Summary
Här beskriver vi en metod för att uttrycka och rena hög kvalitet norovirus utskjutande (P) domäner i E. coli för användning i röntgenkristallografi-studier. Denna metod kan tillämpas på andra calicivirus P domäner, såväl som icke-strukturella proteiner, det vill säga., Viralt protein genomet bunden (VPG), proteas, och RNA-beroende RNA-polymeras (RdRp).
Abstract
Norovirus kapsiden består av en enda stor strukturell protein, benämnt VP1. VP1 är indelad i ett skal (S) domän och en utskjutande (P) domänen. S-domänen bildar en sammanhängande byggnadsställning runt virala RNA, medan P domän bildar virala spikar på S-domänen och innehåller bestämningsfaktorer för antigenicitet och värd-cellinteraktioner. P domänen binder kolhydratstrukturer, dvs., Till histo-blodgruppsantigener, som tros vara viktiga för norovirusinfektioner. I detta protokoll, beskriver vi en metod för att producera högkvalitativa norovirus P domäner i höga utbyten. Dessa proteiner kan sedan användas för röntgenkristallografi och ELISA för att studera antigenicitet och värd-cellinteraktioner.
P domänen är för det första klonas in i en expressionsvektor och därefter uttryckas i bakterier. Proteinet renas med användning av tre steg som involverar immobiliserade metall-jon-affinitetskromatografi och storleksuteslutningskromatografi. Iprincip är det möjligt att klona, uttrycka, rena och kristallisera proteiner i mindre än fyra veckor, vilket gör detta protokoll ett snabbt system för analys av nya framväxande stammar norovirus.
Introduction
Humana norovirus är den största orsaken till akut gastroenterit i hela världen 1. Dessa virus tillhör Caliciviridae familjen, av vilka det finns minst fem släkten, däribland Norovirus, Sapovirus, Lagovirus, Vesivirus och Nebovirus. Trots sin höga effekt på vården och bred distribution, är studiet av mänskliga norovirus hämmas av bristen på en robust cellodlingssystem. Hittills finns det inga godkända vacciner eller antivirala strategier tillgängliga.
Norovirus huvudsakliga kapsidproteinet, benämnd VP1, kan delas in i ett skal (S) domän och en utskjutande (P) domänen 2. P-domänen är ansluten till S-domänen av ett flexibelt gångjärn (H) region. S-domänen bildar en byggnadsställning runt det virala RNA: t, medan det P-domänen bildar den yttersta delen av den virala kapsiden. P-domänen samman i biologiskt relevanta dimerer när det uttrycks i bakterier. P dimer samverkar med kolhydratstrukturer, benämnd histo-blodgruppsantigener (HBGAs) som finns som lösliga antigener i saliv och återfinns på vissa värdceller 3. P domän HBGA interaktion tros vara viktigt för infektion 4. I själva verket visade en färsk rapport om vikten av syntetiska HBGAs eller HBGA uttryckande bakterier för humant norovirusinfektion in vitro 5.
Aktuella studier om värdfästcellen av norovirus i huvudsak utförs med viruslika partiklar (VLP) som kan uttryckas i insektsceller eller med rekombinanta P domäner uttrycks i Escherichia coli (E. coli). För att förstå P domän HBGA samverkan på atomär upplösning, kan P domän HBGA komplexa strukturer lösas med hjälp av röntgenkristallografi. Här beskriver vi ett protokoll för P domän expression och rening som gör att produktionen av P-domän i hög kvantitet och kvalitet för att användas för röntgen crystallography. Dessutom kan denna metod användas för andra calicivirus P domäner och icke-strukturella proteiner.
P domänen är kodon-optimerad för E. coli expressions och klonades in i en standard överföringsvektor. P domänen är sedan åter klonas in i en expressionsvektor som kodar för en polyhistidin (His) -märkningen och ett mannosbindande protein (MBP) som följs av ett proteas klyvningsstället. MBP-His-P-domän-fusionsprotein uttrycks i E. coli, följt av tre reningssteg. MBP-His-P domänfusionsprotein renas med användning av immobiliserad metalljon-affinitetskromatografi (IMAC). Därefter fusionsproteinet klyvs med humant rhinovirus (HRV) 3C-proteas och P-domänen separeras från MBP-His genom ett ytterligare IMAC reningssteg. Slutligen är P-domänen renades med användning av storlekssorterande kromatografi (SEC). Det renade P-domänen kan sedan användas för röntgenkristallografi. Screening av proteinkristallisationsbetingelser är performed med kommersiellt tillgängliga screening kit med olika P domänproteinkoncentrationer. Kristalltillväxt observeras och de mest lovande förutsättningar optimeras.
Med de metoder som beskrivs här, är det möjligt att gå från gen till protein för att strukturera inom mindre än fyra veckor. Därför är vårt sätt att P-domänen uttryck, rening och kristallisation lämplig att studera norovirus-värd samverkan på molekylär nivå och ger viktiga data för att hjälpa till up-to-date vaccin design och läkemedelsscreening.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. P Domain Kloning
- Bestäm P domänen kodande regionen genom sekvensuppställning av norovirus stammar (t.ex. GII.10 stam, GenBank: AF504671, PDB-ID: 3ONU) 6. Dessutom ta bort den flexibla regionen vid den C-terminala änden av P-domänen (Figur 2A). Kodon-optimera DNA för E. coli uttryck och inkluderar BamHI (N-terminal) och NotI (C-terminala) restriktionsställen för att under klon P domän-kodande regionen i pMalc2x expressionsvek 6,7.
Obs: P-domänen kodande regionen optimeras och syntetiseras av en kommersiell tjänst. P-domän-kodande regionen (insats) är ca 1 kb i längd och levereras i en standardöverföringsvektor. - Digest 2 pg av överföringsvektorn med vardera 1 | il BamHI (20000 U / ml) och NotI (10.000 U / ml) restriktionsenzymerna under 1 h vid 37 ° C med en av tillverkaren levererade buffertar.
- Separera diger insatsen på en 1% agarosgelunder 20 min vid 135 V och rena det insatta DNA från gelén med användning av ett kommersiellt kit.
- Förbered pMalc2x expressionsvektorn genom digerering av 2 | j, g av denna vektor med varje 1 ^ il BamHI (20000 U / ml) och NotI (10.000 U / ml) restriktionsenzymerna under 1 h vid 37 ° C. Rena vektorn från en agarosgel såsom beskrivits ovan (1,3). Obs: Båda proverna (1,2 och 1,4) kan lagras vid -20 ° C.
- Ligera den renade insatsen i den digere pMalc2x vektorn vid BamHI- och Notl-restriktionsställen med ett pl T4-DNA-ligas (400.000 U / ml) under 15 min vid rumstemperatur (RT) (figur 2B och 2C). Använd åtminstone 20 ng av pMalc2x vektor och en vektor: insert förhållandet 1: 3 (molekylvikt). Ligeringsblandningen är vanligtvis ~ 20 ^.
- Förvandla 2 pl av ligeringsblandningen i 50 pl kemiskt kompetenta E. coli DH5a bakteriella celler med användning av ett standardtransformationsprotokoll (10 min på is, värmechock 45 sek vid 42 ° C) och växa i 600xl SOC-medium under 1 timme vid 37 ° C. Centrifugera de transformerade cellerna under 3 min vid 1000 xg, kassera supernatanten och återsuspendera pelleten i 30 pl SOC-medium.
- Plate transformationsblandningen på LB-agarplattor, som innehöll 100 ng / ml ampicillin för selektion, och växa över natten vid 37 ° C. Välj minst fem kolonier.
- För vart och ett av de fem kolonier, ympa 2-3 ml kultur av LB-medium kompletterat med 50 mikrogram / ml ampicillin (LB-amp) och växa genom att skaka över natten vid 160 rpm vid 37 ° C.
- Extrahera plasmider från över natt-kulturen med hjälp av ett kommersiellt kit. Verifiera närvaron av P-domänen insatsen genom sekvensering med en pMalc2x framåtriktad primer (5'-TCAGACTGTCGATGAAGC-3 ') och omvänd primer (5'-GATGTGCTGCAAGGCGAT-3').
2. P Domain Expression
- Transformera en il (150 ng / | il - 400 ng / | j, l) av pMalc2x vektor som kodar för MBP-His-P-domänfusionsprotein i 50 pl kompetenta E. coli BL21-celler med användning av ett standardtransformationsprotokoll (10 min på is, värmechock 45 sek vid 42 ° C) och växa i 600 | j, l SOC-medium under 1 timme vid 37 ° C. Subkultur i 120 ml LB-amp över natten vid 160 rpm och 37 ° C.
- Inokulera nio liter (t.ex. 6 x 5 L flaskor med 1,5 L-medium vardera) av LB-amp med subkultur (1: 100). Odla cellerna under skakning vid 160 rpm och 37 ° C till dess att OD 600 når 0,4-0,6. Därefter sänka temperaturen till 22 ° C under ~ 1 timme och därefter inducera proteinexpression med 0,66 mM isopropyl-β-D-tiogalaktopyranosid (IPTG) 8. Odla cellerna över natten vid 22 ° C (~ 18 h).
Obs: Temperaturen kan varieras, men vi rekommenderar att använda 22 ° C eller lägre. - Skörda cellerna genom centrifugering (10.543 xg, 15 min, 4 ° C). Kassera supernatanten och frysa cellpelleten vid -20 ° C.
st reningssteg och proteasklyvning
- Förbereda buffertar som används under de proteinreningssteg från förrådslösningar för att garantera reproducerbarhet och stabilitet av experimenten. Förbered fyra olika buffertar för den immobiliserade metalljoner affinitetskromatografi (IMAC), var och en innehållande en annan koncentration av imidazol (10 mm, 20 mm, 50 mm och 250 mm). För SEC, förbereda en gel-filtreringsbuffert (GFB) med en högre saltkoncentration, men utan imidazol. Använd avjoniserat vatten och filtrera alla buffertar före användning med en porstorlek av 0,45 | j, m.
Obs: För en detaljerad buffertsystemet beredning, se tabell 1. - Tina cellpelleten från nio liter kultur och lös upp i 150 ml PBS vid 4 ° C. Sonikera cellsuspensionen tre gånger under 2 min (effekt 130 W, amplitud 20%, pulsfrekvensen 50%) för att sönderdela cellerna. Håll cellsuspensionen på is under ultraljudsbehandling.
- centrifugeGE den sonikerade cellsuspensionen (43.667 xg, 30 min, 4 ° C) för att separera cellrester från supernatanten innehållande uttryckta proteinet. Samla in supernatanten och kasta pelleten.
- Tvätta och jämvikta 10 ml (= 1 kolonnvolym [CV]) uppslamning av nickel (Ni) -NTA agarospärlor med 10 mM imidazol buffert i en kromatografikolonn. Tillsätt de jämviktade Ni-pärlor till supernatanten från steg 3,3 innehållande uttryckt MBP-His-P-domän-fusionsprotein och inkubera under 30 minuter vid 4 ° C med långsam rotation.
- Efter inkubation tillämpa hela Ni-bead-proteinblandningen till en kromatografikolonn. Tvätta kolonnen långsamt med varje 5 CV av 10 mM, 20 mM och 50 mM imidazol-buffertar, som börjar med 10 mM och sedan 20 mM och sista 50 mM (figur 3A).
- Eluera MBP-His-P-domän-fusionsprotein med användning av 250 mM imidazol buffert (figur 3A). Under elueringen, kontrollera OD 280 nm att kontrollera elueringen av fusionsprotein (ökningen i OD 280nm). Fortsätt elueringen tills OD 280 nm sjunker till ~ 0,1. Tvätta pärlor med stora mängder 250 mM imidazol buffert (minst 10 CV), följt av åtminstone 10 CV av 10 mM imidazol buffert. Spara pärlorna för andra reningssteget (avsnitt 4).
- Verifiera närvaron av MBP-His-P domänfusionsprotein med SDS-PAGE med användning av en 12% SDS-polyakrylamidgel (10 x 8 cm) 9 (figur 3A). Utför gelelektrofores på 45 A och 200 V under 45 minuter.
- Koncentrera (t.ex., med användning av en kommersiell koncentrator) den eluerade MBP-His-P-domän-fusionsprotein till en slutlig koncentration av ~ 3 mg / ml. Klyva MBP-His-P domänfusion med HRV-3C-proteas under dialys mot 2 L av 10 mM imidazol buffert (~ 1: 100) över natten vid 4 ° C (figur 3A). Beroende på den slutliga volymen av koncentrerad protein, utför dialys i en dialyskassett eller dialysrör.
Obs: Mängden HRV-3C-proteas för proteinklyvning beräknas enligt den specifika proteasaktiviteten (2 U / ^ il, är en U tillräcklig för att klyva 100 ^ g protein) och mängden av eluerat fusionsprotein som varierar på expressionsnivån och kan beräknas från SDS-PAGE-resultatet (3,7 ).
4. 2 nd Rening Steg
- Jämvikt Ni-pärlorna från steg 3,6 i 10 mM imidazol buffert.
- Inkubera den dialyserade proteinet från steg 3,7 (innehållande klyvd P domän, MBP-protein, och HRV-proteas) med de jämviktade Ni-pärlor (4,1) under 30 min vid 4 ° C med långsam rotation.
- Applicera Ni-kornsblandningen till en kolonn och samla genomströmning (klyvs P domän) (figur 3B). Mäta koncentrationen av protein som kommer ut ur kolonnen tills OD 280 nm når ~ 0.1.
Obs! MBP-His bör förbli bundna till Ni-pärlor (Figur 3B). - Kontrollera förekomsten av kluvna P domän med SDS-PAGE med en 12% gel såsom beskrivits ovan (figur 3B). Koncentrera eluerade P domän till ~ 3 mg / ml och dialysera över natten vid 4 ° C mot GFB för efterföljande SEC rening.
5. 3: e Rening Steg
- Tvätta pumpar och rör av HPLC reningssystemet och pre-jämvikt SEC-kolonn (se Materials List) med GFB.
- Injicera P-domänen till kolonnen vid en flödeshastighet av 1 ml / min med användning av en superloopen (upp till 12 ml) eller slinga (upp till 3 ml), beroende på volymen av det koncentrerade provet. Efter injektionen är avslutad, ökar flödeshastigheten till 2,5 ml / min.
- När OD ökar och P-domänen kommer från kolonnen, samla fraktioner av 1,5 ml. Kontrollera fraktioner med användning av SDS-PAGE med en 12% gel (fig 4A och 4B). Pool endast de renaste fraktionerna och koncentrera till ~ 3 mg / ml och ~ 8 mg / ml.
Obs: Efter ~ 110 ml (void volym) de flesta föroreningarna elueras från en SEC-kolonn med 320 ml bäddvolym. DeP domän elueras vanligtvis som en dimer. Elueringstid / volym av P-domänen dimeren är beroende av prep grade (pg) av SEC-kolonn.
6. Kristallisation av P Domän
- Använd P domänen vid ~ 3 mg / ml och 8 mg / ml för inledande kristallisa screening. Bered minst 100 pl P domän per koncentration för första skärmar med 384 kommersiellt tillgängliga screening förhållanden. Utföra screening vid 18 ° C i en 96-brunnars plattformat, där reservoaren innehåller 100 | il av moderlösningen och en droppe består av 0,2 | il moderlösningen och 0,2 | j, l protein.
- Upprepa och optimera framgångsrika kristallisationsbetingelser. Därför använder 15-brunnsplattor som innehåller 3 rader. Inrätta den första raden med 100% moderlösningen, den andra raden med 90% moder-lösning och 10% vatten, och den tredje raden med 80% moder-lösning och 20% vatten. Använda en droppstorlek av 2 | j, l (1 | j, l protein + 1 ^ il mor lösning) och 50081; l moderlösningen som en reservoarvolym.
- Använd optimerade kristall villkor för samarbete kristallisering av P-domänen med ligander. Förbered plattor som beskrivs i 6.2. Istället för 2 | il droppstorlek, skapa droppar innehållande en il moderlösningen, 1 | j, l protein och 1 | il av ligand vid en koncentration av 1 mg / ml.
- Samla in data uppsättningar av enkristaller med hjälp av synkrotronljus. Utför molekylär ersättning med användning av publicerade P domänstrukturer med en hög sekvenslikhet som första sökningen modell 6,10-13.
Obs: Förekomst av en ligand dyker upp som un-modellerad klump elektrondensitet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Schemat för den beskrivna protokollet avbildas i figur 1. Protokollet omfattar 6 stora delar som inkluderar kloning av målgenen, uttryck, ett tre-stegs rening och kristallisation. Figur 2 illustrerar utformningen av expressionskonstruktionen (EG) och egenskaper hos pMalc2x expressionsvektor. Sekvensen för kloningsstället (MCS) i pMalc2x vektorn multipel visar restriktions- och proteas-klyvningsställen. Figur 3 visar representativa SDS-PAGE-resultaten av MBP-His-P-domän-fusionsprotein och klyvs P domänen med motsvarande scheman för de två första reningssteg. Det tredje reningssteget avbildas i figur 4 och innebär en reningsschema, elueringen kromatogram av renad P-domän och en representativ SDS-PAGE följd av insamlade fraktioner. De renaste fraktionerna (enligt SDS-PAGE) poolas, Koncentrated, och användes för röntgenkristallografi.
Figur 1. Schematisk av Norovirus P Domain Expression och rening. Protokollet för norovirus P domän uttryck och rening innehåller sex stora delar, som omfattar kloning och uttryck (1 och 2), rening (3-5), och kristallisering (6). Röda trianglar representerar P-domänen (gen och protein), medan blå rektanglarna representerar MBP-His. Ni-NTA-agarospärlor som används under IMAC (3 och 4) illustreras som stora cyan sfärer. SEC-pärlor är avbildade som gråa sfärer.
Figur 2. Design och kloning av uttryckskonstruktionen (EG). P-domänen EGUttrycket vektorkarta, och det multipla kloningsstället (MCS) är B visas. A) Justering av norovirus kapsidproteinet (VP1) och P-domänen EG illustrerar utformningen av EG med C-terminal deletion (grön). ) Schematisk representation av pMalc2x expressionsvektor som används för P-domänen uttryck i E. coli med ampicillinresistent kassett (AmpR), lac-operonet (lacl), mannosbindande protein (hane, MBP) och en MCS C) Sekvens av MCS i pMalc2x expressionsvektom.. Markerad är restriktionsenzymklyvningsställen (röda lådor) och igenkänningssekvensen LEVLFQGP för HRV 3C-proteaset (precision, blue box).
Figur 3. Schematisk och Representativa resultat för 1: a och 2: a Purförgasning Steg. Rening överblick och representativa SDS-PAGE-resultat. A) Rening av MBP-His-P-domän-fusionsprotein med användning av Ni-NTA-agarospärlor (stora cyan sfärer). Den 12% SDS-PAGE-gel visar B) Separation av MBP-His (blå rektangel) från kluvna P domän (röd triangel) MBP-His-P-domän-fusionsprotein.. Eluering av kluvna P domänen analyseras genom SDS-PAGE på en 12% gel.
Figur 4. Schematisk och Representativa resultat för 3: e reningssteg. Kromatogram P domän eluering med användning av SEC och motsvarande SDS-PAGE resultat. Svarta siffror indikerar fraktioner som samlas in. A) Schematisk bild av separationen på SEC-kolonn (SEC pärlor avbildas som gråa sfärer). Den 12% SDS-PAGE visar proteinet närvarandei fraktionerna som samlas in under SEC eluering och som därefter samman och användes för röntgenkristallografi. B) SEC kromatogram visar den uppmätta absorbansen (svart linje) över elueringsvolym. Den röda linjen visar när P-domänen injicerades i SEC-kolonnen. C) Zoom in på andra topp B. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
| buffertnamn | 1 M Tris pH 7,6 | 5 M NaCl | 3,5 M imidazol, pH 8 |
| 250 mM imidazol buffert | 20 ml | 40 ml | 71 ml |
| 50 mM imidazol buffert | 20 ml | 40 ml | 14 ml |
| 20 mM imidazol buffert | 20 ml 40 ml | 5,7 ml | |
| 10 mM Imidazol-buffert | 20 ml | 40 ml | 2,8 ml |
| GFB (Gelfiltrering buffert) | 25 ml | 60 ml | - |
Tabell 1. Pipettering System för vanliga buffertar som användes under rening. Stamlösningar av Tris-HCl, är natriumklorid (NaCl), och imidazol framställd såsom anges i huvudet på bordet. Den mängd stamlösning som krävs för att förbereda en L av den önskade bufferten i vatten är representerat.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Här beskriver vi ett protokoll för uttryck och rening av norovirus P domäner i hög kvalitet och kvantitet. Norovirus är inte väl studerat och strukturdata kontinuerligt behövs. Såvitt vi vet har domän produktion P med hjälp av andra protokoll (t.ex. GST-märkt P domäner) varit problematiskt, så långt, och tillräckliga strukturella uppgifter om norovirus-värd interaktion har saknats. Med den metod som beskrivs här, har vi nyligen bidragit väsentligt till förståelsen av de molekylära detaljerna i norovirus kolhydratbindande. Det nuvarande protokollet kan anpassas till en mängd olika proteiner. Beror dock framgångsrikt genomförande av detta protokoll på flera faktorer inom varje del av reningsmetoden.
Utformningen av expressionskonstruktionen är det första steget av betydelse. Vi utför kodon-optimering av P domänexpressionskonstruktionen för att förbättra uttrycket avkastning i E. coli och ta bort relevanta restriktionsställen, som finns inom den kodande regionen. Dessutom tar vi bort en flexibel region vid C-terminalen som kan vara till nackdel för proteinveckning under uttryck och protein packning under kristallisation. Uttryck som MBP-fusionsprotein är ett sätt att hålla proteinet i lösning under uttryck.
Beträffande lösligt protein uttryck finns ytterligare parametrar att ta hänsyn till. E. coli BL21-stammen är optimerad för hög avkastning proteinuttryck och därför används i detta protokoll. Expression utförs över natt vid 22 ° C och en reducerad mängd av IPTG användes för induktion. Detta är gynnsamt för kinetiken för proteinuttryck och som ett resultat, kommer mindre protein aggregera i inklusionskroppar på grund av felveckning. Därför är det viktigt att kyla ner odlingen till 22 ° C före induktion av proteinexpression med IPTG. Om proteinutbytet är inte tillfredsställande, är det möjligt att ytterligare minska tempure och justera mängden av IPTG.
Vissa försiktighet bör iakttas när det gäller reningskolonner. I princip kan Ni-pärlor återanvändas flera gånger. Dock kommer bindningsförmåga minskar över tiden. Om Ni-lösning förlorar sin standard blå färg, kan pärlorna skalas och laddas med hjälp av instruktionerna i tillverkarens handbok. Vidare är det viktigt att bibehålla den SEC-kolonn i gott skick och rengöra den regelbundet för att tillåta hög prestanda. Beroende på proteinstorlek som måste renas en annan prep grade (PG) i SEC-kolonn bör väljas. P domän dimeren är ~ 65 kDa i storlek och kan vara väl avskild från orenheter av ~ 100 kDa under användning av en 75 pg-kolonn, medan större proteiner kan vara bättre separeras med användning av en 200 pg-kolonn.
Som en kombination av optimerad sekvens design, uttryck och reningsförfarande är det möjligt att få mycket ren och hög kvalitet P domän med vår method. På grund av den höga kvaliteten på det renade P-domänen, ytterligare studier är lämpliga, inklusive immunisering för antikroppsproduktion, NMR-experiment, och ELISA-baserade studier. Vidare kan den renade P-domänen kan användas för komplexbildning med Fab-antikroppar och nanobodies 14,15. Såvitt vi vet är detta det första protokollet som gör P domänkristallisation i en hög genomströmning sätt och med hjälp av detta protokoll, har vi fastställt över 20 komplexa strukturer av olika norovirus och lagovirus P domäner i komplex med HBGAs 6,16.
Enligt vår erfarenhet kan det protokoll begränsas till proteiner upp till 65 kDa. Emellertid kapsidproteiner av olika caliciviruses 17 och icke-strukturella proteiner, såsom viralt protein genomet bunden (VPG), proteas, och RNA-beroende RNA-polymeras (RdRp) uttrycktes framgångsrikt och renades med användning av denna metod (opublicerad). Vid tillämpning av denna metod för att kapsidproteinerna av andra virus, it kan vara nödvändigt att variera och optimera flera parametrar (t ex., imidazol koncentration av elueringsbufferten) för att få tillräcklig mängd protein. Dessutom kan olika andra än GFB (t.ex. PBS eller TBS) lagringsbuffertar testas för optimal proteinstabilitet.
Majoriteten av de analyserade konstruktioner gav i kubik / plattliknande kristaller som diffrakterade till höga upplösningar. Därför tillhandahåller föreliggande protokollet ett verktyg för att få rent protein som kristalliserar väl. Så länge som det är nu robust cellkultur modell tillgänglig, utgör denna metod ett betydande steg för att bidra till förståelsen av norovirus-värdinteraktion cell.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| P domain DNA | Life Technologies | GeneArt Gene Synthesis | |
| pMalc2x vector | On request | ||
| BamHI | New England Biolabs | R0136L | |
| NotI | New England Biolabs | R0189L | |
| T4 DNA Ligase | New England Biolabs | M0202S | |
| QIAquick Gel Extraction Kit | Qiagen | 28704 | |
| QIAprep Spin Miniprep Kit | Qiagen | 27104 | |
| S.O.C. Medium | Life Technologies | 15544-034 | |
| Econo-Column Chromatography Column | Bio-Rad | 7372512 | 2.5 x 10 cm, possible to use other size |
| Ni-NTA Agarose | Qiagen | 30210 | |
| Vivaspin 20 | GE Healthcare | various | cutoff of 10 kDa, 30 kDa and 50 kDa used |
| Subcloning Efficiency DH5α Competent Cells | Life Technologies | 18265-017 | |
| One Shot BL21(DE3) Chemically Competent E. coli | Life Technologies | C6000-03 | |
| HRV 3C Protease | Merck Millipore | 71493 | |
| HiLoad 26/600 Superdex 75 PG | GE Healthcare | 28-9893-34 | SEC column |
| JCSG Core suites | Qiagen | various | 4 screens with each 96 wells |
| Carbohydrates | Dextra Laboratories, UK | various | Blood group products |
References
- Ahmed, S. M., et al. Global prevalence of norovirus in cases of gastroenteritis: a systematic review and meta-analysis. Lancet Infect. Dis. 14, 725-730 (2014).
- Prasad, B. V., Matson, D. O., Smith, A. W. Three-dimensional structure of calicivirus. J. Mol. Biol. 240, 256-264 (1994).
- Choi, J. M., Hutson, A. M., Estes, M. K., Prasad, B. V. Atomic resolution structural characterization of recognition of histo-blood group antigens by Norwalk virus. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, 9175-9180 (2008).
- Marionneau, S., et al. Norwalk virus binds to histo-blood group antigens present on gastroduodenal epithelial cells of secretor individuals. Gastroenterology. 122, 1967-1977 (2002).
- Jones, M. K., et al. Enteric bacteria promote human and mouse norovirus infection of B cells. Science. 346, 755-759 (2014).
- Hansman, G. S., et al. Crystal structures of GII.10 and GII.12 norovirus protruding domains in complex with histo-blood group antigens reveal details for a potential site of vulnerability. J. Virol. 85, 6687-6701 (2011).
- Fath, S., et al. Multiparameter RNA and codon optimization: a standardized tool to assess and enhance autologous mammalian gene expression. PLoS One. 6 (e17596), (2011).
- Jacob, F., Monod, J. Genetic regulatory mechanisms in the synthesis of proteins. J. Mol. Biol. 3, 318-356 (1961).
- Laemmli, U. K. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4. Nature. 227, 680-685 (1970).
- Kabsch, W. Automatic Processing of Rotation Diffraction Data from Crystals of Initially Unknown Symmetry and Cell Constants. J. Appl. Crystallogr. 26, 795-800 (1993).
- Mccoy, A. J., et al. Phaser crystallographic software. J. Appl. Crystallogr. 40, 658-674 (2007).
- Emsley, P., Lohkamp, B., Scott, W. G., Cowtan, K. Features and development of Coot. Acta Crystallogr. Sect. D-Biol. Crystallogr. 66, 486-501 (2010).
- Adams, P. D., et al. PHENIX: a comprehensive Python-based system for macromolecular structure solution. Acta Crystallogr. Sect. D-Biol. Crystallogr. 66, 213-221 (2010).
- Koromyslova, A. D., Hansman, G. S. Nanobody binding to a conserved epitope promotes norovirus particle disassembly. J. Virol. 89, 2718-2730 (2015).
- Hansman, G. S., et al. Structural basis for broad detection of genogroup II noroviruses by a monoclonal antibody that binds to a site occluded in the viral particle. J. Virol. 86, 3635-3646 (2012).
- Singh, B. K., Leuthold, M. M., Hansman, G. S. Human noroviruses' fondness for histo-blood group antigens. J. Virol. 89, 2024-2040 (2015).
- Leuthold, M. M., Dalton, K. P., Hansman, G. S. Structural analysis of a rabbit hemorrhagic disease virus binding to histo-blood group antigens. J. Virol. 89, 2378-2387 (2015).
