of DNA concentration |
Qubit Fluorimeter | Life Technologies | Qubit® 3.0 | Fluorometer used to confirm integration site library DNA concentration |
2200 TapeStation System | Agilent | G2964AA | Tape-based assay to confirm integration site library DNA size distribution |
MiSeq | Illumina | SY-410-1003 | Used for NGS |