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Biology

में मानव Norovirus फैला हुआ डोमेन का उत्पादन Published: April 19, 2016 doi: 10.3791/53845
Automatic Translation
1,2, 1,2, 1,2, 1,2
1Schaller Research Group, University of Heidelberg and the German Cancer Research Center, 2Department of Infectious Diseases, Virology, University of Heidelberg

Summary

यहाँ, हम व्यक्त करने और उच्च गुणवत्ता नोरोवायरस को शुद्ध फैला हुआ (पी) ई में डोमेन के लिए एक विधि का वर्णन कोलाई एक्स-रे क्रिस्टलोग्राफी पढ़ाई में उपयोग के लिए। इस विधि अन्य calicivirus पी डोमेन, साथ ही गैर संरचनात्मक प्रोटीन, को लागू किया जा सकता है अर्थात्।, वायरल जीनोम प्रोटीन से जुड़े (VPG), प्रोटीज, और आरएनए निर्भर शाही सेना पोलीमरेज़ (RdRP)।

Abstract

नोरोवायरस कैप्सिड एक भी प्रमुख संरचनात्मक प्रोटीन से बना है, VP1 करार दिया। VP1 एक खोल (एस) डोमेन और फैलने वाला (पी) डोमेन में विभाजित है। डोमेन वायरल शाही सेना के चारों ओर एक सन्निहित पाड़ रूपों, जबकि पी डोमेन रूपों डोमेन पर वायरल spikes और प्रतिजनकता और मेजबान सेल बातचीत के लिए निर्धारकों में शामिल है। पी डोमेन कार्बोहाइड्रेट संरचनाओं बांधता है, अर्थात्।, Histo-रक्त समूह एंटीजन, जो लगा रहे हैं नोरोवायरस संक्रमण के लिए महत्वपूर्ण है। इस प्रोटोकॉल में, हम उच्च पैदावार में उच्च गुणवत्ता नोरोवायरस पी डोमेन के उत्पादन के लिए एक विधि का वर्णन है। ये प्रोटीन तो प्रतिजनकता और मेजबान सेल बातचीत का अध्ययन करने के क्रम में एक्स-रे क्रिस्टलोग्राफी और एलिसा के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है।

पी डोमेन सबसे पहले एक अभिव्यक्ति वेक्टर में क्लोन और फिर बैक्टीरिया में व्यक्त किया जाता है। प्रोटीन तीन कदम है कि स्थिर शामिल धातु आयन आत्मीयता क्रोमैटोग्राफी और आकार अपवर्जन क्रोमैटोग्राफी का उपयोग शुद्ध होता है। मेंसिद्धांत, यह क्लोन करने के लिए एक्सप्रेस, शुद्ध, और कम से कम चार सप्ताह है, जो इस प्रोटोकॉल नए उभरते नोरोवायरस उपभेदों का विश्लेषण करने के लिए एक तेजी से सिस्टम बनाता में प्रोटीन मणिभ संभव है।

Introduction

मानव noroviruses तीव्र आंत्रशोथ दुनिया भर में 1 के प्रमुख कारण हैं। ये वायरस Caliciviridae परिवार, जिनमें से Norovirus, Sapovirus, Lagovirus, Vesivirus, और Nebovirus सहित कम से कम पांच पीढ़ी, देखते हैं के हैं। स्वास्थ्य देखभाल प्रणाली और व्यापक वितरण पर अपने उच्च प्रभाव के बावजूद, मानव noroviruses के अध्ययन के लिए एक मजबूत सेल संस्कृति प्रणाली की कमी आड़े आती है। तिथि करने के लिए, वहाँ कोई अनुमोदित टीके या उपलब्ध एंटीवायरल रणनीतियों रहे हैं।

नोरोवायरस प्रमुख कैप्सिड प्रोटीन, VP1 करार दिया, एक खोल (एस) डोमेन और फैलने वाला (पी) डोमेन 2 में विभाजित किया जा सकता है। पी डोमेन एक लचीला काज (एच) क्षेत्र द्वारा एस डोमेन से जुड़ा है। डोमेन वायरल शाही सेना के चारों ओर एक पाड़ रूपों, जबकि पी डोमेन वायरल capsid की outmost हिस्सा है। जब बैक्टीरिया में व्यक्त पी डोमेन जैविक रूप से प्रासंगिक dimers में assembles। पी डीImer कार्बोहाइड्रेट संरचनाओं के साथ सूचना का आदान प्रदान, histo-रक्त समूह एंटीजन (HBGAs) कि लार में घुलनशील एंटीजन के रूप में मौजूद है और निश्चित मेजबान कोशिकाओं 3 पर पाए जाते हैं करार दिया। पी डोमेन-HBGA बातचीत संक्रमण 4 के लिए महत्वपूर्ण माना जाता है। दरअसल, हाल ही में एक रिपोर्ट सिंथेटिक HBGAs या इन विट्रो 5 में HBGA व्यक्त मानव नोरोवायरस संक्रमण के लिए बैक्टीरिया के महत्व का पता चला।

वर्तमान noroviruses के मेजबान सेल लगाव के बारे में अध्ययन मुख्य रूप से वायरस की तरह कणों (VLPs) है कि कीट कोशिकाओं में या कोलाई (ई कोलाई) में व्यक्त पुनः संयोजक पी डोमेन के साथ व्यक्त किया जा सकता है के साथ प्रदर्शन कर रहे हैं। परमाणु संकल्प पर पी डोमेन-HBGA बातचीत को समझने के लिए, पी डोमेन-HBGA जटिल संरचना एक्स-रे क्रिस्टलोग्राफी का उपयोग कर हल किया जा सकता है। यहाँ, हम उच्च मात्रा और गुणवत्ता में पी डोमेन के उत्पादन एक्स-रे Crystall के लिए इस्तेमाल किया जा करने की अनुमति देता है कि पी डोमेन अभिव्यक्ति और शुद्धि के लिए एक प्रोटोकॉल का वर्णनography। इसके अलावा, इस विधि अन्य calicivirus पी डोमेन और गैर संरचनात्मक प्रोटीन के लिए लागू किया जा सकता है।

पी डोमेन ई के लिए कोडोन-अनुकूलित है कोलाई अभिव्यक्ति और एक मानक हस्तांतरण वेक्टर में क्लोन। पी डोमेन तो एक अभिव्यक्ति वेक्टर कि एक polyhistidine (उनकी) टैग और एक mannose बाध्यकारी प्रोटीन (MBP) है कि एक प्रोटीज दरार साइट द्वारा पीछा कर रहे encodes में फिर से क्लोन है। MBP-अपने-पी डोमेन संलयन प्रोटीन ई में व्यक्त किया जाता है कोलाई, तीन शुद्धि चरणों द्वारा पीछा किया। MBP-अपने-पी डोमेन संलयन प्रोटीन स्थिर धातु आयन आत्मीयता क्रोमैटोग्राफी (IMAC) का उपयोग कर शुद्ध होता है। अगले, संलयन प्रोटीन मानव rhinovirus (HRV) -3C प्रोटीज और पी डोमेन से अलग किया जाता है साथ cleaved है MBP-उनका एक अतिरिक्त IMAC शुद्धि कदम से। अन्त में, पी डोमेन आकार अपवर्जन क्रोमैटोग्राफी (एसईसी) का उपयोग कर शुद्ध होता है। शुद्ध पी डोमेन तो एक्स-रे क्रिस्टलोग्राफी के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है। प्रोटीन क्रिस्टलीकरण की स्थिति की स्क्रीनिंग perfo हैअलग पी डोमेन प्रोटीन सांद्रता का उपयोग व्यावसायिक रूप से उपलब्ध स्क्रीनिंग किट के साथ rmed। क्रिस्टल विकास मनाया जाता है और सबसे होनहार की स्थिति अनुकूलित कर रहे हैं।

साथ तरीकों यहाँ वर्णित है, यह कम से कम चार सप्ताह के भीतर की संरचना करने के लिए प्रोटीन जीन से जाने के लिए संभव है। इसलिए, पी डोमेन अभिव्यक्ति, शुद्धि, और क्रिस्टलीकरण की हमारी विधि आणविक स्तर पर नोरोवायरस मेजबान बातचीत का अध्ययन और अप-टू-डेट वैक्सीन डिजाइन और दवा स्क्रीनिंग में सहायता करने के लिए महत्वपूर्ण डेटा प्रदान करने के लिए उपयुक्त है।

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Protocol

1. पी डोमेन क्लोनिंग

  1. नोरोवायरस स्ट्रेन के अनुक्रम संरेखण द्वारा पी डोमेन कोडिंग क्षेत्र का निर्धारण करते हैं (जैसे, GII.10 तनाव, GenBank: AF504671, PDB आईडी: 3ONU) 6। इसके अलावा, पी डोमेन (2A चित्रा) के सी टर्मिनल अंत में लचीला क्षेत्र को हटा दें। ई के लिए डीएनए कोडोन-अनुकूलन कोलाई अभिव्यक्ति और BamHI (एन टर्मिनल) और चना (सी टर्मिनल) प्रतिबंध क्रम में उप क्लोन करने के लिए साइटों पी डोमेन pMalc2x अभिव्यक्ति वेक्टर 6.7 में क्षेत्र कोडिंग शामिल हैं।
    नोट: पी डोमेन कोडिंग क्षेत्र अनुकूलित और एक व्यावसायिक सेवा के द्वारा संश्लेषित है। पी डोमेन कोडिंग क्षेत्र (डालने) लंबाई में लगभग 1 केबी और एक मानक हस्तांतरण वेक्टर में दिया है।
  2. प्रत्येक 1 μl BamHI (20,000 यू / एमएल) और चना (10,000 यू / एमएल) के प्रतिबंध 37 डिग्री सेल्सियस पर 1 घंटे के लिए एंजाइमों निर्माता के साथ आपूर्ति buffers के साथ हस्तांतरण वेक्टर के 2 माइक्रोग्राम डाइजेस्ट।
  3. एक 1% agarose जेल पर पचा डालने को अलग करें135 वी पर 20 मिनट के लिए और जेल से डालने के डीएनए एक वाणिज्यिक किट का उपयोग कर शुद्ध।
  4. इस सदिश के 2 माइक्रोग्राम पचाने प्रत्येक 1 μl BamHI (20,000 यू / एमएल) और चना (10,000 यू / एमएल) के प्रतिबंध 37 डिग्री सेल्सियस पर 1 घंटे के लिए एंजाइमों के साथ द्वारा pMalc2x अभिव्यक्ति वेक्टर तैयार करें। ऊपर के रूप में (1.3) में वर्णित एक agarose जेल से वेक्टर शुद्ध। नोट: दोनों के नमूने (1.2 और 1.4) -20 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहित किया जा सकता है।
  5. कमरे के तापमान (आरटी) (चित्रा 2 बी और 2 सी) पर 15 मिनट के लिए 1 μl टी -4 डीएनए ligase (400,000 यू / एमएल) के साथ BamHI और चना प्रतिबंध साइटों पर पचता pMalc2x वेक्टर में शुद्ध डालने ligate। सम्मिलित अनुपात 1: 3 (आणविक वजन) pMalc2x वेक्टर और एक वेक्टर के कम से कम 20 एनजी का प्रयोग करें। बंधाव मिश्रण आमतौर पर ~ 20 μl है।
  6. 50 μl रासायनिक सक्षम ई में बंधाव मिश्रण के 2 μl रूपांतरण कोलाई DH5α एक मानक परिवर्तन प्रोटोकॉल (बर्फ पर 10 मिनट, गर्मी झटका 42 डिग्री सेल्सियस पर 45 सेकंड) का उपयोग बैक्टीरियल कोशिकाओं और 600 में बढ़ने37 डिग्री सेल्सियस पर 1 घंटे के लिए μl समाज माध्यम। अपकेंद्रित्र बदल कोशिकाओं 1,000 XG पर 3 मिनट के लिए, सतह पर तैरनेवाला त्यागें, और समाज माध्यम के 30 μl में गोली resuspend।
    1. लेग अगर प्लेटों पर परिवर्तन मिश्रण थाली, चयन के लिए 100 माइक्रोग्राम / एमएल एम्पीसिलीन युक्त, और 37 डिग्री सेल्सियस पर रात भर बढ़ता है। कम से कम पांच कालोनियों का चयन करें।
  7. पांच कालोनियों में से प्रत्येक के लिए, लेग मध्यम 50 माइक्रोग्राम / एमएल एम्पीसिलीन (लेग एएमपी) के साथ पूरक के 2-3 मिलीलीटर संस्कृति टीका लगाना और 37 डिग्री सेल्सियस पर 160 rpm पर रात भर झटकों से बढ़ता है।
  8. एक वाणिज्यिक किट का उपयोग कर रातोंरात संस्कृति से प्लास्मिड निकालें। एक pMalc2x आगे प्राइमर (5'-TCAGACTGTCGATGAAGC-3 ') के साथ अनुक्रमण द्वारा पी डोमेन डालने की उपस्थिति सत्यापित करें और प्राइमर रिवर्स (5'-GATGTGCTGCAAGGCGAT -3')।

2. पी डोमेन अभिव्यक्ति

  1. MBP-अपने-पी डोमेन के लिए pMalc2x वेक्टर कोडिंग की - (400 एनजी / μl 150 एनजी / μl) 1 μl रूपांतरणसक्षम ई के 50 μl में संलयन प्रोटीन एक मानक परिवर्तन प्रोटोकॉल (बर्फ पर 10 मिनट, गर्मी झटका 42 डिग्री सेल्सियस पर 45 सेकंड) का उपयोग कोलाई BL21 कोशिकाओं और 37 डिग्री सेल्सियस पर 1 घंटे के लिए 600 μl समाज माध्यम में हो जाना। रात भर में 160 आरपीएम और 37 डिग्री सेल्सियस पर लेग amp के 120 मिलीलीटर में उपसंस्कृति।
  2. नौ लीटर उपसंस्कृति (: 100 1) के साथ लेग amp के (1.5 एल मध्यम से प्रत्येक के साथ जैसे, 6 एक्स 5 एल बोतल) टीका लगाना। 0.6 - 160 आरपीएम और 37 डिग्री सेल्सियस पर झटकों तक आयुध डिपो 600 तक पहुँच जाता 0.4 कोशिकाओं को विकसित। बाद में, ~ 1 घंटे के लिए 22 डिग्री सेल्सियस तक तापमान कम और फिर isopropyl-β-D-thiogalactopyranoside के 0.66 मिमी (IPTG) 8 के साथ प्रोटीन अभिव्यक्ति प्रेरित। 22 डिग्री सेल्सियस (~ 18 घंटा) में रात भर कोशिकाओं को विकसित।
    नोट: तापमान अलग किया जा सकता है, लेकिन हम 22 डिग्री सेल्सियस या कम उपयोग करने की सलाह देते हैं।
  3. centrifugation द्वारा कोशिकाओं फसल (10,543 XG, 15 मिनट, 4 डिग्री सेल्सियस)। सतह पर तैरनेवाला त्यागें और -20 डिग्री सेल्सियस पर सेल गोली फ्रीज।

सेंट शुद्धि कदम और protease दरार

  1. buffers कि reproducibility और प्रयोगों की स्थिरता की गारंटी करने के लिए शेयर समाधान से प्रोटीन शुद्धि चरणों के दौरान इस्तेमाल कर रहे हैं तैयार करें। स्थिर धातु आयन आत्मीयता क्रोमैटोग्राफी के लिए चार अलग-अलग बफ़र्स (IMAC), प्रत्येक imidazole का एक अलग एकाग्रता से युक्त (10 मिमी, 20 मिमी, 50 मिमी, और 250 मिमी) तैयार करें। सेकंड के लिए, एक उच्च नमक एकाग्रता के साथ एक जेल निस्पंदन बफर (GFB) तैयार करते हैं, लेकिन imidazole के बिना। विआयनीकृत पानी का प्रयोग करें और 0.45 माइक्रोन के एक छेद के आकार के साथ उपयोग करने से पहले सभी बफ़र्स फिल्टर।
    ध्यान दें: एक विस्तृत बफर तैयार करने के लिए योजना, 1 टेबल को देखें।
  2. नौ लीटर संस्कृति से सेल गोली गला लें और 4 डिग्री सेल्सियस पर 150 मिलीलीटर पीबीएस में भंग। सेल निलंबन 2 मिनट (शक्ति 130 डब्ल्यू, आयाम 20%, पल्स आवृत्ति 50%) के लिए तीन बार Sonicate कोशिकाओं को बाधित करने के लिए। sonication के दौरान बर्फ पर सेल निलंबन रखें।
  3. Centrifuजीई sonicated सेल निलंबन (43,667 XG, 30 मिनट, 4 डिग्री सेल्सियस) व्यक्त प्रोटीन युक्त सतह पर तैरनेवाला से सेल मलबे को अलग करने के लिए। सतह पर तैरनेवाला लीजिए और गोली त्यागें।
  4. धो और संतुलित 10 मिलीलीटर (= 1 स्तंभ मात्रा [cv]) निकल (नी) एक क्रोमैटोग्राफी स्तंभ में 10 मिमी imidazole बफर के साथ -NTA agarose मोती का घोल। 3.3 कदम से सतह पर तैरनेवाला को equilibrated नी मोती जोड़े युक्त MBP-अपने-पी डोमेन संलयन प्रोटीन व्यक्त की और धीमी गति से रोटेशन के साथ 4 डिग्री सेल्सियस पर 30 मिनट के लिए सेते हैं।
  5. ऊष्मायन के बाद, एक क्रोमैटोग्राफी स्तंभ के लिए पूरे नी मनका प्रोटीन मिश्रण लागू होते हैं। 10 मिमी, 20 मिमी, और 50 मिमी imidazole buffers, 10 मिमी, तो 20 मिमी और पिछले 50 मिमी (चित्रा 3) के साथ शुरू की प्रत्येक 5 सीवी के साथ धीरे-धीरे स्तंभ धो लें।
  6. MBP-अपने-पी डोमेन संलयन प्रोटीन 250 मिमी imidazole बफर (चित्रा 3 ए) का उपयोग Elute। क्षालन के दौरान, संलयन प्रोटीन की क्षालन (ओवर ड्राफ्ट 28 में वृद्धि को सत्यापित करने के आयुध डिपो 280nm जाँच0nm)। क्षालन जारी रखें जब तक आयुध डिपो 280nm ~ 0.1 करने के लिए चला जाता है। 10 मिमी imidazole बफर के कम से कम 10 सीवी के द्वारा पीछा 250 मिमी imidazole बफर (कम से कम 10 सीवी) की अत्यधिक मात्रा के साथ मोती धो लें। दूसरी शुद्धि कदम (धारा 4) के लिए मोती बचाओ।
  7. एक 12% एसडीएस polyacrylamide जेल (10 x 8 सेमी) 9 (चित्रा 3 ए) का उपयोग एसडीएस पृष्ठ के साथ MBP-अपने-पी डोमेन संलयन प्रोटीन की उपस्थिति को सत्यापित करें। और 45 ए पर जेल वैद्युतकणसंचलन प्रदर्शन करते 45 मिनट के लिए 200 वी।
  8. ~ 3 मिलीग्राम / मिलीलीटर की एक अंतिम एकाग्रता के लिए ध्यान केंद्रित (जैसे, एक वाणिज्यिक concentrator का उपयोग) eluted MBP-अपने-पी डोमेन संलयन प्रोटीन। Imidazole बफर 10 मिमी के 2 एल के खिलाफ डायलिसिस के दौरान HRV -3 सी प्रोटीज साथ MBP-अपने-पी डोमेन संलयन फोड़ना (~ 1: 100) 4 डिग्री सेल्सियस (चित्रा 3 ए) में रात भर। केंद्रित प्रोटीन की अंतिम मात्रा पर निर्भर करता है, एक डायलिसिस कैसेट या डायलिसिस ट्यूबिंग में डायलिसिस प्रदर्शन करते हैं।
    नोट: प्रोटीन के लिए HRV -3 सी प्रोटीज की राशिदरार विशिष्ट प्रोटीज गतिविधि के अनुसार गणना की है और eluted संलयन प्रोटीन है कि अभिव्यक्ति के स्तर पर बदलता है और एसडीएस पृष्ठ परिणाम से अनुमान लगाया जा सकता है की राशि (3.7 (2 यू / μl, 1 यू पर्याप्त प्रोटीन की 100 माइक्रोग्राम फोड़ना करने के लिए है) )।

4. 2 एन डी शुद्धि कदम

  1. 10 मिमी imidazole बफर में 3.6 कदम से नी, मोती संतुलित करना।
  2. 3.7 चरण धीमी गति रोटेशन के साथ 4 डिग्री सेल्सियस पर 30 मिनट के लिए equilibrated नी मोती (4.1) के साथ (cleaved पी डोमेन, MBP प्रोटीन, और HRV-प्रोटीज युक्त) से dialyzed प्रोटीन सेते हैं।
  3. एक स्तंभ के लिए नी मनका मिश्रण लागू करें और प्रवाह के माध्यम से (cleaved पी डोमेन) (चित्रा 3 बी) इकट्ठा। प्रोटीन की एकाग्रता को मापने के रूप में यह स्तंभ उतर आता है जब तक आयुध डिपो 280nm पहुंचता है ~ 0.1।
    नोट: MBP उनकी नी मोती (चित्रा 3 बी) के लिए बाध्य कर रहना चाहिए।
  4. एक 1 के साथ एसडीएस पृष्ठ का उपयोग कर cleaved पी डोमेन की उपस्थिति की जांच2% जेल के रूप में ऊपर (चित्रा 3 बी) का वर्णन किया। ~ 3 मिलीग्राम / एमएल eluted पी डोमेन ध्यान लगाओ और बाद एसईसी शुद्धि के लिए GFB के खिलाफ 4 डिग्री सेल्सियस पर रात भर dialyze।

5. 3 शुद्धि कदम

  1. धो पंप और एचपीएलसी शोधन प्रणाली की पाइप और पूर्व संतुलित एसईसी-स्तंभ (देखें माल की सूची) GFB के साथ।
  2. , 1 मिलीग्राम / मिनट एक superloop (12 एमएल) या पाश (3 मिलीग्राम तक) का उपयोग करने का एक प्रवाह दर पर स्तंभ के लिए पी डोमेन इंजेक्षन केंद्रित नमूने की मात्रा पर निर्भर करता है। बाद इंजेक्शन समाप्त हो गया है, 2.5 मिलीग्राम / मिनट के लिए प्रवाह दर में वृद्धि।
  3. आयुध डिपो बढ़ जाती है और पी डोमेन स्तंभ उतर आता है के रूप में, 1.5 मिलीग्राम के भागों इकट्ठा। (चित्रा -4 ए और 4 बी) 12% की जेल के साथ एसडीएस पृष्ठ का उपयोग कर अंशों की जाँच करें। पूल केवल शुद्धतम भिन्न और ~ 3 मिलीग्राम / एमएल और ~ 8 मिलीग्राम / एमएल के लिए ध्यान देना।
    नोट: ~ 110 मिलीलीटर के बाद (शून्य मात्रा) सबसे अधिक दोष 320 मिलीलीटर बिस्तर मात्रा के साथ एक एसईसी स्तंभ से eluted हैं।पी डोमेन आमतौर पर एक डिमर के रूप में eluted है। क्षालन समय / पी डोमेन डिमर की मात्रा एसईसी स्तंभ के प्रस्तुत करने का ग्रेड (पीजी) पर निर्भर है।

6. पी डोमेन के क्रिस्टलीकरण

  1. प्रारंभिक जांच के लिए क्रिस्टलीकरण ~ 3 मिलीग्राम / एमएल और 8 मिलीग्राम / एमएल पी डोमेन का प्रयोग करें। 384 व्यावसायिक रूप से उपलब्ध स्क्रीनिंग की स्थिति के साथ प्रारंभिक स्क्रीन के लिए एकाग्रता प्रति पी डोमेन के कम से कम 100 μl तैयार करें। एक 96 अच्छी तरह से थाली प्रारूप, जहां जलाशय मां समाधान के 100 μl में शामिल 18 डिग्री सेल्सियस पर स्क्रीनिंग प्रदर्शन और एक बूंद 0.2 μl मां समाधान और 0.2 μl प्रोटीन से बना है।
  2. दोहराएँ और सफल क्रिस्टलीकरण शर्तों का अनुकूलन। इसलिए, 15 अच्छी तरह प्लेटें कि 3 पंक्तियाँ का उपयोग करें। 100% मां समाधान, 90% मां समाधान और 10% पानी, और 80% मां समाधान और 20% पानी के साथ तीसरी पंक्ति के साथ दूसरी पंक्ति के साथ पहली पंक्ति सेट करें। 2 μl (1 μl प्रोटीन + 1 μl मां समाधान) और 500 की एक बूंद के आकार का उपयोग करें81, एक जलाशय मात्रा के रूप में मां समाधान के एल।
  3. सह-crystallizing ligands के साथ पी डोमेन के लिए अनुकूलित क्रिस्टल की स्थिति का प्रयोग करें। 6.2 में वर्णित के रूप में प्लेटें तैयार करें। 2 μl ड्रॉप आकार के बजाय, 1 μl मां समाधान, 1 μl प्रोटीन, और 1 मिलीग्राम / एमएल की एकाग्रता में ligand के 1 μl युक्त बूंदों की स्थापना की।
  4. सिंक्रोटॉन विकिरण का उपयोग कर एकल क्रिस्टल के डेटा सेट ले लीजिए। आरंभिक खोज मॉडल 6,10-13 के रूप में एक उच्च अनुक्रम समानता के साथ प्रकाशित पी डोमेन संरचनाओं का उपयोग आणविक प्रतिस्थापन प्रदर्शन करना।
    ध्यान दें: एक ligand की उपस्थिति इलेक्ट्रॉन घनत्व के संयुक्त राष्ट्र के मॉडलिंग की बूँद के रूप में दिखाता है।

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Representative Results

वर्णित प्रोटोकॉल के योजनाबद्ध चित्र 1 में दिखाया गया है। प्रोटोकॉल 6 प्रमुख भागों है कि लक्ष्य जीन की क्लोनिंग, अभिव्यक्ति, एक तीन कदम शुद्धि, और क्रिस्टलीकरण शामिल शामिल किया गया है। चित्रा 2 अभिव्यक्ति का निर्माण के डिजाइन को दिखाता है (ईसी) और pMalc2x अभिव्यक्ति वेक्टर की विशेषताओं। PMalc2x वेक्टर के कई क्लोनिंग साइट (एमसीएस) के अनुक्रम प्रतिबंध और प्रोटीज दरार साइटों से पता चलता है। चित्रा 3 के पहले दो इसी schematics के साथ MBP-अपने-पी डोमेन संलयन प्रोटीन का प्रतिनिधि एसडीएस पृष्ठ के परिणाम और cleaved पी डोमेन से पता चलता शुद्धि के कदम। तीसरे शुद्धि कदम चित्रा 4 में दिखाया गया है और एक शुद्धि योजना, शुद्ध पी डोमेन के क्षालन वर्णलेख और एकत्र भिन्न के एक प्रतिनिधि एसडीएस पृष्ठ परिणाम शामिल है। शुद्धतम अंशों जमा कर रहे हैं, concentrat (एसडीएस पृष्ठ के अनुसार)एड, और एक्स-रे क्रिस्टलोग्राफी के लिए इस्तेमाल किया।

आकृति 1
चित्रा 1. Norovirus पी डोमेन अभिव्यक्ति और शोधन के योजनाबद्ध। नोरोवायरस पी डोमेन अभिव्यक्ति और शुद्धि के लिए प्रोटोकॉल, छह प्रमुख भागों में शामिल क्लोनिंग और अभिव्यक्ति (1 और 2), शुद्धि (3 से 5), और क्रिस्टलीकरण (6.) को कवर। लाल त्रिकोण, पी डोमेन (जीन और प्रोटीन) का प्रतिनिधित्व करते हैं, जबकि नीले रंग की आयतों MBP-उनका प्रतिनिधित्व करते हैं। नी NTA agarose मोती कि IMAC के दौरान प्रयोग किया जाता है (3 और 4) बड़ी सियान क्षेत्रों के रूप में सचित्र हैं। एसईसी मोती ग्रे क्षेत्रों के रूप में चित्रित कर रहे हैं।

चित्र 2
चित्रा 2. डिजाइन और अभिव्यक्ति का निर्माण की क्लोनिंग (ईसी)। पी डोमेन चुनाव आयोग, अभिव्यक्ति वेक्टर नक्शा, और कई क्लोनिंग साइट (एमसीएस) दिखाए जाते हैं। ए) नोरोवायरस कैप्सिड प्रोटीन (VP1) और पी डोमेन चुनाव आयोग सी टर्मिनल विलोपन के साथ चुनाव आयोग (हरा) के डिजाइन illustrating के संरेखण। बी ) pMalc2x अभिव्यक्ति वेक्टर की योजनाबद्ध प्रतिनिधित्व ई में पी डोमेन अभिव्यक्ति के लिए इस्तेमाल किया एम्पीसिलीन प्रतिरोध कैसेट के साथ कोली (AmpR), लाख-operon (Laci), mannose बाध्यकारी प्रोटीन (पुरुष, MBP) और एक एमसीएस। सी) pMalc2x अभिव्यक्ति वेक्टर के एमसीएस के अनुक्रम। प्रकाश डाला प्रतिबंध एंजाइम दरार साइटों (लाल बक्से) और HRV -3 सी प्रोटीज (प्रेसिजन, नीले बॉक्स) के लिए मान्यता अनुक्रम LEVLFQGP हैं।

चित्र तीन
1 सेंट और 2 एन डी पुर के लिए चित्रा 3. योजनाबद्ध और प्रतिनिधि परिणामवर्गीकरण कदम। शोधन अवलोकन और प्रतिनिधि एसडीएस पृष्ठ के परिणाम दिखाए जाते हैं। ए) MBP-अपने-पी डोमेन संलयन प्रोटीन नी NTA agarose मोती (बिग सियान क्षेत्रों) का उपयोग कर की शुद्धि। 12% एसडीएस पृष्ठ जेल MBP-अपने-पी डोमेन संलयन प्रोटीन। बी) cleaved पी डोमेन (लाल त्रिकोण) से MBP उनकी (नीले आयत के पृथक्करण) से पता चलता। cleaved पी डोमेन के क्षालन एक 12% जेल पर एसडीएस पृष्ठ से विश्लेषण किया है।

चित्रा 4
3 शुद्धि कदम के लिए चित्रा 4. योजनाबद्ध और प्रतिनिधि परिणाम है। एसईसी का उपयोग करते हुए और इसी एसडीएस पृष्ठ परिणाम पी डोमेन क्षालन के chromatogram। काले रंग की संख्या अंशों कि एकत्र कर रहे हैं। ए) एसईसी स्तंभ पर जुदाई के योजनाबद्ध संकेत मिलता है (एसईसी मोती ग्रे क्षेत्रों के रूप में चित्रित कर रहे हैं)। 12% एसडीएस पृष्ठ प्रोटीन वर्तमान पता चलता हैअंशों कि एसईसी क्षालन के दौरान एकत्र की है और जो कर रहे हैं में बाद में जमा और एक्स-रे क्रिस्टलोग्राफी। बी के लिए उपयोग किया जाता है) एसईसी वर्णलेख मापा absorbance (काला लाइन) क्षालन मात्रा पर पता चलता है। लाल रेखा इंगित करता है। जब पी डोमेन) बी के दूसरे शिखर करने के लिए एसईसी-स्तंभ। सी में इंजेक्ट किया गया था ज़ूम यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

बफर नाम 1 एम Tris पीएच 7.6 5 एम NaCl 3.5 मीटर Imidazole, पीएच 8
250 मिमी Imidazole बफर 20 मिलीलीटर 40 मिलीलीटर 71 मिलीलीटर
50 मिमी Imidazole बफर 20 मिलीलीटर 40 मिलीलीटर 14 मिलीलीटर
20 मिमी Imidazole बफर 20 मिलीलीटर 40 मिलीलीटर 5.7 मिलीलीटर
10 मिमी Imidazole बफर 20 मिलीलीटर 40 मिलीलीटर 2.8 मिलीलीटर
GFB (जेल निस्पंदन बफर) 25 मिलीलीटर 60 मिलीलीटर -

तालिका 1 शुद्धि के दौरान इस्तेमाल किया आम बफ़र के लिए Pipetting योजना। Tris एचसीएल के शेयर समाधान, सोडियम क्लोराइड (NaCl), और imidazole के रूप में मेज के शीर्षक में संकेत दिया तैयार हैं। शेयर पानी में वांछित बफर के 1 एल तैयार करने की जरूरत समाधान की राशि का प्रतिनिधित्व करती है।

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Discussion

यहाँ, हम उच्च गुणवत्ता और मात्रा में अभिव्यक्ति और नोरोवायरस पी डोमेन की शुद्धि के लिए एक प्रोटोकॉल का वर्णन है। Noroviruses अच्छी तरह से अध्ययन नहीं कर रहे हैं और संरचनात्मक डेटा लगातार की जरूरत है। हमारे ज्ञान करने के लिए, अन्य प्रोटोकॉल (जैसे, जीएसटी टैग पी डोमेन) का उपयोग कर पी डोमेन उत्पादन समस्याग्रस्त किया गया है, अब तक, और नोरोवायरस मेजबान बातचीत पर पर्याप्त संरचनात्मक डेटा याद कर दिया है। साथ विधि यहाँ वर्णित है, हम हाल ही में नोरोवायरस की आणविक विवरण को समझने के लिए काफी योगदान दिया है बाध्यकारी कार्बोहाइड्रेट। वर्तमान प्रोटोकॉल प्रोटीन की एक किस्म के लिए अनुकूलित किया जा सकता है। हालांकि, इस प्रोटोकॉल के सफल कार्यान्वयन के कई कारकों पर निर्भर करता है शोधन विधि के प्रत्येक भाग के भीतर।

अभिव्यक्ति का निर्माण के डिजाइन महत्व का पहला कदम है। हम पी डोमेन अभिव्यक्ति का निर्माण की कोडोन-अनुकूलन प्रदर्शन ई में अभिव्यक्ति उपज में सुधार कोलाई और निकालने के releVant प्रतिबंध साइटों, कोडिंग क्षेत्र के भीतर मौजूद है। इसके अलावा, हम सी टर्मिनस कि क्रिस्टलीकरण के दौरान अभिव्यक्ति और प्रोटीन पैकिंग के दौरान प्रोटीन तह के लिए हानिकर हो सकता है पर एक लचीला क्षेत्र को हटा दें। MBP संलयन प्रोटीन के रूप में अभिव्यक्ति अभिव्यक्ति के दौरान समाधान में प्रोटीन रखने के लिए एक मतलब है।

घुलनशील प्रोटीन अभिव्यक्ति के बारे में अतिरिक्त पैरामीटर पर विचार किया जा सकता है। ई कोलाई BL21 तनाव उच्च उपज प्रोटीन अभिव्यक्ति के लिए अनुकूलित है और इसलिए इस प्रोटोकॉल में इस्तेमाल किया। अभिव्यक्ति 22 डिग्री सेल्सियस पर रात भर किया जाता है और IPTG की एक कम राशि शामिल करने के लिए प्रयोग किया जाता है। यह प्रोटीन अभिव्यक्ति के कैनेटीक्स के लिए अनुकूल है और एक परिणाम के रूप में, कम प्रोटीन misfolding के कारण शामिल किए जाने के शरीर में कुल जाएगा। इसलिए, यह IPTG के साथ प्रोटीन अभिव्यक्ति की प्रेरण से पहले 22 डिग्री सेल्सियस के लिए संस्कृति शांत करने के लिए महत्वपूर्ण है। प्रोटीन उपज संतोषजनक नहीं है, तो यह संभव है कि आगे temperat कम करने के लिएUre और IPTG की राशि को समायोजित।

कुछ ख्याल शुद्धि कॉलम के बारे में लिया जाना चाहिए। सिद्धांत रूप में, नी, मोती कई बार पुन: उपयोग किया जा सकता है। हालांकि, बाध्यकारी क्षमता समय के साथ कम हो जाएगा। नी समाधान अपने मानक नीले रंग खो देता है, मोती छीन लिया और निर्माता की पुस्तिका में दिए गए निर्देशों का उपयोग कर उत्साहित किया जा सकता है। इसके अलावा, यह उचित हालत में एसईसी स्तंभ बनाए रखने और उच्च प्रदर्शन की अनुमति के लिए इसे नियमित रूप से साफ करने के लिए महत्वपूर्ण है। प्रोटीन आकार की है कि एक अलग प्रस्तुत करने का ग्रेड (पीजी) शुद्ध किया जा करने के लिए एसईसी स्तंभ के आधार पर चुना जाना चाहिए। पी डोमेन डिमर आकार में ~ 65 केडीए है और अच्छी तरह से, एक 75 पीजी स्तंभ का उपयोग ~ 100 केडीए के दोष से अलग किया जा सकता बड़ा प्रोटीन बेहतर हो सकता है, जबकि एक 200 पीजी स्तंभ का उपयोग कर अलग कर दिया।

अनुकूलित अनुक्रम डिजाइन, अभिव्यक्ति, और शोधन प्रक्रिया का एक संयोजन के रूप में यह हमारे मेथ का उपयोग बहुत शुद्ध और उच्च गुणवत्ता पी डोमेन हासिल करने के लिए संभव हैआयुध डिपो। शुद्ध पी डोमेन की उच्च गुणवत्ता के कारण, अतिरिक्त अध्ययन एंटीबॉडी के उत्पादन, एनएमआर प्रयोगों, और एलिसा आधारित अध्ययन के लिए टीकाकरण सहित उपयुक्त हैं। इसके अलावा, शुद्ध पी डोमेन फैब एंटीबॉडी और Nanobodies 14,15 के साथ जटिल गठन के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है। हमारे ज्ञान करने के लिए, यह पहली प्रोटोकॉल है कि एक उच्च throughput ढंग से पी डोमेन क्रिस्टलीकरण अनुमति देता है और, इस प्रोटोकॉल का उपयोग होता है, हम HBGAs 6,16 के साथ परिसर में विभिन्न नोरोवायरस और lagovirus पी डोमेन के 20 से अधिक जटिल संरचना निर्धारित किया है।

हमारे अनुभव के अनुसार, प्रोटोकॉल 65 केडीए के लिए ऊपर प्रोटीन के लिए सीमित किया जा सकता है। हालांकि, इस तरह के वायरल जीनोम प्रोटीन से जुड़े (VPG), प्रोटीज, और आरएनए निर्भर शाही सेना पोलीमरेज़ (RdRP) के रूप में विभिन्न caliciviruses 17 और गैर संरचनात्मक प्रोटीन, के capsid प्रोटीन सफलतापूर्वक व्यक्त की और इस विधि (अप्रकाशित) का उपयोग कर शुद्ध किया गया। अन्य वायरस के प्रोटीन capsid को जब इस पद्धति को लागू करने, मैंटी भिन्न है और कई मापदंडों का अनुकूलन करने के लिए आवश्यक हो सकता है (उदाहरण के लिए।, क्षालन बफर के imidazole एकाग्रता) प्रोटीन की पर्याप्त मात्रा में प्राप्त करें। इसके अलावा, विभिन्न भंडारण GFB (जैसे, पीबीएस या टीबीएस) के अलावा अन्य बफ़र्स इष्टतम प्रोटीन स्थिरता के लिए परीक्षण किया जा सकता है।

विश्लेषण किया निर्माणों के बहुमत घन / प्लेट की तरह क्रिस्टल, जो उच्च प्रस्तावों को विवर्तित में सामने आए। इसलिए, वर्तमान प्रोटोकॉल शुद्ध प्रोटीन है कि अच्छी तरह से क्रिस्टलीकृत प्राप्त करने के लिए एक उपकरण प्रदान करता है। जब तक वहाँ अब मजबूत सेल संस्कृति मॉडल उपलब्ध है, इस पद्धति में एक महत्वपूर्ण कदम नोरोवायरस मेजबान सेल बातचीत की समझ में योगदान करने का गठन किया।

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
P domain DNA Life Technologies GeneArt Gene Synthesis
pMalc2x  vector On request
BamHI New England Biolabs R0136L
NotI New England Biolabs R0189L
T4 DNA Ligase New England Biolabs M0202S
QIAquick Gel Extraction Kit Qiagen 28704
QIAprep Spin Miniprep Kit Qiagen 27104
S.O.C. Medium Life Technologies 15544-034
Econo-Column Chromatography Column Bio-Rad 7372512 2.5 x 10 cm, possible to use other size
Ni-NTA Agarose Qiagen 30210
Vivaspin 20 GE Healthcare various cutoff of 10 kDa, 30 kDa and 50 kDa used
Subcloning Efficiency DH5α Competent Cells Life Technologies 18265-017
One Shot BL21(DE3) Chemically Competent E. coli Life Technologies C6000-03
HRV 3C Protease Merck Millipore 71493
HiLoad 26/600 Superdex 75 PG GE Healthcare 28-9893-34 SEC column
JCSG Core suites Qiagen various 4 screens with each 96 wells
Carbohydrates Dextra Laboratories, UK various Blood group products

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References

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आण्विक जीवविज्ञान अंक 110 क्लोनिंग नोरोवायरस पी डोमेन प्रोटीन अभिव्यक्ति प्रोटीन शुद्धि क्रिस्टलीकरण
में मानव Norovirus फैला हुआ डोमेन का उत्पादन<em&gt; ई। कोलाई</em&gt; एक्स-रे क्रिस्टलोग्राफी के लिए
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Leuthold, M. M., Koromyslova, A. D., Singh, B. K., Hansman, G. S. Production of Human Norovirus Protruding Domains in E. coli for X-ray Crystallography. J. Vis. Exp. (110), e53845, doi:10.3791/53845 (2016).

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