Summary
כאן, אנו מתארים שיטה להביע ולטהר norovirus באיכות גבוהה בולטות (P) תחומים ב E. coli לשימוש במחקרים קריסטלוגרפיה באמצעות קרני רנטגן. שיטה זו יכולה להיות מיושמת על תחומי P calicivirus אחרים, כמו גם חלבונים הלא מבניים, כלומר., הגנום צמוד חלבונים נגיפיים (VPG), פרוטאז, ו RNA רפליקאז (RdRp).
Abstract
קפסיד norovirus מורכב חלבון מבני גדול יחיד, כינת VP1. VP1 מחולק פגז (S) תחום תחום בולט (P). תחום S מהווה פיגום רציף סביב רנ"א הנגיפי, ואילו צורות המושלמות P קוצים ויראלי על תחום S ומכיל הקבע עבור אינטראקציות antigenicity ומארח תאים. תחום P נקשר מבני פחמימות, כלומר., אנטיגנים קבוצת histo-דם, אשר נחשבים חשובים עבור זיהומי norovirus. בפרוטוקול זה, אנו מתארים שיטה לייצור תחומי P norovirus באיכות גבוהה בתשואות גבוהות. חלבונים אלה לאחר מכן ניתן להשתמש עבור קריסטלוגרפיה באמצעות קרני רנטגן ו ELISA כדי לחקור אינטראקציות antigenicity ומארח תאים.
תחום P הוא משובט ראשית לתוך וקטור ביטוי ולאחר מכן הביע בחיידקים. החלבון הוא מטוהר באמצעות שלושה צעדים כרוכים משותקים כרומטוגרפיה זיקת מתכת-יון כרומטוגרפיה הדרת גודל. בעקרונית, אפשר לשכפל, מפורש, לטהר, ולגבש חלבונים בתוך פחות מארבעה שבועות, מה שהופך בפרוטוקול זה מערכת מהירה לניתוח זני norovirus המתהווה.
Introduction
Noroviruses אדם הם הגורם העיקרי של גסטרואנטריטיס חריפה ברחבי העולם 1. וירוסים אלה שייכים למשפחת Caliciviridae, אשר יש לפחות חמישה סוגים, כולל norovirus, Sapovirus, Lagovirus, Vesivirus, ו Nebovirus. למרות השפעה הגבוה על מערכת הבריאות והפצה רחבה, חקר noroviruses אדם נפגע על ידי עדר מערכת תרבית תאים חזקה. נכון להיום, אין חיסונים שאושרו או אסטרטגיות אנטי זמינות.
חלבון קפסיד הגדול norovirus, כינת VP1, ניתן לחלק תחום פגז (S) ואת התחום בולט (P) 2. תחום P מחובר תחום S ידי ציר גמיש (H) באזור. תחום S מהווה פיגום סביב רנ"א הנגיפי, ואילו תחום P מהווה את החלק קצוני של קפסיד ויראלי. תחום P מרכיב לתוך הדימרים רלוונטיים מבחינה ביולוגית כאשר הביעו בחיידקים. ה- P דimer אינטראקציה עם מבני פחמימות, כינת אנטיגנים קבוצת histo-דם (HBGAs) שנמצאים כמו אנטיגנים מסיסים המצויים ברוק ומצאו בתא פונדקאי מסוים 3. האינטראקציה תחום-HBGA P נחשב חשוב זיהום 4. ואכן, לאחרונה דווח חשף את החשיבות של HBGAs הסינטטי או HBGA להביע חיידקי זיהום norovirus אנושי במבחנה 5.
מחקרים שוטפים לגבי מצורף התא המארח של noroviruses מבוצעים בעיקר עם חלקיקים דמויי וירוס (VLPs) שיכול לבוא לידי ביטוי בתאי חרקים או עם תחומי P רקומביננטי לידי ביטוי Escherichia coli (E. coli). כדי להבין את יחסי הגומלין P תחום-HBGA ברזולוציה אטומית, P מבנים מורכבים תחום-HBGA ניתן לפתור באמצעות קריסטלוגרפיה באמצעות קרני רנטגן. כאן אנו מתארים פרוטוקול עבור ביטוי מושלם P וטיהור המאפשר ייצור של תחום P בכמות ובאיכות גבוהה לשמש crystall רנטגןography. יתר על כן, שיטה זו יכולה להיות מיושמת על תחומי P calicivirus אחרים וחלבונים הלא מבניים.
תחום P הוא קודון אופטימיזציה עבור E. ביטוי coli ו משובטים לתוך וקטור העברה סטנדרטי. תחום P הוא מחדש משובט לתוך וקטור ביטוי מקודד polyhistidine התג (שלו) לבין חלבון מחייב מנוז (MBP) כי הם ואחריו אתר מחשוף פרוטאז. חלבון ההיתוך המושלם MBP-שלו-P מתבטא E. coli, ואחריו שלושה שלבים לטיהור. חלבון ההיתוך המושלם MBP-שלו-P מטוהר באמצעות כרומטוגרפיה זיקת יון מתכת משותקת (IMAC). לאחר מכן, חלבון ההיתוך הוא בקע עם rhinovirus אדם (HRV) פרוטאז -3C ואת תחום P מופרד MBP-שלו על ידי צעד טיהור נוסף IMAC. לבסוף, תחום P הוא מטוהר באמצעות כרומטוגרפיה הדרת גודל (SEC). התחום P מטוהרים לאחר מכן ניתן להשתמש עבור קריסטלוגרפיה באמצעות קרני רנטגן. הקרנת התגבשות תנאי חלבון היא performed עם ערכות הקרנה זמינות מסחרי באמצעות ריכוזי חלבון שונים P מושלם. צמיחת קריסטל הוא ציין והתנאים המבטיחים ביותר ממוטבים.
עם השיטות שתוארו כאן, אפשר לעבור גן לחלבון לבנות בתוך פחות מארבעה שבועות. לכן, השיטה שלנו הביטוי המושלם P, טיהור, ההתגבשות מתאימה לחקור את אינטראקצית norovirus לארח ברמה המולקולרית ולספק נתונים חשובים כדי לסייע עַדכָּנִי חיסון הקרנת עיצוב תרופה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. שיבוט דומיין P
- קבע את תחום P באזור קידוד על ידי יישור רצף של זנים norovirus (למשל, זן GII.10, GenBank: AF504671, PDB-ID: 3ONU) 6. יתר על כן, הסר את האזור הגמיש בסוף C- המסוף של תחום P (איור 2 א). קודון-לייעל את ה- DNA עבור E. ביטוי coli וכוללים BamHI (N-terminal) ו NotI (C-terminal) אתרי הגבלה כדי-שיבוט תת התחום P קידוד באזור לתוך וקטור ביטוי pMalc2x 6,7.
הערה: תחום P באזור קידוד ממוטבת, מסונתז על ידי שירות מסחרי. תחום P קידוד באזור (להוסיף) הוא כ 1 kb באורך נמסר וקטור העברה סטנדרטי. - תקציר 2 מיקרוגרם של וקטור העברת עם 1 כל BamHI μl (20,000 יח '/ מ"ל) ו NotI (10,000 יח' / מ"ל) הגבלה אנזימים עבור שעה 1 ב 37 מעלות צלזיוס עם היצרן סיפק מאגרים.
- הפרד את הכנס מתעכל על ג'ל agarose 1%במשך 20 דקות ב 135 V ולטהר את ה- DNA הכנס מן הג'ל באמצעות ערכה מסחרית.
- הכן את וקטור ביטוי pMalc2x ידי לעכל 2 מיקרוגרם של וקטור זה עם כל 1 μl BamHI (20,000 יח '/ מ"ל) ו NotI (10,000 יח' / מ"ל) הגבלה אנזימים עבור שעה 1 ב 37 מעלות צלזיוס. לטהר את הווקטור מן ג'ל agarose כמתואר לעיל (1.3). הערה: שניהם דגימות (1.2 ו -1.4) ניתן לאחסן ב -20 ° C.
- ולקשור את הכנס מטוהרים לתוך וקטור pMalc2x מתעכל על אתרי הגבלה BamHI ו NotI עם 1 μl האנזים T4-דנ"א (400,000 U / ml) במשך 15 דקות בטמפרטורת החדר (RT) (איור 2B ו 2C). השתמש לפחות 20 ננוגרם של וקטור pMalc2x ו וקטור: יחס הכנס 1: 3 (משקל מולקולרי). תמהיל הקשירה הוא בדרך כלל ~ 20 μl.
- Transform 2 μl של תמהיל הקשירה לתוך 50 μl כימי מוסמכות E. coli DH5α תאים חיידקיים באמצעות פרוטוקול טרנספורמציה סטנדרטי (10 דקות על קרח, הלם חום 45 שניות על 42 מעלות צלזיוס) ולגדול 600בינוני SOC μl עבור שעה 1 ב 37 מעלות צלזיוס. צנטריפוגה התאים שינו במשך 3 דקות XG ב 1000, לבטל את supernatant, ו resuspend גלולה ב 30 μl של המדיום SOC.
- פלייט לערבב טרנספורמציה על צלחות LB-אגר, המכיל אמפיצילין 100 מיקרוגרם / מ"ל לבחירה, לגדול בין לילה ב 37 מעלות צלזיוס. חמש מושבות בחר לפחות.
- עבור כל אחד מחמשת מושבות, לחסן תרבות 2-3 מ"ל של LB-בינוני בתוספת 50 מיקרוגרם / מ"ל אמפיצילין (LB-אמפר) ולגדול ידי ניעור לילה ב 160 סל"ד ב 37 מעלות צלזיוס.
- חלץ פלסמידים מתרבים הלילה באמצעות ערכה מסחרית. בדוק את הנוכחות של הכנס מושלם P על ידי רצף עם פריימר קדימה pMalc2x (5'-TCAGACTGTCGATGAAGC-3 ') לאחור תחל (5'-GATGTGCTGCAAGGCGAT-3').
2. ביטוי דומיין P
- Transform 1 μl (150 ng / μl - 400 ng / μl) של קידוד וקטור pMalc2x עבור התחום MBP-שלו-P חלבון היתוך לתוך 50 μl של א המוסמכת coli BL21 תאים באמצעות פרוטוקול טרנספורמציה סטנדרטי (10 דקות על קרח, הלם חום 45 שניות על 42 מעלות צלזיוס) ולגדול 600 μl בינוני SOC עבור שעה 1 ב 37 מעלות צלזיוס. תת לתוך 120 מ"ל של אמפר LB לילה ב 160 סל"ד ו -37 מעלות צלזיוס.
- לחסן תשעה ליטרים (למשל, 6 x 5 צלוחיות L עם 1.5 בינוני L כל אחד) של מגבר LB עם תת (1: 100). לגדל את התאים רועד ב 160 סל"ד ו -37 ° C עד OD 600 מגיע 0.4 - 0.6. בהמשך לכך, מנמיכים את הטמפרטורה ל 22 מעלות צלזיוס במשך ~ 1 hr ולאחר מכן להשרות את ביטוי חלבון עם 0.66 מ"מ של איזופרופיל- β-D-thiogalactopyranoside (IPTG) 8. לגדל את התאים לילה בשעה 22 ° C (~ 18 שעות).
הערה: הטמפרטורה יכולה להיות מגוונת, אבל אנחנו ממליצים להשתמש 22 ° C או נמוך יותר. - קציר התאים על ידי צנטריפוגה (10,543 XG, 15 דק ', 4 ° C). בטל supernatant ולהקפיא התא גלולה ב -20 ° C.
s = "jove_title"> 3. שלב טיהור -1 ו פרוטאז מחשוף
- כן מאגרים המשמשים במהלך שלבי טיהור חלבונים מפתרונות מניות להבטיח שחזור יציבות של הניסויים. הכן ארבעה מאגרים שונים עבור כרומטוגרפיה זיקה יון המתכת משותקת (IMAC), שכל אחת מהן מכילה ריכוז שונה של imidazole (10 מ"מ, 20 מ"מ, 50 מ"מ, ו -250 מ"מ). עבור SEC, להכין חיץ ג'ל-סינון (GFB) עם ריכוז מלח גבוה, אך ללא imidazole. השתמש במי deionized ולסנן את כל המאגרים לפני שימוש עם גודל נקבובי של 0.45 מיקרומטר.
הערה: ערכת הכנה חיץ מפורט, עיין בטבלה 1. - להפשיר את התא גלולה מתשע התרבות ליטר ו להתמוסס 150 מ"ל PBS ב 4 ° C. Sonicate השעית התא שלוש פעמים במשך 2 דקות (כוח 130 W, 20% משרעת, תדירות דופקת 50%) כדי לשבש את התאים. שמור על השעיית התא על קרח במהלך sonication.
- Centrifuge השעית תא sonicated (43,667 XG, 30 דק ', 4 ° C) כדי להפריד פסולת תא מן supernatant המכיל חלבון לידי ביטוי. איסוף supernatant וזורקים את הכדור.
- לשטוף לאזן 10 מ"ל (= 1 נפח הטור [CV]) תרחיף של ניקל (Ni) חרוזים agarose -NTA עם חיץ imidazole 10 מ"מ בטור כרומטוגרפיה. מוסיפים את החרוזים Ni equilibrated כדי supernatant משלב 3.3 המכיל הביעו MBP--P שלו חלבון היתוך מושלם דגירה במשך 30 דקות ב 4 ° C עם סיבוב איטי.
- לאחר דגירה, להחיל את התערובת Ni-חרוז-חלבון שלם טור כרומטוגרפיה. לשטוף את העמודה לאט עם כל 5 קורות חיים של 10 מ"מ, 20 מ"מ, ו -50 מאגרים imidazole מ"מ, החל עם 10 מ"מ, אז 20 מ"מ ו 50 מ"מ (איור 3 א).
- Elute החלבון היתוך מושלם MBP-שלו-P באמצעות חיץ imidazole 250 מ"מ (איור 3 א). במהלך elution, לבדוק את 280nm OD לאמת את elution של חלבון ההיתוך (עליית OD 280nm). המשך elution עד 280nm OD יורד ל ~ 0.1. שטפו את החרוזים עם כמויות עודפות של חיץ imidazole 250 מ"מ (לפחות 10 קו"ח), ואחריו 10 קו"ח לפחות 10 מ"מ חיץ imidazole. שמור את החרוזים על צעד הטיהור השני (סעיף 4).
- לוודא את נוכחותו של החלבון היתוך מושלם MBP-שלו-P עם SDS-PAGE באמצעות ג'ל 12% SDS-polyacrylamide (10 x 8 ס"מ) 9 (איור 3 א). בצע ג'ל אלקטרופורזה ב 45 ו -200 V עבור 45 דקות.
- תתרכז (למשל, באמצעות concentrator מסחרי) החלבון היתוך מושלם eluted MBP-שלו-P לריכוז סופי של ~ 3 מ"ג / מ"ל. קליב היתוך מושלם MBP-שלו-P עם פרוטאז HRV-3C במהלך דיאליזה נגד 2 L של 10 מ"מ חיץ imidazole (~ 1: 100) לילה ב 4 ° C (איור 3 א). בהתאם לנפח סופי של חלבון מרוכז, לבצע דיאליזה בבית צינורות קלטת או דיאליזה דיאליזה.
הערה: כמות פרוטאז HRV-3C לחלבוןמחשוף מחושב בהתאם לפעילות פרוטאז הספציפי (2 U / μl, 1 U מספיקה כדי לדבוק 100 מיקרוגרם של חלבון) וכמות חלבון היתוך eluted משתנה על רמת הביטוי וניתן לאמוד מתוך תוצאת SDS-PAGE (3.7 ).
שלב טיהור 4. 2 nd
- לאזן את-חרוזים ניקל משלב 3.6 ב 10 חיץ imidazole מ"מ.
- דגירת חלבון dialyzed משלב 3.7 (המכיל תחום P בקע, חלבון MBP, ו-פרוטאז HRV) עם סיבוב Ni-החרוזים (4.1) equilibrated למשך 30 דקות ב 4 ° C עם איטי.
- החל את התערובת Ni-חרוז לעמודה ולאסוף את הזרימה דרך (תחום P ביקע) (איור 3 ב). למדוד את הריכוז של חלבון כפי שהיא באה את הטור עד 280nm OD מגיע ~ 0.1.
הערה: MBP-שלו צריך להישאר כבול אל-חרוזי ניקל (איור 3 ב). - בדוק את הנוכחות של תחום P בקע באמצעות SDS-PAGE עם 1ג'ל 2% כפי שתואר לעיל (איור 3 ב). לרכז את תחום P eluted כדי ~ 3 מ"ג / מ"ל ו dialyze לילה ב 4 ° C נגד GFB לטיהור SEC שלאחר מכן.
שלב טיהור 5. 3 rd
- לשטוף משאבות וצינורות של מערכת טיהור HPLC מראש לאזן את העמודה SEC (ראה רשימת חומרים) עם GFB.
- להזריק את תחום P לעמודה בקצב זרימה של 1 מ"ל / min באמצעות superloop (עד 12 מ"ל) או לולאה (עד 3 מ"ל), בהתאם לכמות של המדגם מרוכז. לאחר הזריקה נגמר, להגדיל את קצב הזרימה 2.5 מ"ל / דקה.
- ככל שעולה OD ואת תחום P יורד בטור, לאסוף שברים של 1.5 מ"ל. בדוק שברים באמצעות SDS-PAGE עם ג'ל 12% (איור 4 א ו -4). בריכה רק שברים הטהור להתרכז כדי ~ 3 מ"ג / מ"ל ו ~ 8 מ"ג / מ"ל.
הערה: לאחר ~ 110 מ"ל (נפח חלל) ביותר זיהומים הם eluted מעמודה SEC עם 320 מ"ל נפח המיטה. התחום P בד"כ eluted כמו דימר. Elution זמן / נפח של דימר המושלם P תלוי כיתת prep (PG) של טור SEC.
6. התגבשות של דומיין P
- השתמש מושלם P ב ~ 3 מ"ג / מ"ל ו -8 מ"ג / מ"ל להקרנה התגבשות ראשונית. הכן לפחות 100 μl של תחום P לכל ריכוז למסכים ראשוני עם 384 תנאי הקרנה זמינים מסחרי. בצע סינון על 18 מעלות צלזיוס במתכונת צלחת 96-היטב, שם המאגר מכיל 100 μl של פתרון אמא וירידה מורכבת 0.2 פתרון אמא μl 0.2 חלבון μl.
- חזור לייעל התגבשות תנאים מוצלחים. לכן, להשתמש בצלחות 15-היטב המכילות 3 שורות. הגדרה בשורה הראשונה עם פתרון אמא 100%, בשורה השנייה עם פתרון אמא 90% ו -10% מים, והשורה השלישית עם פתרון אמא 80% ומי 20%. השתמש גודל טיפה של 2 μl (1 μl חלבון + 1 μl פתרון אמא) ו -50081; l של פתרון אמא ככרך המאגר.
- השתמש תנאים קריסטל אופטימיזציה עבור שיתוף בגיבושו של תחום P עם הליגנדים. כן צלחות כמתוארים 6.2. במקום 2 גודל טיפה μl, להגדיר טיפות המכילות 1 פתרון אמא μl, 1 חלבון μl, ו 1 μl של ליגנד בריכוז של 1 מ"ג / מ"ל.
- אסוף ערכות נתונים של גבישים יחידים באמצעות קרינת synchrotron. בצע החלפה מולקולרית באמצעות מבנים מושלמים P שפורסמו עם דמיון רצף גבוה ככל 6,10-13 מודל חיפוש ראשוני.
הערה: הנוכחות של ליגנד מופיעה בתור בועה-דגם un של צפיפות אלקטרונים.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
סכמטית של הפרוטוקול המתואר מתוארת באיור 1. הפרוטוקול מכסה 6 חלקים עיקריים הכוללים שיבוט של גן המטרה, ביטוי, טיהור בן שלושה שלבים, וגיבוש. איור 2 מדגימה את העיצוב של מבנה הביטוי (EC) ו מאפיינים של וקטור ביטוי pMalc2x. הרצף של אתר השיבוט המרובה (MCS) של וקטור pMalc2x מציג את אתרי מחשוף הגבלת פרוטאז. איור 3 מציג תוצאות SDS-PAGE נציג של חלבון היתוך המושלם MBP--P שלו מושלמת P בקע עם השרטוטים המקבילים של שני הראשונים מדרגות טיהור. צעד הטיהור השלישי מתואר באיור 4 וכרוך ערכת טיהור, הכרומתוגרמה elution של תחום P מטוהר מכך SDS-PAGE נציג של שברים שנאספו. שהברים הטהורים (לפי SDS-PAGE) הם אספו, תרכיזיםed, ושימשו קריסטלוגרפיה באמצעות קרני רנטגן.
איור 1. סכמטי של ביטוי טיהור norovirus P דומיין. הפרוטוקול לביטוי מושלם norovirus P וטיהור מכיל שישה חלקים עיקריים, המכסים שיבוט וביטוי (1 ו -2), טיהור (3 עד 5), ואת ההתגבשות (6.). משולשים אדומים מייצגים את תחום P (גנים וחלבונים), ואילו מלבנים כחולים מייצגים את MBP-שלו. Ni-נ.ת.ע חרוזי agarose המשמשים במהלך IMAC (3 ו -4) מומחש כמו כדורי ציאן גדולים. חרוזי SEC מתוארים תחומים אפורים.
עיצוב איור 2. שיבוט של לבנות הביטוי (EC). תחום P EC, מפת וקטור ביטוי, ואת אתר השיבוט המרובה (MCS) מוצגים. א) מערך של חלבון קפסיד norovirus (VP1) ואת תחום P EC הממחיש את העיצוב של EC עם מחיקת C- מסוף (הירוק). B ייצוג סכמטי) של וקטור ביטוי pMalc2x המשמש ביטוי מושלם P ב E. coli עם הקלטת התנגדות אמפיצילין (AmpR),-אופרון הלקטוז (לאצי), מנוז-חלבון מחייב (זכר, MBP) ורצף MCS. C) של MCS של וקטור ביטוי pMalc2x. מודגשות הן אתרי מחשוף אנזים הגבלה (תיבות אדומות) ואת רצף הכרת LEVLFQGP עבור פרוטאז 3C HRV (דיוק, קופסא כחולה).
איור 3. תוצאות סכמטי ונציג עבור -1 ו -2 nd פורשלב ification. סקירת טיהור ותוצאות SDS-PAGE נציג מוצגים. א) טיהור של חלבון ההיתוך המושלם MBP-שלו-P באמצעות חרוזי agarose Ni-נ.ת.ע (ספירות ציאן גדולות). הג'ל 12% SDS-PAGE מציג את ההפרדה MBP-שלו-P תחום היתוך חלבון. B) של MBP-שלו (מלבן כחול) מדומיין P ביקע (משולש אדום). Elution של תחום P ביקע מנותח על ידי SDS-PAGE על ג'ל 12%.
איור 4. תוצאות סכמטי ונציג עבור שלב טיהור 3 rd. הכרומתוגרמה של elution מושלם P באמצעות SEC המקביל תוצאה SDS-PAGE. מספרים בשחורים לציין את השברים שנאספים. א) סכמטי של ההפרדה על עמודת SEC (חרוזי SEC מתוארים תחומי אפור). 12% SDS-PAGE מציג את ההווה חלבוןאת השברים שנאספות במהלך elution SEC ואשר לאחר מכן הם אספו ושימשו קריסטלוגרפיה באמצעות קרני רנטגן. ב) chromatogram SEC מציגה את ספיגת נמדדת (קו שחור) מעל נפח elution. הקו האדום מציין כאשר התחום P הוזרק SEC-טור. C) התקרב כדי הפסגה השנייה של B. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
| שם מאגר | 1 M טריס pH 7.6 | 5 M NaCl | 3.5 M Imidazole, pH 8 |
| חיץ 250 מ"מ Imidazole | 20 מ"ל | 40 מ"ל | 71 מ"ל |
| חיץ 50 מ"מ Imidazole | 20 מ"ל | 40 מ"ל | 14 מ"ל |
| חיץ 20 מ"מ Imidazole | 20 מ"ל 40 מ"ל | 5.7 מ"ל | |
| חיץ 10 מ"מ Imidazole | 20 מ"ל | 40 מ"ל | 2.8 מ"ל |
| GFB (ג'ל חיץ סינון) | 25 מ"ל | 60 מ"ל | - |
טבלת 1. Scheme Pipetting עבור החוצצים נפוצים במהלך טיהור. פתרונות מניות של טריס-HCl, נתרן כלורי (NaCl), ו imidazole ערוך כמצוין בכותרת של הטבלה. כמות מניות הפתרון הדרוש כדי להכין 1 ליטר של החיץ הרצוי במים מיוצגת.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
כאן אנו מתארים פרוטוקול עבור הביטוי וטיהור תחומי P norovirus באיכות גבוהה ובכמות. Noroviruses אינם נלמדים היטב נתונים מבניים נדרשים ברציפות. למיטב ידיעתנו, ייצור מושלם P תוך שימוש בפרוטוקולים אחרים (למשל, תחומים P-tagged GST) כבר בעייתי, עד כה, ונתונים מבניים מספיק על האינטראקציה norovirus המארח כבר חסר. בשיטה מתוארת כאן, תרמנו לאחרונה באופן משמעותי להבנה את הפרטים המולקולריים של norovirus פחמימות מחייבות. הפרוטוקול הנוכחי ניתן להתאים מגוון של חלבונים. עם זאת, יישום מוצלח של פרוטוקול זה תלוי במספר גורמים בתוך כל חלק משיטת הטיהור.
עיצוב של מבנה הביטוי הוא הצעד הראשון של חשיבות. אנו מבצעים אופטימיזציה-קודון של לבנות ביטוי מושלם P כדי לשפר את התשואה ביטוי E. coli ולהסיר releאתרי הגבלת vant, הווה בתוך אזור הקידוד. יתר על כן, אנו מסיירים אזור גמיש בבית C- הסופי שיכול להיות נח עבור קיפול חלבונים במהלך ביטוי ואריזת חלבון במהלך התגבשות. ביטוי כמו חלבון היתוך MBP הוא מתכוון לשמור את החלבון בתמיסה במהלך ביטוי.
לגבי ביטוי חלבון מסיס יש פרמטרים נוספים שיש לקחת בחשבון. .ה זן coli BL21 הוא אופטימיזציה עבור ביטוי חלבון תשואה גבוהה ולכן בשימוש בפרוטוקול זה. הביטוי מתבצע לילה בשעה 22 ° C ו סכום מופחת של IPTG משמש לזירוז. זהו נוחים קינטיקה של ביטוי חלבון וכתוצאה מכך, פחות חלבון המצרפי יהיה לתוך גוף הכללה בשל misfolding. לכן, חשוב לצנן את התרבות ל -22 מעלות צלזיוס לפני הגיוס של ביטוי חלבון עם IPTG. אם תשואת החלבון אינה משביעת רצון, אפשר עוד להקטין את לטמפרטורותיור ולהתאים את כמות IPTG.
טיפול מסוים יש לנקוט לגבי עמודות הטיהור. באופן עקרוני, Ni-חרוזי ניתן לעשות שימוש חוזר מספר פעמים. עם זאת, קיבולת מחייב תופחת לאורך זמן. אם Ni-הפתרון מאבד את הצבע הכחול הסטנדרטי שלה, החרוזים יכולים להיות חשופים ו מוחדרים באמצעות ההוראות בחוברת של היצרן. יתר על כן, חשוב לשמור על עמודת SEC במצב תקין ולנקות אותו באופן קבוע כדי לאפשר ביצועים גבוהים. בהתאם לגודל החלבון כי יש להיטהר ציון הכנה שונה (PG) של טור SEC צריך להיבחר. דימר המושלם P הוא ~ 65 kDa בגודלם ניתן להפריד היטב מן הטומאות של ~ 100 kDa באמצעות טור 75 pg, ואילו חלבונים גדולים יכולים להיות טוב יותר מופרדים באמצעות טור 200 pg.
כשילוב של עיצוב רצף אופטימיזציה, ביטוי, הליך טיהור אפשר להשיג טהור מאוד גבוהה תחום איכות P באמצעות ספיד שלנוod. בשל האיכות הגבוהה של תחום P המטוהר, מחקרים נוספים מתאימים, כוללים חיסונים לייצור נוגדנים, ניסויי NMR, ומחקרים מבוססים ELISA. יתר על כן, התחום P מטוהרים יכול לשמש ליצירת מורכבות עם נוגדנים Fab ו Nanobodies 14,15. למיטב ידיעתנו, זהו הפרוטוקול הראשון המאפשר התגבשות מושלמת P באופן תפוקה גבוה, תוך שימוש בפרוטוקול זה, שקבענו למעלה מ -20 מבנים מורכבים של תחומי P norovirus ו lagovirus שונים בקומפלקס עם 6,16 HBGAs.
על פי הניסיון שלנו, הפרוטוקול עשוי להיות מוגבל חלבונים עד 65 kDa. עם זאת, חלבונים קפסיד של caliciviruses שונים 17 וחלבונים הלא מבניים, כגון צמודות הגנום חלבון נגיפי (VPG), פרוטאז, ו RNA רפליקאז (RdRp) באו לידי ביטוי בהצלחה מטוהרים באמצעות שיטה זו (לא פורסם). כאשר פונים בשיטה זו כדי קפסיד חלבונים של וירוסים אחרים, יש ליt עשוי להיות נחוץ כדי להשתנות לייעל כמה פרמטרים (למשל., ריכוז imidazole של למאגר elution) כדי לקבל כמות מספקת של חלבון. בנוסף, מאגרים לאחסון אחרים מלבד GFB (למשל, PBS או TBS) יכולים להיבדק על יציבות חלבון אופטימלית.
רוב המבנים נתחו ניב בגבישים מעוקבים / צלחת דמוית, אשר מתפזרים כדי-רזולוציות גבוהות. לכן, בפרוטוקול הנוכחי מספק כלי להשיג חלבון טהור כי מתגבש היטב. כל עוד יש כיום מודל תרבית תאים המתקדמות זמין, מתודולוגיה זו מהווה צעד משמעותי לתרום להבנת אינטראקצית תא norovirus-מארח.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| P domain DNA | Life Technologies | GeneArt Gene Synthesis | |
| pMalc2x vector | On request | ||
| BamHI | New England Biolabs | R0136L | |
| NotI | New England Biolabs | R0189L | |
| T4 DNA Ligase | New England Biolabs | M0202S | |
| QIAquick Gel Extraction Kit | Qiagen | 28704 | |
| QIAprep Spin Miniprep Kit | Qiagen | 27104 | |
| S.O.C. Medium | Life Technologies | 15544-034 | |
| Econo-Column Chromatography Column | Bio-Rad | 7372512 | 2.5 x 10 cm, possible to use other size |
| Ni-NTA Agarose | Qiagen | 30210 | |
| Vivaspin 20 | GE Healthcare | various | cutoff of 10 kDa, 30 kDa and 50 kDa used |
| Subcloning Efficiency DH5α Competent Cells | Life Technologies | 18265-017 | |
| One Shot BL21(DE3) Chemically Competent E. coli | Life Technologies | C6000-03 | |
| HRV 3C Protease | Merck Millipore | 71493 | |
| HiLoad 26/600 Superdex 75 PG | GE Healthcare | 28-9893-34 | SEC column |
| JCSG Core suites | Qiagen | various | 4 screens with each 96 wells |
| Carbohydrates | Dextra Laboratories, UK | various | Blood group products |
References
- Ahmed, S. M., et al. Global prevalence of norovirus in cases of gastroenteritis: a systematic review and meta-analysis. Lancet Infect. Dis. 14, 725-730 (2014).
- Prasad, B. V., Matson, D. O., Smith, A. W. Three-dimensional structure of calicivirus. J. Mol. Biol. 240, 256-264 (1994).
- Choi, J. M., Hutson, A. M., Estes, M. K., Prasad, B. V. Atomic resolution structural characterization of recognition of histo-blood group antigens by Norwalk virus. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, 9175-9180 (2008).
- Marionneau, S., et al. Norwalk virus binds to histo-blood group antigens present on gastroduodenal epithelial cells of secretor individuals. Gastroenterology. 122, 1967-1977 (2002).
- Jones, M. K., et al. Enteric bacteria promote human and mouse norovirus infection of B cells. Science. 346, 755-759 (2014).
- Hansman, G. S., et al. Crystal structures of GII.10 and GII.12 norovirus protruding domains in complex with histo-blood group antigens reveal details for a potential site of vulnerability. J. Virol. 85, 6687-6701 (2011).
- Fath, S., et al. Multiparameter RNA and codon optimization: a standardized tool to assess and enhance autologous mammalian gene expression. PLoS One. 6 (e17596), (2011).
- Jacob, F., Monod, J. Genetic regulatory mechanisms in the synthesis of proteins. J. Mol. Biol. 3, 318-356 (1961).
- Laemmli, U. K. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4. Nature. 227, 680-685 (1970).
- Kabsch, W. Automatic Processing of Rotation Diffraction Data from Crystals of Initially Unknown Symmetry and Cell Constants. J. Appl. Crystallogr. 26, 795-800 (1993).
- Mccoy, A. J., et al. Phaser crystallographic software. J. Appl. Crystallogr. 40, 658-674 (2007).
- Emsley, P., Lohkamp, B., Scott, W. G., Cowtan, K. Features and development of Coot. Acta Crystallogr. Sect. D-Biol. Crystallogr. 66, 486-501 (2010).
- Adams, P. D., et al. PHENIX: a comprehensive Python-based system for macromolecular structure solution. Acta Crystallogr. Sect. D-Biol. Crystallogr. 66, 213-221 (2010).
- Koromyslova, A. D., Hansman, G. S. Nanobody binding to a conserved epitope promotes norovirus particle disassembly. J. Virol. 89, 2718-2730 (2015).
- Hansman, G. S., et al. Structural basis for broad detection of genogroup II noroviruses by a monoclonal antibody that binds to a site occluded in the viral particle. J. Virol. 86, 3635-3646 (2012).
- Singh, B. K., Leuthold, M. M., Hansman, G. S. Human noroviruses' fondness for histo-blood group antigens. J. Virol. 89, 2024-2040 (2015).
- Leuthold, M. M., Dalton, K. P., Hansman, G. S. Structural analysis of a rabbit hemorrhagic disease virus binding to histo-blood group antigens. J. Virol. 89, 2378-2387 (2015).
